JPH0223873A - 高レベル発現の組換え真核細胞の作成 - Google Patents
高レベル発現の組換え真核細胞の作成Info
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- JPH0223873A JPH0223873A JP1050931A JP5093189A JPH0223873A JP H0223873 A JPH0223873 A JP H0223873A JP 1050931 A JP1050931 A JP 1050931A JP 5093189 A JP5093189 A JP 5093189A JP H0223873 A JPH0223873 A JP H0223873A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/8128—Antithrombin III
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ＤＮＡのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ）は、外来性遺伝子を培養中の動物細胞に移入させ
るために広く用いられる方法である。この技術は、近年
、一方では種々の遺伝子の多くの調節ＤＮＡ領域を同定
してそれらの機能を分析するために、また一方では、医
薬的に興味あるタンパク質をそれらの天然型または実質
的天然型として調製するために用いられてきた。
ｏｎ）は、外来性遺伝子を培養中の動物細胞に移入させ
るために広く用いられる方法である。この技術は、近年
、一方では種々の遺伝子の多くの調節ＤＮＡ領域を同定
してそれらの機能を分析するために、また一方では、医
薬的に興味あるタンパク質をそれらの天然型または実質
的天然型として調製するために用いられてきた。
遺伝子移入のためには、現在多くの異なる技術を用いる
ことができる。用いる技術に応じて、トランスフェクト
された（ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）遺伝子は、単一の
コピーまたは集合連結物（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｎ
ｃａｔｅｍｅｒｓ）として統計学的な工程で宿主細胞の
染色体に取り込まれろ。これに関して、トランスフェク
トされた遺伝子の発現率は、多くの因子、例えは、コピ
ー数、組み入れ部位、使用されるプロモーターおよびエ
ンハンサ−の強さ、およびｍ ＲＮ Ａの安定性など、
に依存する。
ことができる。用いる技術に応じて、トランスフェクト
された（ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）遺伝子は、単一の
コピーまたは集合連結物（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｎ
ｃａｔｅｍｅｒｓ）として統計学的な工程で宿主細胞の
染色体に取り込まれろ。これに関して、トランスフェク
トされた遺伝子の発現率は、多くの因子、例えは、コピ
ー数、組み入れ部位、使用されるプロモーターおよびエ
ンハンサ−の強さ、およびｍ ＲＮ Ａの安定性など、
に依存する。
現在の技術では、外来性ＤＮＡの染色体領域への高転写
活性を伴う特異的な取り込みには、実質的には未解決の
問題がある。しかしながら、コピー数を操作することは
可能である。コピー数と発現レベルとの間には連関があ
ることから、遺伝子増幅の可能性をもたらす系（ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）は高収率での遺伝子の発現のために興味がも
たれる。多くの増幅可能な真核細胞性の遺伝子が近年記
述されてきている。後者のうち、もっともよく特徴づけ
されているものは、ジヒドロフオレート・リダクターゼ
（ｃｌｉｔ＋ｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓ
ｅ、 Ｄ ＨＦ Ｒ）遺伝子であり、これは阻害剤であ
るメソトレキセート（Ｍｅｔｂｏｔｒｅｘａｔｅ、 Ｍ
Ｔ Ｘ ）の濃度の上昇に従って、細胞中で増幅され
る。これに間して、機能性の内生性Ｄ ＨＦ Ｒ遺伝子
をもはや所有しないチャイニーズハムスター卵巣細胞株
（ｃｈｉｎａｓｅ ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ ｃｅｌ
ｌ １ａｎｅ、 ＣＨＯ細胞株） （Ｌｌｒｌａｕｈ
およびＣｔ＋ａｓｉｎ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ１、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃ＋、 ＵＳＡ １：Ｌ。
活性を伴う特異的な取り込みには、実質的には未解決の
問題がある。しかしながら、コピー数を操作することは
可能である。コピー数と発現レベルとの間には連関があ
ることから、遺伝子増幅の可能性をもたらす系（ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）は高収率での遺伝子の発現のために興味がも
たれる。多くの増幅可能な真核細胞性の遺伝子が近年記
述されてきている。後者のうち、もっともよく特徴づけ
されているものは、ジヒドロフオレート・リダクターゼ
（ｃｌｉｔ＋ｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓ
ｅ、 Ｄ ＨＦ Ｒ）遺伝子であり、これは阻害剤であ
るメソトレキセート（Ｍｅｔｂｏｔｒｅｘａｔｅ、 Ｍ
Ｔ Ｘ ）の濃度の上昇に従って、細胞中で増幅され
る。これに間して、機能性の内生性Ｄ ＨＦ Ｒ遺伝子
をもはや所有しないチャイニーズハムスター卵巣細胞株
（ｃｈｉｎａｓｅ ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ ｃｅｌ
ｌ １ａｎｅ、 ＣＨＯ細胞株） （Ｌｌｒｌａｕｈ
およびＣｔ＋ａｓｉｎ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ１、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃ＋、 ＵＳＡ １：Ｌ。
４２１６−４２２０、＋９８０）は、外生性ＤＨＦＲ遺
伝子およびそれと結合した遺伝子の増幅にとくに適して
いる（にａｕｆｍａｎおよびＳｌ＋ａｒｐ： Ｊ、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏ１、 Ｌ５３．６０１−６２１．１９８
２）。
伝子およびそれと結合した遺伝子の増幅にとくに適して
いる（にａｕｆｍａｎおよびＳｌ＋ａｒｐ： Ｊ、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏ１、 Ｌ５３．６０１−６２１．１９８
