JPH022387A - 免疫学的に活性なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エピトープ及び特にＰＴの８１サブユニットに含まれる
免疫学的に優性な防御エピトープに係る。本発明は、該
エピトープ又は抗百日咳毒素防御モノクロナール抗体に
対する毒素自体のものと同等の免疫化学反応性を示す該
エピトープの領域と一致したアミノ酸配列を有する合成
ペプチドにも係る。

さらに、本発明は、抗百日咳ワクチン及び診断用キット
の調製における合成ペプチドの使用に係る。

百日咳は、桿菌である百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）によって起こる呼吸器系の病気で
あり、カタル期又は発作の間に、呼吸器系を介して、患
者から罹患し易い健康者に伝染する。

百日咳は痙傘、大脳障害を生ずることがあり、時には、
特に幼児及び母性の抗百日咳抗体が欠けた新生児では死
亡する場合があるため、このような病気に対して有効な
ワクチンが望まれている。

現在では、マーシオレートで殺菌し、５６℃で処理した
病原菌を含有する抗百日咳ワクチンが使用されているが
、この場合、たとえ永久免疫を与えることができるとし
ても、望ましくない副作用があること又はその調製、精
製及び安定性に由来する問題があること等のたぬ、完全
には満足できるものではない。

かかる理由から、欠点のない抗百日咳ワクチンの調製が
熱望されている。

近年、未処理の天然抗原ではなく、抗原の非常に小さい
領域を複写するペプチド（エピトープ又は抗原性決定子
と呼ばれる）を含有する合成ワクチンの製造が注目を集
めるようになっているが、該ペプチドは伝染因子を中和
する抗体の生成を誘発する。

エピトープは隣接性であり、特殊な線状のアミノ酸配列
によって、又は連鎖に沿って分離されているが、タンパ
ク質の３次構造における折り目（ｆｏｌｄ）に近いとこ
ろで会合するアミノ酸群によって構成されることが知ら
れている。

従って、合成ワクチンの調製には防御抗原及び該抗原に
含まれる抗原性決定子（ｉ）の両方が必要であり、立体
性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔ　ｉｏｎａｌ）エピトープの場
合、天然抗原内に存在するものと同じ立体配座をとるよ
うに決定子と同様のアミノ酸配列を有する合成ペプチド
が必要である。

現在までのところ、多糖抗原に含有されるエピトープに
ついては広く研究が行なわれているが、タンパク質分子
、特に百日咳毒素（ビルレント段階の百日咳菌によって
生産され、分泌されるタンパク質）のエピトープの構造
及びサイズに関する研究は極めて少ない。

５個のオリゴペプチド又はサブユニット　（Ｓｌ、Ｓ２
、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５）（それぞれの遺伝子は、特開昭
６２−　２２８２８６号に開示されている如く、クロー
ン化され、配列決定されている）でなるＰＴは、百日咳
菌による感染症に対して防御的に作用する主抗原の１つ
である。事実、菌体性ワクチンで免疫されたヒトにおい
て抗ＰＴ抗体が見出されており［Ａｓｈｖｏｒｔｈ　Ｌ
．＾．Ｅ．ら「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）Ｊ　１０月
。

８７８−８８１　（１９８３）］、エーロゾル手段によ
ってビルレント細菌で感作せしめたマウスにおいて、ホ
ルムアルデヒドで無毒化処理したＰＴを使用することに
よって有効な防御が達成されている［Ｓａｔｏ　Ｈら［
インフエクション・アンド・イミュノロジー（ｌｔ＋４
ｅｃｔ．　ａｎｄ　ｌｍｍｕｎ．）Ｊ　４１．　３１３
　（１９８３）］。

従って、ＰＴの免疫学的に優性なエピトープの同定によ
り、抗原の作用機構がさらに理解されること、及びエピ
トープ自体又はその領域と同一の配列を有する短いペプ
チドを従来の化学合成法又は組換えＤＮＡ技術により容
易に合成及び／又は精製できるようになるため、該エピ
トープの同定が特に望まれている。

中でも、百日咳毒素のＳ１サブユニットに含有される免
疫学的に優性なエピトープ（アミノ酸２３５個でなる）
の同定が特に興味深い。事実、５ａｔｏらは、完全な百
日咳毒素に対して生産され、インビトロでＰＴを中和し
、ビルレント百日咳菌による脳内感染からマウスを防御
するモノクロナール抗体（ＭＡｂ）が酵素活性Ｓ１サブ
ユニットを認識することを観察している　［ｒｌｎｆｅ
ｃｔ、　ａｎｄ　１ｍｍｕｎ、Ｊ　５５．９０９−９１
５（１９８７）］。

本発明によれば、免疫学的に優性なエピトープを形成す
るＳｌの領域が新たに同定され、ｌ又はそれ以上の領域
を含有し、かつインビトロで正しい立体配座をとりかつ
本来の百日咳毒素を中和する抗体の生成を誘発するペプ
チドが合成された。

特に、免疫学的に優性なエピトープの形成、中でも、こ
のエピトープの正しい立体配座の形成に必須の３種類の
非隣接性の領域Ａ、　Ｂ及びＣが、Ｓｌのペプチド鎖に
おいて、それぞれアミノ酸１−２０．４０−８０及び１
２３−１８０の間で同定された。

さらに、これら領域の１つのみを含有する合成ペプチド
がインビトロでそれら自体を正しい立体配座で再構成（
ｒｅｆｏｌｄ）でき、ペプチドがこの領域又は他の２つ
の領域を含有することを見出した。

また、これら領域の１つにおいてアミノ酸を置換する場
合には、抗体の結合に必要な立体配置をとるペプチドの
能力が破壊されることが見出された。

このように、本発明の目的は、百日咳毒素の８１サブユ
ニットに含有される免疫学的に優性なエピトープを特定
及び同定することにある。

本発明の他の目的は、Ｓｌの免疫学的に優性なエピトー
プ及び／又は天然の抗原を中和する抗体の形成を誘発で
きるＳｔの領域と同じアミノ酸配列を育する合成ペプチ
ドにある。

本発明のさらに他の目的は、治療上の有効量で該ペプチ
ドを含有してなるワクチンにある。

本発明の目的は、百日咳菌による感染を判断するための
診断用キットの調製における該合成ペプチドの使用にあ
る。

本発明の他の目的は、該明細書の記載及び実施例から明
白になるであろう。

本発明によれば、Ｓｌに含有される免疫学的に優性なエ
ピトープがＳｔと類似のアミノ酸配列を有するが、異な
る長さのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を持たな
い合成ペプチドの抗ＰＴモノクロナール抗体に対する免
疫活性をテストすることによって決定された。

合成ペプチドは、公知の化学合成法、又は異なる長さの
３′末端及び／又は５′末末端ヌクレオチド列を持たな
いＳｌをコード付ける遺伝子を含有するハイブリッドプ
ラスミドによって形質転換させた宿主微生物を使用する
発酵法によって調製される。

特に、ＰＴＥ　２５５プラスミド（特開昭６２−２２８
２８６号）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［Ｉで消
化し、消化混合物から８１をコード付ける遺伝子を含有
する６００塩基対（ｂｐ）のＤｌｉＡフラグメントを分
離し、該フラグメントを好適な制限酵素で消化し、得ら
れた３′末端及び／又は５′末末端ヌクレオチド列を持
たないフラグメントをＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で
処理して予め直線化された発現プラスミドとし、得られ
たハイブリッドプラスミドによって宿主微生物を形質転
換することからなる方法によって合成ペプチドを調製し
た。

この目的に好適な宿主微生物は、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ）、バシラス属菌又は酵母の中から選ばれる
。

特に、市販のに２−Δ肛−Δｔｒｐ大腸菌［Ｒｅｍａｕ
ｔＥ、ら「ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　１５．８１−９３　
（１９８１）］を使用した。

