JPH02238894A - エンドセリンに対する抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエンドセリンに結合特異性を有する点で有用か
つ新規な抗体に関する．更に詳しくは、抗原抗体反応に
基づく臨床検査薬の開発あるいは病態生理学の研究に有
用な抗体に関する．〔略号〕 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合、それらはＩ　Ｕ
ＰＡＣ　−　Ｉ　ＵＢ　　Ｃｏｗ＋ｎｉｓｓｉｏｎ　ｏ
ｎ　８１ｏ１ｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ
による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づく
ものであり、その例を次ぎに挙げる．また、アミノ酸な
どに関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけ
ればＬ体を示すものとする． Ｔｒｐ：トリプトファン Ｉ１ｅ：イソロイシン Ｌｓｕ：ロイシン Ａ　ｓ　ｐ　：アスパラギン酸 Ｐｒｏ　：プロリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｇｌｙ：グリシン Ｈ　ｉ　ｓ　：ヒスチジン Ｃｙｓ：システイン Ａ　ｒ　ｇ　：アルギニン Ｓｅｒ：セリン Ｍｅｔ：メチオニン Ａｓｎ：アスパラギン Ｌｙｓ：リジン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｇｉｎ：グルタミン Ｖａｌ：バリン Ｔｙｒ：チロシン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｂｏａ　：　ｔ−ブトキシカルボニル Ｔｏｓ：トシル ＯＢｚｌ：ベンジルエステル ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル Ｂｚｌ：ベンジル ＣＱ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシ力ルボニルＢ　ｒ
−Ｚ　：　２−６プロモベンジルオキシ力ルボニルＡ　
ｃ　ｍ　：アセトアミドメチル ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＴＥＡ：トリエチルアミン ＰＡＭ：４−（オキシメチル）フェニルアセトアミドメ
チル ｐＴｓ・ＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸ＨＯＮＢ　：　
Ｎ−ヒドロキシー５一ノルボルネンー２，３−ジカルボ
キシイミド ＯＮＢ　：　Ｎ−ヒドロキシ−５一ノルボルネンー２，
３−ジカルボキシイミド・エステルＤＭＦ　：　Ｎ，Ｎ
’　−ジメチルホルムアミドＤＣＣ　：　Ｎ，Ｎ’　−
ジシクロへキシル力ルポジイミド ＷＳＣＤ−Ｈ（１２　：　１−ｘチ／Ｉ／−３−（３−
ジメチルアミノプロビル）一カルポジイミド・塩酸塩 〔従来の技術〕 内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に対
する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている．　し
かし，これまでアンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓ
ｉｎ　）が内皮細胞から得られるという報告（サーキュ
レーション・リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｓ
ｓｅａｒｃｈ），　６０．　４２２１　（１９８７））
以外には、これらの収縮反応をつかさどる内皮由来の液
性因子は、まだ１つも同定されていなかった．最近．真
崎らは啼乳類または鳥類の血管内皮細胞培養上清より，
強力な血管平滑筋収縮作用を有する分子量２，５００±
３００の新規なペプチドを見出した（特願昭６２−２５
５３８１号）．単離・精製された上記のペプチドのうち
の一つはアミノ酸分析（ニンヒドリン法）、分子量測定
およびその他のデータから、アミノ酸２１個からなるペ
プチド（以後，エンドセリン■と表す）であることが判
明しており、エンドセリン■のアミノ酸配列は Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｓｒ　Ｌｅｕ　Ｍ
ｅｔＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ
　ＰｈｅＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ　ｌｅ　
Ｉ　ｌａ　Ｔｒｐであり、ＣｙｓとＣｙｓの間でＳ−Ｓ
結合が２組存在（１Ｃｙ　ｓ−１ｓＣｙ　ｓ　，　３Ｃ
ｙ　ｓ−”Ｃｙ　ｓ）し、分子量は２，４９２である． また，真崎，音田らによりエンドセリンの遺伝情報を指
定するブタおよびヒト遺伝子のクローニングもなされた
（特願昭６２　−　２７５６１３号、および特願昭６２
−３１３１５５号）．さらに、エンドセリンＩの前駆体
としてアミノ酸約４０個からなるペプチド（以後、エン
ドセリン■と表わす）および約２００個からなるペプチ
ド（以後、エンドセリン■と表す）も得られている．本
明細書においてはエンドセリン■、エンドセリン■およ
びエンドセリン■をあわせてエンドセリンと総称する． エンドセリン■としては、たとえば第１３図で示される
アミノ酸配列５３〜９ｌのブタエンドセリン■や第１４
図で示されるアミノ酸配列５３〜９０のヒトエンドセリ
ン■などが挙げられる． エンドセリン■としては、たとえば第１３図で示される
アミノ酸列１〜２０３のブタエンドセリン■や第１４図
で示されるアミノ酸配列１〜２１２のヒトエンドセリン
■などが挙げられる． 〔発明が解決しようとする課題〕 該エンドセリンは、その強力な血管平滑筋収縮作用の点
から，例えば本態性高血圧症、心不全等の各種疾患と因
果的に，または症候的に関連する可能性が考えられてい
る．これらを解明するためには、エンドセリンの研究，
特に代謝経路，分泌機構，リセプター等に関する研究を
総合的に行なう必要がある．イムノアッセイ等の免疫学
的手法は、そのための最も有効な手段の一つと考えられ
、エンドセリンに特異的な抗体を作製することが極めて
重要視されている．しかしながら，これまでエンドセリ
ンの検出法としては生物活性に基づく方法しか知られて
おらず、今後の研究には、より迅速、簡便かつ高感度な
検出法の開発が必須である． ［１１題を解決するための手段〕 本発明は、エンドセリンに結合特異性を有するポリクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する． 本発明のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗
体を用いることにより、エンドセリンの免疫学的測定系
が確立され、組織化学的知見を得ることも可能となる．
また，該抗体を用いる免疫吸着クロマトグラフィーによ
りエンドセリンを単離・精製することができる．これら
のことは、エンドセリンの生理学的意義、各種疾患との
関連の説明，さらには、これらの診断薬、治療薬の研究
開発を行なう上で非常に有用である． 本発明のポリクローナル抗体の調製は一般に免疫抗原の
エンドセリンとキャリアー蛋白との複合体をつくり、こ
のものを動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から抗
エンドセリン抗体含有物を採取、抗体の分離精製を行う
ことによる．本発明のモノクローナル抗体の調製に当っ
ては，上記免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終
免疫３〜５日後に牌臓あるいはリンパ節を採取、それら
に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定
的に力価の高い抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し
、モノクローナルなハイブリドーマを得ることによる． 免疫抗原のエンドセリンとしては、例えば，前記文献等
に記述された天然精製標品あるいは合成標品等いずれも
使用でき，先に述べたエンドセリンＩ、エンドセリン■
、エンドセリン■およびそれらの一部分がこの中に含ま
れる． 本発明で用いられる種々のベプチドは、ペプチド合成の
公知の常套手段で製造しうる．同相合成法，液相合成法
のいずれによってもよい．同相法によりエンドセリンを
合成する場合、メリーフィールドの同相ペプチド合成方
法〔ジャーナルオブジアメリカンケミカルソサイエテイ
　（Ｊ．Ａｍ．　Ｃｈｅｗ．　Ｓｏｃ．），８５，２１
４９（１９６３））を用いるのが好ましい．不溶性樹脂
として当該技術分野で知られたもののいずれであっても
よく、例えばクロ口メチル化されたスチレンージビニル
ベンゼン共重合体，フェナシルアセティックメチル化さ
れたスチレンージビニルベンゼン共重合体のようなポリ
スチレン型樹脂、ポリジメチルアクリルアミド樹脂のよ
うなポリアミド型樹脂が挙げられる．Ｃ末端のＮ一保護
アミノ酸を不溶性樹脂に結合させた後、エンドセリンの
Ｃ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次結合し、
次いでフッ化水素で処理した後、ジスルフィド結合を形
成させ目的とするエンドセリンを合成することができる
．Ｎー保護アミノ酸としては、α−アミノ基はすべてＢ
ｏｃ基で保護し、セリンおよびスレオニンの水酸基はＢ
ｚｌ基で、グルタミン酸，アスパラギン酸のω一カルボ
ン酸はＯ　Ｂ　ｚ　ｌ基、リジンのｉ−アミノ基はＣＱ
−Ｚ基、システインのチオール基はＡｃｍ基、ＭｅＢｚ
１基、チロシンの水酸基はＢｒ−Ｚ基、ヒスチジンのイ
ミダゾール基およびアルギニンのグアニド基はＴｏＳ基
、トリプトファンのインドール基はＣＨＯ基で保護する
のが好ましい． 液相法による合成の手段としては、たとえば「ザペプチ
ズ（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　Ｊ　，第１巻（１９
６６年）　．　Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｂｋａ
著、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
，　Ｕ．Ｓ．Ａ．あるいは“ペプチド合成”，泉屋ら著
、丸善株式会社（１９７５年）に記載された方法、たと
えばアジド法、クロライド法、酸無水物法、混合無水物
法、ＤＣＣ法、活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを
用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸化還元法．Ｄ
ＣＣ／アディテイブ（例，ＨＯＮＢ，ＨＯＢｔ，ＨＯＳ
ｕ）法などがあげられる． 補乳動物を免疫するために用いられるエンドセリンとキ
ャリアー蛋白との蛋白複合体に関し、キャリアー蛋白の
種類およびキャリアーとハプテン（この場合ペプチド）
との混合比は，キャリアーにカブリングさせて免疫した
ハプテンに対して抗体が効率よく出来れば、どの様なも
のをどの様な比率でカブリングさせてもよいが、例えば
、牛血清アルブミンや牛サイログロプリン，ヘモシアニ
ン等を重量比でハプテン１対し０．１〜２０、好ましく
は１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる． また、ハプテンとキャリアーのカブリングには、種々の
縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデビトや
カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が好都合に
