JPH0223886A

JPH0223886A - 結合部位模倣体を作成するための抗―イデイオタイプ抗体仲介法

Info

Publication number: JPH0223886A
Application number: JP6489889A
Authority: JP
Inventors: Morton A Vodian; モートン　エイ．ボディアン
Original assignee: Synbiotics LLC
Current assignee: Synbiotics LLC
Priority date: 1988-03-17
Filing date: 1989-03-16
Publication date: 1990-01-26
Also published as: EP0386275A2; EP0386275A3; AU3118689A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、抗−イデイオタイプ抗体、さらに詳しくはリ
ガンドまたはその特異的結合パートナ−の立体配置構造
を決定するための抗−イデイオタイプ抗体仲介法に関す
る。

発明の背景基礎的な代謝過程を理解する能力は分子生物学の新技法
によって著しく増大してきた。多くの過程が現在では、
分子のレベルで、１個の複雑な分子またはリガンドの他
の相補的リガンドへの特異的結合、それによって生じる
そのリガンド対のメンバーの一方または両者の活性にお
ける変化を介して認識されている。このようなりガント
−リガンド相互作用はきわめて特異的で、そのリガンド
対の結合部位の相補性の構造立体配置によって生じる。

このようなリガンドーリガンド対の例としては、抗原−
抗体、リガンド−レセプター、酵素−基質、酵素−補酵
素、酵素−インヒビターｒ）ＮＡ　−ｒ）ＮＡ　、　ｒ
）ＮＡ　−ＲＮＡ　、ならびに細胞表面上の相当するレ
セプターに結合できるホルモン、薬剤、ウィルスおよび
抗原を含めた分子のホストラ挙げられる。

ｘ＃Ｉｌ結晶解析やコンピューターモデリングのような
革新的な技術は、一部のリガンドの構造立体配置に対す
る洞察力を提供してきた。他のりガント、とくにレセプ
ターは、たとえばそれらが十分量精製できないために、
このような技術に通合しない。他はその化学的組成のた
めに結晶化させることができない。

抗体は特異的結合対のメンバーの一例である。

抗体は、宿主生物体が異物として認識する抗原と呼ばれ
る物質による刺激に応答して免疫系のある種の細胞に工
って産生される複雑な糖タンパク質である。動物は数百
万の異なる種類の抗体を産生ずることができ、そのそれ
ぞれの種が抗原上のエピトープと呼ばれる特異的部位を
認識しそれに結合することができる。特定の抗原の存在
に応答して、抗体結合部位またはＣｎＲと呼ばれ、抗原
の工ビトープに対して立体配置的に相補性の結合部位を
有する抗体が産生ずる。抗体の可変領域は通常、全抗体
分子の小部分から構成される。

抗体自身が抗原として機能することもできる。

たとえば、動物を特定の抗体で免疫感作すると、その免
疫感作抗体のエピトープに特異的な抗体の産生が起こる
。この免疫感作抗体のＣｒ）Ｒに特異的な抗体は、抗−
イデイオタイプ抗体または抗−イデイオタイプと呼ばれ
る。すなわち、Ｃｒ）Ｒは抗原のエピトープおよび抗−
イデイオタイプの可変領域の両者に結合できる場合があ
る。これらの特異的結合反応はいずれも結合対の立体配
置的相補性に基づくものであるから、抗−イデイオタイ
プのＣＤＲは実際、抗原のエピトープと立体配置的に類
似している。このような立体配置的に均等なＣＤＲは内
部像と呼ばれる。

最近、抗原の代わりに内部像をもつ抗−イデイオタイプ
を用いる試みが行われてきた。たとえば、米国特許第４
，４９０，３５８号には、死滅または弱毒化病原の代え
て、合成ワクチンとして抗−イデイオタイプを使用する
方法が記載されている。このような合成ワクチンは、完
全に死滅していないあるいは弱毒化病原を感染の恐れが
ある動物に導入することに伴う危険を除去するという利
点がある。しかしながら、この工うな抗−イデイオタイ
プの使用には、抗体の残りの非Ｃｒ）Ｒ部分の存在に伴
うある種の欠点がある。たとえば、そのタンパク質分子
の９５係以上に及ぶ非結合部分自体が、受給対象によっ
て異物として認識されるエピトープを有し、最終的に宿
主からの抗体の排除をもたらす免疫応答を生じる可能性
がある。また、異物として認識されないでも、抗−イデ
イオタイプは免疫系調節体として認識され、導入された
抗−イデイオタイプの濃度に依存して増強または阻害効
果の誘発をみる場合が考えられる。タンパク分解酵素た
とえばトリジシンおよびパパインで切断することによっ
て製造された抗体フラグメント（Ｆａｂ　）も知られて
いるが、これらもまた非結合領域のかなシの部分を含有
している。

したがって、リガンド対の特異的結合部位の構造立体配
置を決定し、このような構造立体配置を有する合成分子
またはその変異体を製造する方法が必要である。抗−イ
デイオタイプの内部像はこの工うな構造立体配置を与え
るが、無関係の構成部分を含まない内部像が必要である
。本発明はこのような要求を達成し、それに伴う利点を
提供するものである。

発明の要約本発明は、リガンドの特異的結合部位の構造立体配置を
、問題の特異的結合部位の内部像であるＣｒ）Ｒを有す
る抗−イデイオタイプを作成し、そのＣＤＲをコードす
るＤＮＡのヌクレオチド配列を同定し、相当するアミノ
酸配列から立体配置モデルを発生させる方法を提供する
ものである。他の態様においては、特異的結合部位に対
し立体配置的に忠実な結合部位模倣体を合成する方法を
提供する。

このような結合部位模倣体は、活性について元のりガン
トの特異的結合パートナ−の可能性をスクリーニングす
るために使用できる。別の態様においては、結合部位模
倣体はそれ自体ワクチンとして使用することができ、ま
た造影剤ま九はトキシンと抱合させることができる。さ
らに、結合部位模倣体は、たとえば、相当する。特異的
結合パートナ−に結合してそれを活性化または不活性化
するホルモンまたは薬剤類縁体として治療に使用するこ
とができる。別の態様においては、Ｃｒ）Ｒの立体配置
慣造の決定は、特異的結合能が変化した変異体分子の発
生に便用することができる。

図面の簡単な説明第１図は、フローダイヤグラムにより、本発明の方法お
よび生成物を示す図である。

発明の詳細な記述本発明は、リガンドまたはその特異的結合パトナーの特
異的結合部位の構造立体配置を決定し、それを合成的に
再生する方法に関する。このような方法は、相補性リガ
ンドに結合し、それを活性化または不活性化することが
できる特異的ペプチドまたは他の分子の合成を可能にす
る点で著しい利点がある。合成ペプチドは、元のリガン
ドの結合部位と同一であっても、また結合親和性が上昇
もしくは低ドしたものであってもよい。

定義本明細書において用いられる「リガンド」の語は、特異
的結合部位によって他の分子を特異的に認識し、結合す
る任意の分子を意味する。この語は特異的結合対のいず
れかのパートナ−を指す。

このような結合対としては、これらに限定されるもので
はないが、抗原−抗体、リガンド−レセプター、酵素−
基質、酵素−補酵素、酵素−インヒビター　ＤＮＡ　−
ｒ）ＮＡ％ＤＮＡ　−ＲＮＡ　、および細胞表面上の相
当するレセプターに結合する任意の分子が包含され、こ
れらはそれぞれリガンド−リガンド対とも呼ばれる。本
明細書においては、リガンドーリガンド対の語は、一般
に、リガンドとその特異的結合パートナ−を指すもので
ある。

本明細書において用いられる「結合部位模倣体」の語は
、それらが誘導されたリガンドの特異性を維持し、それ
らの特異的結合パートナ−に対して同一のまたは変化し
た親和性を有する合成ペプチドまたは他の分子を意味す
る。リガンドの結合特異性はその特異的結合部位の構造
立体配置に由来するものであるから、リガンドの特異的
結合部位と結合部位模倣体の立体配置は実質的に同等で
ある。結合部位模倣体は、結合部位自体に無関係な構造
は含まないことを意図するものであるが、結合部位の立
体配置を維持するために必要な構造は包含してもよい。

本明細書において用いられる「構造立体配置」−！たは
「立体配置」の語は、分子の三次元形状とトポロジーを
指し、またその三次元形状を横切る荷電分布を包含する
。

本明細書において用いられる「相補性」または「立体配
置的に相補性」の語は、相互に、特異へ選択的かつ優先
的に結合する反対の立体配置を有するリガンド結合部位
を指すこの結合には、共有結合または非共有結合を包含
してもい。相補性とは比唸的にいえば、「鍵穴と鍵」ま
たは「鋳型と鋳造物」の関係に類似する。

不明Ｉ！Ｉ［１４Ｉにおいて用いられる「抗−イデイオ
タイプ」または「抗イデイオタイプ抗体」の語は、第一
の抗体のＣＤＨに特異的に結合する第一の抗体に対して
産生される抗体を指す。

本明細書において用いられる「ＣＤＲＪの語は抗体の抗
体結合部位を指し、認識された工ざトープに特異的に結
合する抗体の部分である。これは抗体コードする核酸の
可変軸域によってコードされる。

本明細書において用いられる「内部像」の語は、第一の
抗体に対して誘導された抗−イデイオタイプ抗体のＣＤ
Ｒを指し、このＣＤＲは第一の抗体によって認識される
特異的結合部位と実質的に均等な構造立体配置を有する
。

本明細書に用いられる「特異的結合部位」の語は、リガ
ンドの特異的結合パートナ−に特異的に結合するリガン
ドの部分を意味する。それは、そのリガンドをコードす
る核酸の部分である「リガンド結合部位核酸」によって
コードされる。

本発明は、特異的結合部位の描出および複製のための抗
−イデイオタイプ抗体仲介法に関する。

リガンドおよびその特異的結合パートナ−に対する抗−
イデイオタイプ抗体が誘導される。リガンドまたは特異
的結合パートナ−のいずれかに対する三次元の忠実性を
維持するモノクローナル抗イデイオタイプ抗体を用いて
、特異的結合部位を模倣する合成ペプチドまたは他の分
子を製造することができる。結合部位模倣体（ＢＳＭ　
）は、特異的抗体のメツセンジャーＲＮＡの解析により
製造することができる。可変領域の同定およびスクリー
ニングにより、適当なコンピュータータンパク質モデリ
ングシステムに使用できる情報が得られるＢＳＭの合成
が可能になる。別法として、抗体結合領域（ｃＤＲ）の
解析ののち、ペプチドセグメントを合成し、ＢＳＭとし
て試験することもできる。プロＢＳＭ　Ｋ対してアミノ
ｍｔｉ加、欠失または修飾を行い、牛ν異的なりＳＭを
合成することも可能である。

本発明は、抗−イデイオタイプ抗体に含まれる情報を利
用して、リガンドの特異的結合部位の立体配置構造のモ
デルを発生させるという考え方に基づくものである。こ
のようなモデルはさらに、リガンドの特異的結合部位に
対して同等なまたは実質的に同等な構造立体配置を有す
る分子の構築に使用される（結合部位模倣体またはプロ
結合部位模倣体）。このような結合部位模倣体は、たと
えば特異的結合パートナ−の可能性の結合親和性による
スクリーニング、競合的イムノアッセイの工うな−ＬＬ
１１シ匹−診断、放射性造影の工うな立呂！診断、ワク
チンのようなｉｎ　ＶｉＷＯ予防、特定の特異的結合パ
ートナ−の活性化もしくは不活性化によるホルモンもし
くは薬剤類縁体として用いるｉ！Ｉ　ＶｉＹＯ治療など
、様々な用途を有する。さらに、このような結合部位模
倣体は、所望により、特異的結合パートナ−に対する結
合親和性が変化するように修飾することができる。