ついで、形質転換させた菌株を、炭素源、窒素源及び無
機塩の存在下、適当な培地において温度３０ないし４０
℃、２ないし１８時間で生育させた。

培地から菌体を分離し、常法によって溶菌処理し、溶菌
物質からペプチドを回収、精製した。

本発明によって、下記の合成ペプチドを発現させるハイ
ブリッドプラスミドを作製した。

ＮＧＯ（１−２１２）　　　　：　２１３−２３５力ル
ボキシ末端配列を持たない ＮＲＩＪ　（１−１８０）　　　　＋　１８１−２３５
力ルボキシ末端配列を持たない ＢＡＬ　（１−１２３）　　　　：　１２４−２３５力
ルボキシ末端配列を持たない ＳＡＬ　（１−１０９）　　　　：　１１０−２３５力
ルボキシ末端配列を持たない ＳＰＨ（１−６１１）　　　　：　６９−２３５力ルボ
キシ末端配列を持たない ２５５／５Ｐ）Ｉ　　（６ｇ−２３５）：　１−６７ア
ミノ末端配列を持たない ２５５／ＢＳＬ　（１２４−２３５）：　１−１２３ア
ミノ末端配列を持たない ２５５／ＳＡＬ　（＋０９−２３５）・１−１０８アミ
ノ末端配列を持たない １６−Ａ　（１１−２３５）　　　：　１−１０アミノ
末端配列を持たない １ｇ−Ａ　（１４９−２３５）　　：　１−１４８アミ
ノ末端配列を持たない ３４−Ａ　（５３−２１２）　　　：　１−５２アミノ
末端配列及び２１３−２３５カルボキシ 末端配列を持たない ＮＧＯ−ＢＡＬ　（１２４−２１２）：　１−１２３ア
ミノ末端配列及び２１３−２３５カルボキ シ末端配列を持たない ついで、ドツトプロット　［Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｙ、
Ｎ、　ｒアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）Ｊ　１１２．１９５−２０３　（１
９８１）コ及びラジオイムノアッセイによってペプチド
を試験して、抗ＰＴモノクロナール抗体に対する免疫活
性を測定した。

この目的に適する抗体は、当分野で公知のもの、特にＳ
１サブユニットと反応する防御又は非防御抗体の中から
選ばれる。

好適には、防御ＭＡｂ　ＬＩＯ［Ｐｅｒｅｒａ　Ｖ、Ｙ
、ら［ジャーナル・才ブ・ジェネラル・マイクロバイオ
ロジー　（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、）Ｊ　１３
２．５５３−５５６　（１９８６）］、３Ｆ１０及びｌ
Ｂ？　［５ａｔｏ　Ｈ，らｒｌｎｆｅｃｔ、　１ｍｌｌ
１ｕｎ、Ｊ　４６゜４２２−４２８　（１９８４）’、
　５ａｔｏ　Ｈ，らｒｌｎｒｅｃｔ　１ｍ＋＋＋ｕｎ、
Ｊ　５５゜９０９−９１５　（１９ｇ？）］及び２．３
．４及び５（ＤｒｕｓｉｌｌａＢｕｒｎｓ及びＣ，Ｍａ
ｎｃｌａｒｋによって得られたもの）、及び非防御ＭＡ
ｂ　（Ｄｒｕｓｉｌｌａ　Ｂｕｒｎｓ及びＣ，Ｍａｎｃ
ｌａｒｋによって得られたもの）及び６Ｇ７（常法に従
って発明者らの実験室で得られたもの）を使用できる。

第１表及び第１図に示すデータから、下記の事項が観察
される。

６０７　ＭＡｂ　（非防御）は、ＢＡＬＳＳＡＬ、　５
ＰＩＩ及び１８−Ａを除き、総てのペプチドを認識する
。従って、Ｓｌのアミノ酸１２３−１４９の間の領域の
地図に加入されなければならない。

モノクロナール抗体は百日咳毒素の５ＩＢＰＰサブユニ
ット［アルギニン（Ａ　ｒ　ｇ　）の代わりに１４３位
にトレオニンを有する］を認識しないことから、このア
ミノ酸の存在は、ペプチドが認識されるためには必須で
あると結論される。

ＩＭＡｂ　（非防御）は、カルボキシ末端アミノ酸を持
たないすべてのペプチド（ＳＰＴ＋　（１−６８）を含
む）を認識し、初めのアミノ酸１０個を持たないペプチ
ド１６−＾を認識しない。従って、含有されるＳｌの領
域はアミノ酸ｌと６８の間にあり、エピトープの構造に
はアミノ酸１−１０配列が特に重要であることが結論さ
れる。

ＭＡｂ２．３．４．５．３Ｆ１０、ＩＢ？及びＬＩＯＣ
非保防御）はペプチドＮＣＯ及びＮＲＵを認識するが、
ＢＡＬ、　ＳＡＬ及びＳＰＨを認識しない。従って、こ
れらは、ＳＬのアミノ酸１８０−１２３の間の領域の地
図に加入されなければならない。

ＬＩＯは、５ＩＢＰＰ及び気管支敗血症菌毒素（ｂｒｏ
ｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃ　ｔｏｘｉｎ）の５ＩＢＢサブユ
ニット［セリン（Ｓｅｔ）の代わりに１６２位にプロリ
ン（Ｐｒｏ）を含有する］のいずれをも認識しないため
、ＬＩＯは抗ＰＴモノクロナール抗体によって認識され
るこの位置の周りの領域であることが考えられる。

しかしながら、この原則は、アミノ末端配列を欠いてい
るが、１２４−１８０領域を含有するペプチドが免疫化
学反応を生じなかったことが観察された時点で破棄され
た。従って、１２３位のアミノ酸の上流側の配列はＭＡ
ｂによって認識されたエピトープの一部を構成すること
は明らかである。

抗体がアミノ酸１０個でなるアミン末端配列を持たない
ペプチド１６−Ａを認識しないため、抗体を結合するた
めには領域１−２０（第１図中の領域Ａ）及び領域１２
４〜１８０（第１図中の領域Ｃ）の両方が必要であるこ
とが結論される。

８１分子の半分ずつ（モノクロナール抗体によって別々
には認識されない）がインビトロで免疫学的に優性なエ
ピトープを再構成できるか否かをチエツクするため、そ
れぞれアミノ末端配列を欠くペプチドＢＡＬ（１−１２
３）及びｐａｃｔ−６８）を互いに混合したところ、免
疫反応に関してはマイナスであった。

詳しくは、ペプチドを５ｍＭメルカプトエタノールを添
加した８Ｍ尿素に溶解させ、得られた混合物を４℃で４
ないし２４時間反応させた。ついで、混合物を、４Ｍ尿
素を含有する塩−リン酸塩緩衝液（ＳＰＢ）に対して２
４時間、２Ｍ尿素を含有するＳＰＢに対して７２時間透
析した。

ついで、混合物を適当に希釈し、ドツトプロット分析及
びラジオイムノアッセイによるＭＡｂに対する免疫活性
の測定に使用した。第２表に示すように、ペプチドＢＡ
ｔ、（ｍ独ではモノクロナール抗体によって認識されな
い）は、アミノ末端配列を欠くペプチドと混合される際
、プラスの反応性を示す。

これは、Ｓｌの各半分は抗体によって認識されるように
正しい立体配座をとることができること及び、エピトー
プの形成には、１２３位のアミノ酸の周囲の領域は必要
でないことを示す。事実、２つのペプチドＢＡＬ及び２
５５／ＢＡＬの混合物（この領域で破壊された）はモノ
クロナール抗体によって認識された。

ペプチドＳＰＨ及びそれぞれアミノ末端領域を欠くペプ
チド１６−Ａ及び３４−Ａの混合物のテストによって得
られた結果は、しかしながら、５ＰＩＩがペプチド１６
−＾及び３４−Ａによってのみ補完されることを示した
。

これは、６８位（第１図中の領域Ｂ）の付近の第３領域
がエピトープの形成及びモノクロナール抗体の結合には
必要であることを示唆する。

観察された事項、すなわち免疫学的に優性なエピトープ
の形成及び抗体の結合に領域Ａ、　Ｂ及びＣが必要であ
ることを確認するため、Ｓｔサブユニットをコード付け
る遺伝子を部位突然変異（インビトロでＤＩ＋八分子分
子位において非常に正確に突然変異を生じさせることが
できる）によって変性させ、変異の効果をインビトロ及
びインビボでテストした。

