JPH02238884A - ネコ科白血病ウイルス抗原をコードする遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを含有する宿主 - Google Patents
ネコ科白血病ウイルス抗原をコードする遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを含有する宿主Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は蛋白質化学、組換ＤＮＡ技法、及びウィルス
疾患の免疫予防に関する。さらに詳しくは、この発明は
ネコ科白血病ウィルス（ｆｅｌｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉ
ａｖｉｒｕｓ） （ＦｅＬＶ）ワクチンとして有用な新
規な蛋白質に関する。
疾患の免疫予防に関する。さらに詳しくは、この発明は
ネコ科白血病ウィルス（ｆｅｌｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉ
ａｖｉｒｕｓ） （ＦｅＬＶ）ワクチンとして有用な新
規な蛋白質に関する。
ＦｅＬＶ
ＦｅＬＶはネコ類において新生物疾患及び非新生物疾患
の両者を惹起する伝染性の発癌性ＲＮＡウィルスである
。ＦｅＬＶ感染はネコ類における疾患関連死の主要な原
因である。ＦｅＬＶの複製の過程でウィルスＲＮＡゲノ
ムのＤＮＡコピーが作られ、そして感染された細胞のＤ
ＮＡ中に挿入される。組み込まれたＦｅＬＶ ＯＮＡは
、感染された細胞から放出される一層多くのウィルスの
複製をコードする。宿主の遺伝子との組換によってネコ
科肉腫ウィルス（ｆｅｌｉｎｅａａｒｃｏｍａ ｖｉｒ
ｕｓ） （ＦｅＳＶ）が生ずることによって、このウィ
ルスは細胞形質転換を惹起することができる。
の両者を惹起する伝染性の発癌性ＲＮＡウィルスである
。ＦｅＬＶ感染はネコ類における疾患関連死の主要な原
因である。ＦｅＬＶの複製の過程でウィルスＲＮＡゲノ
ムのＤＮＡコピーが作られ、そして感染された細胞のＤ
ＮＡ中に挿入される。組み込まれたＦｅＬＶ ＯＮＡは
、感染された細胞から放出される一層多くのウィルスの
複製をコードする。宿主の遺伝子との組換によってネコ
科肉腫ウィルス（ｆｅｌｉｎｅａａｒｃｏｍａ ｖｉｒ
ｕｓ） （ＦｅＳＶ）が生ずることによって、このウィ
ルスは細胞形質転換を惹起することができる。
ＦｅＬＶゲノムは、インターバルウィルス蛋白質をコー
ドするｇａｇ遺伝子、ウィルスＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ（逆転写酵素）をコードするｐｏｌ遺伝子、並び
にウィルスエンベローブ蛋白質ｇｐ７０及びｐ１５Ｂを
コードするｅｎｖ遺伝子から成る６０−７ＯＳ単鎮ＲＮ
Ａである。
ドするｇａｇ遺伝子、ウィルスＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ（逆転写酵素）をコードするｐｏｌ遺伝子、並び
にウィルスエンベローブ蛋白質ｇｐ７０及びｐ１５Ｂを
コードするｅｎｖ遺伝子から成る６０−７ＯＳ単鎮ＲＮ
Ａである。
ウィルス干渉試験及び中和試験は、エンベローブ抗原の
３種類のサブグループ（Ａ，Ｂ及びＣと称される）であ
って、類似しているがしかし相互に異り、そして３種類
の認識されたＦｅＵＶサブグループ（やはりＡ．Ｂ及び
Ｃと称される）を生じさせるものが存在することを示し
た。
３種類のサブグループ（Ａ，Ｂ及びＣと称される）であ
って、類似しているがしかし相互に異り、そして３種類
の認識されたＦｅＵＶサブグループ（やはりＡ．Ｂ及び
Ｃと称される）を生じさせるものが存在することを示し
た。
ＦｅＬＶに暴露されたネコの連命はＦｅＬＶ・・・特に
ＦｅＬＶエンベローブ抗原に対するその免疫反応に依存
するであろう。研究は、暴露された集団の約４０％が高
力価の抗−ＦｅＬＶエンベロープ抗体を示しそして免疫
となり、約３０％が適切に反応せずそして持続的に感染
し、そして約３０％は感染せずそして免疫されないが感
受性のままであることを示した。暴露された集団の有意
な部分が自然免疫を獲得するという事実は、研究者をし
て、種々の物質をＦｅＬＶに対するワクチンとして試み
させる。不活性化されたウィルスは高投与量でなければ
効果的でないことが見出された。精製されたｇｐ７０も
また一般にワクチンとして効果的でないことが見出され
た。殺された腫瘍細胞は白血病の予防には有効であるが
ウィルス血症に対してはそうでないことが報告されてい
る。ＦｅＬＶに感染された細胞系（ＦＬ−７４）の組織
培養培地から得られる可溶性腫瘍細胞抗原も試みられ、
そしてＦｅＬＶウィルス感染の誘導を予防するために有
効であることが見出された。
ＦｅＬＶエンベローブ抗原に対するその免疫反応に依存
するであろう。研究は、暴露された集団の約４０％が高
力価の抗−ＦｅＬＶエンベロープ抗体を示しそして免疫
となり、約３０％が適切に反応せずそして持続的に感染
し、そして約３０％は感染せずそして免疫されないが感
受性のままであることを示した。暴露された集団の有意
な部分が自然免疫を獲得するという事実は、研究者をし
て、種々の物質をＦｅＬＶに対するワクチンとして試み
させる。不活性化されたウィルスは高投与量でなければ
効果的でないことが見出された。精製されたｇｐ７０も
また一般にワクチンとして効果的でないことが見出され
た。殺された腫瘍細胞は白血病の予防には有効であるが
ウィルス血症に対してはそうでないことが報告されてい
る。ＦｅＬＶに感染された細胞系（ＦＬ−７４）の組織
培養培地から得られる可溶性腫瘍細胞抗原も試みられ、
そしてＦｅＬＶウィルス感染の誘導を予防するために有
効であることが見出された。
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） （１９８１） ２１４
： １１２５−１１２８及び英国特許出願ＧＢ ２１
０３６２２Ａは、口蹄疫（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｄｉｓｅ
ａｓｅ ｖｉｒｕｓ） （ＦＭＤＶ）ワクチンとして有
用な微生物的に生産されるポリペプチドを記載している
。相補的ＤＮＡ （ＣＤＮＡ）断片が、キャブシド蛋白
質ｖＰ，をコードするＦＭＤＶゲノムの部分から調製さ
れた。これらのｃＤＮＡ挿入部がトリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーターを含有する細菌プラスミドに導入され
、そしてこの組検体ブラスミドがコンビテントＥ．コ’
） （Ｅ，ｃｏｌｉ）を形質転換するために使用され
た。この組換体細菌は、ｔｒｐｌＪ−グー及びｔｒｐＢ
遺伝子の一部分によりコードされるポリペプチドとＡＰ
３挿入部によりコードされるポリペプチドとから成る融
合蛋白質を発現した。この融合蛋白質は精製され、そし
て抗−ＶＰ３抗体を結合するその能力及び家畜における
ＦＭＤＶ感染を予防するその能力についてインービトロ
及びインービボにおいて試験サレた。サイｘ ｙｘ （
Ｓｃｉｅｎｃｅ） （１９８１） ２１９ ：６１４−
６２０は、狂犬病ウィルスゲノム由来の遺伝子組換体Ｅ
．コリにおける発現による狂犬病ウィルスの表面蛋白質
の合成を記載している。
： １１２５−１１２８及び英国特許出願ＧＢ ２１
０３６２２Ａは、口蹄疫（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｄｉｓｅ
ａｓｅ ｖｉｒｕｓ） （ＦＭＤＶ）ワクチンとして有
用な微生物的に生産されるポリペプチドを記載している
。相補的ＤＮＡ （ＣＤＮＡ）断片が、キャブシド蛋白
質ｖＰ，をコードするＦＭＤＶゲノムの部分から調製さ
れた。これらのｃＤＮＡ挿入部がトリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーターを含有する細菌プラスミドに導入され
、そしてこの組検体ブラスミドがコンビテントＥ．コ’
） （Ｅ，ｃｏｌｉ）を形質転換するために使用され
た。この組換体細菌は、ｔｒｐｌＪ−グー及びｔｒｐＢ
遺伝子の一部分によりコードされるポリペプチドとＡＰ
３挿入部によりコードされるポリペプチドとから成る融
合蛋白質を発現した。この融合蛋白質は精製され、そし
て抗−ＶＰ３抗体を結合するその能力及び家畜における
ＦＭＤＶ感染を予防するその能力についてインービトロ
及びインービボにおいて試験サレた。サイｘ ｙｘ （
Ｓｃｉｅｎｃｅ） （１９８１） ２１９ ：６１４−
６２０は、狂犬病ウィルスゲノム由来の遺伝子組換体Ｅ
．コリにおける発現による狂犬病ウィルスの表面蛋白質
の合成を記載している。
エミ二等、ネイチュア−（Ｎａｔｕｒｅ） （１９８１
） ３０４：６９９−７０３は、ポリオウィルス由来の
合成ベブチドに対する免疫反応を相乗強化するために低
い感染量より少い（ｓｕｂｉｎｆｅｃｆ ｉｏｕｓ）量
及び保護量より少い（ｓｕｂｐｒｏｔｅｃｔ ｉｖｅ）
量の生ポリオウィルスが使用され得ることを報告してい
る。あたかも、最初の合成ワクチンが免疫系を“開始”
（ｐｒｉｍｅ） Ｌ、そして次のウィルス性追加免疫
（ｂｏｏｓｔ）が有効な液性反応（ｈｕｍｏｒａｌ ｒ
ｅｓｐｏｎｓｅ）に７おける最初に開始された免疫反応
の増幅を可能にするかのようである。
） ３０４：６９９−７０３は、ポリオウィルス由来の
合成ベブチドに対する免疫反応を相乗強化するために低
い感染量より少い（ｓｕｂｉｎｆｅｃｆ ｉｏｕｓ）量
及び保護量より少い（ｓｕｂｐｒｏｔｅｃｔ ｉｖｅ）
量の生ポリオウィルスが使用され得ることを報告してい
る。あたかも、最初の合成ワクチンが免疫系を“開始”
（ｐｒｉｍｅ） Ｌ、そして次のウィルス性追加免疫
（ｂｏｏｓｔ）が有効な液性反応（ｈｕｍｏｒａｌ ｒ
ｅｓｐｏｎｓｅ）に７おける最初に開始された免疫反応
の増幅を可能にするかのようである。
他の研究者は、微生物的に生産された（組換体）ワクチ
ンを用いて同様の知見を報告している。
ンを用いて同様の知見を報告している。
これらは、ポリオウィルス及び肝炎Ｂウィルス（組換体
によって開始／生ウィルスによって追加免疫）、及び口
蹄疫ウィルス（組換体によって開始／殺されたウィルス
によって追加免疫）を包含する。
によって開始／生ウィルスによって追加免疫）、及び口
蹄疫ウィルス（組換体によって開始／殺されたウィルス
によって追加免疫）を包含する。
この発明は、ＦｅＬＶの抗原決定基を規定するアミノ酸
配列を含んで成り、そしてネコにおける液性反応を誘発
し又は開始するため、及びＦｅＬＶ感染に対してネコを
免疫するために有用なポリペプチドに関する。これらの
ポリペプチドは、（１）このようなアミノ酸配列をコー
ドするＦｅＬＶ ｅｎｖ ＤＮＡ配列を含有する組換体
ＤＮＡの微生物中での直接発現により、又は（２）小ポ
リペプチドの場合には常用のポリペプチド合成法により
製造することができる。精製されたｇｐ７０蛋白質は有
効なＦｅＬＶワクチンでなかったことを従来技術が報告
しているから、これらのポリペプチドの免疫原性は予想
されない。
配列を含んで成り、そしてネコにおける液性反応を誘発
し又は開始するため、及びＦｅＬＶ感染に対してネコを
免疫するために有用なポリペプチドに関する。これらの
ポリペプチドは、（１）このようなアミノ酸配列をコー
ドするＦｅＬＶ ｅｎｖ ＤＮＡ配列を含有する組換体
ＤＮＡの微生物中での直接発現により、又は（２）小ポ
リペプチドの場合には常用のポリペプチド合成法により
製造することができる。精製されたｇｐ７０蛋白質は有
効なＦｅＬＶワクチンでなかったことを従来技術が報告
しているから、これらのポリペプチドの免疫原性は予想
されない。
この発明の微生物的に生産されるポリペプチドは、Ｆｅ
ＬＶのｇｐ７０エンベロープ蛋白質のアミノ酸配列の少
なくとも一部分と相同なアミノ酸配列を含んで成り、そ
してネコにおいて液性反応を誘発又は開始し且つＦｅＬ
Ｖ感染に対してネコを免疫する免疫原である。このよう
な蛋白質の１つの群は、抗原決定基を規定するネコ科白
血病ウィルスのｇｐ７０エンベローブ蛋白質の部分に融
合したｔｒｐ日蛋白質の部分及びｔｒｐ リーダーペプ
チドの部分を含んで成る、Ｅ．コリにより生産された融
合蛋白質である。この群のポリペプチドは、入手可能な
分子クローン化ＦｅＬＶ ＤＮＡ配列からｅｎｖ遺伝子
の断片を単離し、又はｅｎｖ遺伝子断片を合成し、該断
片を、プラスミドを有するＥ．コリの発現を指令するＥ
．コリｔｒｐ ＬＥ’配列を用いる複製可能なプラスミ
ドに導入し、そして得られた形質転換体を適切な細菌培
養培地中で増殖せしめることにより作られた。このポリ
ペプチドは、細胞を溶解し、該溶解物からＥ．コリエン
ドトキシンを除去し、そしてジスルフィド結合を開裂せ
しめる還元剤で前記溶解物を還元することによってＥ．
コリ細胞から取り出すことができよう。次に、この物質
を再酸化するのが好ましい。
ＬＶのｇｐ７０エンベロープ蛋白質のアミノ酸配列の少
なくとも一部分と相同なアミノ酸配列を含んで成り、そ
してネコにおいて液性反応を誘発又は開始し且つＦｅＬ
Ｖ感染に対してネコを免疫する免疫原である。このよう
な蛋白質の１つの群は、抗原決定基を規定するネコ科白
血病ウィルスのｇｐ７０エンベローブ蛋白質の部分に融
合したｔｒｐ日蛋白質の部分及びｔｒｐ リーダーペプ
チドの部分を含んで成る、Ｅ．コリにより生産された融
合蛋白質である。この群のポリペプチドは、入手可能な
分子クローン化ＦｅＬＶ ＤＮＡ配列からｅｎｖ遺伝子
の断片を単離し、又はｅｎｖ遺伝子断片を合成し、該断
片を、プラスミドを有するＥ．コリの発現を指令するＥ
．コリｔｒｐ ＬＥ’配列を用いる複製可能なプラスミ
ドに導入し、そして得られた形質転換体を適切な細菌培
養培地中で増殖せしめることにより作られた。このポリ
ペプチドは、細胞を溶解し、該溶解物からＥ．コリエン
ドトキシンを除去し、そしてジスルフィド結合を開裂せ
しめる還元剤で前記溶解物を還元することによってＥ．
コリ細胞から取り出すことができよう。次に、この物質
を再酸化するのが好ましい。
免疫原性であると同定されたｇｐ７０蛋白質の部分は、
標準的ポリペプチド合成技法により合成しそして担体蛋
白質と連結して有効なＦｅＬＶ免疫原を製造することが
できる。
標準的ポリペプチド合成技法により合成しそして担体蛋
白質と連結して有効なＦｅＬＶ免疫原を製造することが
できる。
ポリペプチド、又はポリペプチドー担体蛋白質接合体は
ワクチンとして使用するために適当なアジニバント及び
非経ロビークルと混合される。ネコにこれらのワクチン
の免疫量を非経口的に投与することにより、ネコをＦｅ
ＬＶに対して免疫することができる。これらは好ましく
は免疫反応を開始するために使用され、そして次に殺さ
れたウィルス又は感染量より少ない量の生ウィルスによ
り追加免疫が行われる。
ワクチンとして使用するために適当なアジニバント及び
非経ロビークルと混合される。ネコにこれらのワクチン
の免疫量を非経口的に投与することにより、ネコをＦｅ
ＬＶに対して免疫することができる。これらは好ましく
は免疫反応を開始するために使用され、そして次に殺さ
れたウィルス又は感染量より少ない量の生ウィルスによ
り追加免疫が行われる。
この発明の微生物的に生産されたポリベプチドは幾つか
の観点において天然ＦｅＬＶエンベローブ蛋白質と異る
。このポリペプチドの実質的な部分又はすべてが天然Ｆ
ｅＬＶｇｐ７０蛋白質の配列と相同であろうが、ほとん
どの場合それは天然ｇｐ７０蛋白質のアミノ酸配列の部
分のみを含んで成るであろう。
の観点において天然ＦｅＬＶエンベローブ蛋白質と異る
。このポリペプチドの実質的な部分又はすべてが天然Ｆ
ｅＬＶｇｐ７０蛋白質の配列と相同であろうが、ほとん
どの場合それは天然ｇｐ７０蛋白質のアミノ酸配列の部
分のみを含んで成るであろう。
これらのポリペプチドはまたｐ１５Ｂ蛋白質の部分を含
有する。さらに、前記相同な配列が微生物によって生産
されるので、天然ｇｐ７０のようにプロセシング（すな
わちグリコシル化）されないであろう。
有する。さらに、前記相同な配列が微生物によって生産
されるので、天然ｇｐ７０のようにプロセシング（すな
わちグリコシル化）されないであろう。
融合蛋白質である具体例、例えばｔｒｐＬＢ’ −ｇｐ
Ｔ０融合蛋白質は、天然ｇｐ７０にとって外来性である
アミノ酸配列を含む。このようなポリペプチドの二次構
造及び三次構造は、グリコシル化の不存在又は外来性ア
ミノ酸配列の存在のために天然ｇｐ７０と異るであろう
。これらの相違は免疫的相違に反映されるであろう。
Ｔ０融合蛋白質は、天然ｇｐ７０にとって外来性である
アミノ酸配列を含む。このようなポリペプチドの二次構
造及び三次構造は、グリコシル化の不存在又は外来性ア
ミノ酸配列の存在のために天然ｇｐ７０と異るであろう
。これらの相違は免疫的相違に反映されるであろう。
融合蛋白質の好ましい群は、ｇｐ８５蛋白質のおよそア
ミノ酸２１０及び２５００間に存在するｇｐ７０蛋白質
の親水性領域及びｇｐ７０−ｐｌ５Ｂ連結部すなわちお
よそアミノ酸４１５及び４５００間（ｇｐ８５分子の仮
定される出発部から数え始める）に存在する親水性領域
の少なくとも１つの全部又は実質的部分と相同であるア
ミノ酸のセグメントを含むボリペプチドである。
ミノ酸２１０及び２５００間に存在するｇｐ７０蛋白質
の親水性領域及びｇｐ７０−ｐｌ５Ｂ連結部すなわちお
よそアミノ酸４１５及び４５００間（ｇｐ８５分子の仮
定される出発部から数え始める）に存在する親水性領域
の少なくとも１つの全部又は実質的部分と相同であるア