第１図はフローチャートにより、抗−イデイオタイプ抗
体の情報の取得および利用のための基本的操作を例示し
たものである。要約すれば、図中ではリガンドー特異的
結合パートナ一対（Ｌ９：ＳＢＰ　）としたりガント−
リガンド対を選択し、リガンドおよび特異的結合対の両
者に対し抗体を産生させる（それぞれＡｔ）ＬおよびＡ
ｂＳＢＰ）。抗体の産生方法は本技術分野においてはよ
く知られている。産生させる抗体はモノクローナル抗体
であることが好ましい。ハイブリドーマによるモノクロ
ーナル抗体作成の一般的方法も工く知られているとおり
である〔たとえば、コーラ−およびミルスタイｙ　（Ｋ
ｏｈｌｅｒ　ｇａ　Ｍｉｌｅｔｅｉｎ　）ネイチャー第
２５６巻、第４９５頁、１９７５年）。

連続継代性の抗体産生細胞系はまた、融合以外の技術、
たとえば癌ｒ）ＮＡによる８リンパ球の直接トランスホ
ーメーションまタハエデスタインパールウイルスによる
トランスフェクションによって創成することができる〔
たとえば、シュライア−（５ｃｈｒθｉＡｒ　）ら：ハ
イブリドーマ・テクニックス、１９８０年；ハマーリン
グ（Ｈａｍｍｅｒｒｉｎｇ　）ら：モノクローナル・ア
ンタイボデイズ・アンド・Ｔセル・ハイブリドーマズ、
１９８１年：ケネツ）　（Ｋｅｎｎθ１１　）ら：モノ
クローナル・アンタイボデイズ、１９８０年参照〕。ハ
イブリドーマはマウスリンパ球をマウス骨髄腫細胞と輪
台させて形成するのが好ましいが、ラット、イヌ、ウサ
ギまたはヒトのような他の哺乳動物からの細胞もまた便
用できる。

また、望ましさは劣るがポリクローナル抗体も使用でき
る。この場合には、天然または合成の精製リガンドおよ
び精ｇ！特異的結合パートナ−を用いて選択された哺乳
動物（たとえば、マウス、ウサギ、ヤヤ、ウマ等）を免
疫感作し、免疫感作した動物から後に血清を集め、公知
の操作に従って処理する。所望の抗原と他の抗原に対す
るポリクローナル抗体を含む組成物を、所望の抗原を結
合させたカラムに通し５、望ましくない抗体を除去する
ことができる。

一方、ＡｂＬおよびＡｋｌ　ＳＢＦは、同様に上述の本
技術分野でよく知られた方法により、モノクローナル抗
イデイオタイプ抗体、Ｘ　−Ａｔ）ＬおよびＸ−Ａｂ　
ＳＢＰの産生に使用することができる。抗体が両世代と
もモノクローナルであるかまた最初の抗体がボリクａ−
ナルであるかには関係なく、抗体および抗−イデイオタ
イプ抗体は、いずれも同−糧の動物で産生させる。

Ｌま九はＳＢＦの内部像であるＣＤＲをもつ抗−イデイ
オタイプ抗体を同定するためには、Ｘ　−ＡｂＬとＸ　
−ＡｂＳＢＦを互いに結合できるものを決定するためそ
れぞれについてスクリーニングする。両抗体は同じ起源
のものであ夛、相補性ＣＤＲを介する以外に相互に結合
することはできないので、結合したものは元のリガンド
または特異的結合パートナ−の特異的結合部位に対する
立体配置的忠実性を維持している筈である。

次に、Ｘ　−Ａｔ１ｌＬまたはＸ　−ＡｂＳＢＰのＣＤ
Ｒをコードするヌクレオチド配列を決定する。抗−イデ
イオタイプ抗体を分泌するハイブリドーマからのメツセ
ンジャーＲＮＡを単離し、本技術分野でよく知られてい
る方法により配列を決定する。この配列をついで、既知
の免疫グロブリンライブラリーと比較する。たとえば、
デ・ナショナル・インステイチュート・オデ・ヘルス（
ベセスダ、ＭＩ））＄ら入手できるシーンバンクを調べ
る。既知のライブラリーと配列を対照して異なる配列を
決定するには、数種のソフトウェアが利用できる。たと
えば、ＤＮＡインスベクターｍ＋（チフストコ、プリン
ストンＳＮＨ）　；　ＩＢＩ／パステル（インターナ７
ョナル・バイオチクノロシーズ、インコーポレーション
、ニューヘゾン、ＣＴ）；ジェネＩＱ（リバーサイド・
サイエンティフィック・エンタープライジズ、シアトル
、ＷＡ）：およびマイクｏジエニー（バイオラド、リッ
チモンド、ＣＡ）がある。この場合、ＣＤＲをコードす
る可変領域は主たる配列とは異なっている。このヌクレ
オチド配列から、よく知られている遺伝暗号に基づいて
、ＣＤＲ自体のアミノ酸配列を確立させることができる
。

アミノ酸配列からペプチドの予想される立体配置の計算
による設計を発生させることができるコンピュータージ
フトウェアプログラムとしては様様なものがある。たと
えば、ホップおよびウツズ（Ｈｏｐｐ　＆＋　Ｗｏｏａ
ｓ　）、１９８３年、「コンキューター・プログラム・
フォア・プレデイクテイング・プロティン・アンタイジ
ェニック・デイターミナンツ」、モ２レキュラー・イム
ノロジー、第２ｏ巻、第４８３頁：カイトおよびトウー
リトル（Ｋｙｔｅ＆　ｒ）ｏｏｌｉｔｔｌ、ｅ　）、１
９８１Ｅ、ｒア・シップｋ”メソッド・フォア・ディス
プレイング°デ°バイトロバシック・キャラクタ−・オ
ア・ア・プロティン」、ジャーナル・オア・モル中ニラ
−、バイオロジー、第１５７巻、第１０５頁、ならびに
コラお２びシアｘｗｙ　（ｃｈｏｕ　＆　Ｆａｓｍａｎ
　）、１９７８年、「エムぎリカル・プレデイクション
ズ・オア・ｙ’ｏｆイン・コンフォーメーション」、ア
ニューアル・レビュー・オア・バイオロジー、第４７巻
、第２５１頁がある。これらの文献は参考として本明細
書に導入する。このような解析から、表面上に存在する
可能性が最も高いペプチドの親水性領域が決定できる。

これらの親水性領域、またはその抗体が三級構造をとっ
た場合に表面上にくることが他の方法で同定された領域
をついで、線プレイに参入させることができる。しかし
ながら、線プレイは、元のリガンドまたは特異的結合パ
ートナ−に類似の結合活性を与えるような三次元立体配
置を想定するには不適当である。しかしながら、活性を
発揮する↓うな正しい立体配置的構造にフラグメントを
配向し、維持するペプチド７ラグメント間の適邑な連絡
配列を決定する方法は公知である。たとえば、［コンピ
ューター・ベイスト・システム・アンド・メソッド・フ
ォア・デイターミニング・アンド・デイスプレイング・
ホシプル・ケミカル・ストラクチャーズ・フォア・コン
パ−ティング・ダブル−・オア・マルチブルーチエイン
・ポリペゾタイズ・ツー・シグナル−チエイン・ポリペ
ゾタイズ」と題する米国特許第４，７０４．６９２号に
は、ポリペプチドの別の鎖に由来するフラグメントの間
のヤヤツプを埋める適当なリンカ−を決定する方法が開
示されている。この記載を参考として本明細書に導入す
る。基礎的連絡配列に結合されても工い線アレイまたは
表面フラグメントから構成されたペプチドを、本明細書
においては、プロ結合部位模倣体（プローＢＳＭ　）と
呼ぶ。このようなプローＢＳＭは、模倣されるリガンド
または特異的結合パートナ−の構造立体配置を示唆する
構造立体配置を有するものである。このプローＢＳＭの
アミノ酸配列はついで、立体配置的忠実性を増大させる
ために系統的に修飾される。たとえば、子連の米国特許
第４，７０４，６９２号に開示されたようなコンピュー
ター支援方法をくり返して、リンカ−によって与えられ
た構造を精密化することができる。また、系統的なアミ
ノ酸置換を利用して、１個のアミノ酸が異なる合成プロ
ーＢＳＭを製造することもできる。これらの修飾プロー
ＢＳＭ　を次に、模倣されるリガンドの特異的結合パー
トナこの工うな特異的結合パートナ−の内部像をもつ抗
−イデイオタイプ、または実際に結合特異的模倣体もし
くはこの工うな特異的結合パートナ−に対する結合親和
性をスクリーニングする。

問題のレセプターに相補性のリガンドと形状的に均等な
モノマーを合成する方法は「メソッド・フォア・デイタ
ーミニング・ミモトーブス」ト題する世界特許第８６１
０６４８７号に開示されている。この特許には、モノマ
ーの無作為な組合せから構成されるダイマーの合成およ
び問題のレセブターに対するこれらの結分親和性のスク
リーニング法が開示されている。活性を示すダイマーに
ついでさらに無作為に七ツマ−を縮合させてトリマーの
配列を形成させ、これの活性を再びスクリーニングする
。

本発明は、間組のりガントの所望の特異的結合部位と立
体配置的忠実性ｔもつように予め選択されるプローＢＳ
ＭまたはＢＳＭを利用する点に特徴がある。特定のアミ
ノ酸位置を選んで、アミノ酸の付加、欠失または置換の
いずれかの修飾を行うことができる。この工うな位置は
無作為に決定することもできるし、またペプチドの立体
配置構造に対する重要性の推定に基づいて選択できる。

多数の一連の置換基が変異体の発生に利用できる。たと
えば、任意の一つの部位で、プローＢＳＭのアミノ酸は
、たとえばＤ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸または適当な特
性を付与すると思われる任意の他の化学的残基から選ば
れる置換基で置換できる。

ま九、本発明の他の態様によれば、プローＢＳＭ変異体
を合成するのではなく、置換され九プローＢＳＭの立体
配置構造の決定および所望の置換体の選択にコンピュー
ター支援方法を使用することもできる。

さらに、問題のリガンドがペプチドではないがサブユニ
ットから構成される分子である場合にも、本発明の方法
は、上述したと同様にして変異体の発生および結合親和
性のスクリーニングに使用できる。

通常、立体配置的忠実性は増大するほど実際望ましいと
考えられるが、本発明の方法はまた、模倣されるリガン
ドの結合親和性と異なる結合親和性またはそれニジ低い
結合親和性を有するＢＳＭの発生にも有利に使用できる
。このように変化させた模倣体は、たとえば、レセプタ
ーに結合はするがそれを活性化しないことが望ましい場
合に利用できる。