用いられる． 縮合生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が可
能な部位にそれ自体あるいは担体，希釈剤とともに投与
されるが、なかでも皮下注射が好ましい．投与に際して
抗体産生能を高めるため，完全フロイントアジュバント
や不完全フロイントアジュバントを投与してもよい．投
与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計３〜６回程度行われ
る．用いられる温血動物としては、たとえばサル，ウサ
ギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ
，ニワトリがあげられる． 抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水（
好ましくは血液）などから採取される。抗血清中の抗エ
ンドセリン抗体価の測定は，例えば後記の標識化エンド
セリンと抗血清とを反応させたのち，抗体に結合した標
識剤の活性を測定することによりなされる．抗体の分離
精製は免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法，アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法，イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原抗体結合物あるいは活性吸着剤により特異抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行われる．このようにして作製された抗
体は，ＩｇＧを主たる成分とし，ＩｇＭ，ＩｇＡ等、他
の免疫グロプリンも含む．また、このものはエンドセリ
ンと特異的に結合し、アンジオテンシンー■には結合し
ない． 一方、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫
された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に牌臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させることにより，抗エンドセリン抗体産生
ハイブリドーマを調製することができる．融合操作は既
知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２５６，４９５　（１９
７５））に従い実施できる．融合促進剤としてはポリエ
チレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）やセンダイウイルスな
どが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる．骨
髄腫細胞としてはたとえばＭＳ−１、Ｐ３Ｕ１．ＳＰ２
／０などがあげられるが、特にＰ３Ｕ１が好ましく用い
られる．用いられる抗体産生細胞（肺臓細胞）数と骨髄
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり
、ＰＥＧ　（好ましくはＰＥＧ１０００〜Ｐ　Ｅ　Ｇ６
０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜
４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキ
ユベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる
． 抗エンドセリン抗体産生ハイブリドーマのスクリーニン
グには種々の方法が使用できるが，たとえばエンドセリ
ンを吸着させた同相（例，マイクロプレート）にハイブ
リドーマ培養上清を添加し，次に西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗免疫グロブリン抗体（細
胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫
グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加
え，固相に結合した抗エンドセリンモノクローナル抗体
を検出するＥＩＡ法、抗免疫グロブリン抗体またはプロ
テインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養土清を
添加し、ＨＲＰで標識したエンドセリンを加え、固相に
結合した抗エンドセリンモノクローナル抗体を検出する
ＥＩＡ法などがあげられる．抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体の選別，育種は通常ＨＡＴ　（ヒボキサンチン
、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０
％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、Ｒ　Ｐ　Ｍ　
Ｉ　１６４０）で行われる．ハイブリドーマ培養上清の
抗体価は，上記の抗血清中の抗エンドセリン抗体価の測
定と同様にして測定できる． 抗エンドセリンモノクローナル抗体の分離精製は上記の
ポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリン
の分離精製法に従って行われる．エンドセリンの一部領
域と反応する抗エンドセリンボリクローナル抗体は、そ
の一部領域に相当するベプチドをハプテンとして免疫し
上記の方法で調製することもできるが，エンドセリンを
ハプテンとして用いて調製された抗エンドセリンボリク
ローナル抗体から、その一部領域に相当するペプチドを
結合したカラムによるアブィニティクロマトグラフィを
用いて調製することもできる．また，エンドセリンの一
部領域と反応する抗エンドセリン抗体を産生ずるハイブ
リドーマおよび，エンドセリンとは反応するがその一部
領域とは反応しない抗エンドセリンモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマの選別はたとえばその一部領
域に相当するペプチドとハイブリドーマが産生ずる抗体
との結合性を測定することにより行うことができる． 上記で得られた抗エンドセリンポリクローナル抗体、該
抗体を含む抗血清あるいは抗エンドセリンモノクローナ
ル抗体を用いて通常の免疫測定法等に従い、エンドセリ
ンの測定乃至組織染色等を行ない得る．エンドセリンの
免疫測定法には次に述べる競合法あるいはサンドイッチ
法を用いるのが好ましい． 競合法においては、本発明で得られた抗エンドセリン抗
体と、被検液および４ｌｌｌＩｆｆｉ化エンドセリンと
を競合的に反応させたのち、抗体に結合した標識化エン
ドセリンの割合を測定することにより，被検液中のエン
ドセリンを定量する． 該エンドセリンの標識剤あるいは後記の抗体の標識剤と
しては，放射性同位元素、酵素，蛍光物質、発光物質な
どが挙げられる．放射性同位元素としては、例えば１２
５　１　，ｌ３１　１　，３Ｈ，１４Ｃなどが、上記酵
素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく，例
えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アル
カリフオスアターゼ、バーオキシダーゼ，リンゴ酸脱水
素酵素等が，蛍光物質としては、フルオレスカミン、フ
ルオレッセンイソチオシアネートなどが，発光物質とし
ては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン，
ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる．さらに、抗体あ
るいはエンドセリンと標識剤との結合にビオチンーアビ
ジン系を用いることもできる．上記の標識剤の活性の測
定に当っては，抗体に結合した＃Ａ識化エンドセリンと
遊離の標識化エンドセリンとを分離（以後Ｂ／Ｆ分離と
略す）する必要があるが，標識剤として酵素を用いた場
合には，このための試薬に不溶化した抗エンドセリン抗
体に対する抗体あるいは不溶化したプロテインＡ等の活
性吸着剤が有利に用いられる．例えば、抗ＩｇＧ抗体（
抗エンドセリン抗体に対する抗体に相当）を固相として
用い、・これと反応性のある上記抗体を介して標識化エ
ンドセリンを固相にある抗ＩｇＧ抗体に結合させ，該同
相上の標識剤を測定することによって行なうことができ
る．標識剤として酵素を用いた場合には、不溶化担体上
の酵素活性の測定には通常の比色法あるいは蛍光法が用
いられる．標識剤にラジオアイソトープ等、非蛋白性物
質を用いた場合には、Ｂ／Ｆ分離に上記の試薬以外にも
不溶化しない抗エンドセリンに対する抗体、硫酸ナトリ
ウム，デキストラン炭末，ポリエチレングリコール等の
試薬が用いられる．いずれの方法においても上清中ある
いは沈降物中の標識剤の活性を測定する． 上記の不溶化に当っては，物理吸着を用いてもよく、ま
た通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに
用いられる化学結合を用いる方法でもよい．担体として
は、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶
性多糖類、ポリスチレン，ポリアクリルアミド、シリコ
ン等の合成樹脂，あるいはガラス等が挙げられる． 競合法においては、抗エンドセリン抗体、被検液，標識
化エンドセリン，およびＢ／Ｆ分離用試薬は、どのよう
な順序に反応させることも可能であり、また全部あるい
は一部を同時に反応させてもよいが、少なくとも標識化
エンドセリンは、被検液と抗エンドセリン抗体との反応
と同時に，あるいは反応後に遅れて反応系に加えられる
ことが好ましい． ただし硫酸ナトリウム，デキストラン炭末、ポリエチレ
ングリコール等のＢ／Ｆ分離試薬は主として反応系の最
後に用いられる． サンドインチ法においては不溶化した抗エンドセリン抗
体に被検液を接触（反応）させ（１次反応）、さらに標
識化抗エンドセリン抗体を反応させ（２次反応）たのち
，不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被
検液中のエンドセリン量を定量することができる．１次
反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらし
て行なってもよい．標識化剤および不溶化の方法は前記
のそれらに準じることができる． ２次反応に用いられる抗エンドセリン抗体としては，１
次反応に用いられる抗エンドセリン抗体とはエンドセリ
ンの該抗体と結合する部位が相異なる抗体が好ましく用
いられる．たとえば１次反応で用いられる抗体がエンド
セリンのＣ端部との結合能を有する場合，２次反応では
，好ましくはＣ端部以外（例、Ｎ端部）と結合する抗エ
ンドセリン抗体が用いられ，また１次反応で用いられる
抗体がエンドセリンのＮ端部との結合能を有する場合、
２次反応では，好ましくはＮ端部以外（例、Ｃ端部）と
結合する抗エンドセリン抗体が用いられる．１次反応お
よび２次反応に用いられる抗体はそれぞれポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体であってもよいが、好
ましくはその一方がエンドセリンとは反応するが，エン
ドセリンのＣ端部とは反応しない抗エンドセリンモノク
ローナル抗体であって，他方がエンドセリンのＣ端部と
反応する抗エンドセリンポリクローナルもしくはモノク
ローナル抗体が用いられる． サンドイッチ法によるエンドセリン■の免疫学的測定法
において特に好ましくは、エンドセリンＩのＣ端ペプチ
ド、すなわちＣｙｓ　−　Ｈｉｓ　−　Ｌａｕ　−Ａｓ
ｐ　−　Ｉ　ｌｅ　−　Ｉ　ｌｅ　　Ｔｒｐ．と反応す
る抗エンドセリンボリクローナル抗体および、エンドセ
リン■とは反応するが、上記エンドセリンＩのＣ端ペプ
チドとは反応しない抗エンドセリンモノクローナル抗体