ミノ酸のセグメントを含むボリペプチドである。
ポリペプチドの特定の好ましい群は、次のアミノ酸配列
（アミノ酸の番号はＦｅＬＶ−３のｇｐ８５分子の仮定
される出発部から始まる）のいずれかの１又は複数の反
覆を含むポリペプチドである。
（アミノ酸の番号はＦｅＬＶ−３のｇｐ８５分子の仮定
される出発部から始まる）のいずれかの１又は複数の反
覆を含むポリペプチドである。
（ａ ） ｍｅｔ ｇｌｙ ｐｒｏ ａｓｎ ｌｅｕ
ｖａｌ ｌｅｕ ｐｒｏ ａｓｐｇｉｎ ｌｙｓ ｐｒ
ｏ ｐｒｏ ｓｅｒ（この配列はＧＡＦｅＬＶ−Ｂのｇ
ｐ７０蛋白質のアミノ酸２１３−２２６に存在する）；
（ｂ） ａｓｐ ｇｉｎ ｌｙｓ ｐｒｏ ｐｒｏ ｓ
ｅｒ ａｒｇ ｇｌｎ ｓｅｒｇｌｎ ｉｌｅ ｇｌｎ
（この配列はＧＡＦｅＬＶ−Ｂのｇｐ７０蛋白質のアミ
ノ酸２２１−２３１に存在する）；（ｃ ） ｐｒｏ
ｇｌｕ ｔｙｒ ｖａｌ ｔｙｒ ｔｈｒ ｔｕｓ ｐ
ｈｅ ａｓｐｌｙｓ ｔｈｒ ｖａｌ ａｒｇ ｌｅｕ
（この配列はＳＴＦｅＬＶ−Ｂのｇｐ７０蛋白質のアミ
ノ酸４１７−４３０に存在する）；及び （ｄ） ａｓｐ ｌｙｓ ｔｈｒ ｖａｌ ａｒｇ ｌ
ｅｕ ａｒｇ ａｒｇ ｇｌｕｐｒｏ ｉｌｅ ｓｅｒ
ｌｅｕ（この配列はＳＴＦｅＬＶ−Ｂのｇｐ８５蛋白
質のアミノ酸４２５−４３７、すなわちｇｐ７０蛋白質
の最後の８アミノ酸及びｐｌ５Ｅ蛋白質の最初の５アミ
ノ酸に存在する）。
ｖａｌ ｌｅｕ ｐｒｏ ａｓｐｇｉｎ ｌｙｓ ｐｒ
ｏ ｐｒｏ ｓｅｒ（この配列はＧＡＦｅＬＶ−Ｂのｇ
ｐ７０蛋白質のアミノ酸２１３−２２６に存在する）；
（ｂ） ａｓｐ ｇｉｎ ｌｙｓ ｐｒｏ ｐｒｏ ｓ
ｅｒ ａｒｇ ｇｌｎ ｓｅｒｇｌｎ ｉｌｅ ｇｌｎ
（この配列はＧＡＦｅＬＶ−Ｂのｇｐ７０蛋白質のアミ
ノ酸２２１−２３１に存在する）；（ｃ ） ｐｒｏ
ｇｌｕ ｔｙｒ ｖａｌ ｔｙｒ ｔｈｒ ｔｕｓ ｐ
ｈｅ ａｓｐｌｙｓ ｔｈｒ ｖａｌ ａｒｇ ｌｅｕ
（この配列はＳＴＦｅＬＶ−Ｂのｇｐ７０蛋白質のアミ
ノ酸４１７−４３０に存在する）；及び （ｄ） ａｓｐ ｌｙｓ ｔｈｒ ｖａｌ ａｒｇ ｌ
ｅｕ ａｒｇ ａｒｇ ｇｌｕｐｒｏ ｉｌｅ ｓｅｒ
ｌｅｕ（この配列はＳＴＦｅＬＶ−Ｂのｇｐ８５蛋白
質のアミノ酸４２５−４３７、すなわちｇｐ７０蛋白質
の最後の８アミノ酸及びｐｌ５Ｅ蛋白質の最初の５アミ
ノ酸に存在する）。
好ましい微生物的に生産される融合蛋白質に代るものと
して、上記のセグメント又は配列（１又は複数の反復）
を合成し、そして適当な蛋白質担体に連結して有効なＦ
ｅＬＶ免疫原を製造することができる。
して、上記のセグメント又は配列（１又は複数の反復）
を合成し、そして適当な蛋白質担体に連結して有効なＦ
ｅＬＶ免疫原を製造することができる。
連結部位を与えるため、このセグメント又は配列にシス
テインを加えることができる。レーナー等、ハ易（１９
８１）遷： ３４０３−３４０７は、小ボリベプチドを
担体蛋白質に連結して免疫原を製造する方法を記載して
いる。他の連結法がカーチ（ｃｈｕｒｃｈ）、Ｗ， Ｒ
，等、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） （１９８３） ８０ ：
２５５、０′スリバン、Ｍ， Ｊ，及びマークス、■
．、メンズ・イン・エンチ％０ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｂｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ（１９８１）７３ ：１４
７−１６６、及びエルランジャー、Ｂ， Ｆ，、メソズ
・イン●エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）７０ ： ８５−１０４
に記載されている。使用することができる担体蛋白質の
例は、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ １ ｉ
ｍｐｅｔ） ヘ％ シ７ ニン、卵アルブミン、ブター
チログロプリン、ウシ血清アルブミンである。ポリペプ
チドと担体蛋白質との接合体を調製するための連結剤に
は、蛋白質を連結するために使用される常用の架橋剤、
例えばアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス
ージアゾ化ベンザジン、カルボジイミド、サクシンイミ
ド、及びイミデートが含まれる。
テインを加えることができる。レーナー等、ハ易（１９
８１）遷： ３４０３−３４０７は、小ボリベプチドを
担体蛋白質に連結して免疫原を製造する方法を記載して
いる。他の連結法がカーチ（ｃｈｕｒｃｈ）、Ｗ， Ｒ
，等、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） （１９８３） ８０ ：
２５５、０′スリバン、Ｍ， Ｊ，及びマークス、■
．、メンズ・イン・エンチ％０ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｂｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ（１９８１）７３ ：１４
７−１６６、及びエルランジャー、Ｂ， Ｆ，、メソズ
・イン●エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）７０ ： ８５−１０４
に記載されている。使用することができる担体蛋白質の
例は、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ １ ｉ
ｍｐｅｔ） ヘ％ シ７ ニン、卵アルブミン、ブター
チログロプリン、ウシ血清アルブミンである。ポリペプ
チドと担体蛋白質との接合体を調製するための連結剤に
は、蛋白質を連結するために使用される常用の架橋剤、
例えばアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス
ージアゾ化ベンザジン、カルボジイミド、サクシンイミ
ド、及びイミデートが含まれる。
この発明はこの明細書において、ＦｅＬＶ株ＧＡ及びＳ
Ｔ〔これらの株のｅｎＶ遺伝子のヌクレオチド配列及び
推定されるアミノ酸配列は出願人によりジャーナル・オ
ブ・ビロロギ−（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ）（１９８４）
４９：６３０に報告されている〕、Ｅ．コリ形質転換体
によるｔｒｐＬＥ’及びＦｅＬＶ−ＧＡｇｐ７０配列の
融合蛋白質の発現、並びにｇｐ７０又はｇｐ７０−ｐ１
５Ｅ連結配列に相同な抗原ポリペプチドと抗体蛋白質と
の接合体の合成に言及して具体的に例示される。しかし
ながら、この発明は他のＦｅＬＶ株及びサブグループの
ｇｐ７０又はｇｐ７０−ｐ１５Ｂ配列に相同な配列を含
むポリペプチド、ｇｐ７０配列がｔｒｐＬＥ’配列以外
のＤＮＡの発現に由来するポリペプチドに融合している
融合蛋白質、及びＥ．コリ以外の形質転換可能な微生物
、例えば他の細菌及び酵母又はウィルスによるポリペプ
チドの発現（これらの生物中で異種性遺伝子配列を複製
しそして発現することができるベクターを使用）を包含
することが意図されることが評価されるであろう。
Ｔ〔これらの株のｅｎＶ遺伝子のヌクレオチド配列及び
推定されるアミノ酸配列は出願人によりジャーナル・オ
ブ・ビロロギ−（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ）（１９８４）
４９：６３０に報告されている〕、Ｅ．コリ形質転換体
によるｔｒｐＬＥ’及びＦｅＬＶ−ＧＡｇｐ７０配列の
融合蛋白質の発現、並びにｇｐ７０又はｇｐ７０−ｐ１
５Ｅ連結配列に相同な抗原ポリペプチドと抗体蛋白質と
の接合体の合成に言及して具体的に例示される。しかし
ながら、この発明は他のＦｅＬＶ株及びサブグループの
ｇｐ７０又はｇｐ７０−ｐ１５Ｂ配列に相同な配列を含
むポリペプチド、ｇｐ７０配列がｔｒｐＬＥ’配列以外
のＤＮＡの発現に由来するポリペプチドに融合している
融合蛋白質、及びＥ．コリ以外の形質転換可能な微生物
、例えば他の細菌及び酵母又はウィルスによるポリペプ
チドの発現（これらの生物中で異種性遺伝子配列を複製
しそして発現することができるベクターを使用）を包含
することが意図されることが評価されるであろう。
従って、例示によって次の例が与えられるが、なんらこ
の発明を限定することは意図されない。
の発明を限定することは意図されない。
例において使用される略号は、ＤＴＴはジチオスレイト
ール； ＡＴＰはアデノシントリホスフェート；ｄＴＴ
Ｐはデオキシチミジントリホスフェート； ＳＤＳは
ドデシル硫酸ナトリウム； ＳＯＳ−ＰＡＧＥはドデシ
ル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動；
ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸；ＡＣはアセテー
ト、ＢＳＡはウシ血清アルブミン； ＥＬＩＳＡはエ
ンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ；ＤＲＡＢ
はジエチルアミノエチル； ＡＢＴＳは２．２′アジノ
ージー（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸；ＨＦ
は弗化水素酸をそれぞれ示す。
ール； ＡＴＰはアデノシントリホスフェート；ｄＴＴ
Ｐはデオキシチミジントリホスフェート； ＳＤＳは
ドデシル硫酸ナトリウム； ＳＯＳ−ＰＡＧＥはドデシ
ル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動；
ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸；ＡＣはアセテー
ト、ＢＳＡはウシ血清アルブミン； ＥＬＩＳＡはエ
ンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ；ＤＲＡＢ
はジエチルアミノエチル； ＡＢＴＳは２．２′アジノ
ージー（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸；ＨＦ
は弗化水素酸をそれぞれ示す。
男
一般的方法
核酸の操作において使用されるすべての酵素はニューイ
ングランドビオラブスもしくはベセスダリサーチラブス
のいずれかから人手し、又は製造者の推奨する方法によ
って調製した。ＤＮＡの消化及び連結、ゲル電気泳動に
よるＤＮＡ断片の単離、並びに細菌宿主の形質転換及び
選択のために使用される条件は組換ＤＮＡの分野におい
て当業者によく知られている標準的方法である。この発
明の実施において使用されるこれらの及び他の分子クロ
ーニンク技法は、マニアチス等、“モレ＋−ラー・クロ
ーニング二ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）″コールドスプリングハーバーラボラ
トリーズ（１９８２）に見ることができる。
ングランドビオラブスもしくはベセスダリサーチラブス
のいずれかから人手し、又は製造者の推奨する方法によ
って調製した。ＤＮＡの消化及び連結、ゲル電気泳動に
よるＤＮＡ断片の単離、並びに細菌宿主の形質転換及び
選択のために使用される条件は組換ＤＮＡの分野におい
て当業者によく知られている標準的方法である。この発
明の実施において使用されるこれらの及び他の分子クロ
ーニンク技法は、マニアチス等、“モレ＋−ラー・クロ
ーニング二ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）″コールドスプリングハーバーラボラ
トリーズ（１９８２）に見ることができる。
制限酵素によるＤＮＡの消化は、特にことわりない限り
完全消化であり、そして３７℃にて１〜５ユニット酵素
／ｔａｒ ＤＮＡ， ３０〜６０分を必要とする。
完全消化であり、そして３７℃にて１〜５ユニット酵素
／ｔａｒ ＤＮＡ， ３０〜６０分を必要とする。
幾つかの消化は意図的に部分的であり、この場合各分子
上のすべての部位より少ない部位が消化される。これら
は一般に３７℃にて０．０５〜０．５ユニット酵素／ｎ
ＤＮＡ， １０〜６０分間で行われる。
上のすべての部位より少ない部位が消化される。これら
は一般に３７℃にて０．０５〜０．５ユニット酵素／ｎ
ＤＮＡ， １０〜６０分間で行われる。
Ｔ４ ＤＮＡ ＩＪガーゼを用いる連結は、接着末端の
連結のためにはＱ．ｌ ｍＭ ＡＴＰ及び０．０１ 〜
０．０５ｗｅｔｓｓ ユニットのりガーゼ／２ ０Ｊｌ
ｌ反応、又は平滑末端の連結のためにはｌ．ＱｍＭ Ａ
ＴＰ及び１．０〜５．０ｗｅｌＳＳユニットのりガーゼ
／２ ０Ｊｉｌ反応を含有する６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７．６） ． ６．６ｍＭ ＭｇＣｊｉ
！２． １ ０ｍＭ ＤＴＴ中で行われる。反応は１４
℃にて６〜１２時間行われる。分子間反応は、接着末端
連結のためには２０ 〜１５０ｇ／ｍｆのベクターＤＮ
Ａを必要とし、そして平滑末端連結のためには１００〜
２００ｘ／ｍｊ’のベクターＤＮＡを必要とする。挿入
ＤＮＡにおいてはベクターＤＮＡを超えて１〜２０倍過
剰量が維持される。分子内反応は１０〜２０Ｋ／一のベ
クターＤＮＡを必要とする。
連結のためにはＱ．ｌ ｍＭ ＡＴＰ及び０．０１ 〜
０．０５ｗｅｔｓｓ ユニットのりガーゼ／２ ０Ｊｌ
ｌ反応、又は平滑末端の連結のためにはｌ．ＱｍＭ Ａ
ＴＰ及び１．０〜５．０ｗｅｌＳＳユニットのりガーゼ
／２ ０Ｊｉｌ反応を含有する６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７．６） ． ６．６ｍＭ ＭｇＣｊｉ
！２． １ ０ｍＭ ＤＴＴ中で行われる。反応は１４
℃にて６〜１２時間行われる。分子間反応は、接着末端
連結のためには２０ 〜１５０ｇ／ｍｆのベクターＤＮ
Ａを必要とし、そして平滑末端連結のためには１００〜
２００ｘ／ｍｊ’のベクターＤＮＡを必要とする。挿入
ＤＮＡにおいてはベクターＤＮＡを超えて１〜２０倍過
剰量が維持される。分子内反応は１０〜２０Ｋ／一のベ
クターＤＮＡを必要とする。
ＧＡ−ＦｅＬＶ−８の分子クローニング及び特徴付けム
リンス等、ジャーナル・オブ・ビロロジ−（Ｊ， Ｖｉ
ｒｏｌ．） （１９８１）３８ ： ６８８により記載
されている様にして、分子クローン化ＧＡ−ＦｅＬＶ−
８プロウィルスをファージラムダ中の組検体ＤＮＡの形
で得た。
リンス等、ジャーナル・オブ・ビロロジ−（Ｊ， Ｖｉ
ｒｏｌ．） （１９８１）３８ ： ６８８により記載
されている様にして、分子クローン化ＧＡ−ＦｅＬＶ−
８プロウィルスをファージラムダ中の組検体ＤＮＡの形
で得た。
要約すれば、ＧＡ−ＦｅＬＶ−８に感染された細胞から
のヒトゲノムＤＮＡがＥｃｏＲ Ｉで消化され、そして
ラムダーファージシャロン４Ａに分子クローン化された
。このような分子クローン化プロウィルスの１つ（ラム
ダＨＦ６０ ’）はトランスフェクションによりイヌＤ
−１７０細胞に導入された場合に感染性であることも著
者によって示された（ムリンス等、前掲）。次に、完全
なプロウィルス配列及びこのウィルスが組み込まれたフ
ランキングヒト配列を含むラムダＨＦ６０のＢｃｏＲ
Ｉ断片が細菌ブラスミドｐＫＣ７〔ラオ及びロジャース
、ジーン（Ｇｅｎｅ） （１９７９）７ ：７９〕のユ
ニーク８ｃｏＲ Ｉ部位に分子クローン化された。ｐＫ
ＨＲ １と称する得られたプラスミド（Ａ． ローチ及
びＮ．ダビドソン）を第１図に示す。分子クローン化プ
ロウィルスの方向付けが、ムリンス等二二一クレイック
・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
）（１９８０）８ ： ３２８７に記載されているよう
にしてウィルスＲＮ＾ゲノムに関して決定された。
のヒトゲノムＤＮＡがＥｃｏＲ Ｉで消化され、そして
ラムダーファージシャロン４Ａに分子クローン化された
。このような分子クローン化プロウィルスの１つ（ラム
ダＨＦ６０ ’）はトランスフェクションによりイヌＤ
−１７０細胞に導入された場合に感染性であることも著
者によって示された（ムリンス等、前掲）。次に、完全
なプロウィルス配列及びこのウィルスが組み込まれたフ
ランキングヒト配列を含むラムダＨＦ６０のＢｃｏＲ
Ｉ断片が細菌ブラスミドｐＫＣ７〔ラオ及びロジャース
、ジーン（Ｇｅｎｅ） （１９７９）７ ：７９〕のユ
ニーク８ｃｏＲ Ｉ部位に分子クローン化された。ｐＫ
ＨＲ １と称する得られたプラスミド（Ａ． ローチ及
びＮ．ダビドソン）を第１図に示す。分子クローン化プ
ロウィルスの方向付けが、ムリンス等二二一クレイック
・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
）（１９８０）８ ： ３２８７に記載されているよう
にしてウィルスＲＮ＾ゲノムに関して決定された。
第２図は、ＰｅＬＶのｅｎｖ遺伝子並びにｇｐ７０及び
ｐ１５Ｂ蛋白質をコードする配列の位置を示す。ｅｎｖ
遺伝子はｇｐ８５前駆体蛋白質をコードし、この蛋白質
は感染された細胞の膜に輸送され、そしてウィルスの出
現の際、成熟ウィルスエンベロープ蛋白質ｇｐＴＯ及び
ｐｌ５ｔ！に切断される。ｇｐ７０蛋白質はウィルスが
細胞受容器に特異的に結合して感染を完成することに関
与し、そして感染に対するウィルス中和抗体反応の生成
に関与する多くの抗原決定基を含有することが知られて