２）。
しかしながら、この方法を用いて充分な生産性を有する
細胞株をスクリーニングするためには適当な増幅および
発現のために一般に４〜８力月を要することから、時間
的および操作的にきわめて高価なものとなる。さらに、
ＭＴＸを介する増幅は、これまてＣＨ○系または同等の
細胞株に限定されてきた。なぜならは、Ｄ ＨＦ Ｒ−
欠失性てはない他の細胞では、非特異的耐性を伴うから
である。更なる因子としては、内生性ＤＨＦＲ遺伝子の
競合的増幅が排除てきないということがあり、これによ
って所望の増幅効果が低減すると考えられる。
細胞株をスクリーニングするためには適当な増幅および
発現のために一般に４〜８力月を要することから、時間
的および操作的にきわめて高価なものとなる。さらに、
ＭＴＸを介する増幅は、これまてＣＨ○系または同等の
細胞株に限定されてきた。なぜならは、Ｄ ＨＦ Ｒ−
欠失性てはない他の細胞では、非特異的耐性を伴うから
である。更なる因子としては、内生性ＤＨＦＲ遺伝子の
競合的増幅が排除てきないということがあり、これによ
って所望の増幅効果が低減すると考えられる。
本発明は、任意の所望の由来の細胞株、すなわち高レベ
ル生産性の野生型細胞株、の直接的で迅速なスクリーニ
ング法である。この方法は、まず、少なくとも二つの選
択性（５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ）遺伝子を目的の非選択性
（ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）遺伝子と共に適当な
細胞または野生型細胞に共トランスフェクション（ｃｏ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させることを含むものであ
る。共トランスフェクションは、別々の遺伝子を同時に
動物細胞に導入するためのきわめて効果的な方法として
知られている。これに関して、共トランスフェクション
は、ごく一般には、ベクターまたはＤ Ｎ Ａ構造物（
５ｔｒｕｃｔ、ｕｒｅｓ）のトランスフェクションとし
ても知られている。共トランスフェクションされたＤＮ
Ａフラグメントは、般に、直接的に隣接して宿主染色体
に組み込まれ、多くの場合、高度に連関した発現がそこ
で進行する。次いで、第一の工程において、すべてのマ
ーカーに関する耐性の選択を、適切な（阻害性）物質を
培地に同時にまたは迅速に続けて添加することによって
行う。同時または１時間以内の添加が好ましいが、本発
明は、１時間〜１２０時間後までの添加をも包含する。
ル生産性の野生型細胞株、の直接的で迅速なスクリーニ
ング法である。この方法は、まず、少なくとも二つの選
択性（５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ）遺伝子を目的の非選択性
（ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）遺伝子と共に適当な
細胞または野生型細胞に共トランスフェクション（ｃｏ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させることを含むものであ
る。共トランスフェクションは、別々の遺伝子を同時に
動物細胞に導入するためのきわめて効果的な方法として
知られている。これに関して、共トランスフェクション
は、ごく一般には、ベクターまたはＤ Ｎ Ａ構造物（
５ｔｒｕｃｔ、ｕｒｅｓ）のトランスフェクションとし
ても知られている。共トランスフェクションされたＤＮ
Ａフラグメントは、般に、直接的に隣接して宿主染色体
に組み込まれ、多くの場合、高度に連関した発現がそこ
で進行する。次いで、第一の工程において、すべてのマ
ーカーに関する耐性の選択を、適切な（阻害性）物質を
培地に同時にまたは迅速に続けて添加することによって
行う。同時または１時間以内の添加が好ましいが、本発
明は、１時間〜１２０時間後までの添加をも包含する。
この結果、唯一のマーカー遺伝子で選択されていた細胞
に較べて、非選択性遺伝子のための発現率が著しく高め
られた細胞株を得ろことができる。同時に、このように
して行われろ発現は、単なる付加的効果ではなく相乗的
効果をもたらす。この系における二つまたはそれ以上の
選択性マーカーを用いることによって、非特異的耐性か
ら生じる困難が避けられる。これに関して、該「マーカ
ー遺伝子」は、目的。非選択性遺伝子と共に一つのベク
ターに、またはいくつカノベクターに分配させて、位置
させることが可能である。
に較べて、非選択性遺伝子のための発現率が著しく高め
られた細胞株を得ろことができる。同時に、このように
して行われろ発現は、単なる付加的効果ではなく相乗的
効果をもたらす。この系における二つまたはそれ以上の
選択性マーカーを用いることによって、非特異的耐性か
ら生じる困難が避けられる。これに関して、該「マーカ
ー遺伝子」は、目的。非選択性遺伝子と共に一つのベク
ターに、またはいくつカノベクターに分配させて、位置
させることが可能である。
さらに、一つ（またはいくつかの）の選択物質の培地中
での濃度を、他を一定に慄ちながら、増加させることに
よって、ずへてのトランスフェクトされた遺伝子のコピ
ー数が増幅された、かつ、とくに、非選択性遺伝子の発
［率の高い細胞を選択することが、可能となる。
での濃度を、他を一定に慄ちながら、増加させることに
よって、ずへてのトランスフェクトされた遺伝子のコピ
ー数が増幅された、かつ、とくに、非選択性遺伝子の発
［率の高い細胞を選択することが、可能となる。
この方法の有利性は、いかなる所望の細胞株にも広く適
用できること、および選択およびスクリーニング工程に
長時間を要しないことにある。これによって、例えば、
活性の研究に必要な量のタンパク質突然変異体を遺伝子
操作によって短時間に得て、これを試験することが可能
となる。
用できること、および選択およびスクリーニング工程に
長時間を要しないことにある。これによって、例えば、
活性の研究に必要な量のタンパク質突然変異体を遺伝子
操作によって短時間に得て、これを試験することが可能
となる。
したがって、本発明は、高レベル発現性の組換え細胞の
産生のための上記の工程、および非選択性遺伝子の突然
変異体のスクリーニングのためのその使用に関する。本
発明の更なる態様は、以下の本例および特許請求の範囲
に詳細に説明される通りである。
産生のための上記の工程、および非選択性遺伝子の突然
変異体のスクリーニングのためのその使用に関する。本
発明の更なる態様は、以下の本例および特許請求の範囲
に詳細に説明される通りである。
例
１、新生ハムスター腎（Ｂ ＨＫ ）細胞の二重選択（
ｄｏ萌＊Ｉｅ ５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）上記の共トランス
フェクションにおいてトランスフェクトされた遺伝子の
数は制限的因子ではない。したがって、二つ以上の遺伝