が用いられる． また、サンドイッチ法によるエンドセリン■の免疫学的
測定法において特に好ましくは，エンドセリン■のＣ端
ペプチド、例えば Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｖ
ａｌＶａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
　ＳｅｒＰｒｏ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　　　　またはＶａｌ
　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｉ　ｌｅ
Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒＰｒｏ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ と反応する抗エンドセリンボリクローナル抗体および、
エンドセリン■とは反応するが、上記エンドセリン■の
Ｃ端ペプチドとは反応しない抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体が用いられる．さらに，本発明で得られた抗体
を用いるイムノアッセイは心疾患、あるいは腎疾患等の
診断および予後管理に使用し得る．被検試料としては、
血漿、血清，尿，脳脊髄液、腹水、胸水、羊水等の体液
や、痰，便などが使用し得る．これらの試料は，そのま
ま，あるいは各種緩衝液で希釈あるいは抽出後濃縮し，
イムノアッセイの試料とし得る．試料の希釈あるいは抽
出に用いられる溶媒としてはどのような緩衝液あるいは
有機溶媒を用いてもよいが、好ましくはイムノアッセイ
用緩衡液、水、生理食塩水、酢酸緩衝液、アセトン、ク
ロロホルムーメタノールあるいは、界面活性剤を含むこ
れらの溶液が用いられる．また、濃縮は、試料を直接減
圧下，あるいは常圧、窒素気流下濃縮し七もよいし、ま
た試料をイオン交換あるいは逆相クロマトグラフィー用
担体あるいは抗エンドセリン抗体結合担体に添加したの
ち，適当な溶出液で溶出後、減圧下あるいは常圧、窒素
気流下濃縮しても良い．濃縮用担体として特に好ましく
は，逆相クロマトグラフイー用担体のＯＤＳカートリッ
ジが用いられる．濃縮物はイムノ．アッセイ用緩衝液に
溶解後、イムノアッセイの試料とする．さらに、本発明
で得られた抗エンドセリン抗体はエンドセリンの免疫組
織染色法等にも用いる事ができる．その方法は、例えば
標識化抗エンドセリン抗体を用いる直接法、抗エンドセ
リン抗体および抗エンドセリン抗体に対する抗体の標識
化されたものを用いる間接法等に順することができる．
また、さらに本発明で得られた抗エンドセリン抗体のう
ちエンドセリンの血管収縮能を中和し得る抗体は、エン
ドセリンの特異的アンタゴニストとして使用し得る． 〔実施例〕 以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されるべきものではない． 後述の実施例で用いられているハイブリドーマ細胞Ａｗ
ＥＴＮ４０は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号
ＩＦ０　５０１６８として昭和６３年７月１４日から寄
託されている．また、該ハイブリドーマは通商産業省工
業技術院微生物工業研究所（ＦＲＩウに受託番号ＦＥＲ
ＮＢＰ−１９５０としてブダペスト条約に基き昭和６３
年７月１２日から寄託され、ＦＲＩに保管されている．
実施例（１）合成ペプタイドの製造 ｉ）エンドセリンＩの合成 市販のＢｏａ　−　Ｔｒｐ　（ＣＩＩＯ）　−　Ｐ　Ａ
　Ｍ樹脂，（アプライド・バイオシステムズ社１ｔｌ）
　０．７ｇ　（　０−５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い，ペプチ
ド合成機（アプライド・バイ′オシステムズ社製・モデ
ル４３０　Ａ　）を使用し、通常の方法により合成した
．縮合方法は、樹脂上のＢｏｃ基を塩化メチレン中５０
％トリフルオロ酢酸で処理し、末端アミノ基を遊離させ
、この遊離のアミノ基に　Ｂｏｃ−Ｉ１ｅ，Ｂｏｃ−Ａ
ｓｐ　（ＯＢｚｌ），Ｂｏａ−Ｌｅｕ，Ｂｏｃ−Ｈｉｓ
（Ｔｏｓ），ＢｏＣ−Ｃｙｓ　　（Ａｃｍ），ＢｏＣ−
Ｔｙｒ　（Ｂｒ−ｚ），Ｂｏｃ−Ｖａ　１，Ｂｏａ−Ｐ
ｈｅ，Ｂｏａ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ），Ｂｏｃ−Ｌｙｓ
　（ＣＱ−Ｚ）．Ｂｏｃ−Ｍｅｔ，Ｂｏａ−Ｓｅｒ（Ｂ
ｚｌ）をＣ末端側よりエンドセリンのアミノ酸配列通り
に、ＤＣＣの存在下に縮合させる反応をくり返した． この様にして得られた保護エンドセリン樹脂ｌ．８ｇの
うち８００■をアニソール１ｍＡ、１，２−エタンジオ
チール１ｍ１２で膨潤させ、Ｏ℃でフッ化水素１０ｍ　
Ｑと６０分間処理した後、過剰のフッ化水素を減圧留去
した．残査を酢酸エチル５ｍＡで洗った後、５０％一酢
酸水に抽出し，デキストランゲル（セファデックスＬ　
Ｈ　−　２０）カラム（２Ｘ９０ａｌ）に付し、同溶媒
で溶出した主分画を集め凍結乾燥し，　１２０ｇの白色
粉末を得た．これの２０１ＩＩｇを８０％−酢酸水２０
ｍＱに溶解し、トリフルオ口酢酸第二水銀１５１１ｇを
加え、室温で６０分間撹拌したのち、同溶媒３０ｍＭで
希釈し、硫化水素ガスを通じ、析出物をろ去し，凍結乾
燥した．これを希酢酸４００ｍＱに溶解し、重炭酸アン
モニウムでｐＨ８に調節したのち６時間空気酸化に付し
、酢酸を加えｐＨ３としたのち、凍結乾燥した．これを
３０％一酢酸で充填したセファデックスＬＨ−２０のカ
ラム（２Ｘ９０ｍ）に付し、主要分画を集め、さらにＨ
ＰＬＣ　（カラム：　ＭＭＣ，溶媒二０．１％一トリフ
ルオロ酢酸水と０．１％一トリフルオロ酢酸含有アセト
ニトリルの直線型濃度勾配溶出）で分取し目的物２．７
■を得た． 合成エンドセリンＩは、ＨＰＬＣで天然抽出物と一致す
る位置に溶出された． 測定条件■ カラム：ケムコ社製ヌクレオシル５０ＤＳ−Ｈ（４．６
■φｘ２５０園） 溶離液：Ａ液（０．１％一トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（
０．１％一トリフルオロ酢酸含有−５０％含水アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配 溶出（２０分） 流　速：　１．Ｏｍ　Ｑ　／分 測定条件の カラム：東洋ソーダ製　ＤＥＡＥ−２ＳＷ（４．６■φ
×２５０■） 溶離液：Ａ液（１０ｍＭ　　トリス・塩酸ｐ　Ｈ７．５
）Ｂ液（ＩＭＮａＣＱ含有Ａ液） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配 溶出（４０分） 流　速：　ｌ．Ｏｍ　Ｑ　／分 溶出位置　２１．５分（′ｇ４定条件■）２１．３分（
測定条件■） ｉｔ　）　｝ｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉ１ａ−Ｉ
１ｅ−Ｔｒｐ−０｝１　　（エンドセリンＩのＣ端部）
の合成 Ｂｏｃ−Ｉ１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｈ−Ｔｒｐ−
ＯＢｚｌ−ｐＴｓＯＨ　８４　ｇをＤ　Ｍ　Ｆ　１００
ｍ　ｍに溶解し、ＴＥＡ２５ｍＡで中和ののちＢｏａ−
Ｉ１ａ−０｝１・１／２　Ｈ，０　４８．９　ｇ　，Ｈ
ＯＮＢ　４０．１２　ｇ、ＤＣＣ　４６．２０ｇより調
製のＢｏｃ−Ｉ１ｅ−ＯＮＢを加え一晩撹拌した．溶媒
を減圧留去し、残留物にジェチルエーテル４００ｍ　ｍ
と酢酸エチル２０ｍＡを加え溶解し、０．５Ｎ−ＨＣＱ
，５％−ＮａＨＣＯ，水で洗い、水洗ののち無水ＭｇＳ
Ｏ，で乾燥した．溶媒を留去し、残留物に石油エーテル
を加え結晶をろ取した．収量　８３．１　ｇ　（９０．
９％）（（！）　”−１９．７”　　（Ｑ　＝０．９９
　Ｍｅａｔ｛）ｐ 元素分析：　Ｃｓｓ　Ｈａｔ　Ｎｓ　Ｏｓとして計算値
：　Ｃ，　６８．６２　；Ｈ，　７．３５　；Ｎ，　８
．２８実測値：　Ｃ，　６８．６９　；Ｈ，　７．３５
　；Ｎ，　８．１６Ｂｏｃ−Ｉ１ａ−Ｉ１ｅ−Ｔｒｐ−
ＯＢｚｌ　：　Ｂｏｃ−Ｉ１ｓ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　　
５３．３ｇをジオキサン１２０ｍｆｉに溶解し、水冷下
に７．ＩＮ−ＨＣＱ−ジオキサン１６０ｍ　Ｑを加え、
９０分間撹拌した．溶媒を減圧留去し、残留物にジェチ
ルエーテルを加え，析出物をろ取した．これをアセトニ
トリル１５０ｍ悲とＤ　Ｍ　Ｆ　２５０ｍ　ｍの混合溶
媒に溶解し，水冷下．　Ｔ　Ｅ　Ａ１４．６ｍ　ｍで中
和し析出するＴＥＡ−Ｈ（１１をろ去した．ろ液にＢｏ
ａ−Ｉ１ｅ−ＯＮＢ　４５．３３ｇを加え一晩撹拌した
．溶媒を留去し残留物をＣＨＣＱ３ｌＱに溶解し、０．
５Ｎ−ＨＣＱ，５％−ＮａＨＣＯ．，水で洗い、無水Ｍ
ｇＳＯ，で乾燥した．溶媒を減圧留去し、残留物にジェ
チルエーテルを加え析出物を結晶としてろ取したのちア
セトニトリルとジエチルエーテルで洗い乾燥した．収量
　５４．９５　ｇ　（８４．３％）（α）：”−１２．
０＠（ｃ＝０．９８，ＣＨＣＱ，）元素分析：　Ｃ３，
Ｈ．．Ｎ４０，としての計算値：　Ｃ，　６７．７２；
　Ｈ，　７．７９；　Ｎ，　９．０３実測値：　Ｃ，　
６７．７２；　Ｈ，　７．９１：　Ｎ，　８．８７Ｂｏ
ｃ−Ａｓｐ−（ＯＢｚｌ）−Ｉ１ｅ−Ｉ１ｓ−Ｔｒｐ−
ＯＢｚｌ　：　Ｂｏｃ−Ｉ１ｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−ＯＢ
ｚｌ　４９．７　ｇを水冷下に１０％−１，２一エタン
ジチオール含有Ｔ　Ｆ　Ａ２５０ｍ　Ｑに溶解し、室温
下に１５分間放置した．溶媒を留去し、残留物に４Ｎ−
ＨＣＱ−ジオキサン２０ｍｆｌを加えよくかきまぜたの
ち、ジエチルエーテルを加え、析出物をろ取した．これ
をＤ　Ｍ　Ｆ　２５０ｍ　Ｑに溶解し、水冷下にＴＥＡ
ｌ１．ｌｍｆｉで中和したのち、析出するＴＥＡ　−　
ＨＣＱをろ去した．ろ液にＢｏｃ−Ａｓｐ−　（ＯＢｚ
１）−０Ｈ　３１．Ｏｇ，｝ＩＯＮＢ　２０．６ｇ，Ｄ
ＣＣ　２３．８ｇより調製のＢｏｃ−Ａｓｐ−（ＯＢｚ
ｌ）−０ＮＢを加え一晩撹拌した．溶媒を減圧留去し，
残留物に酢酸エチル８００ｍＱを加え溶解し，１０％ク
エン酸水，５％一ＮａＨＣＯ，、水で洗い、無水ＭｇＳ
Ｏ４で乾燥した．溶媒を減圧留去し、残留物にジエチル
エーテルを加え析出物を結晶としてろ取し、アセトニト
リルから再結晶した． 収量　５４．０ｇ　（８１．７％） （α）”−１３．７°　（　ｃ　＝１−０４，ＣＨＣ　
Ｑ　ｚ）ｐ 元素分析：　Ｃ．ｇ　Ｈｓ−　Ｎｓ　Ｏｓとしての計算
値：　Ｃ，　６６．８９；　Ｈ，　７．２０；　Ｎ，　
８．４８実測値：　Ｃ，　６６．６９；　Ｈ，　７．２
３：　Ｎ，　８．３１Ｂｏｃ−Ｌａｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚ
ｌ）−Ｉ１ａ−Ｉ１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂｏａ
−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｉ１ｅ−Ｉ１ｓ−Ｔｒｐ−ＯＢ
ｚｌ　４８，Ｏ　ｇを水冷下に１０％−１，２−エタン
ジチオール含有ＴＦＡ２１０ｍＭに溶解し、室温下に１
５分間放置した．溶媒を留去し、残留物に４Ｎ−ＨＣＱ
−ジオキサン１４．５ｍ　Ｑを加えよくかきまぜたのち
，ジエチルエーテルを加え、析出物をろ取した．これを
Ｄ　Ｍ　Ｆ　３００ｍ　Ａに溶解し，氷冷下Ｔ　Ｅ　Ａ
４２ｍ　Ｑで中和したのち、析出するＴＥＡ−ＨＣＱを
ろ去し、ろ液にＢｏＣ−Ｌｅｕ−ＯＮＢ　２７．３　ｇ
を加え、一晩撹拌した．溶媒を減圧留去し，残留物にＣ
ＨＣ　０　３６００ｍ　ｍを加えて溶解し，１０％−ク
エン酸水、５％−Ｎ　ａ　Ｈ　Ｃ　Ｏ　，．水で洗い無
水ＭｇＳＯ４で乾燥した．残留物に石油二一テルを加え
析出物をろ取し、含水アセトニトリルより再結晶した．