本発明の他の態様においては、全抗体分子の三級構造か
ら結合部位自体の形状および結合特性を決定するために
、抗−イデイオタイプまたはその実質的部分の全アミノ
酸配列をコンピューター支援精査「コンピューターモデ
リング」に付すことができる。このようなコンピュータ
ー支援プログラムの例には、プロモス・モル牟ニラ−・
ダイナミックス・パッケージ〔アクピスト（Ａｑｖｉｓ
ｔ　）ら：　１９８５年、ジャーナル・オデ・モルキュ
ラー・バイオロジー、第１８３巻、第４６１頁〕または
フロード二モルキュラー・グラフィックス・プログラム
〔ジョーンズ（ＪＯｎｅｅ　、　Ｔ、　Ａ、　）　、コ
ンビューテーショナル・クリスタログラフイー６０６、
クラレンドン、オフスフオード、１９８２年〕がある。

これらは参考として本明細書に導入する。

これらの方法で、抗体の相互作用重鎖および軽鎖ならび
に特異的結合部位の二次および三次構造が予測される。

さらに、この情報自体、特異的結合部位（ＢＳＭ　）と
立体配置構造的に均等な、３〜２０個ま九はそれ以上の
残基のアミノ酸配列の誘導を可能にする。このような立
体配置構造的に均等な配列が抗−イデイオタイプ抗体に
ついて発生された場合には、この配列全会成し、その相
当するイディオタイプ抗体（または適当なリガンドま九
は模倣体）への結合を試験する。この配列がまた、アミ
ノ酸付加、欠失または置換の出発点として使用できる。

この方法で、抗−イデイオタイプＣＤＨの構造の複製（
または修飾）至適配列が製造できる。

間組のリガンドの特異的結合部位と立体配置的に均等な
合成ペプチド（または他の化学分子）を結合部位模倣体
（ＢＳＭ　）と呼ぶ。特異的な変異結合活性を有するよ
うに修飾されたＢＳＭを修飾ＢＳＭと呼ぶ。

ＢＳＭは様々な利用性を有する。たとえはワクチンとし
て使用することができ、弱毒化病原または抗−イデイオ
タイプ抗体（あるいはＦａｂ　）の予防接種に伴う問題
を回避できる。さらに、その特異的結合能は、全抗体を
用いる場合と類似の方法で、１ｎマ１ｖＯ診断たとえば
放射造影、または抗体の技術分野で報告されている方法
に従ってｉｎ　ｖｉｖｏ治療たとえば放射免疫抱合体も
しくは免疫トキシンに利用することができる。たとえば
、米国特許第４，３３１．４７−号、第４，４６０，５
５９号１第４・４６０・５６１号および第４．６２４．
８４６号が参考になる。これらは参考として本明細書に
導入する。

さらに、これらのＢＳＭは、相当するレセプターを活性
化または不活性化される薬剤またはホルモン類縁体とし
て使用できる。しかも、これらは様様なイムノアッセイ
たとえば競合的イムノアッセイに使用できる。

以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を
限定するものではない。これらは使用できる代表例とい
えるが、本技術分野の熟練者には既知の他の別操作を本
発明の範囲から逸脱することなくそれらに代えて採用す
ることも可能である。

例　　■ ブタ　ツマ））ｅｌｆン（ｐｓＴ　）は天然の成長ホル
モンであり、デラカおよびゾンネンパーグ（Ｉｌｅ’１
ｌａｃｈａ　＆　８ｏｎｎｅｎｂｅｒｇ　）の方法（１
９６４年、ジャーナル・オデ・バイオロジカル・ケミス
トリ、第２３９巻、第１５１５〜１５２０＊）に工って
単離、精製できる。この文献は参考として本明細書に導
入する。特異的ｐＳＴレセプターおよびそれらの精製に
ついては、数種の動物の各組織で、ボーデン（Ｇｏｒｄ
＠ｎ　）らにより、１９７６年、ファーマコロジカル・
し♂ニー、第２５巻、第１７９〜１９０頁に記載されて
いる。この文献を本明細書に参考として導入する。

形質膜ｐＳＴレセプターは妊娠ウサイの肝臓から調製す
る。好ましい方法においては、すべての作業を４℃で実
施する。第三妊娠三半期のウサイの肝臓を０．３Ｍスク
ロース中、ポリトロンＦＴＩ　Ｑ（フリンクマン・イン
ストルーメンツ、ウェストバーブ、ＮＹ）ホモジナイザ
ーを用いてホモシネ−ジョンする。ホモジネートをチー
ズ布フィルターに通して、細胞層を除去する。上澄液を
１５．０００Ｘ（）で２０分間遠心分離し、得られた上
澄液を１３０，０ＯＯＧで４５分間遠心分離する。

このペレットは、形質膜の主要部を含んでいる。

ペレットを１Ｑ　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ！　２含有１２　ｍＭ
　）リス塩酸塩緩衝液に懸濁する。ラット肝臓レセプタ
ーの単離にも同じ操作Ｋｌ用できる。ｐＳＴレセプター
を標準方法によってキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）とカップリングさせて、その免疫原性を増強
する。５０μｇのｐｓ’ｒ　を同容量の完全フロインド
アジュバントと混合した混合物を１、ｐ、注射して１０
匹のマウスを免疫感作する。

マウスを４〜８週間放置したのち、不完全フロインドア
ジュバントを用いるほかは前回と同様にしてレセプター
プレバレージョンをブースター投与する。

各処置動物の免疫応答を接種期間中追跡して、最善の反
応動物を決定する。免疫応答は、交互に２週間隔で抗体
力価を、適当な力価に達するまで測定してモニタリング
する。血清サンプルを１０　ｍＭ　ＭｇＣｊ　２および
０．１　％　ＢＡＡ含有２５　ｍＭ　）リス塩酸塩緩衝
液、ｐｌ（７，４に希釈し、１：５．１：１０．１　：
　１０”０および１：１０００血清希釈液を作成する（
最終検定希釈はそれぞれ１：２５．１：５０．１：５０
０および１　：５０００）。希釈血清１００　ａｔ　ｆ
　”３Ｉ　−ｐｓＴ　１００　μｌ（）リス緩衝液中２
０，０００　ｃｐｍ　）、レセプター２００　μｌ（レ
セプタータンパク質２５０μｇ）およびトリス緩衝液と
合し、最終容量５００μノとする。マウスブリードに対
する非特異的結合（ＮＳＢ　）対照はｐＳＴ１００μ！
（レセプタータンパク質２５０μｇ）プラス希釈マウス
ブリード含有チューブを包含する。検定対照はマウスデ
リートの代わりにＮＳＢ添加または］）ＳＴ非添加正常
マウス血清を含有するチューブを包含する。チューブは
４℃で一夜インキユベーションする。冷水２１ｆ、加え
て反応を停止し、４°ＣＣ５３０００ｒｐで２０分間遠
心分離する。

上澄液を傾写して捨てる。ペレットをガンマカウンター
で１分間カウントする。血清中に抗体が存在する場合に
は、レセプターに結合する１２ｂ１−ｐｓ’ｒは減少す
る。

抗体が「十分に高い」場合、すなわち抗体力価がさらに
ブースター投与を行っても増加しないときは、最高の抗
体力価を示すマウスにｐｓＴ　ＶゞデＩＩ　−ＫＬＨｆ
ｒ、１回１・ｐ、注射する（他のリガンドでは１．ｖ、
注射）。６日後に膵臓を取シ出し１以Ｆに記載する工う
に骨髄腫細胞と融合する。

各群の最善の反応動物を同定し、膵臓を取シ出した。各
膵臓をついで緩衝液中に取り、攪拌して単一細胞の懸濁
液に変えた。＠濁液中のリンパ球の細胞数をカウントし
た。ついで、膵臓細胞の懸濁液を骨髄腫細胞との融合工
程に使用し次。

骨髄腫細胞は選択可能でなければならない。すなわち、
骨髄種細胞の培養液中での生育は培養メジウムによって
供給される因子に依存性でなければならない。しかしな
がら、抗体発現細胞との融合時には、生じる細胞融合生
成物はこの因子に対するその依存性を失う。したがって
、細胞融合生成物はこの因子の非存在下に培養液中で生
育できる。好ましい骨髄腫細胞系にはＰ３Ｘ６３−Ａｇ
ｅ！およびＰ３ｘ６３−Ａｇ８．８５３が包含される。

これらはそれぞれアメリカン・タイプ・ティシュ−・コ
レクションによって供給された。融合工程の直前に、骨
髄細胞系はそのＳ期に置かれた。

融合工程時には、骨髄腫細胞のサンプルをｐｓ’ｒに関
して最善の反応マウスからの膵臓リンパ球の懸濁サンプ
ルとを合して細胞混合物を作成した。

細胞組成１：２、すなわち１部の骨髄腫細胞と２部の膵
臓リンパ球の細胞混合物を用いて最良の結果がみられた
。

融合を誘導する九めには、上記細胞混合物を標単条件ド
にポリエチレングリコール（ＰＥ０１０００）と合し、
培養メジウム中５０％溶液を形成させた。

１〜２分後に、生成した細胞混合物をメジウム、すなわ
ちダルベツコ最小必須メジウム、１０％ウシ胎仔血清、
ヒポ中サンチン、アミノプテリンおよびチミジンで希釈
した。希釈は１１中細胞が約１〜１．５　Ｘ　１０６の
細胞混合物が得られるように計算した。希釈細胞混合物
のサンプルＱ、２ｍｌをピペットで、マイクロタイター
プレート、好ましくは９６ウエルプレートに取った。マ
イクロタイタープレートのウェルにはマウス胸腺細胞の
支持細胞層を設け７Ｉ２１．。生じた融合生成物はつい
でミクロタイタープレート中で１０〜１２日間イン中ユ
ペーションした。ノ１イブリドーマからの上澄液を抗体
産生についてスクリーニングし、抗体産生細胞を希釈し
、スクリーニングしく増殖スクリーニング）、モノクロ
ーナル抗体産生のために希釈し、スクリーニングし、再
び増殖させ、再びスクリーニングした。選ばれたモノク
ローナル抗体産生細胞を生育させ、腹水抗体産生のため
マウスに注射する。

抗体スクリーニングは、細胞上澄液（ｐｓ’ｒレセプタ
ー抗体を含有すると考えられる）と１２Ｊ　−ｐＳＴに
よるＴ）ＳＴレセゾター上の結合部位に対する競合に基
づくものである。この検定に用いられる検定希釈液は１
Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣＪ　２および０．１　ｑｂ　Ｂ８Ａ含
有２５　ｍＭ　）リス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７，４である
。

細胞上澄液１００μｌを１２Ｘ７５關ガラスチユーブに
移す。妊娠ウサイの肝臓からの１２Ｊ　−ｐＳＴ　１０
　ＬｌμｌとｔｚｓＴレセプター１００μノ（２５０μ
ｇ）を添加する。非特異的結合対照は細胞上澄液の代わ
シにｐｓＴ　１００μｌ　（２，５部ｇ）を含有し、最
大結合対照はトリス緩衝液を含有するが細胞上澄液およ
び付加ｐｓＴは含有しない。無関係の抗体を含有する上
澄液を品質管理のために検定する。チューブを４℃で一
夜インキユベーションする。冷水２１を加えて４°０１
３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して反応を停止する
。上澄液は傾写して捨てる。ペレッ）ｆガンマカウンタ
ーで１分間カウントする。細胞上澄液中にｐＳＴレセプ
ターに対する抗体が存在する場合は、レセプターに結合
する１２６１−　ｐｓ’ｒの量が減少する。適当な腹水
の生成後に、以Ｆの方法で精製抗体を製造する。飽和硫
酸アンモニウムを、ペックマン５／８×３インチポリカ
ルボネートチューブ中、同容量の腹水に、絶えず攪拌し
ながら滴加し、さらに１５分間室温で攪拌し、ついで４
°Ｏｓ　１０．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離した。