子を同時に細胞に導入することは完全に可能である。ヒ
ト抗トロンビン■のための転写単位を種々の選択マーカ
ーの組合せ［ネオマイシン耐性／ＤＨＦＲ、ネオマイシ
ン耐性／ピュロマイシン（ρｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性］
と共にＢ ＨＫ細胞に共トランスフェクションさぜろ１
クリは、目的のへテロの（ｈｅｔｅｒｏ ｌ ｏｇｏｕ
ｓ）構造遺伝子の発現のために呈示される二重選択系の
有利な性質を示すことを意図するものである。
ｄｏ萌＊Ｉｅ ５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）上記の共トランス
フェクションにおいてトランスフェクトされた遺伝子の
数は制限的因子ではない。したがって、二つ以上の遺伝
子を同時に細胞に導入することは完全に可能である。ヒ
ト抗トロンビン■のための転写単位を種々の選択マーカ
ーの組合せ［ネオマイシン耐性／ＤＨＦＲ、ネオマイシ
ン耐性／ピュロマイシン（ρｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性］
と共にＢ ＨＫ細胞に共トランスフェクションさぜろ１
クリは、目的のへテロの（ｈｅｔｅｒｏ ｌ ｏｇｏｕ
ｓ）構造遺伝子の発現のために呈示される二重選択系の
有利な性質を示すことを意図するものである。
１ 、ａ）プラスミド１１Ｓ Ｖ Ａ Ｔ ＩＩＩのプ
ラスミド１） Ａ Ｇ ６０ ／ ｐ Ａ ｄ Ｄ Ｈ
Ｆ Ｒ（ネオマイシン耐性／ Ｄ ＨＦ Ｒｃ Ｄ Ｎ
Ａ ）との共トランスフェクション 本実験のために、ＢＨＫ２１ （ＡＴＣＣＣＣＬ−１０
）！胞を１０％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）を含むＤＭＥ
（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａ３
１ｅ’ｓ）培地て増殖させた。
ラスミド１） Ａ Ｇ ６０ ／ ｐ Ａ ｄ Ｄ Ｈ
Ｆ Ｒ（ネオマイシン耐性／ Ｄ ＨＦ Ｒｃ Ｄ Ｎ
Ａ ）との共トランスフェクション 本実験のために、ＢＨＫ２１ （ＡＴＣＣＣＣＬ−１０
）！胞を１０％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）を含むＤＭＥ
（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａ３
１ｅ’ｓ）培地て増殖させた。
トランスフェクションのために、次の環状プラスミドＤ
ＮＡを燐酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｈ： Ｖｉｒｏｌｏ３ｙ ５４．４５６−４
６７．１９７３）にて０．５ｍｌ容量に共沈澱させた１
２８ｇのｐ Ｓ ＶＡＴｍ （Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ
ら： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ８ｙ ５．７２０−７２
５．１９８７）、０．８７ｚｇのｐＡｄＤＨＦＲ（にａ
ｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ： １９Ｂ２、前出）およ
び０．２μｇのｐ ＡＧ ６０ （Ｃｏｌｂｅｒｅ−
Ｇａｒａｐｉｎら： Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｔ。
ＮＡを燐酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｈ： Ｖｉｒｏｌｏ３ｙ ５４．４５６−４
６７．１９７３）にて０．５ｍｌ容量に共沈澱させた１
２８ｇのｐ Ｓ ＶＡＴｍ （Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ
ら： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ８ｙ ５．７２０−７２
５．１９８７）、０．８７ｚｇのｐＡｄＤＨＦＲ（にａ
ｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ： １９Ｂ２、前出）およ
び０．２μｇのｐ ＡＧ ６０ （Ｃｏｌｂｅｒｅ−
Ｇａｒａｐｉｎら： Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒｉｏｔ。
血、１−１４．１９８１）。共沈澱を５ｍｌの培地と共
に２５ ｃｍ２の培養容器中の１．２Ｘ１０５個の細胞
に加えて、３７℃で１６時間培養した。細胞を５ｍｌの
ＤＭＥ／１０％ＮＣ５と共にさらに４８時間培養した後
に、細胞をｌ：３の割合て５００μ８／ｍＩＧ ４１８
（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ギブコ社製）および０〜３０
０ｎＭＭＴＸを含むＤＭＥ／１０％Ｎ ＣＳ培地中に移
し入れた。６〜１４日の選択期間（培地交換を３〜４日
毎に行った）の後、耐性クローンを計数して、トリプシ
ン処理して剥離させて、クローン混合物として増殖させ
た［混合クローン、すなわち得られたクローン群の集合
（ｐｏｏｌ） ］。
に２５ ｃｍ２の培養容器中の１．２Ｘ１０５個の細胞
に加えて、３７℃で１６時間培養した。細胞を５ｍｌの
ＤＭＥ／１０％ＮＣ５と共にさらに４８時間培養した後
に、細胞をｌ：３の割合て５００μ８／ｍＩＧ ４１８
（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ギブコ社製）および０〜３０
０ｎＭＭＴＸを含むＤＭＥ／１０％Ｎ ＣＳ培地中に移
し入れた。６〜１４日の選択期間（培地交換を３〜４日
毎に行った）の後、耐性クローンを計数して、トリプシ
ン処理して剥離させて、クローン混合物として増殖させ
た［混合クローン、すなわち得られたクローン群の集合
（ｐｏｏｌ） ］。
ＡＴｍの発現率を決定するために、この型の混合クロー
ンの５Ｘ１０５個の細胞を２５０ｆｆ１２の培養容器中
の５ｍｌの培地で培養した。２４時間の後、新鮮な培地
を加えて、さらに２４時間培養した。
ンの５Ｘ１０５個の細胞を２５０ｆｆ１２の培養容器中
の５ｍｌの培地で培養した。２４時間の後、新鮮な培地
を加えて、さらに２４時間培養した。
細胞を計数して、特異的なＥＬＩＳＡ（′ｒｌ＃素結合
免疫吸着法、ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏ ５ｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ） （ドイツ国特許出
願第ｐ ３６２４４５３．８明細書に提示されている）
を用いてＡＴ［ＩＩの含有量を決定した。
免疫吸着法、ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏ ５ｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ） （ドイツ国特許出