いる。
ｐ１５Ｂ蛋白質をコードする配列の位置を示す。ｅｎｖ
遺伝子はｇｐ８５前駆体蛋白質をコードし、この蛋白質
は感染された細胞の膜に輸送され、そしてウィルスの出
現の際、成熟ウィルスエンベロープ蛋白質ｇｐＴＯ及び
ｐｌ５ｔ！に切断される。ｇｐ７０蛋白質はウィルスが
細胞受容器に特異的に結合して感染を完成することに関
与し、そして感染に対するウィルス中和抗体反応の生成
に関与する多くの抗原決定基を含有することが知られて
いる。
ＦｅＬＶ ｅｎＶ遺伝子の位置を決定するために、分子
クローン化ＧＡ − ＦｅＬＶ − ８ウィルスの３′
部分のヌクレオチド配列を決定した。標準的ＤＮＡ配列
決定法及びストラテジーを用いた〔マキサム及びギルハ
ート、メンズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈ．加ム
）（１９８０）６５ ： ４９９ ．サンガー等、μ込
鋒１９７７）７４ ： ５４６３ ；メッシング等、二
二一クレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ， Ｒｅｓ． ） （１９８１） ３０９を参照の
こと〕。ＧＡ−ＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子及びＬＴＲ
領域のヌクレオチド配列、並びにｅｎＶ遺伝子生成物の
推定アミノ酸配列を第３図に示す。公知のネズミ白血病
ウィルスｐ７０及びｐ１５Ｂとの蛋白質配列の相同性は
、それぞれのＦｅＬＶ蛋白質と得られるヌクレオチド配
列との関連付けを可能にした。配列は、エルダー、Ｊ．
Ｈ．及びムリンス、Ｊ．Ｉ．、ジャーナル・オブ・ビｏ
ｏジー（Ｊ．ＶｉｒｏｌｏｇＹ） （１９８３） ４６
：８７１−８８０により決定されたそれと同一である
。
クローン化ＧＡ − ＦｅＬＶ − ８ウィルスの３′
部分のヌクレオチド配列を決定した。標準的ＤＮＡ配列
決定法及びストラテジーを用いた〔マキサム及びギルハ
ート、メンズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈ．加ム
）（１９８０）６５ ： ４９９ ．サンガー等、μ込
鋒１９７７）７４ ： ５４６３ ；メッシング等、二
二一クレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ， Ｒｅｓ． ） （１９８１） ３０９を参照の
こと〕。ＧＡ−ＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺伝子及びＬＴＲ
領域のヌクレオチド配列、並びにｅｎＶ遺伝子生成物の
推定アミノ酸配列を第３図に示す。公知のネズミ白血病
ウィルスｐ７０及びｐ１５Ｂとの蛋白質配列の相同性は
、それぞれのＦｅＬＶ蛋白質と得られるヌクレオチド配
列との関連付けを可能にした。配列は、エルダー、Ｊ．
Ｈ．及びムリンス、Ｊ．Ｉ．、ジャーナル・オブ・ビｏ
ｏジー（Ｊ．ＶｉｒｏｌｏｇＹ） （１９８３） ４６
：８７１−８８０により決定されたそれと同一である
。
ｐｔＧＡ中間体の造成
ＦｅＬＶ ｅｎｖ抗原の発現を指令する細菌プラスミド
はＦｅＬＶ抗原を含む融合蛋白質の発現に関連する幾つ
かの要素を含有する。第４図に言及して、領域Ｉ及び■
はそれぞれ、Ｅ．コリートリプトフアンプロモーター／
オペレーター／リボゾーム結合部位の配列及びＥ．コ９
ｔｒｐＬｂＥ’蛋白質をコードする配列〔蛋白質コー
ド領域のＣ一末端にＥｃｏＲ Ｉ部位を導入するように
変形されたＥ６ コリｔｒｐΔＬＢ１４１３、ミオツァ
り等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａ
ｃ） （１９７８） １３３ ： １４５７に由来する
〕を含有する。このｔｒｐＬＥ’発現系はクライド等〔
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） （１９８１）２１４
：１１２５、及びヨーロッパ特許出願Ｎα８１３０１２
２７． ５：］によりすでに記載されている。ｔｒｐＬ
Ｅ’のヌクレオチド配列を第７図に示す。領域■は、Ｆ
ｅＬＶ ｅｎｖ蛋白質の種々の領域をコードする［ｌＮ
Ａを含有する。
はＦｅＬＶ抗原を含む融合蛋白質の発現に関連する幾つ
かの要素を含有する。第４図に言及して、領域Ｉ及び■
はそれぞれ、Ｅ．コリートリプトフアンプロモーター／
オペレーター／リボゾーム結合部位の配列及びＥ．コ９
ｔｒｐＬｂＥ’蛋白質をコードする配列〔蛋白質コー
ド領域のＣ一末端にＥｃｏＲ Ｉ部位を導入するように
変形されたＥ６ コリｔｒｐΔＬＢ１４１３、ミオツァ
り等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａ
ｃ） （１９７８） １３３ ： １４５７に由来する
〕を含有する。このｔｒｐＬＥ’発現系はクライド等〔
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） （１９８１）２１４
：１１２５、及びヨーロッパ特許出願Ｎα８１３０１２
２７． ５：］によりすでに記載されている。ｔｒｐＬ
Ｅ’のヌクレオチド配列を第７図に示す。領域■は、Ｆ
ｅＬＶ ｅｎｖ蛋白質の種々の領域をコードする［ｌＮ
Ａを含有する。
領域■は合成オリゴヌクレオチドリン力一に由来し、こ
のリンカーは、必要な場合に、全融合蛋白質にわたって
翻訳リーディングフレームを維持するようにｔｒｐｔ，
ε′配列とＦｅＬＶ配列とを融合するために使用される
。
のリンカーは、必要な場合に、全融合蛋白質にわたって
翻訳リーディングフレームを維持するようにｔｒｐｔ，
ε′配列とＦｅＬＶ配列とを融合するために使用される
。
この明細書に記載する細菌プラスミド造成物ｐｔＧＡΔ
Ａｖａ Ｉ ． ｐｔＧＡ△Ａｐａ Ｉ，及びｐｔ９：
３ −１９は、ＦｅＬＶｇｌ）７０の種々の領域を含有
するこのような融合蛋白質をコードする。これらのプラ
スミドは、第５図に略図で示されるようにｔｒｐｔ，ε
′に融合した完全ＦｅＬＶｇｐ８５前駆体蛋白質の配列
を含有する中間体プラスミドｐｔＧＡを介して造成され
た。このストラテジーは、ＦｅＬｖｅｎｖ遺伝子のシグ
ナルペブチド／ｇｐ７０連結部に存在するＢａｌ Ｉ制
限部位を用いる。
Ａｖａ Ｉ ． ｐｔＧＡ△Ａｐａ Ｉ，及びｐｔ９：
３ −１９は、ＦｅＬＶｇｌ）７０の種々の領域を含有
するこのような融合蛋白質をコードする。これらのプラ
スミドは、第５図に略図で示されるようにｔｒｐｔ，ε
′に融合した完全ＦｅＬＶｇｐ８５前駆体蛋白質の配列
を含有する中間体プラスミドｐｔＧＡを介して造成され
た。このストラテジーは、ＦｅＬｖｅｎｖ遺伝子のシグ
ナルペブチド／ｇｐ７０連結部に存在するＢａｌ Ｉ制
限部位を用いる。
プラスミドｐＫＨＲ １を８ａｌＩにより部分解（０．
１〜１．０：Ｌ二７ト／ｎ ＤＮＡ， １０ 〜３０分
間、３７℃）し、そして次にＥｃｏＲ Ｉにより完全消
化（１〜５ユニット／河ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７
℃）した。シグナルペブチド／ｇｐ７０連結部３′側か
らｇｐ８５配列を通って、そしてプロウィルスの３′末
端に接するヒト配列中のＥｃｏＲ １部位で終る目的の
２．８ｋｂ断片をアガロースゲルでの電気泳動により単
離した。この断片を、アンピシリン耐性遺伝子を含有す
るベクターｐＢＲ３２２の２． ９ ｋｂ Ｂａｔ Ｉ
−ＥｃｏＲ Ｉ断片に分子クローニングした。このベ
クター断片は、Ｂａｌ Ｉ及び匂孜ＲＩ （μリＩ：
１〜５ユニット／４ＤＮＡ ，３０〜６０分間、３７℃
； Ｅ！ｃｏＲ ｒ ： 上記ｆ７）通リ） テ完全消
化した後にアガロースゲル中での電気泳動により単離し
ておいた。次に、上記のｐＢＲ３２２断片及びＦｅＬＶ
ｇｌ）８５断片を含有する連結混合物（Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ：接着末端ＢｃｏＲ Ｉ部位の第１段階連結のた
めに、ベクター断片を超える１〜２０倍過剰量のＦｅＬ
Ｖ断片、１０ 〜１００ｘ／ｒｒＬＩ！のベクター断片
、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ ｐＨ７． ６ ．
６． ６ｍＭ ＭｇＣｌｓ １ ０ｍＭＤＴＴ ，０
． １ｍＭ ＡＴＰ， ０．０１〜０．０５ｗｅｉｓｓ
ユニ７ト／２ ０Ｉｉ１反応、１４℃にて４〜１２時
間；ＢａｌＩ末端の第２段階分子内平滑末端連結のため
に、１ｍＭＡＴＰ及びｌ． Ｏ 〜５， Ｑｗｅｉｓｓ
ユ＝−）トのリガーゼ／２ ０Ｉｄ反応を含有する上
記緩衝液中に１０〜２０ｘ／ｍｊ！のベクターに稀釈し
、そして１４℃にて１２時間インキュベート）を用いて
Ｅ．コリＫ１２株ＭＭ ２９４をアンピシリン耐性に形
質転換した。誘導されたブラスミドをＢｃｏＲ Ｉ及び
Ｂａｌ Ｉ制限部位の再生について試験した。このよう
なブラスミドの１つをｐＧＡｅｎｖと称する（第５図パ
ート１）。
１〜１．０：Ｌ二７ト／ｎ ＤＮＡ， １０ 〜３０分
間、３７℃）し、そして次にＥｃｏＲ Ｉにより完全消
化（１〜５ユニット／河ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７
℃）した。シグナルペブチド／ｇｐ７０連結部３′側か
らｇｐ８５配列を通って、そしてプロウィルスの３′末
端に接するヒト配列中のＥｃｏＲ １部位で終る目的の
２．８ｋｂ断片をアガロースゲルでの電気泳動により単
離した。この断片を、アンピシリン耐性遺伝子を含有す
るベクターｐＢＲ３２２の２． ９ ｋｂ Ｂａｔ Ｉ
−ＥｃｏＲ Ｉ断片に分子クローニングした。このベ
クター断片は、Ｂａｌ Ｉ及び匂孜ＲＩ （μリＩ：
１〜５ユニット／４ＤＮＡ ，３０〜６０分間、３７℃
； Ｅ！ｃｏＲ ｒ ： 上記ｆ７）通リ） テ完全消
化した後にアガロースゲル中での電気泳動により単離し
ておいた。次に、上記のｐＢＲ３２２断片及びＦｅＬＶ
ｇｌ）８５断片を含有する連結混合物（Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ：接着末端ＢｃｏＲ Ｉ部位の第１段階連結のた
めに、ベクター断片を超える１〜２０倍過剰量のＦｅＬ
Ｖ断片、１０ 〜１００ｘ／ｒｒＬＩ！のベクター断片
、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ ｐＨ７． ６ ．
６． ６ｍＭ ＭｇＣｌｓ １ ０ｍＭＤＴＴ ，０
． １ｍＭ ＡＴＰ， ０．０１〜０．０５ｗｅｉｓｓ
ユニ７ト／２ ０Ｉｉ１反応、１４℃にて４〜１２時
間；ＢａｌＩ末端の第２段階分子内平滑末端連結のため
に、１ｍＭＡＴＰ及びｌ． Ｏ 〜５， Ｑｗｅｉｓｓ
ユ＝−）トのリガーゼ／２ ０Ｉｄ反応を含有する上
記緩衝液中に１０〜２０ｘ／ｍｊ！のベクターに稀釈し
、そして１４℃にて１２時間インキュベート）を用いて
Ｅ．コリＫ１２株ＭＭ ２９４をアンピシリン耐性に形
質転換した。誘導されたブラスミドをＢｃｏＲ Ｉ及び
Ｂａｌ Ｉ制限部位の再生について試験した。このよう
なブラスミドの１つをｐＧＡｅｎｖと称する（第５図パ
ート１）。
ｔｒｐＬＥ’発現ベクターのＢｃｏＲ Ｉ部位に、適切
なリーディングフレーム内に完全ｇｐ８５配列を分子内
クローニングすることを可能にするために、合成オリゴ
ヌクレオチドアダプターを使用した。ブラスミドｐＳＹ
Ｃ７９中の合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
を第５図バート２に示す。ＢａｍＨＩ ，Ｓｍａ ｒ
／Ｘｍａ ｌ ， ＥｃａＲ １部位を含有するポリリ
ン力一が２コピーの合成Ｅ．コリｌａｃ遺伝子オペレー
ター配列の両端に隣接する。このアダプターを含有する
ブラスミドは細菌宿主１ａｃオペロンの誘導をもたらし
、そしてそのためにこれらの細胞のコロニーはＸ−ｇａ
ｌプレート上で青色表現型を示す。
なリーディングフレーム内に完全ｇｐ８５配列を分子内
クローニングすることを可能にするために、合成オリゴ
ヌクレオチドアダプターを使用した。ブラスミドｐＳＹ
Ｃ７９中の合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
を第５図バート２に示す。ＢａｍＨＩ ，Ｓｍａ ｒ
／Ｘｍａ ｌ ， ＥｃａＲ １部位を含有するポリリ
ン力一が２コピーの合成Ｅ．コリｌａｃ遺伝子オペレー
ター配列の両端に隣接する。このアダプターを含有する
ブラスミドは細菌宿主１ａｃオペロンの誘導をもたらし
、そしてそのためにこれらの細胞のコロニーはＸ−ｇａ
ｌプレート上で青色表現型を示す。
ｐｔＧＡブラスミドの造成におけるこのアダプターの使
用を第５図パート２に示す。プラスミドｐＳＹＣ７９を
Ｘｍａ Ｉにより消化してポリリンカーを切断し、そし
てその部位をＰｏｔ Ｉ （Ｋｌｅｎｏｗ断片）によ
りフィルーインした（ＸＩＴｌａ Ｉ ： １ 〜５ユ
ニット／ｎ，３０〜６０分間、３７℃； Ｋｌｅｎｏｗ
酵素：マニアチス等、前掲、３９４頁に記載されている
ようにして修復反応を実施）。得られた小平滑末端アダ
プター断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精
製した。プラスミドｐＧＡｅｎｖをＢａｌＩで部分消化
し（上記）、そして精製されたアダプター断片に連結し
たＣＴ４ ＤＮＡ ！Ｊガーゼ：分子間平滑末端連結を
上記（分子内）のようにして、しかし２００〜／ｒｎｌ
のベクター及び２０〜１００倍のアダプターにおいて実
施した〕。この材料を用いてＥ．コ！ＪＫ１２株ＭＭ２
９４をアンピシリン耐性に、そしてＸ−ｇａｌプレート
上で青色表現型を示すように形質転換した。得られたプ
ラスミドをＥｃｏＲ Ｉで分析して所望のＢａｌ Ｉ部
位における挿入を証明し、そして｝ｌａｅ ＩＩＩで分
析してアダプター／ＢａｌＩ部位の連結部の適切な融合
を確認した。後者は連結部のＤＮＡ配列決定により確言
忍された。１つのこのようなブラスミドをｐＧＡｅｎｖ
− １ａｃと称する（第５図パート２）。
用を第５図パート２に示す。プラスミドｐＳＹＣ７９を
Ｘｍａ Ｉにより消化してポリリンカーを切断し、そし
てその部位をＰｏｔ Ｉ （Ｋｌｅｎｏｗ断片）によ
りフィルーインした（ＸＩＴｌａ Ｉ ： １ 〜５ユ
ニット／ｎ，３０〜６０分間、３７℃； Ｋｌｅｎｏｗ
酵素：マニアチス等、前掲、３９４頁に記載されている
ようにして修復反応を実施）。得られた小平滑末端アダ
プター断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精
製した。プラスミドｐＧＡｅｎｖをＢａｌＩで部分消化
し（上記）、そして精製されたアダプター断片に連結し
たＣＴ４ ＤＮＡ ！Ｊガーゼ：分子間平滑末端連結を
上記（分子内）のようにして、しかし２００〜／ｒｎｌ
のベクター及び２０〜１００倍のアダプターにおいて実
施した〕。この材料を用いてＥ．コ！ＪＫ１２株ＭＭ２
９４をアンピシリン耐性に、そしてＸ−ｇａｌプレート
上で青色表現型を示すように形質転換した。得られたプ
ラスミドをＥｃｏＲ Ｉで分析して所望のＢａｌ Ｉ部
位における挿入を証明し、そして｝ｌａｅ ＩＩＩで分
析してアダプター／ＢａｌＩ部位の連結部の適切な融合
を確認した。後者は連結部のＤＮＡ配列決定により確言
忍された。１つのこのようなブラスミドをｐＧＡｅｎｖ
− １ａｃと称する（第５図パート２）。
ｔＥｃｏＲ Ｉにより消化（上記のように）した後、得
られるアダプター付ＦｅＬＶｇｐ８５配列含有ｐＧＡｅ
ｎｖ−１ａｃの２．８ ｋｂ ＢｃｏＲ Ｉ断片を電気
泳動により単離し、そしてやはりＢＣＯＲ Ｉにより消
化された（上記のように） ｐｔｒｐＬＥ’に連結（Ｔ
４ ０Ｎ＾リガーゼ：上記のような接着末端連結）した
。プラスミドｐｔｒｐＬＢ’は、ｔｒｐＬε′遺伝子の
ＡＴＧの２８５ｂｐ上流のＰｖｕ Ｕ部位からＬＩＥ’
遺伝子のＣ一末端に形成されたＥｃｏＲ１部位までのＥ
．コリｔｒｐΔＬＢｌ４１３オペロンの配列を含有する
（このｔｒｐΔＬＢ１４１３配列はヨーロッパ特許出願
Ｎα８１３０１２２７． ５に記載されている）。
られるアダプター付ＦｅＬＶｇｐ８５配列含有ｐＧＡｅ
ｎｖ−１ａｃの２．８ ｋｂ ＢｃｏＲ Ｉ断片を電気
泳動により単離し、そしてやはりＢＣＯＲ Ｉにより消
化された（上記のように） ｐｔｒｐＬＥ’に連結（Ｔ
４ ０Ｎ＾リガーゼ：上記のような接着末端連結）した
。プラスミドｐｔｒｐＬＢ’は、ｔｒｐＬε′遺伝子の
ＡＴＧの２８５ｂｐ上流のＰｖｕ Ｕ部位からＬＩＥ’
遺伝子のＣ一末端に形成されたＥｃｏＲ１部位までのＥ
．コリｔｒｐΔＬＢｌ４１３オペロンの配列を含有する
（このｔｒｐΔＬＢ１４１３配列はヨーロッパ特許出願
Ｎα８１３０１２２７． ５に記載されている）。
このＰｖｕ Ｉｔ−ＢｃｏＲ Ｉ断片はｐＢＲ３２２の
Ｐｖｕ ＩＩ −ＢｃｏＲ Ｉ断片に分子クローニング
されているものである。
Ｐｖｕ ＩＩ −ＢｃｏＲ Ｉ断片に分子クローニング
されているものである。
第６図に示されている得られたプラスミドはアンピシリ
ン耐性を提供し、そしてｔｒｐＬＢ’蛋白質断片をコー
ドする。第７図はＬＨ’遺伝子及び推定されるアミノ酸
配列を示す。ｐｔｒｐＬＥ’ベクター及び２．８ ｋｂ
ＦｅＬＶｇｐ８５断片を含有する連結混合を用いてＥ
．コリＫ１２ ＭＭ２９４をアンピシリン耐性及びＸ一
ｇａｌプレート上での白色表現型に形質転換した。
ン耐性を提供し、そしてｔｒｐＬＢ’蛋白質断片をコー
ドする。第７図はＬＨ’遺伝子及び推定されるアミノ酸