上澄液は捨てた。ベレットを／２容のＰＢＳに懸濁し、
同容の硫酸アンモニウムを滴加し、さらに１５分間攪拌
し、上述のようにして遠心分離した。ペレットを／２容
のＰＢＳに再懸濁し、Ｑ、２ＭＮａＣ！含有０．０１　
Ｍリン酸塩緩衝液ｐ’７−４、ＩＪｉ！に対して一夜透
析し、この間１回透析緩衝液を交換した。１０１の使イ
捨てピペットにｉＱｍｔのＤＥＡＥｌ充填し九（静水圧
２５０冨罵）。カラムを０．５Ｍリン酸塩緩衝液−７，
０、ついで０．５Ｍ酢酸塩緩衝液ｐｉ−１６，０で１溶
出液の−が６．０になるまで洗浄した。カラムを０．５
Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液−７，０で溶出液の−が７．０に
なるまで洗浄し、ついで数容の０．０５　Ｍ　ＩＪン酸
塩緩ａ液ｐ！−１７，０で洗浄した。カラムの流出管に
ＵＶモニター（２８０ｎｍ）ｔｌ−、モニター流出管を
捕集容器に装着した。透析サンプルをカラムに移して、
０．０５　Ｍ　ＩＪン酸塩緩＠液ｐＨ７，０で溶出した
。タンパク質がＵＶモニターを通過し始めたらば捕集客
器を変え、タンパク質ピークの終末に溶出液の捕集を停
止した。タンパク質検定はピアス・ケミカル・カンパニ
ー（ロックフォード、ＩＬ）のＢＣＡタンパク質検定試
薬を用い検定プロトコールに従った。標準は、ウシアル
ブミン粉末の０．００１　ＭＮａＨＣＯ３中２〜／祷保
存液から作成した。各検定ごとに、標準タンパク質濃度
範囲０〜２５０μＶＷＬｔヲ総容１１２．０１１ｔずつ
検体と同じ緩衝液に作成した。標準液または試験サンプ
ル各０．１−をピペットで１３Ｘ１００ｓｍチューブに
取り、ＢＣ’Ａ操作試薬（５０部の試薬Ａプラス１部の
試薬２　）　２．０　ｄを加え、混合した。チューブは
６０℃で３０分間インキュベーションし、ついで室温に
冷却した。

水ブランクに対する５　６２　ｎｍの吸光度を読み取つ
九。試験サンプルのタンパク値は、試験サンプルのｏ、
ｎ、　をクシアルブミン標槃曲線と比較して測定した。

精製ｐＳＴレセゾター抗体を使用してマウスを免疫感作
し、ｐｓ’ｒレセプターに対する抗−イデイオタイプ抗
体を産生させた。免疫感作スケジュールおよび融合スケ
ジュールはｐｓＴについて上述したと同様とじ九。マウ
スデリードカ価およびｐＳＴに対するモノクローナル抗
−イデイオタイプ抗体両者のスクリーニング方法は以Ｆ
に記述する。この検定はｐＳＴレセプター−抗−イデイ
オタイプ抗体がｐｓ’ｒレセプターと同様に反応し、し
たがってｐｓ’ｒの特異的結合部位をもつ筈であるとい
う事実に基づいている。検定用希釈液は１ＱｍＭＭｇ　
（Ｊ　２および０．１１　ＢＳＡ含有２５　ｍＭ　）リ
ス塩酸塩緩衝液−７，４とした。マウスデリートは１：
５．１：１０．１：１００および１　：　１０００（最
終検定希釈１：２５．１：５０．１：５００および１　
：５０００）に希釈した。正常マウス血清も検定対照と
して使用するため同様に希釈した。希釈試験血清および
正常血清１００μｌを１２Ｘ７５ｍチューブに移した。

”５Ｉ　−ｐｓＴ　１００μ！（２０，０００ｃｐｍ　
）および希釈液を加えて（最終容量５００μｇ）混合し
た。非特異的結合対照チューブにはｐｓＴ　２．５μｙ
を加えた。さらに１セツトの対照にはレセプター２００
μｌ（ウサヤ肝臓しセプタータンパク質２５０μｇ）を
含有させた。

チューブは４℃で一夜インキユベーションした。

反応は、正常つ７血清５０μ！およびペロナール緩衝液
ｐ）１８．６中１６．７　％ポリエチレングリコール１
．５１１１７（最終ＰＥＧ　１２．５憾）を加えて停止
させたチューブを４℃で１０分間インキュベーションし
、ついで４℃、３００Ｑｒｐｍで２０分間遠心分離した
。上澄液は傾潟して捨てた。次にペレットの放射能を測
定した。

抗−イデイオタイプ抗体スクリーニング検定は、１２ｂ
ニー　ｐＳＴ　１ｃ除くすべての材料の希釈剤を細胞培
養メジウムとしたことを除き、マウスブリードのスクリ
ーニングに用いた検定と同様に行った。

その希釈剤は前述したようにＭｇＣｌ２とＢｓＡを含む
トリス塩酸塩緩衝液とした。融合、融合スクリーニング
、モノクローナル抗体スクリーニングｌ’ｃはモノクロ
ーナル抗体増幅の上澄液１００μｌを１２Ｘ２５ｍチュ
ーブ中、１２５Ｉ−Ｇｈｌ　００μｌ（２０，０００ｃ
ｐｍ　）と合した。対照は、５０　ｐｉのテオフィリン
と５０μｊのｐ８Ｔレセゾタ−（肝臓形質膜タンパク質
２５０μｇ）プラス１２５１−ｐｓ’ｒ、ｓｏμｌ　（
２，５μｇ　）　ｐｓ’ｌ”プラスレセプターと１２ｂ
ニー　１）８Ｔ　（ＮＳＢ　）　、およびレセプタープ
ラス１２５１−　□ｈｆ：、スヘテ最終容量２００　ａ
ｌ　テ包含する。チューブは４℃で一夜インキユペーシ
ョンした。反応は５０μｌの正常ウシ血清と、ベロナー
ル緩衝液ｐ）１８．６中１６．６　％ポリエチレングリ
コール１．５Ｒ１を添加して停止させた。チューブを４
℃、３５００　ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄液を
傾写して捨てた。ペレットの放射能はガンマカウンター
を用いて測定する。

Ｂ、ネコ感染性腹膜炎ウィルスＦＩＰは、ｄピンソ７　（ＲｏｂｉｎｓＯｎ　）らによ
って１９７１年、ジャーナル・オプ・アメリカン・ベテ
リナリー・メディカル・アソシエーション、第１５８巻
、第９８１頁に初めて報告されたネコ腸コロナウィルス
である。このウィルスは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレククヨン（ペセスダ、Ｍｒ））から得られる
ｆｃｗｆ細胞系細胞層細胞培養に感染させることによっ
て生育できる。少なくとも３つの主タンパク質、Ｅｌ、
Ｅ２およびヌクレオ午ヤシシトタンパク質から構成され
る。

ＥｌおよびＥ２タンパク質は、ウィルスの表面から突出
するペプロマー構造を形成し、感染可能な宿主細胞の特
異的レセプターと相互作用する特異的要素として働く。

ＦＩＰの特異的レセプターについてはまだ記載はないが
、他のウィルスとくにマウスレオウィルスに対する特異
的レセプターは、ビールトン（ＧａｕｌｔＯｎ　）らに
ニジ、１９８６年、ジャーナル・オデ・イムノロジー、
第１３７巻、第２９６０頁に報告されている。

ＦＩＰレセプターに対する抗−イデイオタイプ抗体の発
生のためには、Ｂａｒｂ　／　ｃ　Ａｎｎマウスに、−
次注射として生存、全非感染ｆｃｗｆ細胞１．０×１０
７個をアジュバントなしで１．ｐ、投与し、４〜６週放
置した。採血−ブースター投与スケジュールを２〜３週
毎に継続し、各ブースター投与１週後に以下のレセプタ
ー検定により血清力価をチエツクした。推定される抗−
レセプターモノクローナル抗体の発生は、最初、血清サ
ンプルを、９６−ウェルプレート中の非感染ｆｃＷｆ細
胞の希釈系列と混合することにより検定した。混合物ヲ
３７°Ｃで２時間インキュベーションしたのチ、各ウェ
ルＫ　２５　ＰＦＵ　Ｏ感染ＦＩＰＶ　ｉ加え、プレー
トを６７°Ｃで３０〜４８時間インキュベーションした
。陽性対照（ウィルス、抗体ではない）が完全な細胞変
性効果を示したとき、すべてのウェルを２５係ホルマリ
ンで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。プレ
ートを顕微鏡で検査した。陽性ウェルには健康な集密的
細胞単層が認められ染料が取シ込まれたが、陰性ウェル
では染料が取り込まれず、実際吹き散らされた。陰性対
照は、シンバイオティックで発生されたモノクローナル
であり、ｉｎ　ＶｉｔｒＯでのＦＩＰ感染に対する保膿
を示すことがくり返し確認されているＩＶＦＰ１２　５
２２゜１３と細胞のプレインキュベーションｌ−包含ス
る。

この抗体は、ＦＡＣ８解析によって明らかなように、ｆ
ｃｖｆ細胞の表面に結合する。血清力価が約１：５１．
０００に達したときマウスを層殺し、ｐｓ’ｒについて
上述したプロトコールに従って膵臓を融合した。ハイブ
リドーマの生育が十分に確立された時点で（１０〜１４
日）、融合を上述のレセプター検定によってスクリーニ
ングした。陽性母細胞を増殖させ、ＨＡＴおよび胸腺細
胞を含む完全メジウム中での限界希釈による増殖後直ち
にクローン化した。クローン化には母細胞ごとに２個の
９６−ウェルプレートを用い、各プレートあた９１００
〜２００個の細胞の細胞濃度とした。生育が確立したの
ち、すべてのモノクローナルカラのＳＮＦ　＋ｉレセプ
ター検定で検定した。陽性群は顕微鏡検査によってモノ
クローナルであることを確認し、さらにアイソタイピン
グおよびウェスタンプロット特異性によって性質を調べ
た。各母細胞からの最良の候補を増殖させ、腹水産生の
ためにマウスに注射し、バックアップクローンは凍結し
た。各クローンｔ、０．５０−の完全メジウム中マウス
あたり３．ＯＸ　１０６個の細胞濃度で５匹のＢａ１ｂ
　／　ｃＡｎｎマウスに注射した。免疫感作のためのＡ
ｂ　１の調製には、腹水をフレオン処理し、ＩｇＭはＰ
ＥＧ沈殿でまたＩｇＧはイオン交換で精製した。候補は
、レセプター検定結果、アイソタイプ、およびウェスタ
ンプロット特異性のようなパラメーターで選択した。つ
いで精製抗体を標準方法でＫＬＨに抱合させ、Ａｂ２産
主のための免疫原として用いた。