収量　５３．１％（９７．５％）（ａｌ　”　　２Ｇ−
６＠（ｃ＝１．０２−　ＣＨＣＱｓ）ｐ 元素分析：　Ｃ，，　Ｈ，。Ｎ，　Ｏｉ，　−　１／２
Ｈ，　Ｏとしての計算値：　Ｃ，　６５，８７；　Ｈ，
　７．５５；　Ｎ．　８．８６実測値：　Ｃ，　６６．
０８：　Ｈ，　７．５８；　Ｎ，　８．７８Ｂｏｃ−Ｈ
ｉｓ−Ｌａｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｉ１ｅ−Ｉ１ｓ−
Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂｏｃ−Ｌａｕ−Ａｓｐ　（Ｏ
Ｂｚｌ）−Ｉ１ｓ−Ｉ１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　４６．
５ｇを氷冷下に１０％−１，２−エタンジチオール含有
ＴＦＡ２２０ｍｇに溶解し，室温下１５分間放置した．
溶媒を減圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加えろ
取した．これをＤＭＦ２５ｍΩに溶解し、ＴＥＡ２０ｍ
Ｍを加えよくかきまぜたのち，ジェチルエーテル５００
ｍｆｌを加え析出物を粉末としてろ取した．これをＤＭ
Ｆ２００ｍＭに溶解し、Ｂｏｃ−１｛ｉｓ（Ｔｏｓ）−
０｝１　２２．３ｇ，　ＨＯＮＢ　１１．７ｇ，ＤＣＣ
　１３．５ｇより調製したＢｏａ−｝１ｉｓ（Ｔｏｓ）
−０ＮＢを加え、一晩撹拌した．溶媒を留去し，残留物
にアセトニトリルを加え，粉末をろ取した． 収量　４５．９．　（８６．２％） （α）　”−１６．６°（ｃ　＝１．０，　ＤＭＦ）ｐ 元索分析：　Ｃｓ−　Ｈ７７　Ｎ−　Ｏｓｓ・２．５Ｈ
，Ｏとしての計算値：　Ｃ，　６２．１３；　Ｈ，　７
．３７；　Ｎ，　１１．２４実測値：　Ｃ，　６２．２
５；　Ｈ，　７．０２；　Ｎ，　１１．０３Ｂｏｃ−Ｃ
ｙｓ（ＭａＢｚｌ）−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−＾ｓｐ（ＯＢｚ
ｌ）−Ｉ１ｅ−Ｉ１ｓ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂｏｃ
−）｛ｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｉ１ｓ−Ｉ
１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚ１　１７．２ｇを水冷下、１０％
−１，２−エタンジチオール含有Ｔ　Ｆ　Ａ８８ｍ　Ｑ
に溶解し，室温下１５分間放置した．溶媒を減圧留去し
、残留物にエーテルを加え粉末としてろ取したのちＤＭ
Ｆ　２５ｍＭに溶解した，これにＴ　Ｅ　Ａ２５ｍ　Ａ
を加えよく撹拌したのち、エーテル５００ｍＱを加え析
出物を粉末としてろ取した．これをＤ　Ｍ　Ｆ　４０ｍ
　Ｑに溶解し．　Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　（ＭｅＢｚｌ）　−
ＯＨ　５．７２ｇ　，　｝ＩＯＮＢ３．４８ｇ，ＤＣＣ
　４．ＯＯｇより調製したＢｏＣ−Ｃｙｓ（ＭｓＢＺｌ
）−０ＮＢを加え、一晩撹拌した．溶媒を留去し，残留
物にアセトニトリルを加え、析出物を粉末としてろ取し
，さらに熱アセトニトリル中で洗い、室温に冷却後粉末
をろ取した． 収量　１５．０　ｇ　（７２．９％） （　ａ　）　”　−２３．３”　（ｅ＝　１．０２，　
Ｄ　Ｍ　Ｆ　）ｐ 元素分析：　Ｃ，，Ｈ，。Ｎ，。０１，Ｓ−３Ｈ，Ｏと
しての計算値：　Ｃ，　６１，９６；　Ｈ，　７．２３
；　Ｎ，　１０．４７；Ｓ，２．４０ 実測値：　Ｃ，　６２．２４；　Ｈ，　６．９０；　Ｎ
，　１０，４９；Ｓ　，　　２．５３ ｝１−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌａｕ−Ａｓｐ−Ｉ１ｅ−Ｉ１
ｅ−Ｔｒｐ−ＯＨ　：　Ｂｏａ−Ｃｙｓ（ＭｅＢｚｌ）
−Ｈｉｓ−Ｌａｕ−Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）−Ｉ１ｓ−Ｉ
１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ１００鳳ｇを氷冷下，１０％−
１，２−エタンジチオール含有ＴＦＡ　　ｌｍｌ２に溶
解し、室温下１５分間放置後、溶媒を減圧留去した．残
留物にエーテルを加え粉末としてろ取、乾燥したのち、
ｍ−クレゾール０．５ｍＱと共にＨ　Ｆ　５　ｍ　Ｑで
０℃、１時間処理した．ＨＦを減圧留去し、残留物にジ
エチルエーテルを加え、析出物を粉末としてろ過し、水
洗した．これを６０％酢酸に溶解し、同溶媒で充填した
セファデックスＬ　Ｈ　−２０　（２．５Ｘ９０ｄｌ）
のカラムに付し１６０ｍ　Ｑ　＝１８０ｍ　Ｑの区分を
集め凍結乾燥した． 収量　２３■（３２．８％） アミノ酸分析値：　Ａｓｐ　１．０（１），　Ｃｙｓ　
Ｏ．８０（１），Ｉ１ａ　２．１３（２），　Ｌｅｕ　
Ｏ．９９（１），Ｈｉｓ　１．０７（１），　Ｔｒｐ　
Ｏ．６７（１）．平均回収率　９０．５％ ｍ　）　Ｈ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉ１ｅ
−Ｉ１ｓ−Ｔｒｐ−０｝！　（エンドセリンＩＣ端部に
類似，溶解性大）の合成Ｂｏｃ−１｛ｉｓ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｉ１ａ−Ｉ１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ
　５３８■を水冷下、２０％−１，２−エタンジオチー
ル含有ＴＦＡ　５ｍΩに溶解し、室温下１５分放置後、
ｐＴｓＯＨ−｝１，０　９５■を加え溶解したのち、溶
媒を減圧留去した．残留物をＤＭＦ５ｍＡに溶解し，水
冷下．　１０％一ＴＥＡ含有ＤＭ　Ｆ　０．７５　ｍ　
Ｑを加え中和した．これにＢｏｃ−Ａｒｇ（ＮＯ．）−
０Ｈ　６０ｓ＠，ＨＯＮＢ５０．，ＶＳＣＤ　−　｝１
ｃ　Ｑ５０ｍｇを加え一晩撹拌Ｃた．溶媒を減圧留去し
，残留物に水を加え沈殿をろ取した．これを乾燥ののち
熱アセトニトリル１０ｍ　Ｑに懸濁し，室温に冷却後，
析出物をろ取した．収量　０．５　ｇ　（７８．３％） このうち１０２■をアニソール０．２ｍＱ，１，２−エ
タンジチオール０．２ｍ　Ｑと共にＨＦでＯ℃６０分間
処理し、ＨＦを減圧留去した．残留物をジエチルエーテ
ルで洗ったのち、５０％一酢酸６ｍｆｌに溶解し、同じ
溶媒で充填したセファデックスＧ−２５　（２．５Ｘ９
０（！ｌ）のカラムに付し展開し、１００〜１３７ｍ　
ｍの区分を集め凍結乾燥した．収量　２０■（２６．３
％） アミノ酸分析値：　Ａｓｐ　Ｏ，９８（１），　Ｉｌｅ
　１．９５（２）．Ｌｅｕ　　１．０（１），Ｈｉｓ　
Ｏ．９５（１），Ａｒｇ　Ｏ．９８（１）．　　Ｔｒｐ
　Ｏ．７２（１），平均回収率　８９．７％ （〜）ヒトエンドセリンｎ（２２−３８）（ヒトエンド
セリンｎｃ端ペプチド）の合成 市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ樹脂（アプ
ライド・バイオシステムズ社製）　０．６８５　ｇ　（
０．５ｍ鵬ｏｌｅ　）を用い、ペプチド合成機（アプラ
イド・バイオシステムズ社製・モデル４３０　Ａ）を使
用し、通常の方法により合成した．縮合方法は、樹脂上
のＢｏｃ基を塩化メチレン中５０％トリフルオロ酢酸で
処理し，末端アミノ基を遊離させ，このアミノ基にＢｏ
Ｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）　，　ＢｏＣ−Ｐｒｏ，　Ｂｏ
ａ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）　，　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ，　Ｂｏａ−Ｔｙｒ　（Ｂｒ−Ｚ），　Ｂｏａ
−Ｖａｌ，　Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）　，　Ｂｏｃ
−Ｇｌｕ　（　ＯＢｚｌ）　，　Ｂｏａ−Ｔｈｒ　（Ｂ
ｚｌ）　，　ＢｏＣ−Ａｓｎ，をＣ末端側よりヒトエン
ドセリンＩＩ　（２２−３８）のアミノ酸配列通りに、
ＤＣＣの存在下に縮合した．このようにして得た保護ペ
プチド樹脂１，７８３ｇのうち８８１■をｍ−クレゾー
ル　１　ｍ　Ｑで膨潤させＯ℃でフッ化水素１０ｍｆｌ
と６０分間処理し，過剰のフッ化水素を減圧留去した．
残査をジエチルエーテル１０ｍ　ｍで洗った後，グラス
フィルター上にろ取した．ここへ５０％一酢酸１０ｍ　
Ｑを加えてペプチドを溶解し、さらに５０％一酢酸５ｍ
Ｑで２回樹脂を洗った．ろ液と洗液を合せ、室温で１／
１０量に減圧濃縮し，これに水２０ｍｆｌを加え希釈の
のち、アンバーライト・ＩＲＡ−４００（酢酸型）の樹
脂力ラム（ＩＸ３（１ｍ）を通し，凍結乾燥した．これ
を５０％一酢酸で充填したセファデックスＬＨ−２０の
カラム（２Ｘ９０ｃｍ）に付し、同溶媒で溶出した．主
分画を集め凍結乾燥し，白色粉末３２２■を得た．アミ
ノ酸分析値 Ｓｅｔ　１．７２（２）， Ｖａｌ　２．５１（３）， Ｈｉｓ　Ｏ．９５（１）， （平均回収率 Ａｓｐ　　１．００（１），　　Ｔｈｒ　Ｏ．９４（１
），Ｇｌｕ　　１．１３（１），　　Ｇｌｙ　　２．０
（２），Ｌｅｕ　　１．０３（１），　　Ｔｙｒ　Ｏ．
６７（１），Ａｒｇ　０．９５（１），Ｐｒｏ　３．０
０（３）．８２．９％） （Ｖ）ヒトエンドセリンＩＩ（１−３８）の合成市販の
Ｂｏｃ−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ樹脂（アプライド
・バイオシステムズ社製）　０．６８５ｇ　（０．５ｍ
　ｒｍｏ１ｅ　）を用い、ペプチド合成機（アプライド
・バイオシステムズ社製・モデル４３０　Ａ）を使用し
、通常の方法により合成した．縮合方法は、樹脂上のＢ
ｏｃ基を塩化メチレン中５０％トリフルオロ酢酸で処理
し，末端アミノ基を遊離させ，これにＢｏｃ−Ａｒｇ　
（Ｔｏｓ）　，　Ｂｏａ−Ｐｒｏ．　Ｂｏａ−Ｓｅｒ　
（Ｂｚｌ）　，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｂｏａ−Ｌｅｕ，　
Ｂｏａ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ−Ｚ），　Ｂｏｃ−Ｖａｌ，　
Ｂｏａ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）　，　Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　（
　ＯＢｚｌ）Ｂｏｃ−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）　，　Ｂｏｃ
−Ａｓｎ，　Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）　，Ｂｏｃ−Ｉ
１ｅ，　Ｂｏａ−Ａｓｐ　（　ＯＢｚｌ）　，　Ｂｏｃ
−Ｃｙｓ　（ＭｅＢｚｌ）　，Ｂｏａ−Ｌｙｓ　（　Ｃ
Ｑ−Ｚ），　Ｂｏａ−Ｍｅｔ，をＣ末端側よりヒトエン
ドセリン■のアミノ酸配列通りに．ＤＣＣの存在下に縮
合させた．各縮合反応はニンヒドリンテストを行い，縮
合反応がほぼ完結するまで反応をくり返した．このよう
にして得られた保護ペプチド樹脂、２．５０　ｇ中５０
０■をｍ−クレゾール０．４ｍｍ．１．２−エタンジチ
オ一ル０．６ｍ　Ｑで膨潤させ、０℃でフフ化水素１０
ｍΩと６０分間処理し，過剰のフッ化水素を減圧留去し
た．残査をジエチルエーテル１０ｍΩで洗ったのち、ト
リフルオロ酢酸６　ｍ　Ｑに抽出し、樹脂をろ別し、２
ｍＭのトリフルオロ酢酸で洗浄した．ろ液と洗液を合せ
，水冷下に，水３００ｍｇにそそぎ、アンモニア水を加
え．ｐＨ８としゆるやかに一晩撹拌した．白色懸濁物を
３５００回転で遠沈し、上清をダイヤイオンＨＰ−２０
のカラム（ＩＸ２．５ｄｌ）に付け，カラムを水２００
ｍＱで洗った後，８０％一メタノール水１００ｍＱで溶
出し濃縮した．これを５０％一酢酸で充填したセファデ