この方法による所望塩基の置換は、下記の手法の１つに
従って実施される。

ＤＮＡにおける所定部位で塩基類似体を取込ませること 誤った方式でヌクレオチドを取込ませること 限定された配列を有するオリゴヌクレオチドのインビト
ロでの合成の間に変異を生じさせること ＤＮＡの塩基と反応する化学的変異誘発物質（たとえば
亜硫酸水素ナトリウム）を使用すること 本発明では、Ｓｌをコード付けする遺伝子を、Ｚｏｌｌ
ｅｒ　Ｍ、Ｊ、らの方法［ｒＤＮ＾Ｊ　３．４７９−４
８８　（１９８４）］に従って操作して、限定された配
列を存する合成オリゴヌクレオチドを使用して変性させ
た。

実施にあたり、クローンＰＴＥ２５５から得た６００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ　−ＨｌｎｄｌＩ［ＤＮＡフラグメント
をベクター（シングル鎖でクローン化されるフラグメン
トのＤＮＡの単離を可能にする）でクローン化した。

この目的に適するベクターは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　
ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＭＢＬ　［Ｄａｎ
ｔｅら「ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）Ｊｌｌ、　１
６４５−１６５５　（１９８３）］又はバクテリオファ
ージＭ１３　［Ｖｉｅｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ　ｒジー
ン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　１９．２６３（１９８２）］から選
ばれる。

本発明では、市販のベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ
Ｋを使用した。

該ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｎ［で処理
し、ついで、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下、リゲーシ
ョン混合物中の６００ｂＰ　ＤＮＡフラグメントに結合
させた。

得られた混合物を使用して市販の大腸菌ＪＭＩＯＩの形
質転換を行い、アンピシリンｌｏｏμ９７村を加えたＬ
Ｂ寒天培地上で形質転換体を選別した。

陽性のクローン（すなわち、ベクター及び６００ｂｐＤ
ＮＡフラグメントで構成されたハイブリッドプラスミド
を含有するもの）を、バクテリオファージが存在する液
状媒体に懸濁化させ、温度３０ないし４０℃に２ないし
１０時間維持した。

この時間の経過後、バクテリオファージを沈殿させ、遠
沈によって溶液から分離し、ｐＨ７，５の緩衝液中に再
度懸濁化させ、水−エチルエーテル飽和フェノールで抽
出し、ついでエタノール及び酢酸アンモニウムで抽出し
てシングル−ストランドＤＮＡを沈殿させた。

ついで、このＤＮＡの一定量を使用し、直接変異誘発に
よって８１遺伝子を変性させた。この目的のため、Ｓｌ
の１−ｔａｏ領域の所定部位に存在するｌ又はそれ以上
のアミノ酸をコード付ける塩基が異なるアミノ酸をコー
ド付ける他の塩基で置換されたヌクレオチド約２０でな
るオリゴヌクレオチドを合成した。特に、Ｓｌをコード
付ける遺伝子の下記変異体を調製し得るオリゴヌクレオ
チドを合成した。

４１ニブライマーＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＧ
Ｔを使用して、チロシン（８）及びアルギニン（９）を
それぞれアスパラギン酸及びグリシンに置換させた。

相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
６２０−ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡ
ＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧ−８５０から６２０−ＣＧＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣＣＣ
Ｇ−６５０に変化した。

２２：　ブライマーＴＧＧＡＧＡＣＧＴＣＡＧＣＧＣＴ
ＧＴを使用して、フェニルアラニン（５０）及びトレオ
ニン（５３）をそれぞれグルタミン酸及びイソロイノン
に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性によ
り、その配列が７５０−＾ＧＣＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣ
ＣＡＣＣＡＧＣ−７７０から７５０−ＡＧＣＧＣＴＧＡ
ＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣ７７０に変化した。

２５ニブライマーＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡ
Ａを使用して、グリシン（９９）をグルタミン酸に置換
させた。

相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
９１０−ＴＡＣ（ｉＧＣＧＣＣＧＣ−９２０から９１０
−ＴＡＣ（ｉＡＡＧＣＣＧＣ−９２０に変化した。

して、アスパラギン酸（１０９）をグリシンに置換させ
た。相当する遺伝子は、このような変性により、その配
列が９３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡ−９４０から９３
０−ＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＡ−９４０に変化した。

２７：ブライマーＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧ
Ｇを使用して、グリシン（１２１）をグルタミン酸に置
換させた。

相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
９５６−ＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＴ−９６６から９５６−
ＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴ−９６６に変化した。

１６：ブライマーＧＣＣＡＴＡＡＧＴＧＣＣＩＩ；ＡＣ
ＧＴＡＴＴＣを使用して、アラニン（１２４）をアスパ
ラギン酸に置換させた。相当する遺伝子は、このような
変性により、その配列が９７６−ＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡ
Ｃ−９８４から９７６−ＴＣｉＧＡＣＡＣＣＴＡＣ−９
８６に変化した。

１７１６：　１６及び１７の２つの変異を併せて包含す
る。

２８ニブライマーＧＣＣＡＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＣＴＧ
Ｇを使用して、グルタミン酸（１２９）をグリシンに置
換させた。

相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
９９０−ＡＧＣＧＡＡＴＡＴＣＴ（０００から９９０Ａ
ＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴ−１０００に変化した。

２９：　ブライマーＧＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＣＧＧＴＧ
ＴＧを使用して、アルギニン（１３５）をグルタミン酸
に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性によ
り、その配列が１０１０−ＧＣＧＣＡＴＴＣＣＧＣ−１
０２０から１０１０−ＧＧＡＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０２
０に変化した。

３１ニブライマーＴＡＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴ
Ｃを使用して、トレオニン（１５９）をリシンに置換さ
せた。相当する遺伝子は、このような変性により、その
配列が１０７０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣ
ＡＣＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡ−１０９０から　１０７
０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡＡＡ
ＡＣＧＧＡＧＴＡ−１０９０に変化した。

２６：プライマーＣＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＣＧＡＣＧＴ
ＡＴＴＣＧ入を使用して、チロシン（１１１）をグリシ
ンに置換させた。さらに、ブライマーのフラグメントの
部分複製によって、１１３位においてアミノ酸Ａｓｐ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙの挿入が生じた。相当する遺伝
子は、このような変性により、その配列が９３０−　Ｇ
ＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ−９５０か
ら９３０−　ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡ
ＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ　−９５０に変化した。

上記オリゴヌクレオチドを、ブライマー中に存在する変
異部取込みベクターのすべてのヌクレオチド配列を複製
するＤＮＡポリメラーゼ用ブライマーとして使用した。

プローブとしてブライマー自体を使用するハイブリダイ
ゼーション法によって、所望の変性を受けたＳ１遺伝子
を含有するベクターを単離した。

ついで、Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、らの方法［ｒＰ、Ｎ、Ａ、
ｓ、Ｊ　７４゜５４６３　（１９７７）］によって、変
性遺伝子の正確なヌクレオチド配列を確認した。

変性遺伝子を含有するベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びｌ１ｉｎｄ［ＩＩで消化して、変性Ｓ１をコード付
ける遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを公知のもの
の中から選ばれた発現プラスミド内でクローン化した。

このハイブリッドプラスミドを使用して、大腸菌、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）及び酵母の
中から選ばれる宿主微生物を形質転換させた。

特に、本発明では、プラスミドＰｅｘ−３４（Ｃｅｎｔ
ｅｒｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　
ハイデルベルグ、西独）及びＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２−
△旧−△ｔｒｐ　［Ｒｅｎ＋ａｕｔ　Ｅ、らｒＧｅｎｅ
Ｊ　１５．８１−９３　（１９８１）コを使用した。

