JPH0223860A - 植物細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、成長とともに細胞集塊を形成する植物細胞を
光照射の下で高密度に液体培養し、併せて同植物培養細
胞より生産される二次代謝化合物を高収量で得る方法に
関する。

（従来の技術） 植物細胞の液体培養には、通気撹拌培養又はエアリフト
培養が一般に行われている。エアリフト培養法では、培
養槽の下方から空気等を導入し、上昇する気泡により、
培地の撹拌が行われている。

そして、光を照射することによって培養中の植物細胞の
増殖、生育及び培養細胞が産生ずる二次代紺産物の生産
が促進されることは知られている。

従来、そのような代謝産物の生産のため光を照射して植
物細胞を液体培養する場合には、ガラス製培養槽の周囲
から光照射を行う方法が一般に採用されている。

一方、光ファイバーを利用して、培養槽の内部から光を
照射する方法は、クロレラ、スピルリナのような細胞集
塊を形成しない単細胞藻類の培養の場合に行われている
。

従来の方法では、植物細胞を培養する場合、培養槽の外
部から光を照射する方法を採っていたため、植物細胞の
生育が促進され培養槽内で増加するにつれて、培養槽内
部への光の透過が植物細胞自身によって妨げられ、培養
植物細胞が十分に光の照射を受けることができないとい
う問題があった。また、光照射が十分でないために植物
細胞により生産される二次代謝産物の生産が抑制され、
目的とする二次代謝産物を大量に得ることができないと
いう問題があった。更に、培地中に充分量の栄養が存在
していても培養槽底部に沈降した細胞集塊は十分な酸素
の供給を受けることができず、枯死する等の種々の障害
があった。そのため、従来の方法によって、植物培養細
胞を光照射の下に大量に培養することは困難であり、ま
してこの細胞より生産される有用な二次代謝産物を商業
的規模で収得することは殆どできなかった。特に、数百
から数千の細胞からなる細胞集塊を形成し、沈降する傾
向の強い陸上植物培養細胞においては、上記の障害は甚
だしいものであった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記の障害を除き、生育及び二次代謝化合物の
生産に光を要求する植物、特に細胞集塊を形成する植物
の細胞を高密度で効率良く培養する方法を提供すること
を目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは前記の目的を達成するために鋭意研究の結
果、成長に伴って細胞集塊を形成する植物細胞を培養槽
中で液体培養するに当たり、槽内に設置された光照射装
置及び培養液を強制撹拌する撹拌装置を有する培養槽を
用いて、培養槽内から光を照射し培養液を強制撹拌しつ
つ植物細胞培養を行ったところ、細胞集塊が形成するに
もかかわらず、植物細胞が極めて良好に生育し、かつ、
該植物細胞により産生される二次代謝化合物が大量に生
産され、収得することができることを見い出し本発明を
完成した。

本発明は細胞集塊を形成する植物細胞を培養槽内の光源
からの光照射及び撹拌装置による培養液の撹拌下で培養
する植物培養細胞の培養方法、並びに同培養方法によっ
て培養された植物細胞が産生ずる二次代謝化合物を生産
する方法である。

本発明に使用する細胞集塊を形成する植物培養細胞とし
ては、特に制限はないが、好ましくは静畜類であり、例
えば、ゼニゴケ、ミドリホラゴケモドキ、トサカボケ、
ウロコゴケ若しくはキブリツポミゴケ等の畜類又はミズ
シダゴケ、ナガミチョウチンゴケ、ススキゴケ、ヒメス
ナゴケ、ウマスギボケ若しくはミャマハリゴケ等の酵類
が挙げられる。

種培養としては、植物細胞を２％グルコースを含む改良
ムラシゲ・スクーグ培地で培養する光従属栄養による培
養法又はグルコースを含まない改良ムラ／ゲ・スクーグ
培地に１〜５％の炭酸ガスを富化した空気を通気し、光
を照射する光独立栄養による培養法により培養した培養
細胞を用いることができる。