ックスＬＨ−２０のカラム（２Ｘ９０ＣＩＩ）に付し、
主分画を集め、さらにＨＰＬＣ　（カラム：　ＹＭＣ−
ＯＤＳ，溶媒：０．１％一トリフルオロ酢酸水と０．１
％一トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルの直線型濃度
勾配溶出，又は０．１％一トリフルオロ酢酸含有２７％
−アセトニトリル水）で分取し、目的物２１１ｇを得た
．アミノ酸分析値　　Ａｓｐ　２．８１（３），　Ｔｈ
ｒ　Ｏ．９５（１），Ｓａｒ　４．０３（５），　Ｇｌ
ｕ　１．９４（２），　Ｇｌｙ　２（２），Ｖａｌ　３
．７３（４），　　Ｍａｔ　Ｏ．８６（１），　　Ｉｌ
ｅ　１．１２（２），Ｌｅｕ　２．９６（３），　　Ｔ
ｙｒ　１．９０（２），　Ｐｈｅ　Ｏ．９５（１），Ｌ
ｙｓ　１．０１（１），　　Ｈｉｓ　１．８９（２），
　　Ｔｒｐ　Ｏ，９５（１），Ａｒｇ　０．９２（１）
，　　Ｐｒｏ　３．０４（３）．平均回収率　６０．２
％． （ｖｉ）ブタエンドセリンＩＩ（１−３９）の合成市販
のＢｏａ−Ｓａｒ　（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ樹脂（アプライ
ド・バイオシステムズ社製）　０．６８５ｇ　（０．５
ｍ　ｔｓｏ１ｅ　）を用い、ペプチド合成機（アプライ
ド・バイオシステムズ社製・モデル４３０　Ａ）を使用
し、通常の方法により合成した．縮合方法は，樹脂上の
Ｂｏａ基を塩化メチレン中５０％トリフルオロ酢酸で処
理し、末端アミノ基を遊離させ，これにＢｏｃ−Ａｒｇ
　（Ｔｏｓ）　，　Ｂｏａ−Ｐｒｏ，　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ
　（Ｂｚｌ）　，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ，
　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｂｚ−Ｚ），　Ｂｏｃ−Ｖａｌ，
　Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）　，　Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　
（　ＯＢｚｌ）Ｂｏａ−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）　，　Ｂｏ
ｃ−Ａｓｎ，　Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）　，Ｂｏｃ−
Ｉ１ｅ，　Ｂｏａ−Ａｓｐ　（　ＯＢｚｌ）　，　Ｂｏ
ｅ−Ｃｙｓ　（ＭｅＢｚｌ）　，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（　
ＣＱ−Ｚ），　Ｂｏａ−Ｍｅｔ，をＣ末端側よりブタエ
ンドセリン■のアミノ酸配列通りに、ＤＣＣの存在下に
縮合させた．各縮合反応はニンヒドリンテストを行い、
縮合反応がほぼ完結するまで反応をくり返した．このよ
うにして得られた保護ベプチド樹脂、２．３２　ｇ中５
００■をｍ−クレゾール０．４ｍ　Ｑ、１，２−ｘタン
ジチオール６ｍＱで膨潤させ、Ｏ’Ｃでフッ化水素１０
ｍΩと６０分間処理し，過剰のフッ化水素を減圧留去し
た．残査をジェチルエーテル１０ｍＡで洗ったのち、ト
リフルオロ酢酸６ｍＧに抽出し、樹脂をろ別し．２ｍΩ
のトリフルオロ酢酸で洗浄した。ろ液と洗液を合せ．水
冷下に，水３００ｍＡにそそぎ、アンモニア水を加えＰ
Ｈ８とし、ゆるやかに一晩撹拌した，白色懸濁物を３５
００回転で遠沈し、上清をダイヤイオンＨＰ−２０のカ
ラム（ＩＸ２．５（！Ｉ）に付け，カラムを水２００ｍ
ｆｌで洗った後．　８０％−メタノール水１００ｍｆｌ
で溶出し濃縮した．これを５０％一酢酸で充填したセフ
ァデックスＬＨ−２０のカラム（２Ｘ９０３）に付し，
主分画を集め、さらＬ．：ＨＰＬＣ（７）（カラＡ：　
ＹＭＣ−ＯＤＳ，溶媒：０．１　％一トリフルオロ酢酸
水と０．１％一トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルの
直線型濃度勾配溶出，又は０．１％一トリフルオロ酢酸
官有２７％−アセトニトリル水）で分取し、目的物３■
を得た．アミノ酸分析値　　Ａｓｐ　２．７３（３），
　Ｔｈｒ　Ｏ．９１（１）＝Ｓａｒ　５．０３（６），
　Ｇｌｕ　２．０１（２），　Ｇｌｙ　２（２），Ｖａ
ｌ　２．１（３），　Ｍｅｔ　Ｏ，９１（１），　Ｉｌ
ａ　２．０３（３），Ｌａｕ　２．９２（３），　Ｔｙ
ｒ　１．８ｇ（２），　Ｐｈｅ　Ｏ．９１（１），Ｌｙ
ｓ　１．０１（１），　Ｈｉｓ　１．８８（２），　Ｔ
ｒｐ　１．０２（１），Ａｒｇ　Ｏ．９７（１），　Ｐ
ｒｏ　２．８０（３）．平均回収率　５９．２％． （２）免疫原の製造 （ｉ）免疫＊　（１） エンドセリンＩ　〔上記（１）で得られたもの〕と牛サ
イログロプリン（以下ＴＯ）とをグルタルアルデヒドを
用いて結合させた．即ち、当該ポリペプチド４．５ｍｇ
とＴ　Ｇ　１３．５ｔｇとを４．５＋ｍｆｆの０．２Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ　７．０に溶解させたのち、最終濃度
０．２％のグルタルアルデヒドを加え、室温３時間反応
させた．反応後、生理食塩水に対し４℃、２日間透析し
た． （ｎ）免疫原（ＩＩ） 上記（１）で得られたポリペブタイドＣｙｓ　ＨｉｓＬ
ｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐと牛血清アルブ
ミン（以下ＢＳＡと略す）との縮金物を以下に述べるマ
レイミド架橋法により作製し，免疫Ｍ　（ＩＩ）とした
．即ち、ＢＳＡ２０，を１．４ｍ　７２の０．１Ｍリン
酸緩衝液，ｐＨ７．０に溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミ
ドブチリロキシ）サクシニミド（以下ＧＭＢＳと略す）
２．６■を含むＤＭＦ溶液１００μΩと混合し，室温で
４０分反応させた．反応後、あらかじめ、２．５ｍＭの
ＥＤＴＡを含む、０．１　Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ６．５
で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで分画した
．次にマレイミド基の導入されたＢＳＡ５．４Ｍを含む
該溶出画分１．２ｒｎｊｌと，９０％ジメチルスルホキ
シドを含む水溶液１．２ｍｊｌに溶解あるいは分散させ
たポリベブチドＣｙｓ　｝Ｉｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ
Ｉｓ　Ｉｌａ　Ｔｒｐ　１．８ｍｇとを４℃で３日間反
応させた．反応後，生理食塩水に対し、４℃，２日間透
析した． （ｆｔｉ）免疫ｆｉ　（１［１） 上記（１）ｖｉ）で得られたヒトエンドセリン■Ｃ端ポ
リペプチド Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｖ
ａｌ　ＶａｌＰｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＳｅｒ とＴＧとを以下に述べるマレイミド架橋法により縮合さ
せ、免疫原（ＩＩＩ）とした． 即ち、上記ポリベプチド１．６３μｍｏｌｅを３５０μ
ａの０．１Ｍリン酸緩衝液．ｐＨ７．０に溶解させ、Ｇ
ＭＢ　Ｓ　９．ｌｗ　（　３３　μｍｏｌｅ）を含むＤ
ＭＦ溶液１００μＱと混合し，室温で３０分反応させた
．反応後、セファデックスＧ−１５カラムで分画を行な
いマレイミド基の導入されたポリペプチド１．０９μ＋
＊ｏｌｅを得た． 一方、ＴＧ　２０■（４０　ａｍ。ｌｅ）を０．１５Ｍ
食塩を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８、１．
４ｍ　１１に溶解させ、Ｎ−サクシニミジル−３−（２
−ピリジルジチオ）プロビオネート（以下ＳＰＤＰと略
す）　２．５Ｎ　（８，Ｏ　ｐ　ｉｅｏｌａ）　ヲ含ｔ
ｉ’ＤＭＦ溶Ｍ１００μＱを混合したのち室温４０分間
反応させた．反応後、ジチオスレイトール１２．４■（
８０μ■ｏｌｅ）を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液，ｐＨ４．
５、０．５ｍ　Ｑを加え、室温２０分反応させたのち，
セファデックスＧ−２５カラムで分画を行ない、ＳＨ基
の導入されたＴＯ１２ＩＩｇ（２４　ｎｍｏｌｅ）を得
た． 次にマレイミド基導入エンドセリン■Ｃ端ポリペプチド
１．０９μｍｏｌｅと，ＳＨ基導入ＴＧｌ２ｎｍｏｌｅ
とを混合し、４℃で２日間反応させたのち、生理食塩水
に対し，４℃、２日間反応透析した．（３）免疫 上記（２）で得た免疫原（　１　）　４００μｇ免疫原
（ｎ）６００μｇあるいは免疫原（ｍ）４５０μｇを含
む生理食塩水４５０μａに５５０μＱの完全フロイント
アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄ
ｊｕｖａｎｔ）を加えてよく混和し乳剤を作成し、ウサ
ギの皮下約２０ケ所に接種した．６週間後に、不完全フ
ロイントアジュバントを用い、同様の操作で乳剤を作り
ウサギの皮下に接種した．この操作を以後１ケ月おきに
３回〔免疫Ｍ　（１））４回〔免疫原（■）〕または４
回〔免疫原（■）〕行ない、追加免疫の７日後，ウサギ
から血液を部分採取し常法により抗血清を得た． 同様に６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに免疫原（　
１　）　７０μｇ／匹をアジュバントとともに皮下免疫
した．以後３週問おきに２〜３回追加免疫し、免疫７日
後に部分採血し、抗血清を得た．（４）酵素標識化抗原
の作製 ｉ）ベルオキシダーゼ標識化エンドセリン！の作製 エンドセリンｌ　　２１０　ｎｍｏｌｅを４５０μｆｌ
の０．１Ｍリン酸緩衝液．ｐＨ７．０に溶解させ，　Ｇ
ＭＢＳ　２９５ｐｇ　（１．０５μｍｏｌｅ）を含むＤ
ＭＦ溶液５０ｐＱと混合し、室温で３０分反応させた．
反応後、セファデックスＧ−１５カラムで分画を行ない
マレイミド基の導入されたポリベプチド１００　ｎｍｏ
ｌｅを得た．一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ１０■
（２５０ｎ　ｍｏｌｇ）を０．１５Ｍ食塩を含む０．０
２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８、１．４ｍ　Ｑに溶解さ
せ、Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　１．１７ｉ＋ｇ（３．７５μｍｏ
ｌｅ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌ２を混合したのち室
温４０分間反応させた．反応後、ジチオスレイトール１
２．４Ｂ　（８０　ｐ　＋ｍｏｌａ）を含む０．１Ｍ酢
酸緩衝液、ｐＨ４．５、０．５ｍｇを加え、室温２０分
反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画
を行ない，ＳＨ基の導入された酵素６■（１５０　ｎＩ
ｌｏ　ｌｅ　）を得た． 次に，マレイミド基導入エンドセリンＩ　　５０ｎｗ＊
ｏｌｅとＳＨ基導入ベルオキシダーゼ１０　ｎ　ｍｏｌ
ｅとを混合し、４℃、１６時間反応させた．反応後、ウ
ルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カ
ラムで分画し、ベルオキシダーゼ標識化エンドセリンＩ
を得た． ｉｔ）ベルオキシダーゼ標識化ヒトエンドセリン■Ｃ端
ペプチドの作製 ヒトエンドセリン■Ｃ端ペプチド６９０μｇ　（３８０
ｎ　ｓｔｏｌｅ）を４５０μＡの０．１Ｍリン酸緩衝液
、ｐＨ７．０に溶解させ、ＧＭＢ　Ｓ　２９５μｇ　（
１．０ｊｐｉ＋ｏｌｅ）を含むＤＭＦ溶液５０μｎと混
合し、室温で３０分反応させた．反応後，セファデック