ついで、形質転換せしめた微生物を、液状培地中、炭素
源、窒素源及び無機塩の存在下、温度３０ないし４５℃
で２０分ないし５時間培養した。

完了後、遠沈によって菌体を培地から採取し、常法によ
って溶菌化した。

突然変異したペプチドを含有する溶菌細胞を分析して、
そのモノクロナール抗体ＬＩＯに対する免疫反応性を測
定した。

このようにして、ＬｌｏＭＡｂによって認識されず、そ
れぞれ領域Ａ、　Ｂ及びＣに変異を有する３種類のペプ
チド（４１，２２及びＰＢＢ）が単離された（第２図）
。

該事実は、ＬＩＯ抗体との結合にはこれら領域が必須で
あること、及びこれらの領域の１つのみに変異がある場
合には、ＭＡｂがエピトープを認識できないことを証明
している。本発明に従い、３種の変異体をドツトプロッ
トによってテストして、他の防御ＭＡｂに対する免疫活
性を測定した。この結果、これらはペプチド２２及びＰ
ＢＢを認識できるが、ペプチド４１を認識できないこと
が観察された。該事実は、エピトープが正しい配列をと
り、従ってＭＡｂによって認識されるためには、３つの
領域Ａ１Ｂ及びＣが必要であるが、ＭＡｂの特異性はこ
れら領域内で変化することを示す。

本発明によれば、３つの非隣接性領域Ａ、　Ｂ及びＣを
含有する合成ペプチドを、従来の化学合成法によって、
又は組換えＤＮＡ法によって調製できる。

本発明の他の具体例によれば、領域の１つ又は２つを含
有する短いペプチドを合成し、これらを正しい立体配座
に戻しうる条件下においてインビ胆で混合させることに
よってペプチドを調製できる。

本発明では、Ｓｌサブユニットの作用機構についても同
定している。

サブユニットは４１位及び２０１位にノスルフィッドブ
リッジによって橋かけされた２つのシスティンを含有し
ており、酵素的に活性（毒性）となるためには、このブ
リッジが壊される。

上述のモノクロナール抗体はジスルフィッドブリッジ近
くの２つの配列を結合し、分子が２つのシスティン部を
含有する領域を移動させ、これにより活性となる阻止す
る。

この事実は、酵素的に活性なりローン２５５によって生
産されたＳ１サブユニットがなぜ良好な防御を発揮しな
いかを説明している。

実際、ジスルフィッドブリッジを持たないポリペプチド
形として表され、いくつかの分子のみが正しい立体配座
を有して抗体に結合する。

プラスミドＰＴＥ２５５によって形質転換された菌株の
発酵によって得られた酵素的に活性なサブユニットＳ１
は、正しい立体配座を持つ分子を生成するように適当に
処理され、該分子は抗百日咳ワクチンの調製に使用され
る。

本発明は、本発明のペプチド又は該ペプチドの混合物を
免疫学的に有効な量でヒトに投与することからなる百日
咳に対する免疫を誘発する方法にも係る。

治療上有効な量は当業者によって容易に決定されるが、
一般に約０．１ないし１００μｙ／ｋｇｃ体重）である
。

用量は、好ましくは０．１ないし１．０μ９／に９ｃ体
重）である。

ペプチドの投与方法は、最も適切であるものの中から選
ばれ、いずれにしても、該ペプチドを免疫系と接触させ
るものである。

詳しくは、該ペプチドは、筋肉内、静脈内又は活性剤が
リンパ球に到達し、免疫応答を誘発する各種の方法によ
って投与される。

本発明のペプチドは、免疫応答を誘発するに適した形状
で活性剤を含有する医薬組成物の調製に使用される。

容易に注射される形状でペプチドを含有する水溶液及び
懸濁液が好適である。

ペプチドに対する免疫応答を増大させるため組成物の調
製にあたりアジュバントを使用できる。

本発明によれば、該ペプチドは、単独で、又は抗原に対
する免疫応答を増大させる際に一般的に使用するものの
中から選ばれる高分子支持体に結合された状態でヒトに
投与される。

いずれの場合にも、支持体の構造は、免疫応答を増大さ
せる能力がサイズに左右されるため重要ではない。

タンパク質及び多糖の如き高分子支持体を使用する場合
、分子量１０，０００ないし１，０００，０００を有す
る化合物が好ましい。

ペプチドを支持体に結合させる方法は公知のものの中か
ら選択されるが、ペプチドの免疫能力の低下を生じさせ
ないものでなければならない。

本発明によれば、臨床サンプルにおける百日咳菌による
感染を検知するための診断用キットの調製に合成ペプチ
ドを使用できる。

次に、図面について説明する。

第１図は、百日咳毒素のＳｔサブユニット及び変異体の
地図を示す。

図中の矢印は各クローンによって表示される８１分子の
部分を示す。

変異体に組込まれたアミノ酸は１５５−４１．２５５−
２２及び２５５−ＰＢＢで示される。本来の菌株の分子
における相当するアミノ酸はＰＥＦ２５５の白い文字と
じて示されている。

ＰＴＥ２５５クローンの下部に示す数字はアミノ酸配列
に係る。

右端部に、ウェスタンブロッティングにおいて各変異タ
ンパク質が示したモノクロナール抗体との反応性（十又
は−）を表示している。

ＭＡｂの反応性は、２５５〜２２及び２５５−ＰＢＢを
除き（ＭＡｂＬＩＯによってのみ認識されない）、テス
トした７種のＭＡｂに係る。

第２図は、ドツトプロット分析による結果を示すもので
あり、ＬＩＯ抗体はカルボキシ末端領域を欠＜　ＢＡＬ
（ＩＡ）及び５ＰＨ（２Ａ）変異体又はアミノ末端領域
を欠＜　３４Ａ（ＩＢ及び２Ｂ）変異体を認識しないこ
とを表している。インビトロでの再構成の後では、ＢＡ
Ｌ及び３４Ａ（Ｉｃ及びＳＰＨ及び３４Ａ（２Ｃ））変
異体の混合物は抗体によって認識される。

ＩＤ及び２Ｄは、ＰＴＨによって表示される全５１分子
を含有する（コントロール）。

第３図は、百日咳菌（ＳＩＢＰ）、パラ百日咳菌（Ｂｏ
ｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　（
ＳＩＢＰＰ）及び気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
ａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）　（ＳＩＢＢ）の
各Ｓｔサブユニットの配列を示している。

同時に、Ｓ１遺伝子の直接部位変異法及び欠失（ｄｅｌ
ｅｔ　１ｏｎ）によって得られた各種変異体の配列を併
記している。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、限
定するものではない。

実施例１ プラスミドＰＴＥ　２５５１０μ９を緩衝溶液（５０ｘ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ７，４）、ＩＯＪＩＭ　
ＭｇＣＱｔ、　１１０Ｏｘ　ＮａＣυ１００μ１２に計
局化させ、制限酵素Ｘｂａｌ　（ＢＲＬ）　３０単位（
Ｕ）により３６℃で２時間消化し、消化混合物のｌＯμ
ρずつを酵素Ｎｃｏｌ、　Ｂａ１ｌ、Ｎｒｕｌ、５ａｌ
ｔ及びＳｐｈ　Ｉの１つ（各３Ｕ）により３７℃でさら
に２時間処理した。

このようにして消化したＤＮＡ混合物（それぞれ７５ｂ
ｐ　Ｘｂａｌ−Ｎｃｏｌ、　３７７ｂｐ　Ｘｂａｌ−Ｂ
ａｌｌ、　１６５ｂｐ　Ｘｂａｌ−Ｎｒｕｌ、　３５５
ｂｐ　Ｘｂａｌ−Ｓａｉｌ及び５０３ｂｐ　Ｘｂａｌ−
Ｓｐｈ！フラグメントを含有する）に、ラージフラグメ
ントＫｌｅｎｏｖポリメラーゼ３Ｕ及びデシキシヌクレ
オチドｄＡＴＰＳｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの
各５０５ＩＭを含有する溶液２μＱを添加して分子末端
を修繕した。混合物を室温（２０−２５℃）に１５分間
及び６５℃にさらに３０分間推持し、酵素ポリメラーゼ
を不活性化した。この時間の経過後、混合物をリゲーシ
ョン緩衝溶液（６６ＪＩＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌＣＱ（ｐ＋
４７．６）、１１２Ｍ　ＡＴＰ。