培養槽は一般の植物培養に使用する培養槽を必要に応し
て改造して用いることができ、培養する植物細胞の量に
応じて適宜の大きさのものを用いる。

本発明の培養方法に使用できる培地は、一般に植物細胞
の培養に用いられる栄養培地であり、無機成分及び炭素
源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類
を添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地
である。無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナ
トリウム、カルシウム、マグネシウム、硫黄、マンガン
、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト
等の元素を含む無機塩が挙げられる。具体的には硝酸カ
リ・クム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸−
水素カリウム等が例示される。

この培地に必要に応じて添加される植物ホルモンとして
は、ナフタレン酢酸、インドール酢酸、ｐ−クロロフェ
ノキシ酢酸等が例示される。また、ビタミン類としては
、ビオチン、チアミン、ピリドキンン、アスコルビン酸
等が例示される。

本発明の植物培養細胞の培養に用いられる培地の好適な
ものは、ムラシゲ・スクーグ培地又は改変ムラ７ゲ・ス
クーグ培地等である。

本発明に使用する培養槽内に設置する光照射装置として
は、ガラス製保護管内に挿入した光ファイバーあるいは
蛍光管又は保護管を必要としない耐熱性の光ファイバー
をその培養槽の大きさに応じて数十〜数百本程度用いる
。光ファイバーは、その直径が、例えば３ｍｍ程度であ
っても良く、長手方向の複数箇所に光を放出する部分を
設けても良く、これを培養槽の底の撹拌装置よりやや上
方に先端が位置するように挿入しても良い。

本発明において、植物培養細胞を培養する場合は、光源
としてキセノンランプのような人工光源あるいは太陽集
光装置により集光、伝送しｔ；太陽光を用いることがで
き、連続的又は断続的に光を植物培養細胞に照射し、通
気下で撹拌装置を１分間１００〜３００回転で作動させ
る。このことにより細胞は均一に浮遊し、有効に光照射
を受ける。

このような培養方法で植物細胞を培養すると、高密度ま
で培養することができる。

撹拌装置は小規模の培養装置では、浮遊式のマグネチッ
ク・スターラー撹拌子、大規模の培養装置においてはメ
カニカルカップラーにより外部モーターと接続した撹拌
羽根を有する撹拌装置を使用する。なお、培養槽に用い
る通気装置は焼結ガラスのような多孔質素材あるいはテ
フロン等に多数の細孔を加工したものを散気管（スパジ
ャー）として使用すると好都合である。

なお、従来強制撹拌下に槽内から光を照射する方法は行
われていなかった理由の一つは、適当な培養槽が入手で
きなかったことである。即ち、細胞集塊を十分に浮遊さ
せるには、強力な撹拌が必要であるが１光照射のために
槽内各所に光ファイバーを導入すると、通常の撹拌機を
備えた培養槽では撹拌が不可能であった。

そこで・本発明者らは、本発明の方法に特に適する撹拌
装置も作成した。この撹拌装置は、培養槽本体内部に固
定できる枠組み及びその枠組み内を回転する撹拌羽根か
らなっている。好ましくは、撹拌羽根はマグネット式の
回転子を用いる。こうして枠組み内に回転子を置くこと
により、細胞集塊が沈降して来ても撹拌が妨げられるこ
となく、かつ、回転子（撹拌羽根）の動きによる細胞の
損傷を防ぐことができる。

第１図に示す好ましい撹拌装置において、マグネット回
転子１が枠組み２の軸３と同軸に設けられている。これ
を培養槽内の底面に置いて、槽外に設置されたマグネッ
トで槽内回転子を回転させる。枠組みの上腕４及び下腕
５は伸縮自在で、その外方先端６は培養槽内面に接して
枠組み２の回転を防止する形状を有する。

更に、撹拌装置の羽根の形状を選ぶことにより、細胞の
損傷を最小限に止めつつ、最大の撹拌効果を得ることが
望ましい。また、消費されり栄養ｉを適宜補充すること
によって細胞を極めて高濃度に培養することができる。

本発明は、畜類培養細胞のように、細胞の生育と二次代
謝化合物生産の両方に光を必要とする培養細胞系につい
ては勿論のこと、ブドウ培養細胞によるアントシアニン
生産のように成長には光を必要としないが、光により二
次代謝化合物の生産が促進されるような高等植物細胞系
に対しても応用することができる。