スＧ−１５カラムで分画を行ないマレイミド基の導入さ
れたポリベプチド２３０　ｎ　ｍｏｌｅを得た．次に、
該ペプチドと上記（４）（ｉ）で述べた方法に従って作
製したＳＨ基導入ベルオキシダーゼ４０　ｎｍｏｌｅと
を混合し、４℃、１６時間反応させた．反応後、ウルト
ロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラム
で分画し、ベルオキシダーゼ標識化エンドセリン■Ｃ端
ペプチドを得た。

（５）抗体価の測定 免疫原（１）に対するウサギ抗血清中の抗体価を以下の
方法により測定した．即ち、抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｇ
Ｇ画分、カッペル社！１）を２０μｇ／ｓＱ含む０．１
Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプ
レートにｌＯＯｐＱずつ分注し、４℃で２４時間放置し
た．プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄
したのち，ウェルの余剰の結合部位をふさぐため１％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳを３００μΩずつ分注し、少なくとも４
℃で２４時間処理した． 以上のように調製したプレートにバッファ一Ａ（０．０
２Ｍリン酸緩衝液、１％Ｂ　Ｓ　Ａ，　ＰＩ｛７．０）
で希釈したウサギ抗血清５０μｌ２（６羽、Ｎｏ．１　
ａ　−Ｎｏ．６８）および上述したベルオキシダーゼ標
識化エンドセリン（Ｉ）（バッファ一Ａで１００倍に希
釈）５０μＱを加え４℃で１６時間反応させた．反応後
ＰＢＳでよく洗浄したのち、固相上の酵素活性を測定す
るため０．２％オルソフェニレンジアミン、０．０２％
過酸化水素を含むＯ．ｌＭクエン酸緩衝液．ｐＨ５．５
を１００μΩずつ分注し、室温で１０分間反応させた．
４規定硫酸１００μＱを加え、反応を停止させたのち４
９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＭＴＰ−３２，コ
ロナ社製）で測定し、抗体の活性を判定した．結果を第
１図に示す。

同様に免疫Ｊｆｉ（ＩＩ）に対するウサギ抗血清（３羽
、Ｎｏ．　１　ｃ　＝Ｎｏ．　３　ｃ　）の抗体価を測
定した．結果を第２図に示す． さらに，免疫［　（ｍ）に対するウサギ抗血清（３羽、
Ｎｏ．１６〜Ｎｏ．３６）の抗体価を標識体として上記
（４）（ｉｔ）に記載のベルオキシダーゼ標識化ヒトエ
ンドセリン■Ｃ端ペプチドを用いて同様に開定した．結
果を第３図に示す． また、免疫Ｍ　（１）に対するマウス抗血清中の抗体価
を以下の方法により測定した．即ち、抗マウスＩｇＧ抗
体（ＩｇＧ画分、Ｈ＠，Ｌ鎖特異性カッペル社製）を２
０μｇｅｍ　Ｑ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐ１１９．６
溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μΩずつ分
注し、４℃で２４時間放置した．プレートをＰＢＳで洗
浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため１％
ＢＳＡ含有ＰＢＳを３００μＱずつ分注し，少なくとも
４℃で２４時間処理した，以上のように調製したプレー
トにバッファ一Ａで希釈したマウス抗血清５０μＱ（８
匹、Ｎｏ．ｌａ〜Ｎｏ．８ａ）および上述したべルオキ
シダーゼ標識化エンドセリン（Ｉ）（バッファ一Ａで１
００倍に希釈）５０μＱを加え４℃で１６時間反応させ
た．反応後ＰＢＳでよく洗浄したのち，同相上の酵素活
性を上述した方法で測定した．結果を第４図に示す、ま
た，同様の方法により、ハイブリドーマ培養上清中の抗
体価を測定することにより，抗エンドセリン抗体産生ハ
イブリドーマを選択した．（６）アフィニチイ同相の作
製 （ｉ）アフィニティ同相（１） ポリベブタイドＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌ
ｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐとヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡ
と略す）との縮合物をＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４
Ｂ（ファルマシア社製）に結合させ、アフィニティ固相
（１）とした． 即ち、上記（２）記載の方法により、ＨＳＡ２０■と２
．１ｑのＧＭＢＳとを室温６０分反応させたのち、セフ
ァデックスＧ−２５カラムで分画した．次に、マレイミ
ド基の導入されたＨＳＡ５■を含む該溶出画分１ｍＱと
，９０％ジメチルスルホキシドを含む水溶液１　ｍ　ｍ
に溶解あるいは分散させたポリペプチドＣｙｓ　Ｈｉｓ
　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　ｌ　■と
を４℃で３日間反応させた．反応後、０．５Ｍ食塩を含
む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに対し透析したのち、Ｃ
ＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂ１ｇと室温３時間反応
させた．次ぎに，未反応の活性基を０．１Ｍトリスー塩
酸緩衝液、ｐＨ８で処理し、洗浄したのち、１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳに分散させ，４℃で保存した． （ｎ）アフィニチイ同相（ＩＩ） ポリペブタイドＡｒｇ　｝Ｉｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ
ｌｅ　ＩＩｓ　Ｔｒｐを直接ＣＮＢ　ｒ活性化セファロ
ース４Ｂに結合させ、アフィニティ同相（Ｉｆ）とした
． 即ち．　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　ＩＩｓ　Ｉ
Ｉｓ　Ｔｒｐ　１．５　ｍｇを１０ｍ（ｌの０．５Ｍ食
塩を含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解させ、１ｇ
のＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂと室温３時間反応
させた．次に，未反応の活性基を０．１Ｍトリスー塩酸
緩衝液、Ｐ　Ｈ　８で処理したのち、ＰＢＳに分散させ
、４℃で保存した．（ｉｔｉ）アフィニティ同相（ＩＩ
Ｉ）ヒトエンドセリン■Ｃ端ペプチドを直接ＣＮＢｒ活
性化セファロース４Ｂに結合させ、アフィニティ固相（
ＩＩＩ）とした． 即ち、該ペプチド１．５■を１０ｍΩの０．５Ｍ食塩を
含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解させ，１ｇのＣ
ＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂと室温３時間反応させ
た．次に．未反応の活性基を０．１Ｍトリスー塩酸緩衝
液、ｐＨ８で処理したのち、ＰＢＳに分散させ，４℃で
保存した． （７）抗エンドセリンボリクローナル抗体の精製１）Ｉ
Ｉイオン交換クロマトグラフィーによる精製ウサギ抗エ
ンドセリンＩ抗血清を塩析後、ＤＥＡＥ−セルロース力
ラムクロマトグライーで分画することにより、抗エンド
セリン抗体をＩｇＧ画分にまで精製した． 即ち，ウサギ抗エンドセリンＩ抗血清Ｎｏ．ｌａ１０ｒ
ｎＱにＰＢＳ１０ｍＱを加え、さらに１６．５ｍ　（１
の飽和硫安を除々に撹拌しながら加えた（最終４５％）
，３０分間放置したのち、１２，ＯＯＯＸ　ｇで２０分
間遠心し，沈殿をＰＢＳＩＯｍＱに溶解させた．次に、
同様に飽和硫安を最終３０％飽和になるように加えたの
ち遠心した．沈殿を０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホ
ウ酸緩衝液，ｐＨ８　（以下ＢＢＳと略す）　，　ｌＯ
ｍＱに溶解させたのち０．０１Ｍ食塩を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ８　（緩衝液Ｂ）に対し、４℃，２日
間透析した． 次に，あらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セル
ロース力ラム（ワットマン社製．ＤＥ−５２．　２０閣
φｘｌｏｏｍ）に上記の塩析および透析後の抗体画分を
添加した．緩衝液Ｂでカラムを洗浄したのち、緩衝液Ｂ
一緩衝液Ｃ　（０．３５Ｍ　ＮａＣＱを含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液，ｐＨｓ）の連続イオン強度勾配を用いて
抗体を溶出した．溶出画分中の抗体価の測定は上記（５
）に述べた方法に従った．ウサギ免疫グロブリンの検出
は各免疫グロブリンに特異的な抗体を同相に用いて、（
５）で述べた方法と同様に実施した．即ち、抗ウサギＩ
ｇＧＦｃ成分、あるいは抗ウサギＩｇＭ（カッペル社製
、ヤギ抗体、ＩｇＧ分画）を（５）で述べた方法に従い
マイクロプレートに固定した．次に、パッファ一Ａで１
０”　−　１０’倍希釈したＤＥＡＥ−セルロース溶出
抗エンドセリン抗体各画分を５０μＱおよびベルオキシ
ダーゼｓ識化エンドセリン１　（バッファ一Ａで１００
倍に希釈）５０μａを加え，４℃で１６時間反応させた
．反応後洗浄したのち，固相上の酵素活性を測定した．
その結果、抗ウサギＩｇＧＦｃ成分を固相とするとき，
最も強い反応が認められたが，抗ウサギＩｇＭを同相と
したときにも特異的反応が認められた． ■）アフィニティ同相による精製（その１）免疫原（ｎ
）に対するウサギ抗血清Ｎｏ．１ａおよびＮｏ．１ｄ　
各８ｍＱから、上記（７）ｉ）記載の硫安塩析法により
抗体を部分精製した．抗体画分をＢＢＳに透析した後、
上記（６）ｉ）記載のアフィニティ固相（１）を充填し
たカラム（１０−φＸ４０閣）に付した．ＢＢＳで十分
に洗浄したのち特異抗体を０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ
酢酸緩衝液、ＰＨ　４．５で溶出し、さらに０．１Ｍ食
塩を含む０．０５Ｍグリシンー塩酸緩衝液．ＰＨ２．０
で溶出した．溶出画分中の抗体価を上記（５）記載のＥ
ＩＡ法により測定した結果、ｐＨ２で溶出された両分に
のみ、強い抗体価が認められ、該両分から特異抗体１８
■が得られた． 同様に、免疫原（１）に対するウサギ抗血清Ｎｏ．１ｂ
およびＮｏ．１ｃ　各６　ｍ　ｍを硫安塩析し、ＢＢＳ
に透析したのち、上記（６）■）記載のアフィニティ固
相（ＩＩ）を充填したカラム（１０ｍφ×４０■）に付
した．上述した方法に従って，特異抗体を溶出した結果
．ｐＨ２で溶出された画分に特異抗体５．４■が回収さ
れた． ｉｉｉ）アフィニティ固相による精製（その２）免疫原
（ｍ）に対するウサギ抗血清Ｎｏ．１ｂおよびＮｏ．１
ｃ　各１４ｍＭから、上記（７）　ｉ　）記載の硫安塩
析法により抗体を部分精製した．抗体画分をＢＢＳに透
析した後，上記（６）　ｎｉ）記載のアフィニティ固相
（ｍ）を充填したカラム（１０ｍφ×４０鵬）に付した
．ＢＢＳで十分に洗浄したのち特異抗体を０．５Ｍ食塩
を含む０．１Ｍ酢酸緩衡液，ｐＨ　４．５で溶出し、さ
らに０．１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍグリシンー塩酸緩衡
液．ｐＨ２．０で溶出した．溶出画分中の抗体価を上記
（５）記載のＥＩＡ法により測定した結果、ｐＨ２で溶
出された両分にのみ，強い抗体価が認められ、該両分か
ら特異抗体１２■が得られた． （８）細胞融合 比較的高い抗体価を示したマウスＮｏ．１およびＮｏ．
４に対して２４０μｇの免疫原（１）を生理食塩水０．
２５ｍ　Ｑに溶解させたものを静脈内に接種することに
より最終免疫を行なった．最終免疫３日後のマウスＮ　