免疫感作のプロトコールは次のとおりである。

５匹のマウス１）　　ＣＦＡ中Ｍａｂ　−ＫＬＨ５０１’９　ｓ　’
、ｐ。

２）４週間休止３）ブースター＋１、ＩＦＡ中Ｍａｂ　−ＫＬＨ５０μ
ｙ１１・ｐ・４）１週間休止５）採血す１６）１週間休止７）ブースターナ２．１ｘ　ＰＢＳ中Ｍａ’ｂ　−ＫＬ
Ｈ５０μ９　ｓ　１・ｐ・８）１週間休止９）採血÷２１０）力価により、融合準備Ｗ／１ｘＰＢ８中Ｍａｂ　
−ＫＬＨ２５１４１，ｖ、ブースターまたはさらに１週
間休止し７）と同様にして３回目のブースター５匹のマウス１）　　Ｃ’ＦＡ中Ｍａｂ−ＫＬＨ５０を９　ｓ　’、
ｐ。

２）８週間休止３〜１０）　　前群に同じ血清抗−イデイオタイプ抗体力価の検出は、標準イン中
ユペーション時間および洗浄プロトコールを用いて、次
のようにＥＩ、ＩＳＡによってモニタリングした。Ａｂ
ｌを固相捕捉抗体として用いた。

遮断工程についで、試験血清を加え、イン中ユベークヨ
ンした。洗浄後、ＨＲＰ抱合Ａｔ）　１　ｋ検出抗体と
して導入した。インキュベーションおよび洗浄後にＡＢ
ＴＳ　２．２−アジノージ−（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）基質を加えた。プレートをＥＬＩ８Ａ
リーダー（ＭＲ６００マイクロプレートリーダー、ダイ
ナチク・ラデズ・インコーボレークヨン、アレ午サンド
リア、ＷＶ）上で読み、Ｏ，Ｄ、を読んで力価を測定し
た。力価が有意な上昇を示した場合は、最高の力価を示
したマウスに最終１．ｖ、ブースター投与を行い、３日
後に融合を行った。融合、融合スクリーニングおよびク
ローン化の操作は上述したと同じである。クローンはさ
らに、Ａｂ２で抗原決定基のＡｂ　１認識を妨害する阻
止検定によって特性を明らかにした。

阻止Ａｂ　２　ｆ、増殖し、抗−イデイオタイプの測定
−Ａを類似するＡｂ　３の産生の最終試験のためマウス
に注射した。

例　　■ リガンドに対する抗−イデイオタイプ抗体精製ｐＳＴは
インターナショナル・ミネラルズアンド・ケミカル・コ
ーポレーション（クカデ、イリノイ）から購入した。ｐ
ｓＴは中−ホール°リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ
）　標準方法でカップリングさせてその免疫原性を増強
した。５０μｙノｐＳＴレセフターを等容の完全フロイ
ンドアジュバントと混合した混合物’ｋ　ｉ、ｐ、注射
して１０匹のマウスを免疫感作した。マウスを４〜８週
休止させ、ついで不完全フロインドアジュバントを用い
るほかは曲回と同様にして、レセプタープレバレージョ
ンをブースター投与した。

各処置動物の免疫応答を接種期間中追跡して、最善の反
応動物を決定した。免疫応答は、交互に２週間隔で抗体
力価ｔａ当な力価に達するまで測定してモニタリングし
た。抗体力価の試験には、ｐｓ’ｒ　を炭酸塩緩衝液ｐ
Ｈ９，６で１　：　１０００に希釈し、マイクロタイタ
ープレートに添加した。ｐＳＴを一夜結合させ、過剰分
は除去した。プレートラ洗浄し、無関係な結合部位は０
．５　％　ＢＳＡおよび０．５幅ツイーン含有ＰＢＳで
１５〜３０分間遮断した。プレートを洗浄後、血清タイ
ター（１：５０から１　：　１０２．４００１での希釈
系列）をウェルに加え、３０分間インキュベーションし
た。洗浄後、ヤヤー抗−マウス抗体を加え、プレートラ
３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、
ＨＲＰ基質を加えた。３０分後にプレートを読み、陽性
ウェルを決定した。

抗体が「十分に高い」場合、す々わち抗体力価がさらに
ブースター投与を行っても増加しかいときは、最高の抗
体力価を示すマウスにｐｓ’ｒ　−ＫＬＨｔ　Ｉ　回１
．ｐ−注射した（他のりガントでは、注射は１．ｖ、で
ある）。６日後に膵臓を除去し、上述したようにして融
合させた。ハイブリドーマからの上澄液について抗体産
生をスクリーニングし、抗体産生細胞を希釈しスクリー
ニングしく増殖スクリーニング）、モノクロナール抗体
産生のために希釈し、スクリーニングし、再び増殖させ
、再びスクリーニングした。選ばれたモノクローナル抗
体産生細胞を生育させ、腹水抗体産生のためにマウスに
注射した。

抗体スクリーニング検定には、９．２９のパルビタール
ナトリウムおよび１．５ｇのパルビタール＋０．１ｇナ
トリウムアジドを水中に混合して１１としてベロナール
緩衝液ｐ）１８．６を調製した。希釈液は０．２９のＢ
ＳＡ、　１．０−の正常マウス血清をベロナール緩衝液
で１００ｍＡとした。ついで−】ヲ８・６に調製した。

対照希釈液は、１０幅ウつ胎仔血清、２％Ｌ−グルタミ
ン酸および１１　ＨＡＴ含有ｒ）ＭＥＭとした。細胞上
澄液９０μｌを１２Ｘ７５酊チユーブ中、１２ｂＩ　−
ｐｓＴ　９０　ｔｉｌ　（１０ｓ０００　ｃｐｍ　）と
合した。対照は、対照抗体プラス１２５１−１）ｓ’ｒ
９０μノとした。非特異的結合対照は、対照希釈液９０
μｌプラスｘｚａニー　ｐｓＴ　９０μｌとした。チュ
ーブは４℃で一夜インキユペーションシタ。反応は、冷
正常ウシ血清５０μ！とベロナール緩衝液中１６．６％
ポリエチレングリコール７５０μｌを加えて停止させた
。この溶液を攪拌混合し、１０分間イン中ユペーション
し、４℃、３５００　ｒｐｍで１５分間遠心分離した。

上澄液を畑潟して捨て、ペレットの放射能を測定した。

免疫感作用の抗体の精製には、飽和硫酸アンモニウムを
、ベックマン／Ｂ　Ｘ　３インチポリカルボネートチュ
ーブ中等容の腹水に絶えず攪拌しながら滴加した。この
溶液をさらに１５分間室温で攪拌し、ついで、４℃、１
１０−００Ｏｒｐで１５分間遠心分離した。上澄液は捨
てた。ペレツ）　ｔ　／２容のＰＢＳに懸濁し、等容の
硫酸アンモニウムを滴加した。この溶液をさらに１５分
間攪拌し、上と同様に遠心分離した。ペレットを／２容
のＰＢＳに再懸濁し、Ｑ、２ＭＮａσ含有０．０１　Ｍ
リン酸塩緩衝液、ｐ）１７．４に対して一夜透析し、こ
の間１回透析緩衝液を交換した。１０＃＋７の使い捨て
ピペットに１０１のＤＥＡＥを充填した（静水圧２５０
ｍ）。

カラムを０，５Ｍリン酸塩緩衝液−７，０ついで０．５
Ｍ酢酸塩緩衝液−６，０で、溶出液の−が６．０になる
まで洗浄し、次に３．５ＭＩＪン酸塩緩衝液−７．０で
溶出液の−が７．０になるまで洗浄し、ついで数容の０
．０５　Ｍリン酸緩衝液−７，０で洗浄した。カラムの
流出管にＵＶモニター（２８０ｎｌ！ｌ　）を、モニタ
ー流出管を捕集容器に装置した。透析サンプルをカラム
に移して、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液−７，０で溶出し
た。タンパク質がＵＶモニターを通過し始めたならば捕
集容器を変え、タンパク質ピークの終末に溶出液の捕集
全停止し九。

精製抗体のタンパク質検定はピアス・ケミカル・カンパ
ニーのＢＣＡタンパク質検定試薬を用い検定ゾロトコー
ルに従った。標準は、ウシアルブミン粉末のＯ−００１
Ｍ　　ＮａＨＣＯ３中２　ｍｙ／＃保存液から作成した
。各検定ごとに標準タン７（り質濃度範囲０〜２５０μ
ｇｌＫｌを総容量２．０１ずつ、検体と同じ緩衝液に生
成した。標準液または試験サンプル各０．１１をピペッ
トで１３Ｘ１００１１１ＩＩチユーブに取り、ＢＣＡ操
作試薬（５０部の試薬Ａプラス１部の試薬２　）２．０
１１ｊを加え、混合し九。チューブは６０°Ｃで３０分
間イン中ユベーションし、ついで室温に冷却した。水ブ
ランクに対する５　６２ｎｍの吸光度を読み取った。試
験サンプルのタンパク値は、試験サンプルの０．Ｄ、を
つ７アルブミン標プ抗体を産生させ友。マウスブリード
力価およびｐＳＴに対するモノクローナル抗−イデイオ
タイプ抗体両者のスクリーニング方法は以下のとおりと
した。２〜６０μｍ１／ＷＬｔに希釈したｐｓＴ抗体（
前もって決定したように）をマイクロタイタープレート
に添加し、−夜室温で結合させた。ついでプレートを叩
いてリガンドを除去し、洗浄した。非結合ウェル結合部
位を次に、０．５％ＢＳＡおよび０．５チツイーン２０
含有ＰＢＳにより室温で１５〜３０分間逍断した。プレ
ートを叩いて再び液体を除去し、上述のように洗浄した
。血清サンプル希釈液（１：５〜１　：　１０２．４０
０）をウェルに加え、３０分間インキユベークヨンした
。西洋ワサピペルオ午シダーゼを、最初プレートの抜機
に用いたと同じｐ８Ｔ抗体に抱合させ之。プレートを叩
いて洗浄し、ＨＲＰ　−ｐｓ’ｒ抗体抱合体を加えた。

この溶液を６０分間インキュベーションし、プレートラ
叩いて洗浄し、２００μｌのＡＢＴＳ基質を加えた。こ
の溶液を６０分間イン中ユペーションしついで上述のよ
うにして４０５　ｎｍおよび４９０ｎｍの吸光度を読み
取った。

抗−イデイオタイプ抗体のスクリーニングには２つの方
法を用いた。第一の試験は、マウスデリーズではなく細
胞上澄液を試験したほかは上述したと同様とした。第二
の試験では、ｐｓＴｔｌ”１０００に希釈し、マイクロ
タイタープレートの全ウェルに重加した。プレートラ室
温で一夜インキユペーションしたのち、叩いて液体を除
去し、ついで洗浄した。非結合ウェル結合部位は、０．
５１４　ＢＳＡと０．５チツイーン２０含有ＰＢＳ　を
加えて３０分間インキュベーションして遮断した。同時
に、ｐｓ’ｒ　−ＨＲＰ抱合体を抗−イデイオタイプ抗
体上澄液に加えて、３０分間イン中ユペーションした。