願第ｐ ３６２４４５３．８明細書に提示されている）
を用いてＡＴ［ＩＩの含有量を決定した。
第１図は、トランスフェクション当りのクローン数がＭ
ＴＸａ度の増加にしたがって減少していることを示す。
ＴＸａ度の増加にしたがって減少していることを示す。
一方、分泌されるＡＴｍの竜は、二重選択の場合ではＧ
４１Ｂでの単一選択の場合に較べて４倍多くなっている
。
４１Ｂでの単一選択の場合に較べて４倍多くなっている
。
染色体ＤＮＡを異なるＭＴＸａ度で二重選択させたＢ
ＨＩ（クローンからｉ離して、これをドット−プロット
（ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ −Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
ＨＩ（クローンからｉ離して、これをドット−プロット
（ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ −Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｌ５Ｊ１．
３９３−４旧、１９８２）にて、ニックトランスレーシ
ョン（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）によって３
２ ｐでラベルされたＡ Ｔ ｍ ｃ Ｄ Ｎ Ａから
のフラグメントとハイブリダイズさせた。その結果は、
ＭＴＸに対する耐性の増加とクローン混合物のＡＴＩ［
Ｉ遺伝子平均コピー数およびＡＴｍ発現率の増加とが連
関することを示している。
３９３−４旧、１９８２）にて、ニックトランスレーシ
ョン（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）によって３
２ ｐでラベルされたＡ Ｔ ｍ ｃ Ｄ Ｎ Ａから
のフラグメントとハイブリダイズさせた。その結果は、
ＭＴＸに対する耐性の増加とクローン混合物のＡＴＩ［
Ｉ遺伝子平均コピー数およびＡＴｍ発現率の増加とが連
関することを示している。
Ｌ、ｂ）プラスミドｐＡＢ３−１ （ＡＴ［［［）のプ
ラスミドｐＲＭＨ１４０／ｐＳＶ２ｄｈｆｒ （ネオマ
イシン耐性／ Ｄ ＨＦ Ｒｃ Ｄ Ｎ Ａ ）との共
トランスフェクション 本例は、例１．ａに示された系は、関連遺伝子（ＡＴＩ
ＩＩネオマイシン耐性、ＤＨＦＲ）のための他の転写調
節配列を有するベクターを用いても、小幅変更プロトコ
ールで行うことができることを示すためのものである。
ラスミドｐＲＭＨ１４０／ｐＳＶ２ｄｈｆｒ （ネオマ
イシン耐性／ Ｄ ＨＦ Ｒｃ Ｄ Ｎ Ａ ）との共
トランスフェクション 本例は、例１．ａに示された系は、関連遺伝子（ＡＴＩ
ＩＩネオマイシン耐性、ＤＨＦＲ）のための他の転写調
節配列を有するベクターを用いても、小幅変更プロトコ
ールで行うことができることを示すためのものである。
これらの実験のために、ＢＨＫｍ胞をｌθ％胎児ウシ血
清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥ培地（ｃｕ Ｉ ｔｕ ｒｅ
ｉｌｅｄｉｕｍ、培養環１ｔ！ｙ）で増殖させた。トラ
ンスフェクションのために、次の環状プラスミドＤＮＡ
を燐酸カルシウム法←Ｅ記を参照されたい）にて１ｍ１
ｌｌｆｆＨ：Ｊｔ−沈Ｒすｔｔｆ−： ２０ Ｉｌｇ（
７）ｐＡＢ ３−１．５７ｚｇのｐ ５Ｖ２ｄ ｈ ｆ
ｒ （Ｌｅｅ ら： Ｎａｔｕｒｅ 出−２２８−
２３２，１９８１）および５μｇのｐＲＭＨ１４０（Ｉ
ｕｄｚｉａｋら： Ｃｅ１ｌ １１．１３７−１４６．
１９８２）。
清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥ培地（ｃｕ Ｉ ｔｕ ｒｅ
ｉｌｅｄｉｕｍ、培養環１ｔ！ｙ）で増殖させた。トラ
ンスフェクションのために、次の環状プラスミドＤＮＡ
を燐酸カルシウム法←Ｅ記を参照されたい）にて１ｍ１
ｌｌｆｆＨ：Ｊｔ−沈Ｒすｔｔｆ−： ２０ Ｉｌｇ（
７）ｐＡＢ ３−１．５７ｚｇのｐ ５Ｖ２ｄ ｈ ｆ
ｒ （Ｌｅｅ ら： Ｎａｔｕｒｅ 出−２２８−
２３２，１９８１）および５μｇのｐＲＭＨ１４０（Ｉ
ｕｄｚｉａｋら： Ｃｅ１ｌ １１．１３７−１４６．
１９８２）。
ｐＡＢ３−１は、そのＥｃｏＲＩ切断部位に結合するヒ
トサイトメガロウィルスの位置−１４７〜−５９８のエ
ンハンサ−領域（Ｂｏｓｈａｒｔら：Ｃｅ虹、５２１−
５３０．１９８５）を有していたプラスミドｐｓＶＡＴ
ＩＩＩからなる。共沈澱を２５ｃ…２の培養容器中の５
Ｘ１０５個の細胞に直接に加えて３７℃で３０分間培養
した。５ｍｌの培養培地を加えて、細胞を３７℃でさら
に５〜６時間培養した。次いで、細胞を１５％（Ｖ／Ｖ
）グリセロールを含む培養培地で３７℃で３分間処理し
た。細胞を培養培地で２回洗浄して、次いで培養培地で
３７℃で７２時間培養した。次いで、選択のために、細
胞をｌ二３〜ｌ：４の割合で４００μｇ／ｍｌ ０４１
８を含みかつ１８Ｍ Ｍ Ｔ Ｘを含むあるいは含まな
い培養培地に移し入れた。
トサイトメガロウィルスの位置−１４７〜−５９８のエ
ンハンサ−領域（Ｂｏｓｈａｒｔら：Ｃｅ虹、５２１−
５３０．１９８５）を有していたプラスミドｐｓＶＡＴ
ＩＩＩからなる。共沈澱を２５ｃ…２の培養容器中の５
Ｘ１０５個の細胞に直接に加えて３７℃で３０分間培養
した。５ｍｌの培養培地を加えて、細胞を３７℃でさら
に５〜６時間培養した。次いで、細胞を１５％（Ｖ／Ｖ
）グリセロールを含む培養培地で３７℃で３分間処理し
た。細胞を培養培地で２回洗浄して、次いで培養培地で
３７℃で７２時間培養した。次いで、選択のために、細
胞をｌ二３〜ｌ：４の割合で４００μｇ／ｍｌ ０４１
８を含みかつ１８Ｍ Ｍ Ｔ Ｘを含むあるいは含まな
い培養培地に移し入れた。
１０−１５日の選択期間（培地交換を３〜４日毎に行っ
た）の後、耐性クローンを計数し７、トリプシン処理し
て剥離させてクローン混合物トシて増殖させた。ＡＴｍ
の発現率を例１．ａに記述したようにして決定した。表
１には、二重選択の場合ではトランスフェクション当り
に生じたクローン数がＧ４１８のみでの選択の場合に較
べて約５分の１まで少なくなっていることが示されてい
る。
た）の後、耐性クローンを計数し７、トリプシン処理し
て剥離させてクローン混合物トシて増殖させた。ＡＴｍ
の発現率を例１．ａに記述したようにして決定した。表
１には、二重選択の場合ではトランスフェクション当り
に生じたクローン数がＧ４１８のみでの選択の場合に較
べて約５分の１まで少なくなっていることが示されてい
る。
また、Ａ Ｔ Ｉ［Ｉの発現率は、二重選択によって約
６倍高まることも明らかである。
６倍高まることも明らかである。
表１
Ｇ４１８［ｕｇ／ｍｌｌ ＭＴＸ［ｕＭ］ ］旺−
／” ＡＴｍ発現キトランスフェクン］ン ［μｇ