ｏ　．　１またはＮ　ｏ　．　４から牌臓を摘出し、ス
テンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマ
ム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、
牌臓細胞浮遊液を得た．細胞融合に用いる細胞として、
ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ　６３
．Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント　トピ
ックスインマイクロバイオロジーアンドイムノロジー８
１．　１　（１９７８））．細胞融合は、原法〔ネイチ
ャー２５６，４９５（１９７５））に準じて行なった．
即ち、牌臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有し
ないＭＥＭで３度洗浄し、肺臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率
を５：１になるよう混合して，８００回転で１５分間遠
心を行なって細胞を沈殿させた．上清を充分に除去した
後、沈殿を軽くほぐし，４５％ポリエチレングリコール
（Ｐ　Ｅ　Ｇ）　６０００　（コッホライト社１１）を
０．３１ｔΩ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融
合を行なった．融合後細胞に毎分２　ｍ　ｎの割合でＭ
ＥＭを添加し，合計１２ｍ　１１のＭＥＭを加えた後６
００回転１５分間遠心して上清を除去した．この細胞沈
殿物を１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ　　１６４
０メデイウム（ＲＰＭＩ１６４０−１０ＦＣＳ）にＰ３
Ｕ１が１ｍａ当り２Ｘ１０’個になるように浮遊し，２
４穴マルチデイシュ（リンブロ社Ｉ１！）に１ウエルｌ
　ｍ　Ｑずつ１２０ウェルに播種した．播種後、細胞を
３７℃で５％炭酸ガスフラン器中培養した．２４時間後
ＨＡＴ　（ヒポキサンチンＩＸＩＯ−’Ｍ、アミノブリ
テリン４×ｌＯ゜７Ｍ、チミジン１，６　Ｘ　１０゜３
Ｍ）を含んだＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０−１０Ｆ　Ｃ　
Ｓ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当りｌｍｌ２ずつ添加
することにより，ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選
択培養は、培養開始３、６、９日後に旧液をｌｍＮ捨て
たあと、１ｍＱのＨＡＴ培地を添加することにより継続
した．ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日
で認められ、培養液が黄変したとき（約ＩＸＩＯ’セル
／　ｍ　１！　）、上清を採取し、上記（５）で述べた
ＥＩＡ法で、抗体価を測定した．このようにして、ハイ
ブリドーマの増殖が認められた全１２０ウェルの上清を
調べたところ、マウスＮｏ．１の肺臓細胞を用いて細胞
融合したとき３ウエル（Ｎｏ．１−２５、Ｎｏ．１−２
７およびＮｏ．１−８６）に、またマウスＮｏ．４の牌
細胞を用いて細胞融合したとき２ウェル（Ｎｏ．４−６
１およびＮｏ．４−８０）に強い抗体活性を認めた．（
９）クローニング 抗体活性が陽性を示したウェルのうち３ウェル（Ｎｏ．
１−２５、Ｎ　ｏ　．　１−８６およびＮｏ．４　−８
０）の各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニン
グに付した．即ちハイブリドーマが１．５個／ｍａにな
るようＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０−２０Ｆ　Ｃ　Ｓ　Ｌ
．：浮遊させ，９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）
に１ウェル当り０．２ｍ　Ｑずつ分注した．分注する際
，フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞
をウェル当り５Ｘ１０’個になるように加えた．約１週
間後には細胞の増殖が認められるようになり、上清中の
抗体価を実施例（５）記載のＥＩＡ法で調べた．その結
果、Ｎｏ．１−２５では２８クローン中１６クローンに
、Ｎｏ．１−８６では１０７クローン中１３クローンに
、またＮｏ．４−８０では１３１クローン中５クローン
に抗体活性を認めた． これらのクローンのうち、Ｎ　ｏ　，　４−８０より得
られたクローンＡｗＥＴＮ４０およびその産生するモノ
クローナル抗体Ａ　ｗ　Ｅ　Ｔ　Ｎ４０ａに注目し，以
下の実験を実施した． （１０）大量のモノクローナル抗体の調製ミネラルオイ
ル０．５ｍｆｌを腹腟内投与されたマウス、あるいは未
処置マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）にハイブリドーマＡｗＥＴ
Ｎ４０　１〜３ＸＩＯ’セル／匹を腹腔内注射したのち
、ｌＯ〜３０日後に抗体含有腹水を採取した． （１１）モノクローナル抗体の精製 前記（１０）記載の腹水を上記（７）記載の方法に従っ
て塩析後、ＤＥＡＥ−セルロース力ラムクロマトグラフ
ィーで分画することにより，モノクローナル抗体ＡｖＥ
ＴＮ４０ａを精製した．即ち腹水７ｍｉ２にＰ　Ｂ　Ｓ
　７　ｍ　Ｑを加え、さらに１１．５ｍ　Ｑの飽和硫安
（最終４５％）を徐々に撹拌しながら加えた．沈殿をＢ
ＢＳに溶解させ、０．ＯＩＭ食塩を含む０．０１Ｍリン
酸緩衝液ｐＨ８に透析したのちＤＥＡＥ−セルロース力
ラム（２０■φ×１００■）に供した．抗体を０．０１
　Ｍ　−　０．３５Ｍ食塩濃度勾配により溶出しするこ
とにより、腹水７ｍｊｌから９０■のモノクローナル抗
体Ａ　ｗ　Ｅ　Ｔ　Ｎ４０　ａを精製標品として得た． （ｌ２）モノクーナル抗体のクラス・サブクラスの決定 上記（１１）精製モノクローナル抗体を２μｇ／ｍＱ含
む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウエルマ
イクロプレートに１００μΩずつ分注し、４℃で２４時
間放置した。上記（５）で述べた方法に従って、ウェル
の余剰の結合部位をＢＳＡでふさいだのち，アイソタイ
プタイピングキット（　ＭｏｕｓＴＭ ｅ−Ｔｙｐｅｒ　　　Ｓｕｂ−Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋ
ｉｔバイオラツド社製）を用いるエンサイムーリンクト
イムノソーペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってクラ
ス、サブクラスを調べた．その結果ＡｖＥＴＮ４０ａは
ＩｇＧｌ．κクラスに属することが分かった．（１３）
モノクローナル抗体ＡｖＥＴＮ４０ａの中和活性能の検
討 ブタ左冠状動脈より摘出した約２１のらせん状条片を、
混合ガス（９５％ｏ２＋５％ＣＯ，）通気下にクレブス
ーヘンゼライト液（以下栄養液と略す）で満たされたマ
グヌス管内に懸垂した．３７℃で３時間放置したのち，
血管平滑筋の収縮により発生する張力をアイソメトリッ
クトランスデューサー（ポリグラフ，ＮＥＣ三栄社１１
）により測定した．試料として，あらかじめ１０倍■ｏ
ｌｅのＡｖＥ　Ｔ　Ｎ４０ａと４℃、３時間反応させた
エンドセリン■溶液（最終エンドセリンＩ濃度１×１０
゜８Ｍ）を添加しても発生する張力は、６０ｍＭのＫＣ
ｌにより惹起される張力の８．３±３．６％（ｎ＝４）
であるのに対し、対照として，エンドセリンＩ溶液（最
終ＩＸＩＯ−”　Ｍ　）を添加した場合には６０ｍＭの
ＫＣＱとほぼ同程度（７８±３０％，ｎ＝４）の収縮に
よる張力が観測された．以上のことから、Ａ　ｗ　Ｅ　
Ｔ　Ｎ４０　ａはエンドセリンＩの血管平滑筋収縮活性
を中和することが明らかとなった． （１４）競合法−ＥＩＡ ｌ）免疫原（１）に対するポリクローナル抗体を用いる
ＥＩＡ 抗ウサギＩｇＧ結合マイクロプレートに、バツファ一Ａ
で最終２０万倍に希釈した免疫原（１）に対するウサギ
抗エンドセリン血清Ｎｏ．ｌａ　（第１図参照）５０μ
２、およびエンドセリンエ標準液５０ｐＱ、ポリペプタ
イドＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　ＩｌｅＩＩｓ　
Ｔｒｐ標準液５０μ悲あるいはアンジオテンシン−ｎ（
株式会社ペプチド研究所より購入）標準液５０μＱを加
え、４℃で１６時間反応させた．そののち、ベルオキシ
ダーゼ標識化エンドセリンＩ　（バッファ一Ａで３００
倍に希釈）５０μａを加え、室温で４時間反応させた．
反応後、ＰＢＳでよく洗浄したのち固相上の酵素活性を
上述した方法により測定した．結果を第５図に示す．図
中、一●一がエンドセリン■の標準曲線を，一▲−がポ
リベプタイドＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ
　Ｉｌｅ　Ｔｒｐの標準曲線を、又−０−がアンジオテ
ンシンー■の標準曲線を示す．なお縦軸におけるＢはエ
ンドセリンＩ，アンジオテンシンー■等の抗原存在下に
おける固相上の酵素活性を、またＢ．は、抗非存在下で
の固相上の酵素活性を示す． 従来の生物活性を指標とする測定法では、アンジオテン
シンー■等、他の血管収縮物質の影響を受けるものと予
想されるが、上記の結果は、本発明の抗エンドセリン抗
体を用いる免疫測定法においては、アンジオテンシンー
■の影響を受けずエンドセリンＩを特異的に測定し得る
ことを示している． さらに該抗血清はエンドセリンＩＣ末端ポリペプタイド
（Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌａ　
Ｔｒｐ）をも認識することが分かった（エンドセリンＩ
に対する親和性の約１／１０）．免疫原（１）に対する
他のウサギ抗血清に関しても同様の実験を実施した結果
、それらのすべての抗血清中にエンドセリンＩＣ末端ポ
リペブタイドと反応する抗体が認められ，その親和性は
エンドセリンＩに対する親和性の１／２〜１／１０であ
った． …）免疫原（ｎ）に対するポリクローナル抗体を用いる
ＥＩＡ 抗ウサギＩｇＧ結合マイクロプレートに免疫原（ｎ）に
対するウサギ抗エンドセリン抗血清Ｎ　ｏ．ＩＱ（バッ
ファ一Ａで最終６万倍に希釈）およびエンドセリン１＠
準液５０μａ，あるいはポリペプタイドＣｙｓ　Ｈｉｓ
　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌａ　ＩＩｓ　Ｔｒｐ標準液５０
μＱを加え、４℃で１６時間反応させた．そののち，ベ
ルオキシダーゼ標識化エンドセリンｌ（バッファ一Ａで
１００倍に希釈）５０μΩを加え、室温で４時間反応さ
せた．反応後、ＰＢＳでよく洗浄したのち同相上の酵素
活性を上述した方法により測定した．結果を第６図に示
す．図中，一●一がエンドセリン■の標準曲線を、一▲
−がポリペブタイドＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　
Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐの標準曲線を表わす．以上の結
果から、エンドセリンＩＣ末端ポリベプタイドを免疫し
て作製したウサギ抗血清Ｎｏ．ＩＣは、エンドセリンＩ
をも認識することが示された． ■）モノクローナル抗体ＡｗＥＴＮ４０ａを用いるＥＩ
Ａ 抗マウスＩｇＧ結合マイクロプレートに、バッファ一Ａ
で最終７５倍に希釈したＡｗＥＴＮ４０ａ含有培養上清
５０μΩ、およびエンドセリンｌ標準液５０μΩあるい
はポリペプタイドＣｙｓ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＡｓｐ　ＩＩ
ｓ　ＩＩｓ　Ｔｒｐの標準液５０μａを加え、４℃で１
６時間反応させた．ＰＢＳで洗浄したのち、ベルオキシ