プレートラ叩いて洗浄し、ＨＲＰ抗−イデイオタイプ混
合物を加え、３０分間イン中ユベーションした。プレー
トを叩いて洗浄し、ＨＲＰ基質を加えた。これ’ｅ３０
分間インキエペーションし、吸光度２　ｇＬｘｓＡＩＪ
−ダーで上述のようにして読み取った。吸光度の低い読
みは、上澄液中に存在するｐＳＴと抗−イデイオタイプ
抗体の間に競合があったことを示す。免疫感作用のＡｂ
ｌの調製には、腹水をフレオン処理し、ＩｇＭの場合は
ＰＥＧ沈殿、ＩｇＧの場合はイオン交換によって精製し
た。候補は、検定結果、アイソタイプおよびウェスタン
プロット特異性によって選択した。精製抗体をついで、
標準方法を用いてＫＬＨに抱合し、Ａｂ２産生のための
免疫原として便用した。免疫感作のゾロトコールは次の
とおりである。

１）　　ＣＦ’Ａ中Ｍａｂ−ＫＬＨ５０μ＆　ｓ　１．
ｐ。

２）４週間休止９　ブースター÷１、ＩＦＡ中Ｍａｂ−ＫＬＨ５０１’
９　ｓｌ・ｐ・４）１週間休止９　採血φ１６）１週間休止７）ブースターφ２、Ｉ　Ｘ　ＰＢＳ中Ｍａｂ−ＫＬＨ
５０μ９．１．ｐ。

８）１週間休止９）採血φ２１０）力価により、融合準備ｗ／１ｘｐｓｓ中Ｍａｂ−
ＫＬＨ２５１１ｇ１．ｖ、ブースターま九はさらに１週
間休止し７）と同様にして３回目のブースター１）　　ＣＦＡ中Ｍａｂ−ＫＬＨ５０Ａ９　ｓ　１．ｐ
。

２）８週間休止３−１０）　　的群に同じ血清抗−イデイオタイプ抗体力価の検出は、通常のイン
キュベーション時間および工程間洗浄を用いて、次の工
うにＥＬ　Ｉ　ＳＡでモニタリングした。

Ａｔ）　１　ｔｌ−固相捕捉抗体として用いた。遮断工
程についで、試験血清を加えてインキュベーションした
。洗浄後、ＨＲＰ抱合Ａｂ／、を検出抗体として導入し
た。インキュベーションおよび洗浄後、ＡＢＴ８基質を
加えた。プレー）　Ｑ　ＥＬＩ８Ａ　ＩＪ−グー上で読
み取り、力価を０，Ｄ、の読み取りで測定した。力価が
有意な上昇を示した場合は、最高の力価を示したマウス
に最終１．ｖ、ブースター投与を行い、３日後に融合を
行った。融合、融合スクリーニングおよびクローン化の
操作は上述したと同じである。クローンはさらに、Ａｂ
２で抗原決定基のＡｂ　１認識を妨害する阻止検定によ
って特性を明らかにした。阻止Ａｂ２を増殖し、抗−イ
デイオタイプの測定−Ａを類似するＡｂ３の産生の最終
試験のためマウスに注射した。

Ｂ、　　　ＦＩＰＦＩＰに対する抗−イデイオタイプ抗体の発生の九めに
は、Ｂａｒｂ　／　ｃ　Ａｎｎマウスに、−次注射とし
て生存、全非感染ｆａｗｆ細胞１．０Ｘ１０７個をアジ
ュバントなしで１．ｐ、投与し、４〜６週間休止させた
。マウスに感染細胞５−Ｏｘ　１０ａ個を１．ｐ。

注射してブースター投与を行った。採血−ブースター投
与スケジュールは２〜６週毎に継続し、各ブースター投
与１週後に以下のＥＬＩＳＡ検定にニジ血清力価をチエ
ツクした。通常のインキュベーション時間および洗浄工
ａを採用した。固相捕捉抗体としては予め定められた量
のＦＩＰ感染ｆｃｗｆ細胞または精製ウィルスを用いた
。ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡで適当に遮断したのち、血清
サンプルを希釈系列で加え、イン中ユペーションした。

洗浄後、ＨＲＰ抱合ヤイー抗−マウス抗体を加え、６０
〜６０分間インキエベークヨンした。再び洗浄後、基質
（ＡＢＴＳ　）ｆ：加え、吸光度を測定した。対照とし
て非感染細胞を用い、力価が約１　：　５１，０００に
達したとき、最高力価を示すマウスを融合させた。

ハイブリドーマの生育が確立した時点で（１０〜１４日
）融合をスクリーニングした。全ウェルからのＳＮＦを
上に概述したＥＬＩＳＡフォーマットにより試験した。

陽性母クローンを２４個のウェルプレートに拡大し、力
価と、関連コロナウィルス、たとえばネコ腸コロナウィ
ルス（ＦｅＬＶ　）　、伝播性胃腸ウィルス（ＴＧＥＶ
　）　、ならびにイヌコロナウィルス（ｃＣＶ　）およ
びＦＩＰの無毒性株に対する交差反応性を再試験し九。

この時点でウィルス中和検定も実施した。陽性母細胞は
、ＨＡＴと胸腺細胞を含む完全メジウム中限定希釈によ
シ増殖させたのち直ちにクローン化した。通常、クロー
ン化には母細胞あた９２個の９６−ウェルプレートを用
い、細胞濃度はプレートあたり１００〜２００個とし友
。生育が確立したのち、全モノクローナルからの上澄液
（８ＮＦ　）　ｔｌ−ＥＬＩＳＡ検定で検定した陽性群
は顕微鏡検査によってモノクローナルであることを確認
し、さらにアイソタイピングおよびウエスタンデロツ）
％異性によって特性を明らかにした。各母細胞からの最
良の候補を増幅して、腹水産生のためにマウスに注射し
、バックアップクローンは凍結し友。各クローンを５匹
のＢ！！ＬＩＶＱ　Ａｎｎマウスに、完全メジウム０．
５０鱈中マウスあたＦ）　５．ＯＸ　１０’個の濃度で
注射した。

以下の記述的フローチャートは、ひとつのアプローチか
らの抗体の発生を第二のアプローチからの抗体と比較す
るものである。用語は次のように省略した。

Ａ　＝　ＦＣＷＦ細胞Ｂ＝抗−ＦＩＰレセプターに対する抗−イデイオタイプ
抗体Ｃ＝抗−ＦＩＰウィルス抗体Ｄ＝抗−ＦＩＰレセプター抗体Ｅ＝　ＦＩＰウィルス抗原Ｆ＝抗−ＦＩＰウィルスに対する抗−イデイオタイプ抗
体抗−ＦＩＰレセプター抗体は、ＦＡＣ８５ＴＡＲ（ベク
トン・テイキンソン、マウンテン・ビュー　Ｃ’Ａ）を
用いたＦＡＣ８解析により、ＦＣＷＦ細胞に特異的に結
合することが明らかにされている。この相互作用は抗−
レセゾター抗体に対する抗−イデイオタイプ抗体によっ
て阻害される。ＦＩＰウィルス抗原は抗−ＦＩＰウィル
ス抗体と特異的に反応することが、ウェスタン解析およ
びＥＬＩＳＡ　Ｋよって明らかにさｎている。さらに、
ＦＸＰウィルスと抗−ＦＩＰウィルス抗体の結合は、ウ
ェスタンプロット解析において、抗−ＦＩＰウィルス抗
体に対する抗−イデイオタイプによシ阻吾された。

ウィルス中和検定において（ＦＩＰウィルス＋抗体のイ
ンキュベーション、ついでＦＣＷＦ細胞の感染）、抗−
ＦＩＰレセプター抗体に対する抗−イデイオタイプはＦ
ＩＰウィルスを非感染性にする。

抗−イデイオタイプと抗−ＦＩＰウィルスの同一性は、
Ｒ工Ａにおいて　１２Ｊ標識Ｃのウィルスへの結合が非
標識Ｂによって阻害されたことからもさらに明らかであ
る。

最も重要な証明は、抗−ＦＩＰレセプター抗体および抗
−ＦＩＰウィルス抗体に対する抗−イデイオタイプが、
ネコでＦＩＰウィルスに対する保護免疫を誘発すること
である。臨床試験では、ミョウバン中りまはＦ（２ダ）
ｆ：ｏ、１４および２８日に経口投与し、３３日にウィ
ルスをチャレンジさせるとある程度の保護が誘発される
ことが明らかにされた。

例　　Ｉ抗体とそのエピトープの間の相互作用の詳細な説明には
、抗体が異種分子によって与えられる抗原性表面に結合
する仕方を理解する必要がある。

理想的には、これは抗体−抗原複合体の結晶構造の解析
によってなされるべきであるが、現在ではこれが利用で
きるのはきわめて僅かである。別の戦略として、分子モ
デリングを特定部位の突然変異と組合せて抗体−抗原複
合体のモデルを発生させる。分子モデルを発生させるた
めには、６個は軽鎖（Ｌｌ、Ｌ２、Ｌ３）、６個は重鎮
（Ｈユ、Ｈ２、Ｈ３）抗体から誘導される６個の超可変
またはＣＤＲ領域の並置に工つ−Ｃ形成される抗体複合
部位のアミノ酸配列を知ることが重要である。Ｃｒ）Ｈ
のアミノ酸配列を決定するために用いられる一方法は、
ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を決定する方法である。

ＤＮＡ配列からコドン、最終的にはアミノ酸配列が帰属
できる。

免疫グロブリンをコードするＤＮＡ配列を決定するには
、問題の抗体を産生ずるハイブリドーマから軽鎖および
重鎖可変領域をクローン化する。可変領域のクローニン
グおよび配列決定は以下に概述する方法で行われる。

１）ハイブリドーマからのｐｏｎｙ　Ａメツセンジャー
　ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）の単離（このｍＲＮＡは免疫
グロブリン軽鎖および重鎮、ならびにハウス午−ピング
タンパク質をコードしている）２）単離ｎｏＲＮＡからｃＤＮＡの合成３）　　ｃＤＮ
Ａのプラスミドベクターへのクローニング４）軽鎖または重鎖免疫グロブリン配列に特異的なゾロ
ーデによるプラスミドクローンのスクリーニング（この
工程で、重鎖および軽鎖配列はハウスキーぎング遺伝子
配列から分離される）５）免疫グロブリン配列を含むプ
ラスミドクローンの配列決定６）免疫グロブリン軽鎖および重鎖ＤＮＡ配列のコドン
、ついでアミノ酸への翻訳最終結果は、免疫グロブリン軽鎖および重鎮のアミノ酸
配列の決定である。

１）　　ＲＮＡ　（ｐｏ１７　ＡメツセンジャーＲＮＡ
および他種のＲＮＡたとえば転移ＲＮＡまたはリポソー
ムＲＮＡからなる）は、ハイブリドーマから、細胞のグ
アニジンチオシアネートの存在丁における（版Ａの分解
を阻止するため）溶解によって単離でき、ついでｐｏ１
７　ＡメツセンジャーＲＮＡ　を結合するが他種のＲＮ
Ａ　（転移およびリボソームＲＮＡ　）は結合しないオ
ＩＪ　−１”　＜Ｉ　Ｔセルロースカラム上を、全ＲＮ
Ａを通過させる。ｐｏｎｙ　ＡメツセンジャーＲＮＡ　
ハＪ当な条件ドにオリーｒｄＴセルロースから溶出でき
る。