従って、本発明の培養方法は光従属栄養及び光独立栄養
の植物のいずれにも適用できる利点がある。

本発明の方法で生産される二次代謝化合物の例としては
、ミドリホラゴケモドキ細胞による１゜４−ジメチルア
ズレンのようなテルペン化合物あるいはビタミンＥやβ
−カロチンのようなビタミン類等多数のものがある。

本発明の方法は培養槽の内部の光源からの光照射を行う
ため、細胞集塊を形成する植物細胞が、培養中に次第に
生育しても、照射光が生育し、２細胞により遮断される
ことなく、均一に培養細胞全体に照射されるため、高密
度の細胞生育並びに高収率の二次代謝化合物の生産が達
成できる。また、撹拌装置により培養液を撹拌している
ので、細胞集塊が形成しても沈降することなく槽内に浮
遊するから、この集塊にも均一に光が照射され、かつ酸
素の供給を受けることができる。

実施例１ ゼニゴケ細胞を改変ムラシゲ・スクーグ培地で２２．５
℃で光従属栄養による培養法によって前培養を行った。

次に、前培養され−た細胞懸濁液２００ｍ１＋を７ａ容
培−槽に接種し培養を開始する。

培養条件は、表１に示されるＭＳＫ−２培地を用いて、
人工光源として３００Ｗキセノンランプを用い、光源か
らの光を培養槽内に設置された側面に漏光処理を施した
３５本の直径３ｍｍのプラスチック光ファイバーに分け
て培養槽内に照射し、第１図に示された羽根を用いて毎
分２００回転で撹拌を行い、１〜３．５１１／分の通気
量で通気して培養を行った。

培養液中のグルコース濃度を測定し、グルコースが消費
されている場合には、グルコース、硝酸アンモニウム及
び硝酸カリウムを補充する。

２２８間培養すると、培養開始時に乾燥重量０゜５ｇ／
ｌｉｔ’あったのが４０ｇ／Ｉｌ　（約８０倍）に増加
した。

実施例２ ゼニゴケ細胞の代わりにミドリポラゴヶモドキ細胞を用
いて、培地として表１のＭＳＫ〜４を用いること以外は
実施例１と同様に培養すると、培養開始時に０．５ｇ／
Ｑであった細胞濃度が２４日間の培養後に約１０　ｇ／
Ｑに増加し、細胞乾燥ＩｔＩｋの約１％の１．４−ジメ
チルアズレンが生産されていた。

（発明の効果） 本発明の培養植物細胞培養方法は、従来その高密度大量
培養が困難であった細胞集塊を形成する植物細胞を極め
て効率良く培養することができ、かつ、その細胞の生産
する有用な二次代謝化合物を大量に収得し得る有用な発
明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、培養に用いられる好ましい撹拌装置の平面図
であり； 第２図は、培養に用いられる撹拌装置の側面図である。 １・・・回転子、２・・・枠組み、３・・・軸、４・・
・上腕、　　５・・・下腕、 ６・・・枠組み先端 尾／圀 Ａ 第２図 ム

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成長とともに細胞集塊を形成する植物細胞を液体培
   養するにあたり、培養槽内に存在させた光源から光を照
   射し、及び撹拌装置により培養液を撹拌しながら培養す
   ることを特徴とする植物細胞の培養方法。 ２、細胞を損なうことなく、かつ、該細胞集塊の大部分
   が浮遊する条件で撹拌を行う、請求項１記載の培養方法
   。 ３、植物細胞が蘚苔類の細胞である、請求項１又は２記
   載の培養方法。 ４、植物の細胞を液体培養槽内に存在させた光源からの
   光照射の下及び撹拌装置による培養液の撹拌下で培養し
   、該培養細胞に二次代謝生産物を生産させ、及びこれを
   液体培地から回収することを特徴とする、植物の二次代
   謝生産物の取得方法。 ５、細胞を損なうことなく、かつ、該細胞集塊の大部分
   が浮遊する条件で撹拌を行う、請求項４記載の培養方法
   。 ６、培養槽本体に固定できる枠組み及びその枠組み内を
   回転する撹拌子を有することを特徴とする、細胞集塊を
   形成する植物細胞の培養装置。 ７、前記枠組みが培養槽本体の内部直径に応じて伸縮で
   きる、請求項６記載の培養装置。