／１０６Ｉｔ 胞／２４時間］ ３００ ± ３０ ６０ ± １５ １ ± ０．２ ６ ± ０．３ ＋＋ ３回の別々のトランスフェクション実験の平均イ
ｇ 二重選択混合クローン（３ＭＫ１、表２をを照）を段階
的に増加させたＭＴＸＪ度に培地中で接触させた（１．
１０ＭＭ）。この方法によって、ＡＴｍの発現率を２倍
にすることが可能であった。定量的サザンプロット法（
Ｚｅｔｔｌｅｍｅｉｓｓｌら：前出）によって決定され
たＡＴｍの平均コピー数は、同様にこの第二のＭ ′ｒ
Ｘ選択によって増加する（表２）。
／” ＡＴｍ発現キトランスフェクン］ン ［μｇ
／１０６Ｉｔ 胞／２４時間］ ３００ ± ３０ ６０ ± １５ １ ± ０．２ ６ ± ０．３ ＋＋ ３回の別々のトランスフェクション実験の平均イ
ｇ 二重選択混合クローン（３ＭＫ１、表２をを照）を段階
的に増加させたＭＴＸＪ度に培地中で接触させた（１．
１０ＭＭ）。この方法によって、ＡＴｍの発現率を２倍
にすることが可能であった。定量的サザンプロット法（
Ｚｅｔｔｌｅｍｅｉｓｓｌら：前出）によって決定され
たＡＴｍの平均コピー数は、同様にこの第二のＭ ′ｒ
Ｘ選択によって増加する（表２）。
表２
Ｇ４１８［ｌ１ｇ／ｍｌｌ ＭＴＸ［ＩＩＭ］ ＡＴＩ
ＩＩ遺伝子 ＡＴ［［Ｉ発現コヒ０−／細胞 ［７ｚｇ
／１０６細胞（３ＭＫ１） ／２４時間］ ６ ± ０．２ １２ ± ０．４ １、ｃ）プラスミドｐＳｖＡＴ■のプラスミドｐＡＧ６
０／ｐＳＶ２ＰＡＣ（ネオマイシン耐性／ビュロマイシ
ン耐性）との共トランスフェクションＢ ＨＫ細胞を例
１．ａのようにして共トランスフェクションさせた。た
だし、プラスミド ｐ Ａ ｄ Ｄ ＨＦ Ｒの代わりに０．８７１ｇのプ
ラスミドｐ ５Ｖ２ＰＡＣ（Ｖａｒａら： Ｎｕｃ１
、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １ｌＳ４６１７−４６２４
．１９８６）を用いた。［ｐＳＶ２ＰＡＣは、ストレプ
トミセス中アルボニゲル （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）か
らのＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、動物
細胞における発現で抗生物質ピュロマイシンに対する耐
性を示す。］トトランスフエフされた細胞をＤＭＥ／１
０％ＮＣ５培地＋５００７ｚｇ／ｍ１Ｇ４１８＋０〜３
０μｇ／ｍｌピュロマイシン中で選択し、混合クローン
として増殖させて、上記のようにしてＡＴｍの発現につ
いて分析した。この実験においても、トランスフェクシ
ョン当り得られたクローンの数はピュロマイシン１度の
増加と共に減少する。これに対して、ＡＴＩＩ［の発現
率は二重選択された細胞の場合ではＧ４１Ｂでの単一選
択された細胞の場合に較べて４〜６倍高められる（第２
図）。
ＩＩ遺伝子 ＡＴ［［Ｉ発現コヒ０−／細胞 ［７ｚｇ
／１０６細胞（３ＭＫ１） ／２４時間］ ６ ± ０．２ １２ ± ０．４ １、ｃ）プラスミドｐＳｖＡＴ■のプラスミドｐＡＧ６
０／ｐＳＶ２ＰＡＣ（ネオマイシン耐性／ビュロマイシ
ン耐性）との共トランスフェクションＢ ＨＫ細胞を例
１．ａのようにして共トランスフェクションさせた。た
だし、プラスミド ｐ Ａ ｄ Ｄ ＨＦ Ｒの代わりに０．８７１ｇのプ
ラスミドｐ ５Ｖ２ＰＡＣ（Ｖａｒａら： Ｎｕｃ１
、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １ｌＳ４６１７−４６２４
．１９８６）を用いた。［ｐＳＶ２ＰＡＣは、ストレプ
トミセス中アルボニゲル （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）か
らのＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、動物
細胞における発現で抗生物質ピュロマイシンに対する耐
性を示す。］トトランスフエフされた細胞をＤＭＥ／１
０％ＮＣ５培地＋５００７ｚｇ／ｍ１Ｇ４１８＋０〜３
０μｇ／ｍｌピュロマイシン中で選択し、混合クローン
として増殖させて、上記のようにしてＡＴｍの発現につ
いて分析した。この実験においても、トランスフェクシ
ョン当り得られたクローンの数はピュロマイシン１度の
増加と共に減少する。これに対して、ＡＴＩＩ［の発現
率は二重選択された細胞の場合ではＧ４１Ｂでの単一選
択された細胞の場合に較べて４〜６倍高められる（第２
図）。
２、他の細胞系における二重選択
以下の語例は、二重選択の原理は他の動物細胞の培養に
おいても適用が可能であることを示すためのものである
。
おいても適用が可能であることを示すためのものである
。
２、ａ）プラスミドｐＳＶｔｓｓ”（ヒトインターフェ
ロン−βのｃＤＮＡを含む）のプラスミドｐＡＧ６０／
ｐＳＶ２ＰＡＣ（、ネオマイシン耐性／ピュロマイシン
耐性）とのＣＨＯｍ胞およびマウスｔ、 ＴＫ−ｍ胞
における共トランスフェクション ＣＨＯｄ ｈ ｆ ｒ （ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａ
ｓｅｉｎ。
ロン−βのｃＤＮＡを含む）のプラスミドｐＡＧ６０／
ｐＳＶ２ＰＡＣ（、ネオマイシン耐性／ピュロマイシン
耐性）とのＣＨＯｍ胞およびマウスｔ、 ＴＫ−ｍ胞
における共トランスフェクション ＣＨＯｄ ｈ ｆ ｒ （ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａ
ｓｅｉｎ。
１９８０、前出）およびＬ ＴＫ−（ＡＴＣＣＣＣＬ
１、３）細胞を例１．ａおよび例１．ｃに記述したよう
にして次の環状プラスミドＤＮＡと共トランスフェクシ
ョンさせた＝２μｇのｐＳＶｔＳＳ十（Ｒｅｉｓｅｒお
よびＨａｕｓｅｒ： Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ、、３７．４８
２−４８５．１９８７）、０．２μｇのｐＡＧ６０およ
び０．８μｇのｐＳＶＰＡＣ，）ランスフエクトされた
細胞をＤＭＥ／１０％ＮＣ５＋Ｇ４１８ （ＣＨＯ！Ｉ
胞では３６０ ｔｔ ｇ／ｍ１、Ｌ ＴＫ−細胞では
７００７１ｇ／ｍｌ）＋ビュロマイシン（０〜１０７１
ｇ／ｍｌ）中で選択した後、安定したトランスフェクシ
ョンされた細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ、以下ト
ランスフェクシントと称する）を計数して、細胞を混合
クローンとして増殖させて、インターフェロン−βの発
現率を抗ウイルス分析（Ｆｉｎｔｅｒ： Ｊ、 Ｇｅｎ
、 Ｖｉｒｏｌ。
１、３）細胞を例１．ａおよび例１．ｃに記述したよう
にして次の環状プラスミドＤＮＡと共トランスフェクシ
ョンさせた＝２μｇのｐＳＶｔＳＳ十（Ｒｅｉｓｅｒお
よびＨａｕｓｅｒ： Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ、、３７．４８
２−４８５．１９８７）、０．２μｇのｐＡＧ６０およ