２）　　ＣＤＮＡの合成はガプラーおよびホフマンの方
法、１９８３年、による（ゾーン、第２５巻、第２６５
頁）。この文献は参考として本明細書に導入する。単離
されたｐｏｌｙ　Ａ　ｍＲＮＡは、短いオリーｉ″ｄＴ
ゾライマーにアニーリングする。この短い二本鎖構造は
、逆転写酵素祭加時にＤＮＡ合成の鋳型として働く。逆
転写酵素はｍＲＮＡを用いてＤＮＡ鎖を合成する。最初
のＤＮＡ鎖が合成されたのち、ＲＮＮアーゼ上加えると
ｍＢＮＡの分解が起こる。−重鎖ＤＮＡに、第二のＤＮ
Ａ鎖を合成するｒ）ＮＡボリメラーゼエを加える。二本
鎖分子はコピーＤＮＡまたはｃＤＮＡと呼ばれる。つい
でｃ　ＤＮＡを適当なプラス当なプラスミドおよびＴ　
４１Ｊガーゼ酵素と混合する。この反応でｃＤＮＡはｐ
ｕＣ１９上のクローニング部位内に雪かれる。ｐｕＣ１
９シラスミドベクターは大腸菌株ＨＢ１０１の形質転換
に必要なアンピシリン抵抗性遺伝子そ有する。ｃＤＮＡ
がｐｕｃ１９プラスミドにリゾ−ジョンされ友ならば、
この構造をついでＨＢｌ　０１中に強制またはトランス
フェクションしてクローン化ｃ　ＤＮＡ配列のコぎ一部
を増大させる。クローン化ＤＮＡが繋留されたＨＢｌｏ
ｌは工程４でも免疫グロブリン配列をスクリーニングさ
れる。前述の工うに、ｃＤＮＡは軽鎖および重鎖ならび
に他のハウスキーピング遺伝子をコードするｍＲＮＡか
ら作成された。し次がって、ｐｕＣ１９／　ＣＤＮＡプ
ラスミドにょるＨＢｌ　０１の形質転侯後、形質転換Ｈ
Ｂ１０１の一部は軽鎖遺伝子を、一部は重鎮遺伝子を、
そして一部の軽鎖遺伝子はハウスキーピング遺伝子を含
有する。これらの異なるＨＢｌ　０１形質転換体は、望
ましくないまたはハウスキーピング遺伝子を繋留する形
質転換ＨＢ１０１’を除くために選別しなければならな
い。この選別過程はスクリーニングと呼ばれ、工程４に
略述する。

４）プラスミドクロー：／　（１）ｕＣ１９／　（！Ｄ
ＮＡプラスミド含有大腸１ｇＨｓ１０１）のスクリーニ
ングは、免疫グロブリン遺伝子含有シラスミドの、ハウ
スキーピングまたは望ましくない遺伝子からの分離を可
能にする。プラスミドを幣信するＨＢｌｏｌをアガール
プレート上に播種し、小さなコロニーに生育させる。こ
れらのコロニーを、放射性ゾローゾヲ姉加した濾紙に移
す。放射性プローブは、免疫グロブリン配列を含有する
プラスミドとのみハイブリダイズまたは結合し、ノ・ウ
スキーピングｒ）ＮＡ配列または遺伝子を含有するプラ
スミドとはハイブリダイズまたは結合しない免疫グロブ
リンＩ’）ＮＡ配列である。したがって、放射能により
、免疫グロブリンＤＮＡをもつプラスミドを含有する形
質転換ＨＢ１０１を同定し　／％ウス午−ぎングｒｌＮ
Ａをもつプラスミドを含有する形質転換ＨＢ１０１から
分離することができる。これらのシラスミドを分離する
と、免疫グロブリン配列のみを含有する集団が得られる
。ついでプラスミドの配列を決定すれば免疫グロブリン
遺伝子のヌクレオチド配列を決定できる。

５）免疫グロブリンＤＮＡ配列決定はサンガーのジデオ
中シチェーンターミネーター法によって行われる。この
方法は、アプライド・バイオシステムズ（フォスター・
シティ−ＣＡ）によって供給されているような自動化配
列を用いて行うのが好ましい。チェーンターミネータ−
法は、−重鎖ＤＮＡ鋳型を用いｉｎ　ＶｉｔｒＯでＤＮ
ＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖合成を包含する。

詳しくは、クローン配列を含有するプラスミドＤＮＡ　
（この場合、軽鎖および重鎖配列）を加熱し急速に冷却
して一本鎖に分離し、クローン化ＤＮＡ（ｃＤＮＡ　）
の挿入部位に隣接して結合する合成オリデヌクレオチド
プライマーにアニーリングする。

ＤＮＡポリメラーゼ、１種は放射性である４種のデオ牟
シヌクレオ７ド三リン酸（ｄＡＴＰ　５ｄＧＴＰ　。

ａｃＴｐ　、　ｄＴＴＰ　）　％および４種のジデオキ
シヌクレオチド三リン酸（ｄｄＡＴＰ　、　ｃｌｄＴＴ
Ｐ　、　（１（ＩＧＴＰ　。

ａａｃ’ｒｐ　）の１種を加えると、プライマーがＤＮ
Ａポリメラーゼを一本鎖プラスミドの二本鎖シラスミド
への複製の開始点を与えるので、第二鎖の合成が開始さ
れる。しかしながら、プライマー延長または第二鎖合成
は、成長鎖へのジデオキシヌクレオチド三リンは付加に
工り、完成前に停止する。

ジデオキシヌクレオチドは３′ヒドロキシル基ヲ欠き、
成長ＤＮＡは付加されるチオキンヌクレオシド上に３′
ヒドロ午シル基を要求するので、ｒ）ＮＡ合成時におけ
る付加は合成の停止を生じる。全合成過程は１０分程度
で完結させることができる。この第二鎖合成の最終結果
は、様々な長さの放射性第二鎖の収集である。適当な条
件Ｆに、様々な長さの鎖のコレクンヨンが得られる。反
応混合物にＥＤＴＡおよびホルムアミドを加え、加熱し
て変性させ、電気泳動アクリルアミドデル上に流す。

例　　■ コンピューターモデリングアクリルアミドデルのオートラジオグラフからＤＮＡ配
列が得られたならば、それをコンピューターに入力し、
解析し、他の報告されている免疫グロブリン配列と、数
１のソフトウェアパッケージの１橿を用いて比較する。

この種のパッケージには、ＤＮＡインスベクター■＋（
チフストコ）、ＩＢＩ　／パステル（インターナクヨナ
ル・バイオチクノロシーズ・インコーポレーション）、
ビーン−・ジーン（インテリｒネテイクス）、ジエネデ
ロ（リバーサイド・サイエンティフィック・エンターゾ
ライジズ、リバーサイド、ＣＡ）およびマイクロジエニ
ー（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）がある。配列情
報はついで、クロモス分子動力学パッケージ〔アクピス
ト（Ａｑｖｉｓｔ　）　Ｃ）　：１９８５年、ジャーナ
ル・オプ・モル牟ニラ−・バイオロジー、第１８３巻、
第４６１頁〕またはブロード分子グラフィックスプログ
ラム〔ジョー７（Ｊｏｎａｅ　、Ｔ、Ａ、　）　：コン
ビューテイクヨナル・クリスタログラフイ−３０３、ク
ラレンドン、オフスフオード、１９８２年〕のようなコ
ンピューター解析プログラムを用いて三次元モデルの発
生に使用できる。上記文献は参考として本明細書に導入
する。