配列を示す。ｐｔｒｐＬＥ’ベクター及び２．８ ｋｂ
ＦｅＬＶｇｐ８５断片を含有する連結混合を用いてＥ
．コリＫ１２ ＭＭ２９４をアンピシリン耐性及びＸ一
ｇａｌプレート上での白色表現型に形質転換した。
得られたプラスミドをＥｃｏＲ Ｉで分析して部位の再
生を確認し、そして旧ｎｄＩＩＩ及びＰｖｕ ＩＩで分
析して挿入されたＥ！ｃｏＲ Ｉ断片の方向を決定した
。正しい方向に挿入部を含有する１つのプラスミドをｐ
ｔＧＡと称する。第５図パート３に示されるこのプラス
ミドは適切なリーディングフレーム内にｔｒｐＬＢ’発
現ベクターに融合したＦｅＬＶｇｐ８５配列を含有する
。
生を確認し、そして旧ｎｄＩＩＩ及びＰｖｕ ＩＩで分
析して挿入されたＥ！ｃｏＲ Ｉ断片の方向を決定した
。正しい方向に挿入部を含有する１つのプラスミドをｐ
ｔＧＡと称する。第５図パート３に示されるこのプラス
ミドは適切なリーディングフレーム内にｔｒｐＬＢ’発
現ベクターに融合したＦｅＬＶｇｐ８５配列を含有する
。
ｐｔＧＡ中のｔｒｐＬＥ’ ／ｇｐ７０連結部における
ヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を第８図
に示す。このブラスミドを、プラスミドｐｔＧＡΔＡｖ
ａ１ ， ｐｔＧＡΔＡｐａ、及びｐｔ９：３−１９の
その後の造成のための中間体として使用した。
ヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を第８図
に示す。このブラスミドを、プラスミドｐｔＧＡΔＡｖ
ａ１ ， ｐｔＧＡΔＡｐａ、及びｐｔ９：３−１９の
その後の造成のための中間体として使用した。
ｔＧＡΔＡｖａ Ｉの造成
ｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉブラスミドは、ＦｅＬＶｇｐ７０
のＣ一端側半分とｐｌ５ＢのＮ一端領域とに由来する約
２４０個のアミノ酸を含有するｔｒｐＬＥ’融合蛋白質
である。
のＣ一端側半分とｐｌ５ＢのＮ一端領域とに由来する約
２４０個のアミノ酸を含有するｔｒｐＬＥ’融合蛋白質
である。
このプラスミドは、第９図に概略示すようにしてｐｔＧ
Ａから、中間体造成物ｐｔＧＡμリ■一旦剪■（この造
成中においては、ｐｌ５Ｅをコードする配列中のユニー
クＢａ１１部位と、ｐＨＫＲ ｌ中に組み込まれたＦｅ
ＬＶプロウィルスの３′一末端に隣接する配列中のユニ
ーク旧ｎｄＩＩ［部位との間のｐｔＧＡ配列が除去され
ている）を介して誘導された。ｐｔＧＡＢａｌ Ｉ 一
ＨｉｎｄＩＩＩは次のようにして造成された。ｐｔＧＡ
をＢａｌ Ｉ及び旧ｎｄＩＩＩにより消化し、そして旧
ｎｄＩＩＩ部位を１（ｌｅｎｏｗ断片により上記のよう
にして修復した。次のこの材料を連結し（Ｔ４！Ｊガー
ゼ：上託のような分子内平滑末端条件）モしてＥ．コリ
をアンピシリン耐性に形質転換するために使用した。得
られたコロニーのブラスミドをスクリーニングし、Ｐｅ
ＬＶ配列を含有する２． ３ ｋｂＢｃｏＲ Ｉ断片か
らの１．０ｋｂの除去を確実にした。翻訳は旧ｎｄＩ［
Ｉ部位に遠位の配列中の終止コドンにおいて停止する。
Ａから、中間体造成物ｐｔＧＡμリ■一旦剪■（この造
成中においては、ｐｌ５Ｅをコードする配列中のユニー
クＢａ１１部位と、ｐＨＫＲ ｌ中に組み込まれたＦｅ
ＬＶプロウィルスの３′一末端に隣接する配列中のユニ
ーク旧ｎｄＩＩ［部位との間のｐｔＧＡ配列が除去され
ている）を介して誘導された。ｐｔＧＡＢａｌ Ｉ 一
ＨｉｎｄＩＩＩは次のようにして造成された。ｐｔＧＡ
をＢａｌ Ｉ及び旧ｎｄＩＩＩにより消化し、そして旧
ｎｄＩＩＩ部位を１（ｌｅｎｏｗ断片により上記のよう
にして修復した。次のこの材料を連結し（Ｔ４！Ｊガー
ゼ：上託のような分子内平滑末端条件）モしてＥ．コリ
をアンピシリン耐性に形質転換するために使用した。得
られたコロニーのブラスミドをスクリーニングし、Ｐｅ
ＬＶ配列を含有する２． ３ ｋｂＢｃｏＲ Ｉ断片か
らの１．０ｋｂの除去を確実にした。翻訳は旧ｎｄＩ［
Ｉ部位に遠位の配列中の終止コドンにおいて停止する。
次に、このブラスミドｐｔＧＡ Ｂａｌ Ｉ−｝１ｉｎ
ｄＩＩＩを使用してｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉを形成した。
ｄＩＩＩを使用してｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉを形成した。
ブラスミドをＡｖａ Ｉで完全消化（Ａｖａ Ｉ ：
１〜５ユニット／ＩｌｇＤＮＡ、３０〜６０分間、３７
℃）し、そしてＢｃｏＲ Ｉで部分消化（ＥｃｏＲ Ｉ
： ０．０５〜０． ２ユニット／ｎ ＤＮＡ， １
０〜３０分間、３７℃）した。末端をκｌｅｎｏｗ断片
で修復し、そして約４ｋｂのＡｖａ Ｉ 一部分ＩＥｃ
ｏＲ Ｉ断片をゲル電気泳動により単離した。
１〜５ユニット／ＩｌｇＤＮＡ、３０〜６０分間、３７
℃）し、そしてＢｃｏＲ Ｉで部分消化（ＥｃｏＲ Ｉ
： ０．０５〜０． ２ユニット／ｎ ＤＮＡ， １
０〜３０分間、３７℃）した。末端をκｌｅｎｏｗ断片
で修復し、そして約４ｋｂのＡｖａ Ｉ 一部分ＩＥｃ
ｏＲ Ｉ断片をゲル電気泳動により単離した。
次にこれを再環化（Ｔ４ ＤＮＡ ！Ｊガーゼ：上記の
ような分子内平滑末端条件）し、そしてこれを使用して
Ｅ．コリをアンピシリン耐性に形質転換した。
ような分子内平滑末端条件）し、そしてこれを使用して
Ｅ．コリをアンピシリン耐性に形質転換した。
誘導されたコロニーのブラスミドを、ｔｒｐＬＢ’Ｆｅ
ＬＶ配列連結部における連結部位のＥｃｏＲ １部位の
再生についてスクリーニングした。翻訳リーディングフ
レームはこの連結部にわたって維持される。
ＬＶ配列連結部における連結部位のＥｃｏＲ １部位の
再生についてスクリーニングした。翻訳リーディングフ
レームはこの連結部にわたって維持される。
このプラスミドをｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉと称する。
ｔＧＡΔＡｖａ Ｉの造成
プラスミドｐｔＧＡΔＡｐａ Ｉは、ｅｎｖ遺伝子生成
物のアミノ酸１６７−２９３一由来のｇｐ７０の約１２
０アミノ酸を含有するｔｒｐＬＥ’融合蛋白質をコード
する。このプラスミドは、ｐｔＧＡから、第１０図に概
略示すようにして、中間体造成物ｐｔＧＡＲｓａ Ｉ
（この造成物においては、アミノ酸２９３−２９４の
Ｒｓａ Ｉに遠位のｇｐ７０コード配列が除去されてい
る）を介して誘導した。ｐｔＧＡＲｓａ Ｉを次のよう
にして造成したく第ｌＯ図パートｌ ） 。ｐｔＧＡを
Ｓｍａ Ｉにより完全消化（ＳｍａＩ：１〜５ユニット
／ｘｒＤＮ＾、３０〜６０分間、３７℃）し、そして次
にＢｃｏＲ Ｉにより部分消化（ＥｃｏＲ Ｉ ： ０
．０５〜０．２ユニット／． ＤＮＡ、１０〜３０分間
、３７℃）し、そして約３．４ｋｂのベクター断片を単
離した。次に、ブラスミドｐｔＧ＾をＥＣＯＲ Ｉ（Ｅ
ｃｏＲ Ｉ ： １〜５ユニット／〜ＤＮ＾、３０〜６
０分間、３７℃）及びＲｓａＩ （ＲｓａＩ ： １
〜５ユニット／ガＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）
により完全消化し、そしてｇｐ７０のアミノ一端側半分
をコードする配列を含有する７８０ｂｐ ｌＥｃｏＲ
Ｉ −Ｒｓａ Ｉ断片を単離した。
物のアミノ酸１６７−２９３一由来のｇｐ７０の約１２
０アミノ酸を含有するｔｒｐＬＥ’融合蛋白質をコード
する。このプラスミドは、ｐｔＧＡから、第１０図に概
略示すようにして、中間体造成物ｐｔＧＡＲｓａ Ｉ
（この造成物においては、アミノ酸２９３−２９４の
Ｒｓａ Ｉに遠位のｇｐ７０コード配列が除去されてい
る）を介して誘導した。ｐｔＧＡＲｓａ Ｉを次のよう
にして造成したく第ｌＯ図パートｌ ） 。ｐｔＧＡを
Ｓｍａ Ｉにより完全消化（ＳｍａＩ：１〜５ユニット
／ｘｒＤＮ＾、３０〜６０分間、３７℃）し、そして次
にＢｃｏＲ Ｉにより部分消化（ＥｃｏＲ Ｉ ： ０
．０５〜０．２ユニット／． ＤＮＡ、１０〜３０分間
、３７℃）し、そして約３．４ｋｂのベクター断片を単
離した。次に、ブラスミドｐｔＧ＾をＥＣＯＲ Ｉ（Ｅ
ｃｏＲ Ｉ ： １〜５ユニット／〜ＤＮ＾、３０〜６
０分間、３７℃）及びＲｓａＩ （ＲｓａＩ ： １
〜５ユニット／ガＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）
により完全消化し、そしてｇｐ７０のアミノ一端側半分
をコードする配列を含有する７８０ｂｐ ｌＥｃｏＲ
Ｉ −Ｒｓａ Ｉ断片を単離した。
この断片をベクターに連結（Ｔ４！Ｊガーゼ：２段階法
；分子間接着末端、及び分子内平滑末端）し、そしてこ
の混合物を用いてＥ．コリをアンピシリン耐性にした。
；分子間接着末端、及び分子内平滑末端）し、そしてこ
の混合物を用いてＥ．コリをアンピシリン耐性にした。
得られたブラスミドを３ｃｏＲ Ｉを用いてスクリーニ
ングし、そして目的ブラスミドをｐｔＧＡΔＲｓａ Ｉ
と称する。
ングし、そして目的ブラスミドをｐｔＧＡΔＲｓａ Ｉ
と称する。
ブラスミドｐｔＧＡΔＡｐａ Ｉを、ｐｔＧＡΔＲｓａ
Ｉから、ｇｐ７０のアミノ一端からｇｐ７０のアミノ
１７４−１７５をコードする配列におけるＡｐａ Ｉ部
位までをコードする配列を除去することにより誘導した
。ｐｔＧＡΔｐａ）を次のようにして造成した（第１０
図パート２）。
Ｉから、ｇｐ７０のアミノ一端からｇｐ７０のアミノ
１７４−１７５をコードする配列におけるＡｐａ Ｉ部
位までをコードする配列を除去することにより誘導した
。ｐｔＧＡΔｐａ）を次のようにして造成した（第１０
図パート２）。
プラスミドｐｔＧＡＲｓａ ＩをＥｃｏＲ Ｉで部分分
解（ＥｃｏＲ Ｉ ：０．０５ 〜０． ２ −Ｌ ＝
ット／ｎ ＤＮＡ， １０ 〜３０分間、３７℃）し
、そして接着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ断片）を用いてヌクレオチドトリホスフェートの存在
下で、上記のようにして修復した。
解（ＥｃｏＲ Ｉ ：０．０５ 〜０． ２ −Ｌ ＝
ット／ｎ ＤＮＡ， １０ 〜３０分間、３７℃）し
、そして接着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ断片）を用いてヌクレオチドトリホスフェートの存在
下で、上記のようにして修復した。
次に、この材料をＡｖａ Ｉにより完全消化（Ａｖａｌ
：１〜５ユニット／ｐｇ ＤＮＡ， ３０〜６０分間、
３７℃）して３．７ｋｂベクター断片を得た。この同じ
ブラスミドｐｔＧＡΔＲｓａ ＩをさらにＡｐａ Ｉに
より完全消化（Ａｐａ Ｉ ： １ 〜５−Ｌニット／
ｎ ＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）し、そして接
着末端を上記のようにして修復した。次に、単離された
２８０ｂｐＡｐａ Ｉ −Ａｖａ １断片を、前記の２
段階法によりベクターに連結し、そしてこの混合物を用
いてＥ．コリをアンピシリン耐性に形質転換した。形質
転換体を、ＥｉｃｏＲ Ｉ ／修復一Ａｐａ Ｉ ／修
復連結部におけるＥｃｏＲ Ｉの再生について、及び抗
原の発現についてスクリーニングした。修復された８ｃ
ｏＲ Ｉ及び供■部位の適切な連結がｔｒｐＬＢ’配列
とＦｅＬＶ配列とのインーフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ
）融合をもたらす。目的のブラスミドをｐｔＧＡΔ＾ｐ
ａＩと称する。
：１〜５ユニット／ｐｇ ＤＮＡ， ３０〜６０分間、
３７℃）して３．７ｋｂベクター断片を得た。この同じ
ブラスミドｐｔＧＡΔＲｓａ ＩをさらにＡｐａ Ｉに
より完全消化（Ａｐａ Ｉ ： １ 〜５−Ｌニット／
ｎ ＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）し、そして接
着末端を上記のようにして修復した。次に、単離された
２８０ｂｐＡｐａ Ｉ −Ａｖａ １断片を、前記の２
段階法によりベクターに連結し、そしてこの混合物を用
いてＥ．コリをアンピシリン耐性に形質転換した。形質
転換体を、ＥｉｃｏＲ Ｉ ／修復一Ａｐａ Ｉ ／修
復連結部におけるＥｃｏＲ Ｉの再生について、及び抗
原の発現についてスクリーニングした。修復された８ｃ
ｏＲ Ｉ及び供■部位の適切な連結がｔｒｐＬＢ’配列
とＦｅＬＶ配列とのインーフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ
）融合をもたらす。目的のブラスミドをｐｔＧＡΔ＾ｐ
ａＩと称する。
ｔ９：３−１９の造成
プラスミドｐｔ９：３−１９は、ＦｅＬＶｅｎｖ抗原の
抗原性領域を構成するｇｐ７０の１４アミノ酸を含有す
るｔｒｐＬＢ’融合蛋白質をコードする。このドメイン
の位置は、次のようにしてウィルス中和モノクローナル
抗体を用いてウィルスをマッピングすることにより決定
された。ＦＬ−７４ ＦｅＬＶのｇｐ７ｏ及びｐｌ５Ｅ
蛋白質の複合体〔シュナイダー、Ｊ．等、ジャーナル・
オブ・ビｏｏジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） （１９
８０）３３ ： ５９７−６０５により記載されたよう
にして調製される〕に対して向けられた抗体を分泌する
ハイブリドーマは、ルッッ、Ｈ．等、ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メンズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ）（１９８３）５６ ： ２０９−２２０により
記載されているようにしてｇｐ７０／ｐｌ５Ｅ複合体で
免疫されたマウスからの牌臓細胞から得られた。これら
のモノクローナル抗体のサンプルは獣医ＵＣデービス学
校（ＵＣ ＤａｖｉｓＳｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒ
ｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、医学部、二一ルスペ
ターソン博士から得られた。幾つかのモノクローナル抗
体を、ＣＣＣ ｃｌ．８１（Ｓ” ， Ｌ−）細胞を用
いるフォーカス形成試験においてＦｅＬＶを中和する能
力について試験した。ｃｌ．２５と称する１つのｇｐ７
０モノクローナル抗体は、ＰＬ−７４ ＦｅＬＶ−８を
除くすべてのＦｅＬＶサブグループの試験されたすべて
のウィルスを中和することができた。この抗体を用いて
、このモノクローナル抗体による中和に関与するｇｐ７
０分子上の部位を決定した。
抗原性領域を構成するｇｐ７０の１４アミノ酸を含有す
るｔｒｐＬＢ’融合蛋白質をコードする。このドメイン
の位置は、次のようにしてウィルス中和モノクローナル
抗体を用いてウィルスをマッピングすることにより決定
された。ＦＬ−７４ ＦｅＬＶのｇｐ７ｏ及びｐｌ５Ｅ
蛋白質の複合体〔シュナイダー、Ｊ．等、ジャーナル・
オブ・ビｏｏジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） （１９
８０）３３ ： ５９７−６０５により記載されたよう
にして調製される〕に対して向けられた抗体を分泌する
ハイブリドーマは、ルッッ、Ｈ．等、ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メンズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ）（１９８３）５６ ： ２０９−２２０により
記載されているようにしてｇｐ７０／ｐｌ５Ｅ複合体で
免疫されたマウスからの牌臓細胞から得られた。これら
のモノクローナル抗体のサンプルは獣医ＵＣデービス学
校（ＵＣ ＤａｖｉｓＳｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒ
ｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、医学部、二一ルスペ
ターソン博士から得られた。幾つかのモノクローナル抗
体を、ＣＣＣ ｃｌ．８１（Ｓ” ， Ｌ−）細胞を用
いるフォーカス形成試験においてＦｅＬＶを中和する能
力について試験した。ｃｌ．２５と称する１つのｇｐ７
０モノクローナル抗体は、ＰＬ−７４ ＦｅＬＶ−８を
除くすべてのＦｅＬＶサブグループの試験されたすべて
のウィルスを中和することができた。この抗体を用いて
、このモノクローナル抗体による中和に関与するｇｐ７
０分子上の部位を決定した。
この部位を決定するために使用した方法を第１１図に示
す。ｐＫＨＲ １をＸｈｏ Ｉ及びＢｃｏＲ Ｉにより
消化した。完全２．Ｏｋｂのエンベロープコード配列を
含有するこのプラスミドの３． １ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ
−ｐｃｏＲ Ｉ断片を単離し、そしてＭｎ’″＋の存在
下でＤＮアーゼＩで消化して、分析用アガロースゲルの
εｔａｒ染色から判定した場合に約５００〜７００ｂｐ
の質量平均分子量にした。これは末端−ラベル断片の分
析に基く約１００ｂｐの数平均分子量に相当する。
す。ｐＫＨＲ １をＸｈｏ Ｉ及びＢｃｏＲ Ｉにより
消化した。完全２．Ｏｋｂのエンベロープコード配列を
含有するこのプラスミドの３． １ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ
−ｐｃｏＲ Ｉ断片を単離し、そしてＭｎ’″＋の存在
下でＤＮアーゼＩで消化して、分析用アガロースゲルの
εｔａｒ染色から判定した場合に約５００〜７００ｂｐ
の質量平均分子量にした。これは末端−ラベル断片の分
析に基く約１００ｂｐの数平均分子量に相当する。
ヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＤＮＡポリメ
ラーゼ（κｌｅｎｏｗ断片）で処理することにより断片
を平滑末端化し、そして過剰量の３２ｐ−ラベル合成Ｅ
ｃｏＲ Ｉリンカー（ ５ ’ −” Ｐ −ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ）に連結した。ＥｃｏＲ Ｉで消化して接着末
端を形成した後、断片をセルロース（ＣＦ−１１、ワッ
トマン）上で分画してリンカーモノマー及び残留トリホ
スフェートを除去した。次にこの材料を、ファージーシ
ャロン１６中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ酸
１００４ １００５ （Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）をコードす
るＥｃｏＲ Ｉ部位に分子クローン化した。シャロン１
６ファージＤＮＡをあらかじめＥｃｏＲ Ｉで消化し、
そして５′末端を細菌アルカリ性ホスファターゼを用い
て脱リン酸化しておくことにより挿入頻度を最大にした
。３ｃｏＲ Ｉで消化されたファージＯＮ＾及びＥｃｏ
Ｒ Ｉアダプターを付された断片ＯＮ＾を連結し、そし
てステルンベルグ、Ｎ等、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９７
７） １ ：２５５−２８０により記載されているよう
にして連結混合物をインービトロでパッケージした。
ラーゼ（κｌｅｎｏｗ断片）で処理することにより断片
を平滑末端化し、そして過剰量の３２ｐ−ラベル合成Ｅ
ｃｏＲ Ｉリンカー（ ５ ’ −” Ｐ −ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ）に連結した。ＥｃｏＲ Ｉで消化して接着末
端を形成した後、断片をセルロース（ＣＦ−１１、ワッ
トマン）上で分画してリンカーモノマー及び残留トリホ
スフェートを除去した。次にこの材料を、ファージーシ
ャロン１６中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ酸
１００４ １００５ （Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）をコードす
るＥｃｏＲ Ｉ部位に分子クローン化した。シャロン１
６ファージＤＮＡをあらかじめＥｃｏＲ Ｉで消化し、
そして５′末端を細菌アルカリ性ホスファターゼを用い
て脱リン酸化しておくことにより挿入頻度を最大にした
。３ｃｏＲ Ｉで消化されたファージＯＮ＾及びＥｃｏ
Ｒ Ｉアダプターを付された断片ＯＮ＾を連結し、そし
てステルンベルグ、Ｎ等、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９７
７） １ ：２５５−２８０により記載されているよう
にして連結混合物をインービトロでパッケージした。
約３０． ０００の独立ブラークが得゜られ、プローブ
としてもとのＸｈｏ Ｉ −ＢｃｏＲ Ｉ ＦｅＬＶ断
片を用いるインーシチューブラークハイブリダイゼーシ
ョンにより判定した場合におよそ１０％が挿入部を含有
していた。Ｘ−ｇａｌを含有するプレート上に増殖した
プラークの染色パターンもまた挿入頻度を示し、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子内に挿入部を含有するファージは
白色ブラーク、又はプラークの周縁にかすかな青色の輪
を示すブラークを生成した。
としてもとのＸｈｏ Ｉ −ＢｃｏＲ Ｉ ＦｅＬＶ断
片を用いるインーシチューブラークハイブリダイゼーシ
ョンにより判定した場合におよそ１０％が挿入部を含有
していた。Ｘ−ｇａｌを含有するプレート上に増殖した
プラークの染色パターンもまた挿入頻度を示し、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子内に挿入部を含有するファージは
白色ブラーク、又はプラークの周縁にかすかな青色の輪
を示すブラークを生成した。
ｌＯ％のこのライブラリーを増幅し、そして免疫スクリ
ーニングにおいて使用した。
ーニングにおいて使用した。
ｃｌ．２５により認識される抗原決定基を含有するβ−
ガラクトシダーゼ融合蛋白質のＥ．コリでの発現を検出
する能力を評価するため、シャロン１６のＥｃｏＲ １
部位にフレーム内に完全な成熟ＦｅＬＶｇｐ８５をコー
ドする配列が融合している組換体ファージ、シャロン１
６：ＧＡを造成した。合成ポリリンカーを用いて、エン
ベローブシグナルペブチド／ｇｐ８５連結部をコードす
る配列におけるＢａｌ Ｉ部位を前記（ｐｔＧＡ）のよ
うにしてＥＣＯＲ Ｉ部位を形成するように、そしてβ
−ガラクトシダーゼのＥｃｏＲ １部位とのインーフレ
ーム融合を可能にするように適合させた。
ガラクトシダーゼ融合蛋白質のＥ．コリでの発現を検出
する能力を評価するため、シャロン１６のＥｃｏＲ １
部位にフレーム内に完全な成熟ＦｅＬＶｇｐ８５をコー
ドする配列が融合している組換体ファージ、シャロン１
６：ＧＡを造成した。合成ポリリンカーを用いて、エン
ベローブシグナルペブチド／ｇｐ８５連結部をコードす
る配列におけるＢａｌ Ｉ部位を前記（ｐｔＧＡ）のよ
うにしてＥＣＯＲ Ｉ部位を形成するように、そしてβ
−ガラクトシダーゼのＥｃｏＲ １部位とのインーフレ
ーム融合を可能にするように適合させた。
この実験からの非クローン化ファージをｃｌ．２５決定
基の発現についてスクリーニングした。抗体によって同
定されたファージの精製に続き、免疫スクリーニングの
反復及びＸ−ｇａｌを用いる染色の両方を行った。精製
されたファージは予想されたＦｅＬＶ配列を予想された
方向に含有することが示され、そしてさらにウエスタン
分析においてｃｌ．２５により検出可能な融合蛋白質を
生産することが示された（下記参照のこと）。
基の発現についてスクリーニングした。抗体によって同
定されたファージの精製に続き、免疫スクリーニングの
反復及びＸ−ｇａｌを用いる染色の両方を行った。精製
されたファージは予想されたＦｅＬＶ配列を予想された
方向に含有することが示され、そしてさらにウエスタン
分析においてｃｌ．２５により検出可能な融合蛋白質を
生産することが示された（下記参照のこと）。
ランダムＤＮＡ断片ライブラリーの最初の免疫スクリー
ニングを１００ｍｍプレート当り約１０３のブラーク密
度において行った。最も単純な仮定を用いて、この実験
においては２個プレート当り１個の免疫反応性プラーク
の予想に相当する。この予想はこれらの最初のスクリー
ニングにおいて実現した。反復される免疫スクリーニン
グのために１１個の免疫反応性プラークが選択された。
ニングを１００ｍｍプレート当り約１０３のブラーク密
度において行った。最も単純な仮定を用いて、この実験
においては２個プレート当り１個の免疫反応性プラーク
の予想に相当する。この予想はこれらの最初のスクリー
ニングにおいて実現した。反復される免疫スクリーニン
グのために１１個の免疫反応性プラークが選択された。
試験のために選択された最初の１１プラークの内１個を
除くすべてが精製を可能にする相当に確実なシグナルを
与えた。Ｘ−ｇａｌ染色パターンがこの方法においても
有用であった。免疫反応性及びＸ −ｇａｌ染色により
判定した場合、精製されたファージは均一であった。
除くすべてが精製を可能にする相当に確実なシグナルを
与えた。Ｘ−ｇａｌ染色パターンがこの方法においても
有用であった。免疫反応性及びＸ −ｇａｌ染色により
判定した場合、精製されたファージは均一であった。
免疫反応性ファージからＤＮＡを単離し、そしてこれら
の組換ファージの構造を制限エンドヌクレアーゼ分析に
より試験した。ファージＤＮＡをＢｃｏＲ Ｉで消化す
ることによっ．て挿入断片を遊離せしめ、そしてＤＮＡ
ポリメラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏｗ断片》を用いてｄＴ
ＴＰ及び” Ｐ−ｄＡＴＰにより且辺ＲＩ末端をラベル
した。ポリアクリルアミドゲル分析は、すべての免疫反
応性単離物が同一であり、すべてが１個のユニーク５
０ｂｐ ＢｃｏＲ Ｉ断片を含有していることを示した
。この知見は、スクリーニングにおいて使用された増幅
されたライブラリーの複雑さの考′慮からの予想と一致
する。
の組換ファージの構造を制限エンドヌクレアーゼ分析に
より試験した。ファージＤＮＡをＢｃｏＲ Ｉで消化す
ることによっ．て挿入断片を遊離せしめ、そしてＤＮＡ
ポリメラーゼＩ （Ｋｌｅｎｏｗ断片》を用いてｄＴ
ＴＰ及び” Ｐ−ｄＡＴＰにより且辺ＲＩ末端をラベル
した。ポリアクリルアミドゲル分析は、すべての免疫反
応性単離物が同一であり、すべてが１個のユニーク５
０ｂｐ ＢｃｏＲ Ｉ断片を含有していることを示した
。この知見は、スクリーニングにおいて使用された増幅
されたライブラリーの複雑さの考′慮からの予想と一致
する。
免疫反応性に関与する５０ｂｐ断片のＤＮＡ配列分析を
促進するため、シャロン１６：９−３のＢｃｏＲ Ｉ挿
入部位を含むファージＤＮＡの領域をブラスミドｐｕｃ
１３ （ビエイラ、Ｊ及びメッシング、Ｊ．、未公表
、ベセスダ・リサーチ・ラブス・カタログ（１９８３）
］にサブクローニングした。β−ガラクトシダーゼ遺
伝子のアミノ酸をコードするユニークＳｓｔ Ｉ部位（
第１２図）からＢｃｏＲ Ｉ部位を通って、シャロン１
６のｌａｃオペロン断片の後に位置するＰｓｔ Ｉ部位
までの領域にわたる断片。ＤＮＡ配列分析は、マクサム
及びギルバートの化学的配列決定法を用いて行われた。
促進するため、シャロン１６：９−３のＢｃｏＲ Ｉ挿
入部位を含むファージＤＮＡの領域をブラスミドｐｕｃ
１３ （ビエイラ、Ｊ及びメッシング、Ｊ．、未公表
、ベセスダ・リサーチ・ラブス・カタログ（１９８３）
］にサブクローニングした。β−ガラクトシダーゼ遺
伝子のアミノ酸をコードするユニークＳｓｔ Ｉ部位（
第１２図）からＢｃｏＲ Ｉ部位を通って、シャロン１
６のｌａｃオペロン断片の後に位置するＰｓｔ Ｉ部位
までの領域にわたる断片。ＤＮＡ配列分析は、マクサム
及びギルバートの化学的配列決定法を用いて行われた。
配列は、εｃｏＲ Ｉクローニング部位の３′に隣接す
るＰｖｕ Ｉ１部位から読まれた。
るＰｖｕ Ｉ１部位から読まれた。
配列分析は、合成ＥｃｏＲ Ｉ ！ｊンカー配列を両端
に有するＧＡ − ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の４３
ｂｐの挿入部を示す。これはｇｐ７０をコードするｅｎ
ｖ遺伝子の領域のヌクレオチド６３５−６７８を示し、
そしてβ−ガラクトシダーゼ配列の上流及び下流の両方
と共にインーフレーム融合蛋白質を生じさせるように存
在する。コードされたｇｐ７０断片（ｇｐ７０のアミノ
酸２１３−２２６）の配列を第１２図に示す。配列中の
大文字はＦｅＬＶ配列を示す。λ−シャロン１６：９−
３ヌクレオチド配列中の剣印はＴ−Ｃ変異を示す。
に有するＧＡ − ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の４３
ｂｐの挿入部を示す。これはｇｐ７０をコードするｅｎ
ｖ遺伝子の領域のヌクレオチド６３５−６７８を示し、
そしてβ−ガラクトシダーゼ配列の上流及び下流の両方
と共にインーフレーム融合蛋白質を生じさせるように存
在する。コードされたｇｐ７０断片（ｇｐ７０のアミノ
酸２１３−２２６）の配列を第１２図に示す。配列中の
大文字はＦｅＬＶ配列を示す。λ−シャロン１６：９−
３ヌクレオチド配列中の剣印はＴ−Ｃ変異を示す。
ｃｌ．２５により認識される抗原決定基はこの１４アミ
ノ酸領域に含まれている。
ノ酸領域に含まれている。
この５ ０ ｂｐＥｃｏＲ Ｉ断片をｐｔｒｐＬＥ’の
εｃｏＲ Ｉ部位に分子クローン化して第１３図に示す
ようにｔｒｐＬＥ ’との融合蛋白質として抗原決定基
の発現を得た。
εｃｏＲ Ｉ部位に分子クローン化して第１３図に示す
ようにｔｒｐＬＥ ’との融合蛋白質として抗原決定基
の発現を得た。
サブクローニングブラスミドｐＵｃ１３：９−３をＥｃ
ｏＲ Ｉにより完全消化（ＥｃｏＲ Ｉ ： １〜５ユ
ニット／ｔａｒ ＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）
してεｃｏＲ Ｉ一断片を遊離せしめ、そしてＨａｅ
ｍで消化（ＨａｅｌＩＩ ： １〜５ユニット／ｘ−
ＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）してｐＵｃ １３
ベクターを不活性化した。次に、この混合物を、あらか
じめＢｃｏＲ Ｉにより完全消化されているｐｔｒｐＬ
Ｂ’に連結（Ｔ４！ｊガーゼ：分子間接着末端）し、そ
してこれを用いてＥ．コリをアンピシリン耐性に形質転
換した。形質転換体を、ｃｌ．２５を用いる発現された
蛋白質の免疫的分析によって（下記）抗原を検出するこ
とによって、ｃｌ．２５決定基の出現についてスクリー
ニングした。幾つかの単離物は１個の挿入されたＥｃｏ
Ｒ Ｉ断片を示すサイズの抗原性融合蛋白質を含有する
ことが見出され、１個の単離物ｐｔ９：３−１９は２個
の挿入部を含有し、そして高度に抗原性であることが見
出された。
ｏＲ Ｉにより完全消化（ＥｃｏＲ Ｉ ： １〜５ユ
ニット／ｔａｒ ＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）
してεｃｏＲ Ｉ一断片を遊離せしめ、そしてＨａｅ
ｍで消化（ＨａｅｌＩＩ ： １〜５ユニット／ｘ−
ＤＮＡ， ３０〜６０分間、３７℃）してｐＵｃ １３
ベクターを不活性化した。次に、この混合物を、あらか
じめＢｃｏＲ Ｉにより完全消化されているｐｔｒｐＬ
Ｂ’に連結（Ｔ４！ｊガーゼ：分子間接着末端）し、そ
してこれを用いてＥ．コリをアンピシリン耐性に形質転
換した。形質転換体を、ｃｌ．２５を用いる発現された
蛋白質の免疫的分析によって（下記）抗原を検出するこ
とによって、ｃｌ．２５決定基の出現についてスクリー
ニングした。幾つかの単離物は１個の挿入されたＥｃｏ
Ｒ Ｉ断片を示すサイズの抗原性融合蛋白質を含有する
ことが見出され、１個の単離物ｐｔ９：３−１９は２個
の挿入部を含有し、そして高度に抗原性であることが見
出された。
ブラスミドｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉ ， ｐｔＧＡΔＡｐ
ａＩ，及びｐｔ９：３−１９により形質転換されたＥ．
コリＫ１２株ＭＭ ２９４− １のサンプルは、アメリ
カン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）
、１２３０１パークラウンドライブ、ロックビレ、メリ
ーランドに寄託された。これらの寄託日及び寄託番号を
下に記す。
ａＩ，及びｐｔ９：３−１９により形質転換されたＥ．
コリＫ１２株ＭＭ ２９４− １のサンプルは、アメリ
カン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）
、１２３０１パークラウンドライブ、ロックビレ、メリ
ーランドに寄託された。これらの寄託日及び寄託番号を
下に記す。
サンプル 寄 託 日 ＾ＴＣＣ受託番号ｐ
ｔＧＡΔＡｖａ Ｉ １９８３年１２月２日
３９５２８ｐｔＧＡΔＡｐａ Ｉ １９８３
年１２月２日 ３９５２９ｐｔ ９ ： ３ −
１９ １９８３年１２月２日 ３９５３０こ
れらの寄託はブダペスト条約のもとになされており、そ
してその規定に従って維持され、そして入手可能にされ
るであろう。
ｔＧＡΔＡｖａ Ｉ １９８３年１２月２日
３９５２８ｐｔＧＡΔＡｐａ Ｉ １９８３
年１２月２日 ３９５２９ｐｔ ９ ： ３ −
１９ １９８３年１２月２日 ３９５３０こ
れらの寄託はブダペスト条約のもとになされており、そ
してその規定に従って維持され、そして入手可能にされ
るであろう。
培養
ｔｒｐＬＥ’融合プラスミドを含有するＥ．コリは、典
型的にはＭ９最小培地（マニアチス等、前掲）＋グルコ
ース（０．２％） 、１，ｑ／−Ｂ＋ 、カザミノ酸（
０．５％、木炭処理）、トリブトファン（１００■／ｍ
ｅ）及びアンピシリン（５０ｘ／ｍｊ）中で非誘導条件
下で増殖せしめる。Ｅ．コリ細胞はｔｒｐＬＢ’融合蛋
白質を発現するために種々の方法により誘導され、この
方にはａ）増殖細胞をトリブトファンを欠く上記の培地
に洗い込む方法、ｂ）増殖細胞を限定的なトリプトファ
ン、例えば２〜５■／一を含有する上記培地に洗い込む
方法、又はＣ）例えば発酵槽中で、増殖によってトリブ
トファンの供給が涸渇するように培養する方法が含まれ
る。
型的にはＭ９最小培地（マニアチス等、前掲）＋グルコ
ース（０．２％） 、１，ｑ／−Ｂ＋ 、カザミノ酸（
０．５％、木炭処理）、トリブトファン（１００■／ｍ
ｅ）及びアンピシリン（５０ｘ／ｍｊ）中で非誘導条件
下で増殖せしめる。Ｅ．コリ細胞はｔｒｐＬＢ’融合蛋
白質を発現するために種々の方法により誘導され、この
方にはａ）増殖細胞をトリブトファンを欠く上記の培地
に洗い込む方法、ｂ）増殖細胞を限定的なトリプトファ
ン、例えば２〜５■／一を含有する上記培地に洗い込む