１０ｄ　ＭｇＣ１２ｔ、１０ロノチオトレイトール）で
２００μ（に希釈し、Ｔ４　ＤＮＡリガーチーＵの存在
下、１５℃に１夜推持して、上述のフラグメントを失っ
たＤＮＡ分子を再結合させた。ついで、リゲーション混
合物を使用して、５０℃Ｍ　ＣａＣ＆ｔでの処理［Ｍａ
ｎｄｅｌ　Ｍ。

及びＨｉｇａ　ｌ”１．！＋Ｉｏ１．Ｂｉｏｌｊ　５３
．１５４　（１９７０）］によってココンビテンとした
大腸菌に１２−△ＩＩＬ−△ｔｒｐを形質転換させた。

アンピシリン３０μ９ＩＲＱを添加したＬＢ寒天培地プ
レー）　［１０９／Ｑ　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ
　（ＤＩＦＣＯ）、５９／ＱＢａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　
ｅｘｔｒａｃｔ　（ＤＩＦＣＯ）、５９／（ｌ　ＮａＣ
ｆ２］上に菌体を置き、該プレートを３０℃で１８時間
インキュベートすることによって形質転換の選別を行っ
た。

組換えプラスミドを分析して、正確なヌクレオチド配列
であることを確認した。

これにより、以下のハイブリッドプラスミドが同定され
た。

ＰＴＥ　ＮＣ０ ５ｌ遺伝子は、Ｓｌザブユニットのアミノ酸２３５から
２１３までの間のカルボキシ末端配列をコード付ける部
分を欠いており、ペプチド１２１３をコード付けする。

ＰＴＥ　ＮＲＵ Ｓ１遺伝子は、Ｓｌサブユニットのアミノ酸２５５から
１８０までの間のカルボキシ末端配列をコード付ける部
分を欠いており、ペプチド１１８１をコード付ける。

ＰＴＥ　ＢＡＬ Ｓｌ遺伝子は、Ｓ１サブユニットのアミノ酸２３５から
１２４までの間のカルボキシ末端配列をコード付ける部
分を欠いており、ペプチド１１２３をコード付ける。

ＰＴＥ　５ＡＬ Ｓ１遺伝子は、Ｓｌサブユニットのアミノ酸２３５から
１１０までの間のカルボキン末端配列をコード付ける部
分を欠いており、ペプチド１−１０９をコード付ける。

ＰＴＥ　ＳＰＩ！ Ｓ１遺伝子は、Ｓｌサブユニットのアミノ酸２３５から
６９までの間のカルボキシ末端配列をコード付ける部分
を欠いており、ペプチド１−６８をコード付ける。

スミドの作製 プラスミドＰＴＥ　２５５３サンプル（各ｌＯμ９）を
、緩衝溶液（５０ｚＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２　（ｐＨ７
，４）、ｌｏｘＭ　ＭｇＣＱｔ。

５０１Ｍ　ＭａＣ１２）ｌｏｏμＱ中、３７℃、３時間
で、それぞれ制限酵素Ｓｐｈ　Ｉ、５ａｌｌ及びＢａ１
ｌ（各３０Ｕ）で消化した。

各溶液に、ラーノフラグメントＫｌｅｎｏｖポリメラー
ゼ３Ｕ及びデシキシヌクレオチドｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ
。

ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ　ノ各５０ｘＭを含有する溶液２
μａを添加し、２０−２５℃に１５分間推持した後、６
５℃に３０分間維持して酵素を不活性化させた。ついで
、各溶液に制限酵素旧ｎｄｎ［３００を添加し、得られ
た混合物を３７℃に３時間維持し、ついで１．５％アガ
ロースゲル上に負荷し、７０Ｖで３．５時間泳動させた
。各混合物について２つのバンドが分離され、１つはＳ
ｌの欠失部分を含有し、他はプラスミドＰｅｘ　３４及
びＳｌの一部を含有していた。

その後、Ｍａｎｉａｔｉｓの方法［［モレキュラー・ク
ローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　１ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　ｌｌ１ａｎｕａｌ）ｊＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８２］によって、５２０ｂｐＳ
ｐｈｌ　−ＨｉｎｄＩＩＩ、３７２ｂｐ　５ａｌｌ　−
１１ｉｎｄｌｌｌ及び３９４ｂｐＢａｌｌ　−Ｈｉｎｄ
Ｉ［［フラグメントを電気溶出した。これらフラグメン
トの各１１００ｎを、リゲーション混合物３０μＱ中、
Ｔ４　ＤＮＡリガーチーＵの存在下で、予め制限酵素Ｂ
ａｍ旧で消化し、ポリメラーゼ及びデシキシヌクレオチ
ド溶液で処理しかつ制限酵素ＢｉｎｄＩ［Ｉで消化した
プラスミドＰｅｘ　３４と結合さ仕た。

ついで、リゲーション混合物を使用して、大腸菌に１２
−△Ｉ化−△ｔｒｐを形質転換させ、前記Ａ。

で述べた如く、アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で
形質転換体を選別した。

陽性クローンから抽出したプラスミドの中で、正しい読
み取りフレームにクローン化フラグメントを含有するも
のについて、抗百日咳毒素抗体を使用するウェスタンプ
ロット法によって同定を行った。

これらのプラスミド（ＰＴＥ　２５５／ＳＰＨ，ＰＴＥ
　２５５／ＳＡＬ及びＰＴＥ　２５５／ＢＡＬと略称す
る）は、それぞれアミノ酸１−６７、ｌ−１０８及びｌ
−１２３でなるサブユニットのアミノ末端部をコード付
けるＳｌ遺伝子（それぞれペプチド６ｇ−２３５，１０
９−２３５及び１２４−２３５をコード付ける）の配列
を失っていた。

プラスミドＰＴＥ　ＮＣ０（上記Ａ、の如（して得られ
たもの）のサンプル２つ（１０μｇ）を、緩衝溶液（５
０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＮＣ１２（ｐＨ７，４）、１０ｘＭ
　ＭｇＣＣｔ、　５０ＪＩＭ　ＮａＣ＆）ｔｏｏμＱ中
、それぞれＢｓｔＮｌ（ＢＲＬ）　３０Ｕ及びＢａ１ｌ
（ＢＲＬ）　　３０Ｕにより３７℃、３時間で消化した
。

ついで、消化混合物を、２ｍＭ　ｄＡＴＰｌｄＧＴＰ、
　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの存在下、Ｋｌｅｎｏｖポリメ
ラーゼ３Ｕにより２０−２５℃で１５分間処理して末端
部を補完し、６５℃で３０分間処理して酵素を不活性化
した後、ＤＮＡを再度制限酵素Ｈ４ｎｄＩ［Ｉ　３０Ｕ
により３７℃、３時間で切断した。

消化混合物を１．５％アガロースゲル上に負荷し、７０
Ｖで３．５時間泳動し、上述の如くして、５２７ｂｐＢ
ｓｔＮ１−　ＨｉｎｄＩ［［及び２７９ｂｐ　Ｂａ１ｌ
　−Ｈｉｎｄｌｌフラグメントを電気溶出した。これら
フラグメント１１００ｎを、リゲーション混合物中、Ｔ
４　ＤＮＡリガーゼの存在下、１５℃、１８時間で、前
記Ｂで述べた如く予め処理したプラスミドＰｅＸ　３４
に結合さ仕た。ついで、上述の如くして、大腸菌の形質
転換及び形質転換体の選別を行った。陽性のクローンか
ら抽出した組換えプラスミドの中で、正しい読み取りフ
レームに挿入されたフラグメントを同定した。

該プラスミド（ＰＴＥ　３４Ａ及びＰＴＥ　ＮＣＯ／Ｂ
ＡＬ）は、それぞれアミノ酸１−５２の間及び２３５−
２１３の間の８１サブユニットの各部分をコード付ける
配列及び部分１−１．２３及び２３５−２１３でなる部
分をコード付ける配列（それぞれペプチド５３−２１２
及び１２４−２１２をコード付ける）を欠失したＳ１遺
伝子を含有していた。

Ｄ、プラスミドＰＴＥ　１６−Ａ及び１８−Ａの作製プ
ラスミドＰＴＥ　２５５１０μ９を、緩衝溶液（１００
ｘＭＴｒｉｓ−ＨＣＣ，５０ＪＩＭ　ＮａＣＱＳｌｏｘ
Ｍ　Ｍｇ５Ｏ，）ＬＯＯμＱ中、ＥｃｏＲＩ　３０Ｕで
、ついで緩衝溶液（ＩＯＩＭ　ＣａＣＱｔ。