び０．８μｇのｐＳＶＰＡＣ，）ランスフエクトされた
細胞をＤＭＥ／１０％ＮＣ５＋Ｇ４１８ （ＣＨＯ！Ｉ
胞では３６０ ｔｔ ｇ／ｍ１、Ｌ ＴＫ−細胞では
７００７１ｇ／ｍｌ）＋ビュロマイシン（０〜１０７１
ｇ／ｍｌ）中で選択した後、安定したトランスフェクシ
ョンされた細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ、以下ト
ランスフェクシントと称する）を計数して、細胞を混合
クローンとして増殖させて、インターフェロン−βの発
現率を抗ウイルス分析（Ｆｉｎｔｅｒ： Ｊ、 Ｇｅｎ
、 Ｖｉｒｏｌ。
５．４１９−４２７．１９６９）によって決定した。こ
の目的のために、コンフルエント（ｃｏｎｆ ｌ ｕｅ
ｎｔ）にした細胞をポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）と共に５時
間処理した。１５時間−上清液を集めて分析に供した（
ＤｉｎｔｅｒおよびＨａｕｓｅｒ： ＥＭＢＯＪ、 ｈ
、５９９−６０４．１９８７）。１０７１ｇ／ ｍｌの
ピュロマイシンおよびＧ４１８で二重選択しておいたＣ
ＨＯ混合クローンは、Ｇ４１８で単一選択されたクロ
ーン群に較べて２０倍以上のインターフェロン−βを発
現した（第３Ａ図）。１０μ、ｇ／ｍｌのピュロマイシ
ンおよびＧ４１８で二重選択しておいたＬＴＫ−混合ク
ローンは、Ｇ４１８で単一選択されたクローン群に較へ
て約６倍以上のインターフェロン−βを発現した（第３
Ｂ図）。
の目的のために、コンフルエント（ｃｏｎｆ ｌ ｕｅ
ｎｔ）にした細胞をポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）と共に５時
間処理した。１５時間−上清液を集めて分析に供した（
ＤｉｎｔｅｒおよびＨａｕｓｅｒ： ＥＭＢＯＪ、 ｈ
、５９９−６０４．１９８７）。１０７１ｇ／ ｍｌの
ピュロマイシンおよびＧ４１８で二重選択しておいたＣ
ＨＯ混合クローンは、Ｇ４１８で単一選択されたクロ
ーン群に較べて２０倍以上のインターフェロン−βを発
現した（第３Ａ図）。１０μ、ｇ／ｍｌのピュロマイシ
ンおよびＧ４１８で二重選択しておいたＬＴＫ−混合ク
ローンは、Ｇ４１８で単一選択されたクローン群に較へ
て約６倍以上のインターフェロン−βを発現した（第３
Ｂ図）。
２、ｂ）プラスミドｐＡＢ３７８Ｂ ［ヒト■：Ｃ因子
（１＋ｕｍａｎ ｆａｃｔ、ｏｒ Ｖｌｌｌ：Ｃ）をコ
ードするｃＤＮＡを含む）のプラスミドｐＲＭＨ１４０
／ ｐＳＶ２ｄｈｆｒとのＨＥ７ｍ胞（ハムスター）におけ
る共トランスフエクション プラスミドＩ） Ａ ８３７８ Ｂを構築するために、
ヒト■：Ｃ因子の欠失突然変異体（ドイツ国特許出願第
ｐ ３７２０２４６．４号明細書に提示されているよう
に、アミノ酸位置７４１〜１６８９に欠失を有する）を
コードし、かつ側部にＸｈｏＩ部位を有する、ｃＤＮＡ
をベクターｐＡＢ３−１ （例ｔ、ｂを参照されたい）
にクローニングした。この目的のために、■）八Ｂ５−
１を５ａｌＩ／ＸｂａＩで切断して、突出した５′末端
を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメント
で埋填して、ベクターフラグメント（３，３ｋｂ）を精
製した。精製された■：Ｃ因子ＤＮＡフラグメントのＸ
ｈｏ Ｉの５゛突出末端を同様にして埋填した後、連結
によってベクターｐＡＢ３７８８が得られた。２０１１
ｇのプラスミドｐＡ８３７８Ｂを例ｉ、ｂに記述され
たようにしてプラスミドｌ）ＲＭＨ１４０およびｐＳＶ
２ｄｈｆｒとＨＥ７細胞（Ｃｏｏｋ、 Ｊ、Ｌ−および
Ｌｅｗｉｎ、 Ａ、 Ｍ、： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、
３ｊ１、 １４５５−１４６Ｌ １９７９）において
共トランスフェクションさせた。例ｔ、ｂの記述のよう
にして選択を行った後、トランスフェクション混合物当
り約３００±３０個のクローンが得られた。混合クロー
ンとして増殖させたトランスフェクシントは、２４時間
当り１０’個の細胞当り０．７±０．１ユニツト（Ｕ）
の■：Ｃ因子を発現した。このように、二重選択された
細胞による■：Ｃ因子突然変異体の発現は、別実験にお
けるＧ４１８で選択された混合クローンによる場合に較
べて約３〜６倍多い。■二〇因子活性はＣＯＡ分析（に
ａｂｉ Ｖｉｔｒｕｍ、 Ｌｌｐｐｓａｌａ、スウェー
デン）によって決定された。
（１＋ｕｍａｎ ｆａｃｔ、ｏｒ Ｖｌｌｌ：Ｃ）をコ
ードするｃＤＮＡを含む）のプラスミドｐＲＭＨ１４０
／ ｐＳＶ２ｄｈｆｒとのＨＥ７ｍ胞（ハムスター）におけ
る共トランスフエクション プラスミドＩ） Ａ ８３７８ Ｂを構築するために、
ヒト■：Ｃ因子の欠失突然変異体（ドイツ国特許出願第
ｐ ３７２０２４６．４号明細書に提示されているよう
に、アミノ酸位置７４１〜１６８９に欠失を有する）を
コードし、かつ側部にＸｈｏＩ部位を有する、ｃＤＮＡ
をベクターｐＡＢ３−１ （例ｔ、ｂを参照されたい）
にクローニングした。この目的のために、■）八Ｂ５−
１を５ａｌＩ／ＸｂａＩで切断して、突出した５′末端
を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメント
で埋填して、ベクターフラグメント（３，３ｋｂ）を精
製した。精製された■：Ｃ因子ＤＮＡフラグメントのＸ
ｈｏ Ｉの５゛突出末端を同様にして埋填した後、連結
によってベクターｐＡＢ３７８８が得られた。２０１１
ｇのプラスミドｐＡ８３７８Ｂを例ｉ、ｂに記述され
たようにしてプラスミドｌ）ＲＭＨ１４０およびｐＳＶ
２ｄｈｆｒとＨＥ７細胞（Ｃｏｏｋ、 Ｊ、Ｌ−および
Ｌｅｗｉｎ、 Ａ、 Ｍ、： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、
３ｊ１、 １４５５−１４６Ｌ １９７９）において
共トランスフェクションさせた。例ｔ、ｂの記述のよう
にして選択を行った後、トランスフェクション混合物当
り約３００±３０個のクローンが得られた。混合クロー
ンとして増殖させたトランスフェクシントは、２４時間
当り１０’個の細胞当り０．７±０．１ユニツト（Ｕ）
の■：Ｃ因子を発現した。このように、二重選択された
細胞による■：Ｃ因子突然変異体の発現は、別実験にお
けるＧ４１８で選択された混合クローンによる場合に較
べて約３〜６倍多い。■二〇因子活性はＣＯＡ分析（に
ａｂｉ Ｖｉｔｒｕｍ、 Ｌｌｐｐｓａｌａ、スウェー
デン）によって決定された。
３、！Ｉ換えレトロウィルス粒子の高タイターを得るた
めの方法としての二重選択 レトロウィルスの発現ベクターｐＭ５ＡＴＩＩＩを構築
するために、１．４ｋｂ（１）Ｂ ｇ Ｉ■／ Ｂ ａ
ｍ Ｈ１フラグメント（ＡＴｍｃＤＮＡ）を、を髄増
殖性肉腫ウィルス（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌ＋ｆｅｒａｔｉ