ＦＩＰおよびｐｓＴについて本明細書に引用した特定例
では、軽鎖および重鎖ＣＤＲ領域を、前出のホップおよ
びフッド（Ｈｏｐｐ　＆　ｗｏｏａ日）、カイトおよび
トウーリトル（Ｋｙｔｅ　＆　ｐｏｏ１１ｔをｔ８　）
またはカクオ工び７アスマｙ　（ｃｈｏｕ　ｇａ　Ｆａ
ｓｍａｎ　）の方法によって解析しているが、これらの
文献は参考として不明組替に導入する。これらの方法は
、相互作用する重鎮および軽鎖の二次および三次構造を
予測するものである。この情報はまた、立体配置構造が
結合部位に類似するアミノ酸配列（３〜２０個またはそ
れ以上）の確立を可能にする。立体配置的ｔＷＪ造が類
似する配列が抗−イデイオタイプ抗体に対して発生され
た場合には、配列を標識し、その相当するイディオタイ
プ抗体への結合管試験できる。この配列はまた、アミノ
酸付加、欠失または置換の出発点として利用することも
できる。置換はアミノ酸のｒ）覆またはＬ型のいずれの
型を用いてもよい。これらの次世代配列についてさらに
結合を試験することができる。この方法で、抗−イデイ
オタイプの構造の撥製である至適配列を製造することが
できる。もちろん、この過程はイディオタイプ抗体ＣＤ
Ｈの立体配置を明らかにするためにも同様に使用できる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法およびその生成物を示したフロ
ーダイヤグラムでちる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リガンドの特異的結合部位またはそのリガンドの
特異的結合パートナーの特異的結合部位と立体配置的に
忠実な内部像をもつＣＤＲを有する抗−イデイオタイプ
抗体の製造方法であつて、（ａ）上記リガンドに対する
抗−イデイオタイプ抗体を得る工程、（ｂ）上記リガン
ドの上記特異的結合パートナーに対する抗−イデイオタ
イプ抗体であつて、上記抗体を得たのと同じ種で励起さ
れた抗−イデイオタイプ抗体を得る工程、（ｃ）上記リ
ガンドに対する上記抗−イデイオタイプ抗体が上記リガ
ンドの上記特異的結合パートナーに対する上記抗−イデ
イオタイプ抗体に結合する能力をスクリーニングする工
程、および（ｄ）上記リガンドの上記特異的結合パート
ナーに対する上記抗−イデイオタイプ抗体に結合できる
上記リガンドに対する抗−イデイオタイプ抗体を選択す
る工程からなり、上記リガンドに対する選ばれた抗−イ
デイオタイプ抗体のＣＤＲは上記リガンドの上記特異的
結合部位の内部像であり、上記リガンドの上記特異的結
合パートナーに対する上記抗−イデイオタイプ抗体のＣ
ＤＲは上記リガンドの上記特異的結合パートナーの上記
特異的結合部位の内部像であることを特徴とする抗−イ
デイオタイプ抗体の製造方法
（２）リガンドの特異的結合部位またはそのリガンドの
特異的結合パートナーの特異的結合部位の立体配置構造
の決定方法であつて、（ａ）上記リガンドの上記特異的
結合部位または上記リガンドの上記特異的結合パートナ
ーの上記特異的結合部位の内部像をＣＤＲとして有する
抗−イデイオタイプ抗体を分泌するハイブリドーマ細胞
系を得る工程、（ｂ）上記ハイブリドーマ細胞系のｍＲ
ＮＡを単離する工程、（ｃ）上記ＣＤＲをコードするｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する工程、（ｄ）上記
ヌクレオチド配列に相当するアミノ酸配列を同定する工
程、および（ｅ）上記アミノ酸配列で構成されるペプチ
ドの立体配置構造のモデルを発生させる工程からなり、
上記ペプチドの立体配置構造の上記モデルは上記リガン
ドの特異的結合部位または上記リガンドの上記特異的結
合パートナーの上記特異的結合部位の立体配置構造に対
し立体配置的に忠実であることを特徴とする立体配置構
造の決定方法
（３）リガンドの特異的結合部位またはそのリガンドの
特異的結合パートナーの特異的結合部位に対し立体配置
的に忠実な結合部位模倣体の製造方法であつて、（ａ）
上記リガンドの上記結合部位または上記リガンドの上記
特異的結合パートナーの上記特異的結合部位の内部像を
ＣＤＲとして有する抗−イデイオタイプ抗体を分泌する
ハイブリドーマ細胞系を得る工程、（ｂ）上記ハイブリ
ドーマ細胞系のｍＲＮＡを単離する工程、（ｃ）上記Ｃ
ＤＲをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定す
る工程、（ｄ）上記ヌクレオチド配列に相当するアミノ
酸配列を同定する工程、（ｅ）上記アミノ酸配列で構成
されるペプチドの立体配置構造のモデルを構築する工程
、（ｆ）上記ペプチドの上記立体配置構造に対し立体配
置的に忠実な結合特異的模倣体を発生させる工程、およ
び（ｇ）上記結合特異的模倣体を合成する工程からなる
ことを特徴とする結合部位模倣体の製造方法
（４）結合部位模倣体はペプチドである特許請求の範囲
第３項の製造方法
（５）結合部位模倣体はペプチドではない特許請求の範
囲第３項の製造方法
（６）特許請求の範囲第３項の方法で製造された結合部
位模倣体
（７）リガンドの特異的結合部位またはそのリガンドの
特異的結合パートナーの特異的結合部位の立体配置を示
唆するプロ結合部位模倣体の製造方法であつて、（ａ）
上記リガンドの上記特異的結合部位または上記リガンド
の上記特異的結合パートナーの上記特異的結合部の内部
像をＣＤＲとして有する抗−イデイオタイプ抗体を分泌
するハイブリドーマ細胞系を得る工程、（ｂ）上記ハイ
ブリドーマ細胞系のｍＲＮＡを単離する工程、（ｃ）上
記ＣＤＲをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決
定する工程、（ｄ）上記ヌクレオチド配列に相当するア
ミノ酸配列を同定する工程、（ｅ）上記アミノ酸配列が
三次構造をとつた場合、表面上にくると思われる上記ア
ミノ酸配列の部分を推定する工程、（ｆ）上記アミノ酸
配列の上記部分を埋めて単一のポリペプチド鎖を形成す
る構造として信頼性の高いアミノ酸またはペプチド化学
構造をコンピューターデータベースから選出する工程、
および（ｇ）上記アミノ酸配列の上記部分を埋める上記
の信頼性の高いアミノ酸またはペプチド化学構造を有す
る単一ポリペプチド鎖プロ結合部位模倣体を合成する工
程からなることを特徴とする方法
（８）さらに（ｈ）上記単一ポリペプチド鎖プロ結合部
位模倣体の、上記リガンドまたは上記リガンドの上記特
異的結合パートナーに対する特異的結合親和性をスクリ
ーニングする工程、（ｉ）所望の特異的結合親和性を有
する単一ポリペプチド鎖結合部位模倣体を選択する工程
、および（ｊ）上記の選択された単一ポリペプチド鎖プ
ロ結合部位模倣体を合成する工程からなる特許請求の範
囲第７項の方法
（９）選出工程は以下の下位工程、（ｆ１）上記アミノ
酸配列の上記部分を埋める可能性があるアミノ酸または
ペプチド化学構造の第一の群を創成する工程、（ｆ２）
上記部分を埋めるために適当な方向性を有する第一の群
における候補構造を決定することにより可能性がある候
補構造の第二の群を作成する工程、（ｆ３）第二の群の
候補構造の中で上記部分を埋めるために適当な配向性を
有するものを決定することにより可能性がある第三の群
の候補構造を作成する工程、および（ｆ４）上記第三の
群の上記候補構造の中からコンピューター法を用い、構
造的にフイツトし、上記の作成した単一ポリペプチド鎖
プロ結合部位模倣体が上記リガンドまたは上記リガンド
の上記特異的結合パートナーの立体配置構造にきわめて
類似した立体配置構造に折り畳まれる可能性がきわめて
高くなるものを選択する工程からなる特許請求の範囲第
７項の方法
（１０）特許請求の範囲第７項の方法によつて製造され
たプロ結合部位模倣体
（１１）特許請求の範囲第８項の方法によつて製造され
たプロ結合部位模倣体
（１２）特許請求の範囲第９項の方法によつて製造され
たプロ結合部位模倣体
（１３）特許請求の範囲第１０項の方法によつて製造さ
れたプロ結合部位模倣体
（１４）リガンドまたはそのリガンドの特異的結合パー
トナーの特異的結合部位に対するプロ結合部位模倣体の
立体配置を変更する方法であつて、（ａ）特許請求の範
囲第７項の方法により複数個のプロ結合部位模倣体を合
成する工程、（ｂ）各プロ結合部位模倣体をそのプロ結
合部位模倣体と類似のリガンドまたは特異的結合パート
ナーに対し相補性のリガンドまたは特異的結合パートナ
ーと接触させる工程、（ｃ）各プロ結合部位模倣体と接
触させたリガンドまたは特異的結合パートナーの間の特
異的結合活性の程度を検出する工程、（ｄ）特定の位置
に系統的な付加、欠失または置換が行われたさらに複数
個のプロ結合部位模倣体を合成する工程、および（ｅ）
所望の程度の立体配置忠実性が達成されるまで工程（ｂ
）、（ｃ）および（ｄ）の反復からなることを特徴とす
る方法
（１５）上記所望程度の立体配置適合性は、結合部位模
倣体のそれと同等である特許請求の範囲第１５項の方法
（１６）レセプター−リガンド相互作用の臨界結合特性
を決定する方法であつて、（ａ）上記レセプターの上記
特異的結合部位の内部像をＣＤＲとして有する抗−イデ
イオタイプ抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を得る
工程、（ｂ）上記ハイブリドーマ細胞系のｍＲＮＡを単
離する工程、（ｃ）上記ＣＤＲをコードするｍＲＮＡの
ヌクレオチド配列を決定する工程、（ｄ）上記ヌクレオ
チド配列に相当するアミノ酸配列を同定する工程、（ｅ
）上記アミノ酸配列からなるペプチドの立体配置構造の
コンピュータモデルであつて、上記ペプチドの立体配置
構造の上記モデルはレセプターの立体配置構造に立体配
置的に忠実であるモデルを発生させる工程、（ｆ）リガ
ンドの複数個の結合部位模倣体またはプロ結合部位模倣
体の立体配置構造のコンピューターモデルを発生させる
工程、（ｇ）レセプターのモデル立体配置構造とリガン
ド結合部位模倣体またはプロ結合部位模倣体の各モデル
立体構造との間の結合の特性をコンピューター手段によ
り比較する工程、および（ｈ）レセプターとリガンドの
結合に臨界的な結合特性を決定する工程からなることを
特徴とする方法
（１７）モノマーの配列からなる結合部位模倣体であつ
て、それが模倣するリガンドの特異的結合活性から変化
させた特異的結合活性を有する結合部位模倣体を設計す
る方法であつて、（ａ）上記リガンドの結合部位模倣体
またはプロ結合部位模倣体を発生させる工程、（ｂ）上
記モノマー鎖内に１個の位置を選択する工程、（ｃ）上
記選択部位におけるモノマーの付加、欠失または修飾に
よる結合部位模倣体の系統的修飾を行う工程、（ｄ）各
修飾結合部位模倣体を、特異的結合パートナー、または
上記模倣リガンドの上記特異的結合パートナーの特異的
結合部位の結合部位模倣体と接触させる工程、（ｅ）各
修飾結合部位模倣体と上記特異体結合パートナーまたは
上記特異的結合パートナーの結合特異的模倣体との間の
結合親和性を決定する工程、および（ｆ）所望の結合親
和性を有する修飾結合部位模倣体１種または２種以上を
選択する工程からなることを特徴とする方法
（１８）さらに（ｇ）前に選択した位置以外の選ばれた
位置を選択して工程（ｃ）から（ｆ）までの１回または
２回以上の反復からなる特許請求の範囲第１７項の方法
（１９）病原に対して動物を免疫感作する方法であつて
、（ａ）上記病原の抗原成分に相当する結合部位模倣体
を合成する工程、および（ｂ）上記動物に上記結合部位
模倣体を予防接種する工程からなることを特徴とする方
法
（２０）リガンドの特異的結合部位またはそのリガンド
の特異的結合パートナーの特異的結合部位に対する結合
部位模倣体の立体配置を変化させる方法であつて、（ａ
）特許請求の範囲第７項の方法によつて複数個の結合部
位模倣体を合成する工程、（ｂ）各結合部位模倣体を、
上記結合部位模倣体が模倣するリガンドまたは特異的結
合パートナーと相補性のリガンドまたは特異的結合パー
トナーと接触させる工程、（ｃ）各結合部位模倣体と接
触させたリガンドまたは特異的結合パートナーの間の特
異的結合親和性の程度を検出する工程、（ｄ）特定の位
置における系統的付加、欠失または置換を有するさらに
複数個の結合部位模倣体を合成する工程、および（ｅ）
所望の程度の立体配置忠実性が達成されるまで工程（ｂ
）、（ｃ）および（ｄ）の反復を行うことからなること
を特徴とする方法
（２１）特定のリガンドの欠如によつて生じる病態を有
する対象の処置方法であつて、（ａ）上記リガンドの特
異的結合部位に対して立体配置的に均等なＢＳＭを得る
工程、および（ｂ）上記ＢＳＭの治療有効量を上記病態
の緩解が可能な生理的に許容される剤型として与える工
程からなることを特徴とする方法
（２２）特定のリガンドマーカーを産生するかまたはそ
れに関連する細胞の対象中における存在を検出する方法
であつて、（ａ）上記リガンドマーカーの特異的結合部
位と立体配置的に均等なＢＳＭを検出可能な放射性同位
元素に抱合して注射する工程、および（ｂ）ついで上記
放射標識ＢＳＭの取り込み部位を検出し決定する装置で
走査する工程からなることを特徴とする方法
（２３）リガンドの特異的結合部位と立体配置的に均等
な結合部位模倣体からなることを特徴とする組成物
（２４）リガンドの特異的結合部位と立体配置的に均等
なＢＳＭであり、トキシンに抱合されたＢＳＭからなる
ことを特徴とする組成物
（２５）悪性細胞の表面上のリガンドマーカーの存在に
よつて特徴づけられる悪性腫瘍を有する患者を処置する
治療方法であつて、（ａ）上記マーカーリガンドの特異
的結合パートナーと立体配置的に均等なＢＳＭをトキシ
ンに抱合させて形成させたトキシン抱合ＢＳＭを準備す
る工程、および（ｂ）上記トキシン抱合体を生理的に許
容される剤型として上記患者に導入する工程からなるこ
とを特徴とする方法
（２６）液体サンプル中のリガンドの存在を決定する免
疫検定法において、その検定法における１種または２種
以上のリガンドまたは特異的結合パートナーの代わりに
１種または２種以上のＢＳＭを用いることを特徴とする
改良方法