１０ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、　０．２Ｍ　ＮａＣＱ、　２０
１１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ（１）Ｈ８，１）、ｌｘＭ
　ＥＤＴＡ）中、Ｂａ１３１（ＢＲＬ）　１０で３７℃
において消化した。混合物の一定ｌを１．３．５及び１
０分後に取出し、ついで５′末端部で欠失されたフラグ
メントを旧ｎｄＩ［Ｉで切断し、ゲル電気泳動によって
精製し、溶出後、上述の如くしてプラスミドＰｅｗ　３
４にリガーゼにより結合させた。、得られたリゲーショ
ン混合物を使用して大腸菌を形質転換させ、上述の如く
操作して、形質転換体を選別した。

陽性のクローンから抽出したプラスミドから、正しいフ
レームに挿入されたＳ１遺伝子のフラグメントを含有す
るプラスミド（そのヌクレオチド配列の分析によって確
認）を単離した。

このようにして得られた各種プラスミドから、Ｓｌのア
ミノ末端部をコード付ける配列を持たないＳｌ遺伝子を
含有するプラスミドを選別した。

特に、プラスミドＰＴＥ　１６−Ａは最初のアミノ酸１
０個をコード付けるいくつかのヌクレオチドを欠いてお
り、従って、アミ、ノ酸１１−２３５を含有するペプチ
ドをコード付けるものであり、一方、プラスミドＰＴ２
１８−Ａはアミノ酸１４９−２３５を含有するペプチド
をコード付けるものである。

実施例２ Ａ、　前記実施例１の如くして調製したプラスミドで形
質転換させた大腸菌に１２−△ＨＬ−Δｔｒｐを、液状
ＬＢ培地２０Ｕ２中、暖やかに撹拌しながら３０°Ｃで
ｌ夜培養した。各培地１０峠をＬＢ培地４００ｘＱに接
種し、３０℃で２時間、４２℃で２６５時間培養した。

その後、培養物を４℃において１１００００ｒｐで１５
分間遠心分離し、上澄み液を排出し、菌体を回収し、溶
液（２，５％ショ糖、ｌｏｉＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１（
ｐｔｌ　８．０）、Ｉ　ｄ　ＥＤＴＡ）３．２ｘＱ中に
再度懸濁化させた。

この液にリゾチーム溶液（４０ｚ９＃＋１２）０．１パ
Ｑ及び０．５Ｍ　ＥＤＴＡ０．８ｘＱを添加し、ついで
３７℃で３０分間反応させた。

各溶液に細胞溶解緩衝溶液（１％、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１
００．５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐｉ（６，０
）、６３％Ｍ　ＥＤＴＡ）　８　＊Ｑを加え、０℃に１
５分間、３７℃に３０分間維持した。

音波処理を１分間行った後、溶融した菌体及び封入体を
含有する混合物を１１０００Ｏｒｐで１０分間遠心分離
し、上澄み液を排出し、沈殿物をＩＭ尿素ＳｍＱ中に再
度懸濁化させ、３７℃に３０分間維持した。

混合物を再度遠心分離し、沈殿物又は封入体を回収し、
塩−リン酸塩緩衝溶液（ＳＰＢ）　Ｓ　ｘＱ中に溶解し
、−２０℃で保存した。

ドツトプロットテストに供する前に、封入体を含有する
溶液１００μＱを遠心分離し、沈殿物を１０ｍＭノチオ
トレイトール（ＤＴＴ）を含有する８Ｍ尿素１００μρ
中に！夜で溶解させた。

ついで、各懸濁液（ペプチド１μｇ−）　１０μｍ２ｔ
−ＳＰＢ中でｌ／１０に希釈し、直ちにミニホールド（
ｍｉｎｉｆｏｌｄ）装置を使用するニトロセルロースフ
ィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｈｕｌｌ
）に負荷した。

不溶化せしめたペプチドを含有するフィルターを、１％
Ｄｎｈａｒｄ溶液（０，０３％　ウシアルブミン、０２
％Ｐｉｃｏｌｌ　７０及び０．０２％ポリビニルピロリ
ドン）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含有する０、
１５Ｍ　ＮａＣｌ２゜１０ｄリン酸塩（ｐＨ７、４）Ｓ
ＰＢＩ：懸濁化させ、室温に２時間推持した。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を添加したＰＢＳで２回（
１５Ｆ１（！Ｘ３分間）洗浄し、００５％Ｔｖｅｅｎ　
２０を添加した５ＰＢ１０峠（モノクロナール抗体４μ
ｇ／ｘＱを含有する）と共に室温（２０−２５°Ｃ）で
１夜インキユベートした。

フィルターをｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ、　０．９％ＮａＣｌ
２及び０，１％Ｔｖｅｅｎ　２０（ＳＰＢ）溶液１０ｘ
Ｑで再度洗浄しく３Ｘ１５分間）、ペルオキシダーゼと
共役せしめたヤギガンマグロブリン抗マウスガンマグロ
ブリン（ＴＢＳ中に１／１００で希釈したもの）と共に
インキュベートし、最後にＴＢＳ中で３回、０．０５Ｍ
　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ６，８）、０，３ｘ４−クロロ−１
−ナフトールのメタノール溶液５ｘ（ｊ及びＨｔＯｔ　
７μρ中で１回洗浄した。

室温に５−６０分間維持した後、フィルターを蒸留水で
洗浄し、酵素反応を停止させた。下記第１表に示す結果
から理解されるように、免疫学的に優性なエピトープの
形成には、Ｘ＝ｔＯ領域及び１２３位アミノ酸の下流の
領域が必須である。

さらに、１６３位セリンのプロリン（ＳＩ　ＢＰＰ及び
５ＩＢＢ）による交換はＬＩＯ抗体によっては認識され
ない。

第　　１　　表 合成ペプチド ２ＢＰＰ ＩＢＢ ＮＣＯ（１−２１２） ＮＲＬＩ（１−１８０） ＢＡＬ（１−１２３） ＳＡＬ（１−１０９） ＳＰＩ＋（１−６８） １６−＾（１１−２３５） ３４−Ａ（５３−２１２） ２５５／ＢＡＬ（１２４−２３５） ２５５／５ＡＬ（１０９−２３５） ２５５／５ＰＨ（６Ｂ−２３５） １１ｃＯ／ＢＡＬ（１２４−２１２） １８−Ａ（１４９−２３５） ドツトプロット分析 抗体 防御抗体　　　　　非防御抗体 ＬＩｏ　３ＦＩＯＩＢ７　２　３　４　５　６　１　　
Ｂ６７Ｓｌ　２５５　ニブラスミドＰＴＥ２５５の発現
によって得られたアミノ酸２３５個のＳｌサブユニット
８１８ＰＰ　二百日咳菌のＳｌサブユニット５ＩＢＢ：
気管支敗血症菌毒素のサブユニブト（ｒｅＷｏｕｎｄ）
ペプチドのドツトプロットテストペプチドＳＰＨを含有
する溶液ｌ容及びペプチドＢＡＬを含存刷る溶液ｌ容を
、それぞれ、アミノ末端を欠失した変異体！容と混合し
、４Ｍ尿素ｌＯＯ容に対して２４時間及び４Ｍ尿素及び
塩−リン酸塩緩衝液１００容に対して７２時間透析した
。このようにして、再構成されたペプチドを２Ｍ尿素中
、４℃に使用時まで維持した（１μ９ｈ、Ｑ）。

ついで、モノクロナール抗体に対する再構成ペプチドの
反応性を、上記Ａ項に記載のドツトプロット法及びラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）によってテストした。

実際には、ＲＩＡテストを次のようにして実施した。す
なわち、ペプチドをＳＰＢで１７１Ｏに希釈し、５０μ
Ｑをミクロ滴定プレート上に導入し、希釈しただけのも
のをコントロールとして使用し、モノクロナール抗体を
含有するＳＰＢ　５０μｇ及び１１！５でラベル付けし
たヤギ抗マウス−γ−グロブリングロブリン５０μＣ（
−？１００．Ｇｏｏ　ｃｐｍ／チャンバー）を添加した
。