方法、又はＣ）例えば発酵槽中で、増殖によってトリブ
トファンの供給が涸渇するように培養する方法が含まれ
る。
幾つかの場合には、トリブトファンの存在下で細胞が部
分的に誘導されることが見出される。さらに、これらの
細胞はしばしば誘導された条件下でよりも大きな比率の
非分解誘導蛋白質を含有していた。同様の結果が富培地
での一夜培養においてしばしば得られる。
分的に誘導されることが見出される。さらに、これらの
細胞はしばしば誘導された条件下でよりも大きな比率の
非分解誘導蛋白質を含有していた。同様の結果が富培地
での一夜培養においてしばしば得られる。
ｔｒ ＬＢ’融合蛋白質の検出
上記の方法のいずれかによるｔｒｐＬε’ −ＦｅＬＶ
融合蛋白質の誘導は、プラスミドを担持する細胞内での
高屈折性の粒子の出現をもたらす。これらの粒子は顕微
鏡中で相光学（１２５０ Ｘ ）を用いて観察すること
ができ、そしてＬＥ’融合蛋白質の合成に特徴的である
。
融合蛋白質の誘導は、プラスミドを担持する細胞内での
高屈折性の粒子の出現をもたらす。これらの粒子は顕微
鏡中で相光学（１２５０ Ｘ ）を用いて観察すること
ができ、そしてＬＥ’融合蛋白質の合成に特徴的である
。
発現された蛋白質の特徴付け
プラスミドを含有する細胞の蛋白質生成物をＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＢ ＣレムリＵ．κ．，ネイチュアー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）（１９７０）２２７ ： ６８０）により分析した
。誘導条件下又は非誘導条件下で増殖した細胞を電気泳
動に先立って超音波処理し、そしてサンプル緩衝液中で
煮沸した。第１４図は、ｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉ ， ｐ
ｔＧＡΔＡｐａ Ｉ及びｐｔ９：３−１９プラスミドを
含む細胞からの蛋白質生成物のクマーシーブルー染色し
たゲルを示す。ｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉプラスミドは予想
される４６ｋｄ蛋白質をコードし、一層小さい分解生成
物が観察される。ｐｔＧＡΔＡｐａ Ｉブラスミドは３
６ｋｄ蛋白質をコードし、一層小さい分解生成物が観察
される。
ＡＧＢ ＣレムリＵ．κ．，ネイチュアー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）（１９７０）２２７ ： ６８０）により分析した
。誘導条件下又は非誘導条件下で増殖した細胞を電気泳
動に先立って超音波処理し、そしてサンプル緩衝液中で
煮沸した。第１４図は、ｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉ ， ｐ
ｔＧＡΔＡｐａ Ｉ及びｐｔ９：３−１９プラスミドを
含む細胞からの蛋白質生成物のクマーシーブルー染色し
たゲルを示す。ｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉプラスミドは予想
される４６ｋｄ蛋白質をコードし、一層小さい分解生成
物が観察される。ｐｔＧＡΔＡｐａ Ｉブラスミドは３
６ｋｄ蛋白質をコードし、一層小さい分解生成物が観察
される。
ｐｔ９：３−１９プラスミドは２５ｋｄ融合蛋白質をコ
ードする。
ードする。
これらの蛋白質生成物を、トウビン等、ＰＮＡＳ（１９
７９）７６ ： ４３５０により最初に記載された方法
の変法を用いてウエスタン分析により免疫的に分析した
。蛋白質をＳＯＳ−ＰＡＧＢにより分離し、そしてこの
パターンを固体支持体、例えばＣＮＢｒ活性化紙に電気
泳動的に移す。次に、この紙を特異的抗体、例えばＦｅ
ＬＶｇｐ７０に対する抗体と反応せしめ、抗体と反応す
る蛋白質バンドを、例えば１２５■−ラベルースタフィ
ロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓｕ
）プロテインＡを用いて可視化する〔イバリエ及びジョ
ネス，アナリテイカル・バイオケミストリ−（Ａｎａｌ
， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ） （１９７９） ９７ ：
２４］ ． ｃｌ． ２５又はヤギ抗−ＦｅＬＶｇｌｌ
７０抗体を用いて、第１４図において観察される蛋白質
生成物がＦｅＬＶ’ ｇｐ７０蛋白質配列を含有するこ
とが確認された。
７９）７６ ： ４３５０により最初に記載された方法
の変法を用いてウエスタン分析により免疫的に分析した
。蛋白質をＳＯＳ−ＰＡＧＢにより分離し、そしてこの
パターンを固体支持体、例えばＣＮＢｒ活性化紙に電気
泳動的に移す。次に、この紙を特異的抗体、例えばＦｅ
ＬＶｇｐ７０に対する抗体と反応せしめ、抗体と反応す
る蛋白質バンドを、例えば１２５■−ラベルースタフィ
ロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓｕ
）プロテインＡを用いて可視化する〔イバリエ及びジョ
ネス，アナリテイカル・バイオケミストリ−（Ａｎａｌ
， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ） （１９７９） ９７ ：
２４］ ． ｃｌ． ２５又はヤギ抗−ＦｅＬＶｇｌｌ
７０抗体を用いて、第１４図において観察される蛋白質
生成物がＦｅＬＶ’ ｇｐ７０蛋白質配列を含有するこ
とが確認された。
ＦｅＬＶ抗原の精製
ｐｔＧＡを含有する誘導された細胞からの屈折性粒子を
遠心分離により精製した。細胞を、５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ ， ｐＨ８． ０ ． ５ｍＭ ＥＰＴＡ ，
１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．２％ＮＰ−４０を含
有する緩衝液中に懸濁し、そして超音波処理した。溶解
物を低速心遠にかけ、ＦｅＬＶ抗原の粒子を主として含
有するペレットを、再懸濁、超音波処理及び遠心分離の
数回のサイクルにより洗浄した。最終生成物は緩衝液に
再懸濁することができ、又は還元剤の存在下もしくは非
存在下で１％ＳＤＳにより可溶化することができる。
遠心分離により精製した。細胞を、５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ ， ｐＨ８． ０ ． ５ｍＭ ＥＰＴＡ ，
１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．２％ＮＰ−４０を含
有する緩衝液中に懸濁し、そして超音波処理した。溶解
物を低速心遠にかけ、ＦｅＬＶ抗原の粒子を主として含
有するペレットを、再懸濁、超音波処理及び遠心分離の
数回のサイクルにより洗浄した。最終生成物は緩衝液に
再懸濁することができ、又は還元剤の存在下もしくは非
存在下で１％ＳＤＳにより可溶化することができる。
抗原はさらに可溶化された全細胞溶解物から調製された
。誘導された細胞を５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｆｌ［Ｊ！
ｐＨ ７ ． １ ０ｍＭ ８ＤＴＡ ， ５ ０ｍＭ
ＤＴＴ及び２％ＳロＳを含有する緩衝液中で超音波処
理する。溶解物を短時間加熱（１００℃／５分）して蛋
白質を十分に変性せしめ、そして不溶性破片を遠心分離
により除去する。次にこの溶解物をゲル濾過クロマトグ
ラフ４−（５ ０ｍＭ ＮａＯＡｃ，ｐＨ５．５ ，
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ， ２ｍＭ ＤＴＴ及び０．１％
ＳＯＳを含有する緩衝液中をセフアクリルＳ−２００）
により画分し、そして２Ｑｋｄのすべての両分をプール
しそして濃縮した。
。誘導された細胞を５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｆｌ［Ｊ！
ｐＨ ７ ． １ ０ｍＭ ８ＤＴＡ ， ５ ０ｍＭ
ＤＴＴ及び２％ＳロＳを含有する緩衝液中で超音波処
理する。溶解物を短時間加熱（１００℃／５分）して蛋
白質を十分に変性せしめ、そして不溶性破片を遠心分離
により除去する。次にこの溶解物をゲル濾過クロマトグ
ラフ４−（５ ０ｍＭ ＮａＯＡｃ，ｐＨ５．５ ，
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ， ２ｍＭ ＤＴＴ及び０．１％
ＳＯＳを含有する緩衝液中をセフアクリルＳ−２００）
により画分し、そして２Ｑｋｄのすべての両分をプール
しそして濃縮した。
免疫に先立って、すべてのＳＯＳ含有サンプルを最＃
ＳＯＳ濃度が０．１％になるまで透析する。高い％のＳ
ＯＳ中に可溶化した後、蛋白質は０．１％ＳＯＳ中に可
溶である。
ＳＯＳ濃度が０．１％になるまで透析する。高い％のＳ
ＯＳ中に可溶化した後、蛋白質は０．１％ＳＯＳ中に可
溶である。
約０．１〜２０■の蛋白質を適当なアジュバント（完全
フロインドアジニバント、不完全フロインドアジュバン
ト、水酸化アルミニウム、又は合成アジュバント）と混
合し、そしてネコに接種するのに使用する。
フロインドアジニバント、不完全フロインドアジュバン
ト、水酸化アルミニウム、又は合成アジュバント）と混
合し、そしてネコに接種するのに使用する。
ｇ７０及びｐｇ７０ − １５［Ｅ連結部配列の合成及
び担体蛋白質への連結 ＳＡＭ ＩＩ自動ベプチド合成機（ビオサーチ社、サン
ラファエル，カリホルニア）を用いて次のボリペプチド
を合成した。
び担体蛋白質への連結 ＳＡＭ ＩＩ自動ベプチド合成機（ビオサーチ社、サン
ラファエル，カリホルニア）を用いて次のボリペプチド
を合成した。
ペプチド■
Ｈ −ｃｙｓ ａｓｐ ｌｙｓ ｔｈｒ ｖａｌ ａｒ
ｇ ｌｅｕ ａｒｇ ａｒｇ ｇｌｕｐｒｏ ｉｌｅ
ｓｅｒ Ｉｅｕ−ＯＨペブチド■ Ｈ −ｃｙｓ ｐｒｏ ｇｌｕ ｔｙｒ ｖａｌ ｔｙ
ｒ ｔｈｒ ｈｉｓ ｐｈｅ ａｓｐｌｙｓ ｔｈｒ
ｖａｌ ａｒｇ ｌｅｕ −ＤＨベプチド■ Ｈ −ｃｙｓ ｍｅｔ ｇｌｙ ｐｒｏ ａｓｎ Ｉｅ
ｕ ｖａｌ ｌｅｕ ｐｒｏ ａｓｐｇｌｎ ｌｙｓ
ｐｒｏ ｐｒｏ ｓｅｒ−ＤＨペブチド■ Ｈ −ａｓｐ ｇｌｎ ｌｙｓ ｐｒｏ ｐｒｏ ｓｅ
ｒ ａｒｇ ｇｉｎ ｓｅｒ ｇｉｎｉ１ｅ ｇｌｕ
ｃｙｓ ｓｅｒ −ＯＨこれらのポリペプチドとウシ血
清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン又は
ブタチログロプリンとの接合体を次のようにして製った
。
ｇ ｌｅｕ ａｒｇ ａｒｇ ｇｌｕｐｒｏ ｉｌｅ
ｓｅｒ Ｉｅｕ−ＯＨペブチド■ Ｈ −ｃｙｓ ｐｒｏ ｇｌｕ ｔｙｒ ｖａｌ ｔｙ
ｒ ｔｈｒ ｈｉｓ ｐｈｅ ａｓｐｌｙｓ ｔｈｒ
ｖａｌ ａｒｇ ｌｅｕ −ＤＨベプチド■ Ｈ −ｃｙｓ ｍｅｔ ｇｌｙ ｐｒｏ ａｓｎ Ｉｅ
ｕ ｖａｌ ｌｅｕ ｐｒｏ ａｓｐｇｌｎ ｌｙｓ
ｐｒｏ ｐｒｏ ｓｅｒ−ＤＨペブチド■ Ｈ −ａｓｐ ｇｌｎ ｌｙｓ ｐｒｏ ｐｒｏ ｓｅ
ｒ ａｒｇ ｇｉｎ ｓｅｒ ｇｉｎｉ１ｅ ｇｌｕ
ｃｙｓ ｓｅｒ −ＯＨこれらのポリペプチドとウシ血
清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン又は
ブタチログロプリンとの接合体を次のようにして製った
。
１１ｍｇのＮ−マレイミドー６−アミノカプロイルー２
′一二トロ−４′−スルホン酸ナトリウム塩を６ｍｉの
０．１ Ｍホスフェート、ｐＨ７．５、中２２■の担体
蛋白質の溶液に加える。１５分後、この溶液を０．１Ｍ
ホスフエート、ｐＨ ６ 、中セファデックスＧ−２５
カラム上でクロマトグラフ処理する。蛋白質含有画分を
プールし、１８ｍｇのポリペプチドで処理する。反応を
一夜行い、溶液を６１！の水に対して透析し、０．０１
Ｎ ＮＨ．ＤＨ中セファデックスＧ−５０カラム上でク
ロマトグラフ処理し、凍結乾燥し、そして分析する。
゛ 約０．１〜２０ｍｇの各接合体をアジ二バンドと混合し
、試験動物を免疫するために使用する。
′一二トロ−４′−スルホン酸ナトリウム塩を６ｍｉの
０．１ Ｍホスフェート、ｐＨ７．５、中２２■の担体
蛋白質の溶液に加える。１５分後、この溶液を０．１Ｍ
ホスフエート、ｐＨ ６ 、中セファデックスＧ−２５
カラム上でクロマトグラフ処理する。蛋白質含有画分を
プールし、１８ｍｇのポリペプチドで処理する。反応を
一夜行い、溶液を６１！の水に対して透析し、０．０１
Ｎ ＮＨ．ＤＨ中セファデックスＧ−５０カラム上でク
ロマトグラフ処理し、凍結乾燥し、そして分析する。
゛ 約０．１〜２０ｍｇの各接合体をアジ二バンドと混合し
、試験動物を免疫するために使用する。
前記の融合蛋白質及びペプチドー担体蛋白質接合体をネ
コ及びモルモットにおいて次のようにしてＦｅＬＶワク
チンとして試験する。
コ及びモルモットにおいて次のようにしてＦｅＬＶワク
チンとして試験する。
ネコの試験：免疫原性及び有効性
ポリペプチドによりワクチン処理されたネコの血清中に
おける抗−ｇｌ）７０抗体及びＦｅＬＶ中和抗体の存在
を決定することにより免疫原性を評価することができる
。ワクチン処理されたネコに対するＦｅＬＶの効果を観
察することによって免疫保護を評価することができる。
おける抗−ｇｌ）７０抗体及びＦｅＬＶ中和抗体の存在
を決定することにより免疫原性を評価することができる
。ワクチン処理されたネコに対するＦｅＬＶの効果を観
察することによって免疫保護を評価することができる。
若いＦｅＬＶ不含ネコを使用する。免疫処理に先立って
０日目に採血しそして約２ｍｌの血清をワクチン処理前
対照として集める。所定量のポリペプチド標品を外大腿
筋肉に筋肉内注射する。ネコを０日、２１日及び４２日
目１こ免疫し、そして７日、１４日、２１日、２８日、
３５日及び４２日目に採血して試験血清を得る。
０日目に採血しそして約２ｍｌの血清をワクチン処理前
対照として集める。所定量のポリペプチド標品を外大腿
筋肉に筋肉内注射する。ネコを０日、２１日及び４２日
目１こ免疫し、そして７日、１４日、２１日、２８日、
３５日及び４２日目に採血して試験血清を得る。
免疫原性は抗ＦｅＬＶｇｐ７０抗体のＥＬＩＳＡ測定に
より次のようにして決定した。イムロン■ミクロタイタ
ープレート（ダイナテク）に精製されたＦｅＬＶｇｌ）
７０を３７℃にて３時間被覆する。１００Ｉの被覆緩衝
液（０． １ Ｍ ＮａｚＣ［ｌａ ．０．０２％Ｎａ
Ｎｓ ， ｐＨ ９． ６ ）中ウエル当り５ ０ｎｇ
の蛋白質を使用する。次に、プレートを４℃にて一夜貯
蔵する。数週間安定である。プレートをＢＬＩＳＡ洗浄
液（０．１５Ｍ０．０５％トウィーン２０）で３回洗浄
し、そして１００ Ｊｌｌの実験動物血清を緩衝液３（
緩衡液３ ＝０．１５Ｍ ＮａＣＡ！ ，０．００１Ｍ
ＢＤＴＡ ， ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ，
ｐＨ７． ４ ，０．０５％トウィーン２０）中に稀釈
（通常１：５０）し、ｇｌｌ７０を被覆したウエルに加
え、そして３７℃にて一時間インキユベートした。
より次のようにして決定した。イムロン■ミクロタイタ
ープレート（ダイナテク）に精製されたＦｅＬＶｇｌ）
７０を３７℃にて３時間被覆する。１００Ｉの被覆緩衝
液（０． １ Ｍ ＮａｚＣ［ｌａ ．０．０２％Ｎａ
Ｎｓ ， ｐＨ ９． ６ ）中ウエル当り５ ０ｎｇ
の蛋白質を使用する。次に、プレートを４℃にて一夜貯
蔵する。数週間安定である。プレートをＢＬＩＳＡ洗浄
液（０．１５Ｍ０．０５％トウィーン２０）で３回洗浄
し、そして１００ Ｊｌｌの実験動物血清を緩衝液３（
緩衡液３ ＝０．１５Ｍ ＮａＣＡ！ ，０．００１Ｍ
ＢＤＴＡ ， ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ，
ｐＨ７． ４ ，０．０５％トウィーン２０）中に稀釈
（通常１：５０）し、ｇｌｌ７０を被覆したウエルに加
え、そして３７℃にて一時間インキユベートした。
？レートをＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄し、３７℃にて
４５分間、ホースラディッシュに接合したラビット抗−
ネコ抗体の緩衝液３中１ ： ２００稀釈物１００ｍ／
ウエルと反応せしめる。
４５分間、ホースラディッシュに接合したラビット抗−
ネコ抗体の緩衝液３中１ ： ２００稀釈物１００ｍ／
ウエルと反応せしめる。
プレートをＥＬＩＳＡ洗浄液により３回洗浄し、そして
１００ＪＩｌの基質溶液（５ｍＡ’，０．０５Ｍクエン
酸、ｐＨ４、＋２０ＪＪ１の２７．４５ｍｇ／ｍｌＡＢ
ＴＳ＋２０ｕｌの２％Ｈ２０■）と、バックグラウンド
発色に対するシグナルが適当になるまで反応せしめる。
１００ＪＩｌの基質溶液（５ｍＡ’，０．０５Ｍクエン
酸、ｐＨ４、＋２０ＪＪ１の２７．４５ｍｇ／ｍｌＡＢ
ＴＳ＋２０ｕｌの２％Ｈ２０■）と、バックグラウンド
発色に対するシグナルが適当になるまで反応せしめる。
０．２ ＭＨＦにより反応を停止し、そして４０５０ｍ
における光学濃度を決定する。
における光学濃度を決定する。
ネコ血清中のウィルス中和抗体をフォーカス形成アッセ
イにより次のようにして決定する。クローン８１細胞は
不完全なネズミ肉腫ウィルスゲノムを含有する。細胞に
ＦｅＬＶが感染した後、非一不完全ＦｅＬＶが肉腫ウィ
ルスの発現、及びそれ故に形質転換された細胞の表現形
質の出現を可能にする。