ｖｅ ｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ）のスプライスドナー
（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ）部位およびスプライスア
クセプター（ｓｐｌｉｃｅａｃｃｅｐｔｏｒ）部位を側
部に有するｐ Ｍ ５ ｎｏ。の唯一のＢａｍＨ［部位
にクローニングした。ＢｇｌＩＩリンカ−をベクターｐ
ｓＶＡＴｍ （上記を参照されたい）からの１．６ｋｂ
のＳａ ｌ Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結させる
ことによってＡＴＩＩＩフラグメントを産生して、次い
でＢ ａｍＨＩ ／Ｂｇ Ｉ ［１明断を行った。ｐＭ
５ ｎｏ。は、ｐＢＲ骨格の他に、中でも上記のスプ
ライス部位およびネオマイシン耐性遺伝子およびを髄増
殖性肉腫ウィルスのＬ Ｔ Ｒｓ （ｌｏｎｇ ｔｅｒ
ｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ、長尺末端反復部位）
（Ｏｓｔｅｒｔａｇら： Ｊ、 Ｖｉｒｏ１、 ３３．
５７３−５８２．１９８０： ５ｔａｃｅｙら： Ｊ、
Ｖｉｒｏ１、 ５０、？２５−７３２．１９８４）を
含んでいる。
めの方法としての二重選択 レトロウィルスの発現ベクターｐＭ５ＡＴＩＩＩを構築
するために、１．４ｋｂ（１）Ｂ ｇ Ｉ■／ Ｂ ａ
ｍ Ｈ１フラグメント（ＡＴｍｃＤＮＡ）を、を髄増
殖性肉腫ウィルス（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌ＋ｆｅｒａｔｉ
ｖｅ ｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ）のスプライスドナー
（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ）部位およびスプライスア
クセプター（ｓｐｌｉｃｅａｃｃｅｐｔｏｒ）部位を側
部に有するｐ Ｍ ５ ｎｏ。の唯一のＢａｍＨ［部位
にクローニングした。ＢｇｌＩＩリンカ−をベクターｐ
ｓＶＡＴｍ （上記を参照されたい）からの１．６ｋｂ
のＳａ ｌ Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結させる
ことによってＡＴＩＩＩフラグメントを産生して、次い
でＢ ａｍＨＩ ／Ｂｇ Ｉ ［１明断を行った。ｐＭ
５ ｎｏ。は、ｐＢＲ骨格の他に、中でも上記のスプ
ライス部位およびネオマイシン耐性遺伝子およびを髄増
殖性肉腫ウィルスのＬ Ｔ Ｒｓ （ｌｏｎｇ ｔｅｒ
ｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ、長尺末端反復部位）
（Ｏｓｔｅｒｔａｇら： Ｊ、 Ｖｉｒｏ１、 ３３．
５７３−５８２．１９８０： ５ｔａｃｅｙら： Ｊ、
Ｖｉｒｏ１、 ５０、？２５−７３２．１９８４）を
含んでいる。
ヘルパー細胞株Ｐ ｓ ｉ ２ （Ｍａｎｎら： Ｃｅ
１ｌ ３３．１５３−１５９．１９８３）を１０％ＦＣ
９を含むＤＭＥ培地で増殖させた。トランスフェクショ
ンのために、環状プラスミドＤＮＡの混合物（５μｇの
Ｉ）Ｍ５ＡＴＩＩＩおよび２７ｚｇ（７）ｐＳＶ２ＰＡ
Ｖ） と８ｕｇｔＤマウスＬ５ｓ胞からのせん断したＤ
ＮＡとを燐酸カルシウムにて０．５ｍｌ容量に共沈澱さ
せて、室温にて３０分間インキュベーションした後に５
ｍｌの培養培地中の２Ｘ１０Ｓ個のＰｓｉ２細胞に加え
た。
１ｌ ３３．１５３−１５９．１９８３）を１０％ＦＣ
９を含むＤＭＥ培地で増殖させた。トランスフェクショ
ンのために、環状プラスミドＤＮＡの混合物（５μｇの
Ｉ）Ｍ５ＡＴＩＩＩおよび２７ｚｇ（７）ｐＳＶ２ＰＡ
Ｖ） と８ｕｇｔＤマウスＬ５ｓ胞からのせん断したＤ
ＮＡとを燐酸カルシウムにて０．５ｍｌ容量に共沈澱さ
せて、室温にて３０分間インキュベーションした後に５
ｍｌの培養培地中の２Ｘ１０Ｓ個のＰｓｉ２細胞に加え
た。
３７℃で約１２時間インキュベーションした後に培地を
交換して、さらに２４時間の後に選択培地（単一選択の
場合には１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、二重選択の場合には
１ｍｇ／ｍｌの０４１８および２または５μｇ／ｍｌの
ビュロマイシンをそれぞれ含む１゜％ＦＣ５添加ＤＭＥ
培地）に交換した。１０〜１４日の後、得られたクロー
ンを計数して、集めた。
交換して、さらに２４時間の後に選択培地（単一選択の
場合には１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、二重選択の場合には
１ｍｇ／ｍｌの０４１８および２または５μｇ／ｍｌの
ビュロマイシンをそれぞれ含む１゜％ＦＣ５添加ＤＭＥ
培地）に交換した。１０〜１４日の後、得られたクロー
ンを計数して、集めた。
ウィルスタイター（ｔｉｔｅｒ）を決定するために、５
Ｘ１０５個のＰｓｉ２！Ｉ胞の培養を行い、培地を２４
時間後に交換した。２４時間後に、組換えレトロウィル
ス粒子を含む上清、あるいは適当な希釈物、をＨＩ Ｈ
３Ｔ３ｍ胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８．２４ウエルのプ
レー１−当り１ｏｏｏ〜３０００個の細胞）の感染に用
いた。感染を８７ｚ３／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂ
ｒｅｎ）を添加して約１２時間で行った。次いで培地を
交換して、２４時間後に選択培地（１ｍｇ／ ｍｌの０
４１８）に交換した。選択培地に交換して１０日後に、
得られたクローンを染色して計数した。二重選択からの
クローン混合物では、単一選択の場合のクローン混合物
の約１０倍のウィルスタイターが達成される（第４図）
。
Ｘ１０５個のＰｓｉ２！Ｉ胞の培養を行い、培地を２４
時間後に交換した。２４時間後に、組換えレトロウィル
ス粒子を含む上清、あるいは適当な希釈物、をＨＩ Ｈ
３Ｔ３ｍ胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８．２４ウエルのプ
レー１−当り１ｏｏｏ〜３０００個の細胞）の感染に用
いた。感染を８７ｚ３／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂ
ｒｅｎ）を添加して約１２時間で行った。次いで培地を
交換して、２４時間後に選択培地（１ｍｇ／ ｍｌの０
４１８）に交換した。選択培地に交換して１０日後に、
得られたクローンを染色して計数した。二重選択からの
クローン混合物では、単一選択の場合のクローン混合物
の約１０倍のウィルスタイターが達成される（第４図）
。
第１図は、異なるメソトレキセー）Ｊ度におけろ安定し
たトランスフォーマント数およびＡ Ｔ ｍの発現量を
示す、説明図である。 第２図は、異なるビュロマイシン濃度におけろ安定した
トランスフォーマント数およびＡＴＩＩＩ発現鷹を示す