プレートを４℃で１８時間インキュベートし、ＳＰＢ　
　ＢＡＳ　　Ｎａｐｓで５回洗浄し、各チャンバーに存
在する放射活性をγカウンターで測定した。第２表に示
す結果から、ペプチド１−１２３は、インビトロで他の
すべてのペプチドと共に、すべての防御モノクロナール
抗体によって認識される正しい配置をとることができる
が、ペプチドＳＰＨ（１−６８）はペプチド１６−Ａ　
（１１−２３５）及び３４−Ａ　（５３−２１２）と共
にのみ正確な再構成を生ずる。これは、免疫学的に優性
なエピトープの形成及びＭＡｂによる認識にとっては、
６８位の周囲の領域に第３の領域の存在が必須であるこ
とを示している。

第　　２　　表 へ°ブｆト モノクロナール抗体 ）１）７゛ａフト ラジオイムノアッセイ（ｃａｐ） ６−Ａ ５４−＾ ２５５　　ＳＰＩ’１ ２５５／５ＡＬ ２５５／ＢＡＬ ＮＣＯ／ＢＡＬ ８−Ａ ｍ１ ６−Ａ ４−Ａ ＳＰＩＩ／ＨＩＮＤ ２５５／ＢＡＬ ２５５／ＢＡＬ ＮＣＯ／ＢＡＬ ８−Ａ ラジオイムノアッセイの結果（モノクロナール抗体２に
よって得られたもの）は、他の防御モノクロナール抗体
によって得られた結果と同一であった。

実施例３ Ｓ１遺伝子の変異体の調製 プラスミドＰＴＥ２５５１Ｏｔｔ９を緩衝溶液［１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ）１ｃＩ２　（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ　
ＮａＣＱ、　１０ｍＭ　ＭｇＣｆＬ］１００μρ中に！
！！濁化させ、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌｌの
各３００により３７℃、３時間で消化した。

ついで、消化混合物を１．３％アガロース上に負荷し、
８０ｍＡ、３時間で溶出した。

このようにして操作することにより、２つのバンドが分
離された。１つはベクターを含有する３５００ｂｐであ
り、他方はＳｌサブユニットをコード付ける遺伝子を含
有する８００ｂｐである。６００ｂｐのバンドを電気溶
出し、このフラグメント０．２μ？及び予め制限酵素Ｅ
ａｏＲＩ及びＨｉｎｄ［［で消化したプラスミドＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、サンデ
ィエゴ、カリフォルニア）０．３ｎｇを、緩衝溶液（６
６ｍＭ　Ｔｒｉｓｔｌｃｇ（ｐＨ７，５）、！　ｍＭ　
ＡＴＰ、　１０ｍＭ　ＭｇｃＱｘ、ｌｏｍＭ　ジチオト
レイトール）２０μρ中に＠濁化させ、Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーチーＵの存在下、１５℃、１８時間で結合させた。

ついで、リゲーノヨン混合物を使用して大腸菌ＪＭ１０
１（コンピテントしたもの）を形質転換させ、アンピノ
リン１００μ９／ＭＱ１１７ＰＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チ才ガラクトビラノンド）２０μ９／　ＩＩＱ及び
Ｘ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−Ｄ−ガラクトピラノシド）２０μ９／ｘＱを含有する
ＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選別した。

恒温室において３７°Ｃで１８時間該プレートをインキ
ュベートした。ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ及
び６０ＱｂｐＤＮＡフラグメントでなるハイブリッドプ
ラスミドを含有する白色のコロニーを使用し、下記の如
く操作してクローン化フラグメントのシングル鎖ＤＮＡ
を単離した。すなわち、該コロニーを、ＬＢ液体培地１
５ＲＱ中で、５９０■における光学密度（ＯＤ）が約０
．１５に達するまで培養した。

この培養物に、バクテリオファージＦ１（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎ）のＬＢ＠濁液（５Ｘ１０”バクテリオファージ
／ｚ１２）１０μＱを添加し、得られた溶液を３７℃に
６−８時間推持した。

その後、遠沈によって菌体を培地から分離し、上澄み液
を回収した。この上澄み液を１＋（ｌにポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）及び２．５１℃Ｍ　ＮａＣｌ２の２
０％溶液０．２ｘＱを添加してバクテリオファージを沈
殿させた。

室温（２０−２５℃）に１５分間維持した後、Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ遠心分離機において、２０℃、１２０００９
で５分間遠心分離し、このようにして回収されたバクテ
リオファージをＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ２（１）［１７，５）、ｌ＋ｎＭＥＤＴＡ）１（１
０μρ中に懸濁化させた。

ついでこの液を、ｌ容の水−飽和フェノールで１回、エ
チルエーテルで２回抽出処理し、水相にエタノール２５
０μＱ及び３Ｍ酢酸アンモニウム１０μジを添加してジ
ングルストランドＤＮＡを沈殿させた。

遠沈によってＤＮＡを反応混合物から分離しＴＥＡ衝溶
液２０μρに再度懸濁化させ、直接部位変異［Ｚｏｌｌ
ｅｒらｒＤＮＡＪ　３　、４７９−４８８（１９８４）
］に使用した。

この目的のため、所望のアミノ酸の少なくとも１つをコ
ード付ける塩基を他のアミノ酸をコード付けるように変
化させたオリゴヌクレオチドを、自動’７２１１　　Ｐ
ｌｕｓ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　Ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって合成した。該オリゴヌク
レオチド（プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ内でク
ローン化されたソノグルストランドＤＮＡ内に存在する
配列に対して相捕的である）は、プライマー内に存在す
る変異を取込むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの全ヌクレオチド
配列を転写するＤＮＡポリメラーゼ用のブライマーとし
て使用される。

実際には、合成オリゴヌクレオチド３ｘＭに、１０１Ｍ
　ＡＴＰ　２　μＱ、　Ｋｉｎａｓｅｉｉｉ衝溶液１０
Ｘ　（５００ｚＭ　ＴｒｉｓｌｌＣ（１（ｐＨ８，（１
）、１０（ＩＪＩＩＩＩ　ＭｇＲｚ）　２　ｆｔ　（１
、ＩＱＱｘＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）　ｌ　ｔｔ
　Ｑ及びＫｉｎａｓｅポリヌクレオチド（Ｂｏｃｈｒｉ
ｎｇｅｒ）　５　Ｕを添加し、最終容量を２Ｑ１ｔＱと
した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、７
０℃に１０分間維持して酵素を不活性化させた。ジング
ルストランドＤＩＩＡ（テンプレートとして使用）１μ
り、１　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（（ｐＨ８，０）緩衝溶
液１ｔｔＱ及びｌＯｘＭ　ＭｇＣＱｔ　（Ｋｉｎａｓｅ
　ＩＯＸ　ｌ答中）をプライマー２μσに添加した。混
合物を８０℃に約３分間維持し、ついで室温に約１時間
維持した。

１　ｚＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）　−１０
ｄ　ＭｇＣＱｚ緩衝溶液１０μＱ、　０．０５ｘＭ　Ａ
ＴＰ、　　ｌ　ｘＭ　ＤＴＴ、　４種類のデシキシヌク
レオチド０．５ｉＭ％Ｔ４　ＤＮＡリガーチーＵ及びＤ
ＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）２
．５Ｕを添加した。混合物を１５℃で１夜インキユベー
トし、ついで上述の如き大腸菌ＪＭ　１０１の形質転換
に使用した。

変異誘発に使用したブライマー（Ｐ３１でラベルした）
をプローブとして使用するハイブリッドプラスミド法に
よって、変異Ｓ１遺伝子を含有するプラスミドを同定し
た。実施にあたっては、形質転換されたコロニーを含有
するニトロセルロースフィルターを、６ｘＳＳＣ（ｌｘ
ｓｓｃ＝０．０１５Ｍ　ＮａＣＱ、　０．０１．５Ｍク
エン酸ナトリウム、ｐＨ７）、１０ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ（１％ＢＳＡ、　　１％ＰｉｃｏｌｌＳ１％　ポリビ
ニルピロリドン）及び２％硫酸ドデシルナトリウム（Ｄ
ＳＤ）中、２０−２５℃、１８時間でハイブリダイズし
、ａＸＳＳＣ中、下記の温度で２時間洗浄した。