イにより次のようにして決定する。クローン８１細胞は
不完全なネズミ肉腫ウィルスゲノムを含有する。細胞に
ＦｅＬＶが感染した後、非一不完全ＦｅＬＶが肉腫ウィ
ルスの発現、及びそれ故に形質転換された細胞の表現形
質の出現を可能にする。
形質転換された細胞は局所的に蓄積するため、フォーカ
スが出現する。使用される方法はフィシンジャ一等、ジ
ャーナル・オブ・ビロロギー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ）
（１９７４） １４ ： １７７−１７９からのもので
ある。組織培養皿に、１５％の加熱不活性化ウシ胎児血
清及び５０Ｉｌｇ／ｒｎｌのゼンタマイシンを補充した
マッコイ５Ａ培地５一中２ＸＩＱＳｃｃｃクローン８１
（Ｓ＋Ｌ−）細胞を−１日目に接種する。皿を５％ＣＯ
２加湿インキニベーター中で３７℃にてインキコベート
する。０日目に、細胞を１ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラ
ン（２５ｘ／ｍｌ培地）で３７℃にて１時間処理する。
スが出現する。使用される方法はフィシンジャ一等、ジ
ャーナル・オブ・ビロロギー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ）
（１９７４） １４ ： １７７−１７９からのもので
ある。組織培養皿に、１５％の加熱不活性化ウシ胎児血
清及び５０Ｉｌｇ／ｒｎｌのゼンタマイシンを補充した
マッコイ５Ａ培地５一中２ＸＩＱＳｃｃｃクローン８１
（Ｓ＋Ｌ−）細胞を−１日目に接種する。皿を５％ＣＯ
２加湿インキニベーター中で３７℃にてインキコベート
する。０日目に、細胞を１ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラ
ン（２５ｘ／ｍｌ培地）で３７℃にて１時間処理する。
細胞を２ｒｒＬｌの培地で１回洗浄する。洗浄され処理
された細胞に、小容量（０．２〜０．５ｍｊ！）のウィ
ルス含有ストックの２倍ごとの稀釈物を３７℃にて６０
分間、間欠的にゆり動かしながら感染させる。培地（５
ｍｌ）を皿に加え、そして３７℃にてインキニベーショ
ンを続ける。培地を１日、４日、８日、及び１２日後に
交換する。１０〜１４日後にフォーカスを計数する。
された細胞に、小容量（０．２〜０．５ｍｊ！）のウィ
ルス含有ストックの２倍ごとの稀釈物を３７℃にて６０
分間、間欠的にゆり動かしながら感染させる。培地（５
ｍｌ）を皿に加え、そして３７℃にてインキニベーショ
ンを続ける。培地を１日、４日、８日、及び１２日後に
交換する。１０〜１４日後にフォーカスを計数する。
ウィルス中和抗体の存在を、外来性補体の存在下又は非
存在下で、既知量のウィルスをネコ血清と共にインキユ
ベートした後の感染性ウィルス力価の低下から決定する
。ＣＣＣクローン８１（Ｓ＋？−）細胞を６０ｍｍの組
織培養皿に、−１日目に、５−の培地中皿当り２Ｘ１０
５細胞で接種し、そして５％ＣＯ■加湿インキュベータ
中３７℃にてインキユベートする。血清サンプルを５６
℃にて６０分間熱不活性化する。血清の１００４のアリ
コートを培地中に４倍ごとに逐次稀釈する。すべてのサ
ンプル稀釈物に、５０〜１００フォーカス誘発ユニツ｝
（Ｆｌｕ）を含有するように稀釈されたストックウィル
スｌＯＯＩＩｌを加える。ウィルスー抗体混合物の２重
ウエルに、５０Ｉ１１の１：１０稀釈のラビット補体ｌ
：５０最終稀釈を加える。これらの反応物を３７℃にて
６０分間インキニベートする。８１細胞を１ｒｎｌのＤ
ＥＡＥ−デキストラン（２５ｍｇ／ｍｊ！培地中）で３
７℃にて６０分間処理し、２−の培地で１回洗浄し、次
に間欠的にゆり動かしながらウィルスー抗体混合物を３
７℃にて６０分間感染せしめる。培地（５ｍｌ）を加え
、そして皿を３７℃にて１０〜１４日間、１日、４日、
８日、及び１２日目に培地を交換しながらインキニベー
トする。フォーカスを計数し、そして血清サンプルの中
和力価を、インプットウィルスＦｌｕ力価の５０％の低
下を生じさせる血清稀釈として決定する。
存在下で、既知量のウィルスをネコ血清と共にインキユ
ベートした後の感染性ウィルス力価の低下から決定する
。ＣＣＣクローン８１（Ｓ＋？−）細胞を６０ｍｍの組
織培養皿に、−１日目に、５−の培地中皿当り２Ｘ１０
５細胞で接種し、そして５％ＣＯ■加湿インキュベータ
中３７℃にてインキユベートする。血清サンプルを５６
℃にて６０分間熱不活性化する。血清の１００４のアリ
コートを培地中に４倍ごとに逐次稀釈する。すべてのサ
ンプル稀釈物に、５０〜１００フォーカス誘発ユニツ｝
（Ｆｌｕ）を含有するように稀釈されたストックウィル
スｌＯＯＩＩｌを加える。ウィルスー抗体混合物の２重
ウエルに、５０Ｉ１１の１：１０稀釈のラビット補体ｌ
：５０最終稀釈を加える。これらの反応物を３７℃にて
６０分間インキニベートする。８１細胞を１ｒｎｌのＤ
ＥＡＥ−デキストラン（２５ｍｇ／ｍｊ！培地中）で３
７℃にて６０分間処理し、２−の培地で１回洗浄し、次
に間欠的にゆり動かしながらウィルスー抗体混合物を３
７℃にて６０分間感染せしめる。培地（５ｍｌ）を加え
、そして皿を３７℃にて１０〜１４日間、１日、４日、
８日、及び１２日目に培地を交換しながらインキニベー
トする。フォーカスを計数し、そして血清サンプルの中
和力価を、インプットウィルスＦｌｕ力価の５０％の低
下を生じさせる血清稀釈として決定する。
免疫保護を、ＦｅＬＶでチャレンジされたワクチン処理
体における接続的ウィルス血症についての８ＬＩＳＡア
ッセイにより測定する。方法は次の通りである。実質的
な抗−ｇｐ７０抗体が出現した後、５Ｘ１０６個の生Ｆ
Ｆ６４／ＳＴ−ＦｅＳＶで形質転換されたネコの線維芽
細胞の皮下注射によりネコをチャレンジする。ＦｅＬＶ
コアー蛋白質ｐ２７を認識する幾つかのマウスモノクロ
ーナル抗体を使用して該蛋白質のレベルを測定するＥＬ
ＩＳＡによりウィルス血症を毎週測定する《ルッツ、Ｈ
．等、前掲）。
体における接続的ウィルス血症についての８ＬＩＳＡア
ッセイにより測定する。方法は次の通りである。実質的
な抗−ｇｐ７０抗体が出現した後、５Ｘ１０６個の生Ｆ
Ｆ６４／ＳＴ−ＦｅＳＶで形質転換されたネコの線維芽
細胞の皮下注射によりネコをチャレンジする。ＦｅＬＶ
コアー蛋白質ｐ２７を認識する幾つかのマウスモノクロ
ーナル抗体を使用して該蛋白質のレベルを測定するＥＬ
ＩＳＡによりウィルス血症を毎週測定する《ルッツ、Ｈ
．等、前掲）。
捕捉抗体（ｃａｔｃｈｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ） （
幾つかのマウスモノクローナル抗−ｐ２７抗体からのＩ
ｇＧ画分のプール）を被覆緩衝液（０． １ Ｍ Ｎａ
ＣＯｓ ． ０．０２％ＮａＮ３．ｐＨ９．６）中に５
ｔｔｇ ／ ｒｎｌに稀釈した。イムロン■ミクロタ
イタープレート（ダイナテク）．の各ウエルに１００４
を加え、そして３７℃にて３時間インキユベートシ、次
に４℃にて一夜インキユベートする。被覆されたプレー
トをＥＬＩＳＡ洗浄液（０．１５ＭＮａＣｆ ． ０．
０５％トウィーン２０）で３回洗浄し、そして蒸留水で
１回洗浄する。密封しそして−２０℃で貯蔵する。サン
プルを０．１３％のトウィーン２０を含有する緩衝液３
中に１＝４に稀釈する。ｐＨを調整した後ＢＳＡを０．
１％に添加する。被覆されそして洗浄されたプレートの
２重のウエルに１００１の稀釈されたサンプルを加える
。精製されたｐ２７のスタンダード曲線、１００Ｉの緩
衝液３＋０６１％トウィーン２０中０−５０ｎｇ／ウエ
ルを含む。３７℃にて６０分間インキユベートする。
幾つかのマウスモノクローナル抗−ｐ２７抗体からのＩ
ｇＧ画分のプール）を被覆緩衝液（０． １ Ｍ Ｎａ
ＣＯｓ ． ０．０２％ＮａＮ３．ｐＨ９．６）中に５
ｔｔｇ ／ ｒｎｌに稀釈した。イムロン■ミクロタ
イタープレート（ダイナテク）．の各ウエルに１００４
を加え、そして３７℃にて３時間インキユベートシ、次
に４℃にて一夜インキユベートする。被覆されたプレー
トをＥＬＩＳＡ洗浄液（０．１５ＭＮａＣｆ ． ０．
０５％トウィーン２０）で３回洗浄し、そして蒸留水で
１回洗浄する。密封しそして−２０℃で貯蔵する。サン
プルを０．１３％のトウィーン２０を含有する緩衝液３
中に１＝４に稀釈する。ｐＨを調整した後ＢＳＡを０．
１％に添加する。被覆されそして洗浄されたプレートの
２重のウエルに１００１の稀釈されたサンプルを加える
。精製されたｐ２７のスタンダード曲線、１００Ｉの緩
衝液３＋０６１％トウィーン２０中０−５０ｎｇ／ウエ
ルを含む。３７℃にて６０分間インキユベートする。
プレートをＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄する。特定の接
合体について決定されたように、接合した抗体（ホース
ラディッシュパーオヰシダーゼに接合した２つのマウス
抗−ＦｅＬＶ ｐ２７抗体のプール）を稀釈し、そして
１００Ｉを各ウエルに加える。３７℃にて３０〜６０分
間インキコベートする。プレートをＢＬＩＳＡ洗浄液で
３回洗浄する。各ウエルに１０ロバの基質溶液（５ｒｎ
Ｉ！、０．０５Ｍクエン酸、ｐＨ４＋２０４の２７．
４５ｍｇ／一ＡＢＴＳ＋ ２ ０ ｔｉの２％Ｈ２０）
を加え、そしてシグナル対バックグラウンドの比が適当
になるまで室温にてインキユベートする。
合体について決定されたように、接合した抗体（ホース
ラディッシュパーオヰシダーゼに接合した２つのマウス
抗−ＦｅＬＶ ｐ２７抗体のプール）を稀釈し、そして
１００Ｉを各ウエルに加える。３７℃にて３０〜６０分
間インキコベートする。プレートをＢＬＩＳＡ洗浄液で
３回洗浄する。各ウエルに１０ロバの基質溶液（５ｒｎ
Ｉ！、０．０５Ｍクエン酸、ｐＨ４＋２０４の２７．
４５ｍｇ／一ＡＢＴＳ＋ ２ ０ ｔｉの２％Ｈ２０）
を加え、そしてシグナル対バックグラウンドの比が適当
になるまで室温にてインキユベートする。
１００Ｉの０、２ ＭＨＦにより反応を停止し、そして
４０５ｎｍにおける光学濃度を決定する。ｐ２７の濃度
をスタンダード曲線から決定することができる。
４０５ｎｍにおける光学濃度を決定する。ｐ２７の濃度
をスタンダード曲線から決定することができる。
例に記載した蛋白質生成物は上記の試験により免疫原性
及び免疫保護活性について評価することができ、そして
ＦｅＬＶ感染に対する効果的なワクチンであることが示
される。
及び免疫保護活性について評価することができ、そして
ＦｅＬＶ感染に対する効果的なワクチンであることが示
される。
モルモット試験２免疫原性及び有効性
モルモッ｝ （３５０〜４００ ｇ ，群当り３動物）
を次のようにしてワクチン処理する。
を次のようにしてワクチン処理する。
０日：ワクチン処理・・・完全フロインドアジュバント
中０．２■の接合体又は不完全フロインドアジニバント
中０． ４ ｍｇの融合蛋白質をＩＭ注射する。
中０．２■の接合体又は不完全フロインドアジニバント
中０． ４ ｍｇの融合蛋白質をＩＭ注射する。
１４日：増分追加免疫（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｂｏ
ｏｓｔ） ・・・不完全フロインドアジニバント中０．
２■の接合体又は不完全フロインドアジニバント中０．
４ ｍｇの融合蛋白質を注射する。
ｏｓｔ） ・・・不完全フロインドアジニバント中０．
２■の接合体又は不完全フロインドアジニバント中０．
４ ｍｇの融合蛋白質を注射する。
２８日：最終追加免疫・・・下記のようにして調製した
不活性化ウィルス“１０ｍｌ相当″を注射する。
不活性化ウィルス“１０ｍｌ相当″を注射する。
Ｓｎｙｄｅｒ −Ｔｈｅ ｉ ｌｅｎ （ＳＴ） Ｆｅ
ＬＶに感染したＦＦ６４／２８０ネコ線維芽細胞を標準
培地（改変イーグル培地、Ｌ１５） ＋ １ ０％ウシ
胎児血清（ＦＣＳ）中でコンフルエント単層まで増殖せ
しめた。次にＦＣＳを除去し、そして培地のみと置き代
えた。２４〜４８時間後に上清を集め、そして限外濾過
により約２００倍に濃縮した。ホルムアルデヒドを０．
６重量％に加えてウィルスを不活性化した。濃縮物のア
リコート（０．０５１ｎｌ）を不完全フロインドアジニ
バントにより稀釈し、そして最終追加免疫として使用す
るために調製した。
ＬＶに感染したＦＦ６４／２８０ネコ線維芽細胞を標準
培地（改変イーグル培地、Ｌ１５） ＋ １ ０％ウシ
胎児血清（ＦＣＳ）中でコンフルエント単層まで増殖せ
しめた。次にＦＣＳを除去し、そして培地のみと置き代
えた。２４〜４８時間後に上清を集め、そして限外濾過
により約２００倍に濃縮した。ホルムアルデヒドを０．
６重量％に加えてウィルスを不活性化した。濃縮物のア
リコート（０．０５１ｎｌ）を不完全フロインドアジニ
バントにより稀釈し、そして最終追加免疫として使用す
るために調製した。
各注射から２週間後にモルモットから試験血清を採取し
た。ｇｐ７０並びにペプチドＩ，ＩＩ，Ｉ及び■に対す
る抗体についての、血清の免疫原性試験を、前記のＥＬ
ＩＳＡ法を用いて行った。ウィルス中和試験もさらにモ
ルモットについて前記のフォーカス形成アッセイ、並び
にテラサキＰ，Ｉ．， 及びマクレランド，Ｊ．Ｄ．，
ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ） （１９６４）２０４
：９９８−１０００に従って補体一依存抗体介在細胞
変性（Ｃ’ ＤＡＣ）試験を用いて行った。Ｃ’ ＤＡ
Ｃ試験は、ラビット補体、並びに血清抗体結合及び補体
細胞変性のための標的細胞としてＦＬ７４ （ＦｅＬＶ
感染）ネコ細胞を用いた。
た。ｇｐ７０並びにペプチドＩ，ＩＩ，Ｉ及び■に対す
る抗体についての、血清の免疫原性試験を、前記のＥＬ
ＩＳＡ法を用いて行った。ウィルス中和試験もさらにモ
ルモットについて前記のフォーカス形成アッセイ、並び
にテラサキＰ，Ｉ．， 及びマクレランド，Ｊ．Ｄ．，
ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ） （１９６４）２０４
：９９８−１０００に従って補体一依存抗体介在細胞
変性（Ｃ’ ＤＡＣ）試験を用いて行った。Ｃ’ ＤＡ
Ｃ試験は、ラビット補体、並びに血清抗体結合及び補体
細胞変性のための標的細胞としてＦＬ７４ （ＦｅＬＶ
感染）ネコ細胞を用いた。
これらの試験の結果を表に示す。特にことわらない限り
、カツコを付してない結果は最初のワクチン処理後に採
取した血清についてのものである。
、カツコを付してない結果は最初のワクチン処理後に採
取した血清についてのものである。
カツコ内の結果は殺されたウィルスを注射した後に採取
した血清についてのものである。
した血清についてのものである。
免疫原性試験の結果は、すべてのワクチンがｇｌ）７０
に対する抗体を生成すること、及び殺されたウィルスの
注射が抗−ｇｐ７０反応における有意な増加を生じさせ
ることを示している。（塩水／アジュバントでワクチン
処理され、そして殺されたウィルスにより追加免疫され
た対照は１回の追加免疫の後に大きな反応を示さない。
に対する抗体を生成すること、及び殺されたウィルスの
注射が抗−ｇｐ７０反応における有意な増加を生じさせ
ることを示している。（塩水／アジュバントでワクチン
処理され、そして殺されたウィルスにより追加免疫され
た対照は１回の追加免疫の後に大きな反応を示さない。
）殺されたウィルスによる追加免疫の後の補体依存細胞
変性において相関的な増加が観察された。
変性において相関的な増加が観察された。
この発明のポリペプチドは、ＦｅＬＶに対するネコの能
動免疫のために使用される。このような用途のために、
このペプチドは通常、非経腸的注射のための医薬として
許容される液体担体、例えば塩水、リンゲル液、グルコ
ース溶液、及びハング溶液と共に製剤化されるであろう
。この明細書において、このような担体について使用す
る場合、“医薬として許容される”なる用語は、この担
体が非毒性であり、一般に不活性であり、そして活性成
分の機能に不都合な影響を与えないこ，とを意味する。
動免疫のために使用される。このような用途のために、
このペプチドは通常、非経腸的注射のための医薬として
許容される液体担体、例えば塩水、リンゲル液、グルコ
ース溶液、及びハング溶液と共に製剤化されるであろう
。この明細書において、このような担体について使用す
る場合、“医薬として許容される”なる用語は、この担
体が非毒性であり、一般に不活性であり、そして活性成
分の機能に不都合な影響を与えないこ，とを意味する。
好ましくは、製剤は１又は複数のアジコバンド（所望の
免疫反応を相乗することができる化合物）、例えば一般
に使用される水及び油乳剤（例えば、フロイドドアジ二
バント）、アルム（硫酸カリウムアルミニウム）、水酸
化アルミニウム、リン酸カルシウム、及び合成ポリヌク
レオチドを含有するであろう。ワクチン処理において使
用される投与量及び投与方法は動物の年齢及び重量、非
経腸的投与の方法、及び製剤中でのアジュバントの存在
により非常に異るであろう。個個の投与量は一般に約０
．１〜Ｌｏｍｇのポリペプチドの範囲であろう。示され
ているように、ワクチン注射は好ましくは免疫反応を開
始するために使用され、次に殺されたウィルス、又は感
染量より少量の生ウィルスが注射される。ワクチン処理
の後に、典型的には最初の１年を通して定期的に、そし
てその後に追加免疫接種が行われよう。この明細書にお
いて使用する場合、“免疫原的量”なる語はこれらの投
与量を含むことが意図される。
免疫反応を相乗することができる化合物）、例えば一般
に使用される水及び油乳剤（例えば、フロイドドアジ二