、説明図である。 第３Ａ図は、ＣＨＯ細胞を用いた場合の、異なるピュロ
マイシン濃度における安定したトランスフォーマント数
およびインターフェロンの発現量を示す、説明図である
。 第３Ｂ図は、Ｌ ＴＫ−細胞を用いた場合の、異なる
ビュロマイシン濃度における安定したトランスフォーマ
ント数およびインターフェロンの発現量を示す、説明図
である。 第４図は、異なるピュロマイシン濃度におけるトランフ
エクタント数およびウィルスタイターを示す、説明図で
ある。 第１〜３図では、安定したトランスフォーマントの数が
左縦軸にプロットされて口で表わされている。目的の遺
伝子産物（ＡＴＴＩＩまたはインターフェロン）の量が
右縦軸にプロットされて○て表わされている。種々の阻
害剤（メソトレキセートまたはビュロマイシン）が各々
横軸にプロットされている。
たトランスフォーマント数およびＡ Ｔ ｍの発現量を
示す、説明図である。 第２図は、異なるビュロマイシン濃度におけろ安定した
トランスフォーマント数およびＡＴＩＩＩ発現鷹を示す
、説明図である。 第３Ａ図は、ＣＨＯ細胞を用いた場合の、異なるピュロ
マイシン濃度における安定したトランスフォーマント数
およびインターフェロンの発現量を示す、説明図である
。 第３Ｂ図は、Ｌ ＴＫ−細胞を用いた場合の、異なる
ビュロマイシン濃度における安定したトランスフォーマ
ント数およびインターフェロンの発現量を示す、説明図
である。 第４図は、異なるピュロマイシン濃度におけるトランフ
エクタント数およびウィルスタイターを示す、説明図で
ある。 第１〜３図では、安定したトランスフォーマントの数が
左縦軸にプロットされて口で表わされている。目的の遺
伝子産物（ＡＴＴＩＩまたはインターフェロン）の量が
右縦軸にプロットされて○て表わされている。種々の阻
害剤（メソトレキセートまたはビュロマイシン）が各々
横軸にプロットされている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、二つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子を非選択
性（ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）遺伝子と共にトラ
ンスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させて、選択マー
カー遺伝子および非選択性遺伝子を一つまたはそれ以上
のベクターまたはＤＮＡ構造物上に位置させて、次いで
選択をすべてのトランスフェクトさせた選択マーカーに
ついて行うことからなる、真核細胞における非選択性遺
伝子の発現方法。 ２、すべてのトランスフェクトさせた選択マーカーの選
択を同時にまたは１時間以内で行うことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。 ３、トランスフェクトさせた選択マーカーの連続する選
択を１〜１２０時間、好ましくは２〜７２時間の間隔で
行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ４、単一の非選択性遺伝子を共トランスフェクト（ｃｏ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させることを特徴とする、請求項
１、２または３のいずれか１項に記載の方法。 ５、連続する選択工程において、一つまたはそれ以上、
の阻害物質、好ましくは一つの阻害物質、の濃度を２〜
１００倍に、好ましくは８〜１２倍に増加させることを
特徴とする請求項１、２、３または４に記載の方法。 ６、非選択性遺伝子がＡＴIII、ＦVIII：Ｃ、 ＦVIIIａ、ｔ−ＰＡ、ＥＰＯ、Ｃ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、ＰＡ I 、プロテインＣまたはＩＬ−３をコードす
ることを特徴とする、請求項１、２、３、４または５に
記載の方法。 ７、非選択性遺伝子の突然変異体をスクリーニングする
ための、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3806617A DE3806617A1 (de) | 1988-03-02 | 1988-03-02 | Erzeugung hochexprimierender, rekombinanter, eukaryotischer zellen |
| DE3806617.3 | 1988-03-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0223873A true JPH0223873A (ja) | 1990-01-26 |
Family
ID=6348554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1050931A Pending JPH0223873A (ja) | 1988-03-02 | 1989-03-02 | 高レベル発現の組換え真核細胞の作成 |
Country Status (10)
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|---|---|
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| JP (1) | JPH0223873A (ja) |
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| DK (1) | DK175625B1 (ja) |
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| PT (1) | PT89880B (ja) |
| YU (1) | YU44789A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013526829A (ja) * | 2009-06-11 | 2013-06-27 | サイノファーム タイワン リミテッド | 細胞クローンのための阻害に基づくハイスループットスクリーニング方法 |
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-
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-
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2013526829A (ja) * | 2009-06-11 | 2013-06-27 | サイノファーム タイワン リミテッド | 細胞クローンのための阻害に基づくハイスループットスクリーニング方法 |
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