２５及び２６位の変異体　　　　　　４５℃２８．２２
及び２９位の変異体　　　　４８６Ｃ２７位の変異体　
　　　　　　　　５４℃３１及び４１位の変異体　　　
　　　４６°Ｃ３ａｎｇｅｒ　Ｆ、らの方法［ｒＰ、Ｎ
、Ａ、ｓ、Ｊ　７４．５４６３（１９７７）］に従って
遺伝子のヌクレオチド配列の分析を行うことによって、
変異の誘発を確認した。

上述の如く操作することにより、下記の如く変性された
Ｓｌをフード付ける遺伝子を含有するプラスミドを調製
した。

４１ニブライマーＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＧ
Ｔを使用して、チロシン（８）及びアルギニン（９）を
それぞれアスパラギン酸及びグリシンに置換させた。相
当する遺伝子は、このような変性により、その配列が６
２０−ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣ
ＴＣＣＣＧＣＣＣＧ　−［１５Ｇ　　から　６２０−Ｃ
ＧＣＣＡＣＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣ
ＧＣＣＣＧ−６５０に変化した。

２２：　プライマーＴＧＧＡＧＡＣＧＴＣＡＧＣＧＣＴ
ＧＴを使用して、フェニルアラニン（５０）及びトレオ
ニン（５３）をそれぞれグルタミン酸及びイソロイシン
に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性によ
り、その配列が７５０−ＡＧＣＧＣＴＴＴＣＧＴＣＴＣ
ＣＡＣＣＡＧＣ−７７０から７５０−ＡＧＣＧＣＴＧＡ
ＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣ−７７０に変化した。

２５：　プライマーＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＡＧＡ
ＡＡを使用して、グリシン（９９）をグルタミン酸に置
換させた。相当する遺伝子は、このような変性により、
その配列が９１０−ＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣ−９２０か
ら９１０−ＴＡＣＧＡＡＧＣＣＧＣ−９２０に変化した
。

１７：プライマー　ＣＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
ＧＣＧＣＣを使用して、アスパラギン酸（１０９）をグ
リシンに置換させた。相当する遺伝子は、このような変
性により、その配列が９３０−ＧＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡ
９４０から９３０−ＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＡ−９４０に
変化した。

２７：　プライマーＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡ
ＧＧを使用して、グリシン（１２１）をグルタミン酸に
置換させた。相当する遺伝子は、このような変性により
、その配列が９５６−ＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＴ−９６６
から９５６−ＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴ−９６６に変化し
た。

１６：プライマーＧＣＣＡＴＡＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＴ
ＡＴＴＣを使用して、アラニン（１２４）をアスパラギ
ン酸に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性
により、その配列が９７６−ＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣ９
８４から９７６−ＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣ−９８６に変
化した。

１７１６：　１６及び１７の２つの変異を併せて包含す
る。

２８ニブライマーＧＣＣＡＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＣＴＧ
Ｇを使用して、グルタミン酸（１２９）をグリシンに置
換させた。相当する遺伝子は、このような変性により、
その配列が９９０−＾ＧＣＧＡＡＴＡＴＣＴ−１０００
から９９０−＾ＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴ−１０００に変化
した。

ｚ９ニブライマー　ＧＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＣＧＧＴＧ
ＴＧを使用シて、アルギニン（１３５）をグルタミン酸
に置換させた。相当する遺伝子は、このような変性によ
り、その配列が１ｏｉｎ−ＧＣＧＣＡＴＴＣＣＧＣ−１
０２０から１０１０−　ＧＧＡＣＡＴＴＣＣＧＣ−１０
２０に変化した。

３１：　プライマーＴＡＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧ
ＴＣを使用して、トレオニン（１５９）をリシンに置換
させた。

相当する遺伝子は、このような変性により、その配列が
１０７０−ＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧ
ＡＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡ−１０９０から　１０７０−Ｇ
ＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣ＾ＣＧＡＡＡＡＣＧ
ＧＡＧＴＡ−１０９０に変化した。

使用して、チロシン（１１１）をグリシンに置換させた
。さらに、プライマーフラグメントの部分複写によって
、１１３位においてアミノ酸Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｙの挿入が生じた。相当する遺伝子は、このような
変性により、その配列が９３０−　ＧＴＣＧＡＣＡＣＴ
ＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴ　−９５０から９３０−　Ｇ
ＴＣＧＡ’ＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧ
ＧＣＧＡＣＡＡＴ９５０に変化した。

Ｓ１遺伝子を含有するプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨ４ｎｄｌｌｌで再度消化し、ゲル電気泳動によ
って、消化混合物から上記変異部分を有するＤＮＡフラ
グメントを分離し、電気溶出し、上述の如く操作して、
リゲーション混合物中、ベクターＰＥＸ　３４Ｂ内でク
ローン化した。

リゲーション混合物を使用して、コンピテント大腸菌Ｋ
１２−△Ｈ１−Δｔｒｐを形質転換させ、アンビンリン
３０μ９／ＩＱを添加したＬＢ寒天培地上、３０℃で形
質転換体を単離した。

ついで、変異プラスミドを含有する陽性のクローンを、
実施例２に記載の如くしてＬＢ液体培地中で培養し、溶
菌処理後、得られたＳｌサブユニットの免疫反応活性を
測定した。得られた結果を第２図に示す。

【図面の簡単な説明】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　単独で又は高分子支持体に結合して、百日咳菌によ
   って生産される百日咳毒素を認識しかつ中和する抗体の
   生成をヒトにおいて誘発する免疫学的に活性なペプチド
   において、それぞれアミノ酸１−２０、４０−８０及び
   １２３−１８０に位置するＳ１サブユニットの領域Ａ、
   Ｂ及びＣを正しい配列でかつ非隣接位置で含有すること
   を特徴とする、免疫学的に活性なペプチド。 ２　請求項１記載のペプチドにおいて、４１位及び２０
   １位のシステインがジスルフィッドブリッジによって結
   合されている百日咳毒素のＳ１サブユニットのアミノ酸
   配列１−２３５を含有する、合成ペプチド。 ３　請求項１記載のものにおいて、化学合成によって得
   られたものである、ペプチド。 ４　請求項１記載のものにおいて、該ペプチドをコード
   付ける遺伝子を含有するプラスミドによって形質転換さ
   れた微生物を適当な培地で培養する工程を包含する方法
   によって得られたものである、ペプチド。 ５　請求項４記載のものにおいて、微生物が大腸菌、バ
   シラス属菌又は酵母である、ペプチド。 ６　請求項４記載のものにおいて、プラスミドがＰＴＥ
   ２５５である、ペプチド。 ７　請求項１記載のものにおいて、Ｓ１サブユニットの
   領域Ａ、Ｂ又はＣの少なくとも１つを含有するペプチド
   を合成し、正しい配列をとりかつ本来の百日咳毒素を中
   和する抗体の生成を誘発するように該ペプチドの￥イン
   ビトロ￥組換えを行い、得られたペプチドを分離し、精
   製する工程を包含する方法によって得られたものである
   、ペプチド。 ８　請求項１記載のペプチドを、ヒトにおける治療上有
   効な量で含有してなる、抗百日咳ワクチン。 ９　請求項８記載のものにおいて、前記ペプチドが免疫
   原性高分子支持体に結合されたものである、抗百日咳ワ
   クチン。 １０　請求項９記載のものにおいて、前記支持体がタン
   パク質又は多糖である、抗百日咳ワクチン。 １１　請求項１又は２記載のペプチド、又は請求項８−
   １０のいずれか１項に記載のワクチンを免疫学的に有効
   な量で投与することを特徴とする、百日咳に対する免疫
   を誘発させる方法。 １２　請求項１又は２記載のペプチドを含有したなる、
   臨床サンプル中の百日咳毒素を検出するための診断キッ
   ト。