バント）、アルム（硫酸カリウムアルミニウム）、水酸
化アルミニウム、リン酸カルシウム、及び合成ポリヌク
レオチドを含有するであろう。ワクチン処理において使
用される投与量及び投与方法は動物の年齢及び重量、非
経腸的投与の方法、及び製剤中でのアジュバントの存在
により非常に異るであろう。個個の投与量は一般に約０
．１〜Ｌｏｍｇのポリペプチドの範囲であろう。示され
ているように、ワクチン注射は好ましくは免疫反応を開
始するために使用され、次に殺されたウィルス、又は感
染量より少量の生ウィルスが注射される。ワクチン処理
の後に、典型的には最初の１年を通して定期的に、そし
てその後に追加免疫接種が行われよう。この明細書にお
いて使用する場合、“免疫原的量”なる語はこれらの投
与量を含むことが意図される。
ワクチンは任意の非経口的経路（静脈内、動脈内、腹腔
内、皮下、皮内、筋肉内、又は莢膜内）に投与すること
ができる。
内、皮下、皮内、筋肉内、又は莢膜内）に投与すること
ができる。
第１図は例において使用されるＦｅＬＶ−Ｂ ｅｎｖ遺
伝子の分離源であるプラスミドｐＫＨＲ １の略図であ
る。 第２図は例に記載される発現ベクターの造成において使
用される制限部位を示すｅｎｖ遺伝子の拡大図を包含す
るＦｅＬＶゲノムの略図である。 第３図はＦｅＬＶのガードナー−アルンスタイン（ＧＡ
）株のｅｎｖ遺伝子のコード鎮のヌクレオチド配列、及
びこれから推定されるアミノ酸配列である。 第４図は例に記載されるｔｒｐＬ［Ｅ’ −ＰｅＬＶ融
合蛋方法の流れ図である。 第６図はブラスミドｐｔｒｐＬＢ’の略図である。 第７図はｔｒｐＬＥ’ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列及びこのポリペプチドの推定されるアミノ酸
配列である。 第８図は前記ヌクレオチド配列、及びブラスミドｐｔＧ
Ａ中のｔｒｐＬＢ’ ／ｇｐ７０連結部の推定されるア
めの方法の流れ図である。 第１１図はｇｐ７０分子の抗原決定基を同定する方法の
流れ図である。 第１２図は第１１図の方法により同定された抗原領域の
ヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列である。 第１３図はプラスミドｐｔ９：３ −１９の造成のため
の方法の流れ図である。 第１４図はｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉ ， ｐｔＧＡΔＡｐ
ａ Ｉ，及びｐｔ９：３ −１９の蛋白質生成物のＳＯ
Ｓ−ＰＡＧＢ分析の電気泳動図である。 ＬＴＲ ｇａｇ ｐｏｌ 口η ＨＦ６０由来の ＦＩＧ． ？ ｍＩ−Ｉ ＋ｑ＜ 一υ ｏｃ！１ 才《 ωΦ
卜← ωり ロ二〉２：８■＝８。＝ミ．にろ。叱−
＝８ｏ；ご．：乙。３← ｕｅｕ＜＜ ５ｏ ８．．乏、と．む，む， ０ υ ｈ．ｕ Ｉ−１ ＜，！−
， ３ｚ ３＋１Ｌ ！：ｋ． ３２ Ｌ←
ｕ Ｈａ ａｃ５ＣＪ．Ｊ ＣＪＩＬ ＋−＋
の５ ギＨ ５ Ｌ．ヨ２葺． Ｑ−ＱｊｌＩ−＋ ０１０ ０《 ト← 一＜ ｍ
ｕ ΦＱ０ｒ＋ｕ ｗＩ−１＋＋＋ｕ ｍ←Ｓ←０１
（ ψｊｊ）ロ＠ψ＜一＜＜＜ｃｐ＜ ←
＜＜Ｕ 〉２ 仁一 赳＞ ギウ 撃ｗ ｇｏ ｕａ．
籾， ご。 Ｌ ｉ：：ｗ Ｌ Ｌ ｊｉｂ＞ ３。旨．善、述２耳
７÷一し＄〜ｅ，ヨ。３。５，シ３。谷，４ＥＬ ｅ．
５。Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ ’ｊ。Ｅ＞ ｌ：．Ｊ
Ｌ Ｌ Ｕ、Ｌ ５１−１ ｉ。κ。 ＦＩＧ．３−イの２ ＥｃｏＲｌ Ｅｃｏ Ｒｌ ＦＩＧ．５−１ Ｅｃｏ Ｒｌ ｐｖｕ Ｉ１ εｃｏ Ｒｌ ＦＩＧ．５−２ ｐＧＡ＠ｎｖ−１ａｃ （５．８ｋｂ）εｃｏ Ｒｌ ｐｔＧＡ中のｔｒｐＬＥ’−ＦｅＬＶｇｐ７０連結部Ｇ
ＣＡＣＡＧＧＡＡＴｒＣＣＣＧＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＧ
Ｔ．．，−ａｌａ ｇｌｎ ｇｌｕ ｐｈｅ ｐ
ｒｏ ａｌａ ａｓｎ ｐｒｏ ｓｅｒ−ＦＩＧ．
８ ｎｐ ｔｔ” ＦＩＧ．７ ＥｃｏＲｌ ｐｔＧＡ Ａ Ｂａｌ ｌ−Ｈｉｎ ｄｌｌｌＥｃｏＲ
ｌ ＦＩＧ． ９−２ ｐｔＱＡ ｐｔＧＡ Ｅｃｏ Ｒｌ εｃｏＲｌ ｐｔＧ＾ ＥｃｏＲｌ １ｉ：ｃｏ Ｒｌ ＦＩＧ． ：Ｓ 翼 抗原決定基をマップするための免疫スクリーニングＩａ
ｃＺ εｃｏ Ｒｌ （１９中ｎ＝２） ＦＩＧ． 手 続 補 正 書 （方式） 平成１年１１月７２日
伝子の分離源であるプラスミドｐＫＨＲ １の略図であ
る。 第２図は例に記載される発現ベクターの造成において使
用される制限部位を示すｅｎｖ遺伝子の拡大図を包含す
るＦｅＬＶゲノムの略図である。 第３図はＦｅＬＶのガードナー−アルンスタイン（ＧＡ
）株のｅｎｖ遺伝子のコード鎮のヌクレオチド配列、及
びこれから推定されるアミノ酸配列である。 第４図は例に記載されるｔｒｐＬ［Ｅ’ −ＰｅＬＶ融
合蛋方法の流れ図である。 第６図はブラスミドｐｔｒｐＬＢ’の略図である。 第７図はｔｒｐＬＥ’ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列及びこのポリペプチドの推定されるアミノ酸
配列である。 第８図は前記ヌクレオチド配列、及びブラスミドｐｔＧ
Ａ中のｔｒｐＬＢ’ ／ｇｐ７０連結部の推定されるア
めの方法の流れ図である。 第１１図はｇｐ７０分子の抗原決定基を同定する方法の
流れ図である。 第１２図は第１１図の方法により同定された抗原領域の
ヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列である。 第１３図はプラスミドｐｔ９：３ −１９の造成のため
の方法の流れ図である。 第１４図はｐｔＧＡΔＡｖａ Ｉ ， ｐｔＧＡΔＡｐ
ａ Ｉ，及びｐｔ９：３ −１９の蛋白質生成物のＳＯ
Ｓ−ＰＡＧＢ分析の電気泳動図である。 ＬＴＲ ｇａｇ ｐｏｌ 口η ＨＦ６０由来の ＦＩＧ． ？ ｍＩ−Ｉ ＋ｑ＜ 一υ ｏｃ！１ 才《 ωΦ
卜← ωり ロ二〉２：８■＝８。＝ミ．にろ。叱−
＝８ｏ；ご．：乙。３← ｕｅｕ＜＜ ５ｏ ８．．乏、と．む，む， ０ υ ｈ．ｕ Ｉ−１ ＜，！−
， ３ｚ ３＋１Ｌ ！：ｋ． ３２ Ｌ←
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の５ ギＨ ５ Ｌ．ヨ２葺． Ｑ−ＱｊｌＩ−＋ ０１０ ０《 ト← 一＜ ｍ
ｕ ΦＱ０ｒ＋ｕ ｗＩ−１＋＋＋ｕ ｍ←Ｓ←０１
（ ψｊｊ）ロ＠ψ＜一＜＜＜ｃｐ＜ ←
＜＜Ｕ 〉２ 仁一 赳＞ ギウ 撃ｗ ｇｏ ｕａ．
籾， ご。 Ｌ ｉ：：ｗ Ｌ Ｌ ｊｉｂ＞ ３。旨．善、述２耳
７÷一し＄〜ｅ，ヨ。３。５，シ３。谷，４ＥＬ ｅ．
５。Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ ’ｊ。Ｅ＞ ｌ：．Ｊ
Ｌ Ｌ Ｕ、Ｌ ５１−１ ｉ。κ。 ＦＩＧ．３−イの２ ＥｃｏＲｌ Ｅｃｏ Ｒｌ ＦＩＧ．５−１ Ｅｃｏ Ｒｌ ｐｖｕ Ｉ１ εｃｏ Ｒｌ ＦＩＧ．５−２ ｐＧＡ＠ｎｖ−１ａｃ （５．８ｋｂ）εｃｏ Ｒｌ ｐｔＧＡ中のｔｒｐＬＥ’−ＦｅＬＶｇｐ７０連結部Ｇ
ＣＡＣＡＧＧＡＡＴｒＣＣＣＧＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＧ
Ｔ．．，−ａｌａ ｇｌｎ ｇｌｕ ｐｈｅ ｐ
ｒｏ ａｌａ ａｓｎ ｐｒｏ ｓｅｒ−ＦＩＧ．
８ ｎｐ ｔｔ” ＦＩＧ．７ ＥｃｏＲｌ ｐｔＧＡ Ａ Ｂａｌ ｌ−Ｈｉｎ ｄｌｌｌＥｃｏＲ
ｌ ＦＩＧ． ９−２ ｐｔＱＡ ｐｔＧＡ Ｅｃｏ Ｒｌ εｃｏＲｌ ｐｔＧ＾ ＥｃｏＲｌ １ｉ：ｃｏ Ｒｌ ＦＩＧ． ：Ｓ 翼 抗原決定基をマップするための免疫スクリーニングＩａ
ｃＺ εｃｏ Ｒｌ （１９中ｎ＝２） ＦＩＧ． 手 続 補 正 書 （方式） 平成１年１１月７２日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ネコ科白血病ウィルスのｇｐ８５エンベロープ蛋白
質のアミノ酸配列の少なくとも部分と相同なアミノ酸配
列を含んで成り、そしてネコにおいて液性反応を開始又
は誘発する免疫原でありそしてネコ科白血病ウィルス感
染に対してネコを免疫するのに有用なポリペプチドをコ
ードする遺伝子を含んで成る発現プラスミド。 ２、前記ポリペプチドと他の蛋白質との融合蛋白質をコ
ードする遺伝子を含んで成る特許請求の範囲第１項に記
載の発現プラスミド。 ３、ｐｔＧＡΔＡｖａ I 、ｐｔＧＡΔＡｐａ I 、又は
ｐｔ９：３−１９である、特許請求の範囲第２項に記載
の発現プラスミド。 ４、ネコ科白血病ウィルスのｇｐ８５エンベロープ蛋白
質のアミノ酸配列の少なくとも部分と相同なアミノ酸配
列を含んで成り、そしてネコにおいて液性反応を開始又
は誘発する免疫原でありそしてネコ科白血病ウィルス感
染に対してネコを免疫するのに有用なポリペプチドをコ
ードする遺伝子を含んで成る発現プラスミドにより形質
転換された大腸菌及びその子孫。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55990383A | 1983-12-09 | 1983-12-09 | |
| US06/612,003 US4701416A (en) | 1983-12-09 | 1984-05-18 | Feline leukemia virus vaccine plasmids for fusion protein of the gp70 envelope protein of FELV |
| US612003 | 1990-11-09 | ||
| US559903 | 1995-11-17 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59504369A Division JPH0768266B2 (ja) | 1983-12-09 | 1984-11-29 | ネコ科白血病ウイルスワクチン |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02238884A true JPH02238884A (ja) | 1990-09-21 |
| JPH0767391B2 JPH0767391B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=27072196
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59504369A Expired - Lifetime JPH0768266B2 (ja) | 1983-12-09 | 1984-11-29 | ネコ科白血病ウイルスワクチン |
| JP1111966A Expired - Lifetime JPH0767391B2 (ja) | 1983-12-09 | 1989-05-01 | ネコ科白血病ウイルス抗原をコードする遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを含有する宿主 |
| JP5161425A Expired - Lifetime JP2633457B2 (ja) | 1983-12-09 | 1993-06-30 | ネコ科白血病ウイルス感染の予防方法 |
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|---|---|---|---|
| JP59504369A Expired - Lifetime JPH0768266B2 (ja) | 1983-12-09 | 1984-11-29 | ネコ科白血病ウイルスワクチン |
Family Applications After (1)
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|---|---|---|---|
| JP5161425A Expired - Lifetime JP2633457B2 (ja) | 1983-12-09 | 1993-06-30 | ネコ科白血病ウイルス感染の予防方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0164403B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0768266B2 (ja) |
| AU (1) | AU577557B2 (ja) |
| CA (1) | CA1334387C (ja) |
| DE (1) | DE3484991D1 (ja) |
| HK (1) | HK173996A (ja) |
| WO (1) | WO1985002625A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US4701416A (en) * | 1983-12-09 | 1987-10-20 | Cetus Corporation | Feline leukemia virus vaccine plasmids for fusion protein of the gp70 envelope protein of FELV |
| JPS60169498A (ja) * | 1984-02-10 | 1985-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド誘導体 |
| US5152982A (en) * | 1984-03-26 | 1992-10-06 | Chiron Corporation | Compositions and methods for FeLV vaccination |
| US4663436A (en) * | 1984-04-24 | 1987-05-05 | Scripps Clinic And Research Foundation | Leukemia-associated virus immunogen, vaccine and assay |
| US4794168A (en) * | 1984-04-24 | 1988-12-27 | Scripps Clinic And Research Foundation | Leukemia-associated virus immunogen, vaccine and assay |
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| EP0173997A1 (en) * | 1984-09-06 | 1986-03-12 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines and their preparation |
| EP0203177A4 (en) * | 1984-11-29 | 1987-04-28 | Scripps Clinic Res | POLYPEPTIDES AND ANTIBODIES ASSOCIATED WITH VIRAL GLUCOPROTEINS WITHOUT GLUCOSE. |
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| US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
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| JP2656521B2 (ja) * | 1986-05-30 | 1997-09-24 | ケンブリッジ・バイオサイエンス・コーポレーション | ネコ白血病ウイルス抗原の製造法と用途 |
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| US5837686A (en) * | 1991-11-25 | 1998-11-17 | Peptide Therapeutics Limited | Peptides and antibodies for treatment of rheumatoid arthritis |
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| AU2007351813B2 (en) | 2006-10-31 | 2013-10-10 | East Carolina University | Fusion proteins comprising an anti-inflammatory cytokine and an antigen for treatment of immune disorders |
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Citations (1)
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-
1984
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1989
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| US4701416A (en) | 1987-10-20 |
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