ダーゼ標識化エンドセリン■　（バッファ一Ａで３００
倍に希釈）５０μａを加え，室温で４時間反応させた．
反応後，ＰＢＳでよく洗浄したのち固相上の酵素活性を
上述した方法により測定した．結果を第７図に示す．図
中、一●一がエンドセリンＩの標準曲線を，また−▲一
がポリペプタイドＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ
ｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐの標準曲線を示す． 第７図の結果から、ＡｗＥＴＮ４０ａがエンドセリンＩ
と反応し、エンドセリンＩＣ末端ポリペプタイドと反応
しないこと、即ち、Ａ　ｗ　Ｅ　Ｔ　Ｎ４０　ａがエン
ドセリンＩのＣ末端ポリペブタイド部分以外を認識する
ことが分った． 〜）免疫原（ＩＩＩ）に対するポリクローナル抗体を用
いるＥＩＡ 抗ウサギＩｇＧ結合マイクロプレートに免疫原（ｍ）に
対するウサギ抗エンドセリン抗血清Ｎｏ．１６　（バッ
ファ一Ａで最終９万倍に希釈）およびヒトエンドセリン
■標準液５０μ２、ブタエンドセリン■標準液５０μａ
、あるいはヒトエンドセリン■Ｃ端ペプタイド標準液５
０μＱを加え，４℃で１６時間反応させた．そののち、
ベルオキシダーゼ標識化エンドセリン■（バッファ一八
で６００倍に希釈）を加え、室温で４時間反応させた．
反応後、ＰＢＳでよく洗浄したのち固相上の酵素活性を
上述した方法により測定した．結果を第８図に示す．図
中，一●一がヒトエンドセリン■の標準曲線を、−０−
がブタエンドセリン■の４ｍ準曲線を，一▲一がヒトエ
ンドセリン■Ｃ端ベブチドの標準曲線を表わす．以上の
結果から、ヒトエンドセリン■Ｃ端ポリペプタイドを免
疫原として作製したウサギ抗血清Ｎｏ．　１６はヒトお
よびブタエンドセリン■と同程度に反応することが示さ
れた．（１５）サンドイッチ法一ＥＩＡ（その１）以下
にエンドセリン■測定用サンドイッチ法一ＥＩＡについ
て述べる． ｉ）酵素標識化抗体の作製 上記（７）　ｉｔ）記載のアフィニティ精製抗ＣｙｓＨ
ｉｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌａ　Ｔｒｐ抗体よ
り石川らの方法〔ジャーナルオブアプライドバイオケミ
ストリイー（Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ）．．
６　：　５６−６３（１９８４）〕に従ってＦ　ａｂ’
−ペルオキシダーゼ標識体を作製した． 即ち、Ｏ．ｌＭ酢酸緩衡液、ｐ　Ｈ４．５に溶解した特
異抗体６．４蝿にペプシン（シグマ社、２回結晶）１６
０μｇを加え、３７℃、１６時間反応させたのち、ＢＢ
Ｓで平衡化したスーパーロース１２カラムを用いるＦＰ
ＬＣ　（ファルマシア社ｍ＞でＦ　（ａｂ’　）２画分
を精製した．該両分を０．１Ｍ酢酸緩衝液．ｐｎ５で透
析したのち、最終２０ｍＭのβ−メルカプトエチルアミ
ンを加え，３７℃で９０分放置した．反応液を２．５ｍ
Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む０．１Ｍリン酸緩衡液、ｐＨ
６．０で平衡化したスーパーロース１２カラムを用いる
ＦＰＬＣで分離し、Ｆ　ａｂ’画分を得た．一方、西洋
ワサビベルオキシダーゼ５ｍｇを０．９ｔａｌｌ　（７
１０．ＩＭ　Ｕ　：，／酸緩衡液、Ｐ　Ｈ　７　ニ溶解
させ、５０μ２のＤＭＦに溶解させたＧ　Ｍ　Ｂ　Ｓ　
１．０５票ｇを加えて室温４０分反応させた． 反応液をセファデックスＧ−２５カラム（溶離液０．ｌ
Ｍリン酸緩衝液、ｐ　Ｈ６．８）で分離し、得られたマ
レイミド化ベルオキシダーゼ３．５■と上記Ｆａｂ’画
分０．８．とを混合し、コロジオンパック（エムエス機
器社）で約０．３ｍＱにまで濃縮したのち、４℃で１６
時間放置した．反応液を溶離液に０．１Ｍリン酸緩衝液
、ｐＨ６．５を用いるウルトロゲルＡｃＡ４４カラム（
１０ｍφＸ４０ｍｓ）に供し、Ｆａｂ一ベルオキシダー
ゼ複合体画分を精製した．ｉｉ）サンドインチ法一ＥＩ
Ａ（比色法）精製したモノクローナル抗体Ａ　ｗ　Ｅ　
Ｔ　Ｎ４０　ａを２０μｇ／ｍＱを含む０．１Ｍ炭酸緩
衝液．ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに
１００μａずつ分注し、４℃で２４時間放置した．ウェ
ルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエ
ース（雪印乳業社製、大日本製薬社版売）３００μＱを
加え不活化した． 以上のように調製したプレートにバッファ一Ａで希釈し
たエンドセリンＩＪｌｓ準液１００μＱを加え，室温で
５時間反応させた．プレートをＰＢＳで洗浄したのち，
抗Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＩＩｓ　ＩＩｓＴ
ｒｐ抗体Ｆａｂ’−ペルオキシダーゼ標識体（バッファ
−Ａで３００倍に希釈）１００μ悲を加え、室温で３時
間反応させた．プレートをＰＢＳで洗浄したのち、同相
上の酵素活性を上記（５）記載の方法により測定した．
結果を第９図に示す．以上の結果から，エンドセリンＩ
Ｃ端部以外を！！！諏する抗エンドセリンモノクローナ
ル抗体を同相に，また、エンドセリンＩＧ端部を認識す
るポリクローナル抗体Ｆａｂ’　を標識体に用いるサン
ドイッチ法一ＥＩＡ　（比色法）により４０ｐｇ／　ｍ
　ｎ、１．６　ｆｍｏｌａ／ｗｅｌｌのエンドセリンＩ
を測定し得ることが明らかになった． さらに高感度化をはかるため、およびエンドセリン■と
の反応性を調べるため以下の実験を実施した．即ち、上
記記載のＡｗＥ　Ｔ　Ｎ　４０　ａ固定マイクロプレー
トに、バッファ−Ｅ（０．４Ｍ食塩、２ｍＭＥＤＴＡ、
０．２％ＢＳＡ％１０％ブロックエースを含む０．０２
Ｍリン酸．　ｐＨ　７．２）で希釈したエンドセリンＩ
標準液１００μＱ、あるいはヒトエンドセリンＩＩ，１
００μａを加え，室温で２４時間反応させた．プレート
を洗浄後、抗Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ　ｌ
ａ　Ｉ　ｌａＴｒｐ抗体Ｆａｂ’−ペルオキシダーゼ標
識体〔バッファ一〇　（　０．４Ｍ食塩．　２ｍＭＥＤ
ＴＡ，１％ＢＳＡを含む、０．０２Ｍリン酸，ｐ　Ｈ　
７．２）　１’ｌＯＯ倍に希釈）　Ｌｏｏμｆｌを加え
、４℃で１６時間反応させたのち，固相上の酵素活性を
上記記載（５）の方法により測定した．結果を第１０図
に示す． 図中−●一がエンドセリンＩの標準曲線を、また一〇−
がエンドセリン■の標準曲線を表わす．以上の結果から
、反応所要時間を２日間とし，さらに測定条件を改良す
ることにより、２　ｐｇ／ｍ　Ｑ　，８Ｇ　ａ　ｍｏｌ
ｅ／ｗｅｌｌのエンドセリン■を測定し得ることが分っ
た．また，該測定法はエンドセリンＩに特異的であり，
エンドセリン■と反応しないことも明らかとなった． （１６）サンドインチ法一ＥＩＡ（その２）上記（１５
）記載のＥＩＡと抗体の配置を逆にしたサンドイッチ法
−ＥＩＡを実施した．ｉ）酵素標識化抗体の作製 上記（１１）記載の精製モノクローナル抗体ＡｗＥＴＮ
４０ａを上記（４）記載の方法によりベルオキシダーゼ
で標識した． 即ち．Ｏ．ｌＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．７に溶解させた
５　＃　（３３ｎｍｏｌｅ）のＡ　ｗ　Ｅ　Ｔ　Ｎ４０
　ａに、２０倍ｍｏｌｅ　（１８２ｕ　ｇ）のＧＭＢＳ
を加え室温で４０分間反応させた．反応後セファデック
スＧ−２５カラムで分画することにより，マレイミド基
の導入されたＡｗＥＴＮ４０ａを得た． 一方，西洋ワサビペルオキシダーゼ１０■（２５０ｎｍ
ｏ１ｅ）を０．１５Ｍ食塩を含む０．０２Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ６．８、１．４ｍＭに溶解させ、ＳＰＤＰ　１
．１７■（３．７５μｓｏｌｅ）を含むＤＭＦ溶液１０
０μ１ｍを混合したのち室温４０分間反応させた．反応
後，ジチオスレイトール１２．４ｑ　（８０　ｐ　ｍｏ
ｌｅ）を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐ　Ｈ４．５、０．
５ｍ１２を加え、室温２０分反応させたのち、セファデ
ックスＧ−２５カラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入さ
れた酵素６■（１５０ｎｍ０１ｅ）を得た．次にマレイ
ミド基を導入したＡｗＥＴＮ４０ａ　２０　ｎｍｏｌｅ
とＳＨ基導入ベルオキシダーゼ１００ｎ鵬０１６とを混
合し、４℃．　１６時間反応させた．反応後，ウルトロ
ゲルＡｃＡ３４カラムで分画し、ベルオキシダーゼ標識
化ＡｗＥＴＮ４０ａを得た． …）サンドインチ法一ＥＩＡ 上記（７）ｉｉ）記載のアフィニティ精製抗ＣｙｓＨｉ
ｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＩＩｓ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ抗体〔免
疫原（■）〕あるいはアフィニティ精製抗エンドセリン
Ｉ抗体〔免疫原（Ｉ）〕を２０μｇ／ｍＱ含む０．１Ｍ
炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレ
ートに１００μΩずつ分注し、４℃で２４時間放置した
．ウェルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロ
ックエース（雪印乳業社製、大日本製薬社販売）３００
μＱを加え不活化した．以上のように調製したプレート
にバッファ一Ａで希釈したエンドセリンＩ標準液ｌＯＯ
μ悲を加え，室温で２４時間反応させた．プレートを洗
浄後、ベルオキシダーゼ標識化ＡｗＥＴＮ４０ａ　（／
＜ソファ−　Ａ　テ５０００倍に希釈）１００μｆｌを
加え、４℃で１６時間反応させたのち、固相上の酵素活
性を上記（５）の方法により測定した．結果を第１１図
に示す。

図中、一●−がＡｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌ
ｅ　ＩｌｅＴｒｐ結合アフィニティ力ラムで精製した抗
エンドセリンＩ抗体〔免疫ｆｉ（１））を固相用抗体と
したときの、またー▲一がアフィニティ精製抗Ｃｙｓ　
Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ抗体
〔免疫Ｍ（ＩＩ））を固相川抗体としたときのエンドセ
リンＩの標準曲線を示す。

以上の結果から、上記（１５）と抗体の配置を逆にした
測定系、即ち、固相にエンドセリンＩＣ端部を認識する
抗体を、また標識体にエンドセリンＩＣ端部以外を認識
する抗エンドセリンＩ抗体ＡｗＥＴＮ４０ａを用いるサ
ンドイッチ法−ＥＩＡも、８ｐｇ／ｍＱ、０．３２ｆｍ
ｏｌｅ／ｗｅｌｌのエンドセリン■を測定し得ることが
分った． （１７）サンドイッチ法−ＥＩＡ　（その３）以下にエ
ンドセリン■測定用サンドイッチ法一ＥＩＡについて述
べる． ｉ）酵素標識化抗体の作製 上記（７）　正）のアフィニティ精製抗ヒトエンドセリ
ン■Ｃ端ベプチド抗体１２■より、石川らの方法〔ジャ
ーナルオブアプライドバイオケミストリイー（Ｊ．　Ａ
ｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｓ）．，６　：　５６−６３（
１９８４））および上記（１５）ｉ）記載の方法に従っ
て、Ｆａｂーベルオキシダーゼ標識体を作製した．ｉｔ
）サンドイッチ法一ＥＩＡ　（比色法）上記（１５）　
ｎ）記載のＡｗＥＴＮ４０ａ固定マイクロプレートにバ
ッファ一Ａで希釈したエンドセリン■標準液１００μＱ
、あるいはヒトエンドセリン■標準液１００μＱを加え
、室温で２４時間反応させた．プレートを洗浄後、上記
記載の抗ヒトエンドセリン■Ｃ端ペプチド抗体Ｆａｂ’
　−ペルオキシダーゼ標識体（バッファ一Ａで３００倍
に希釈）１００μＱを加え，４℃で１６時間反応させた
のち，同相上の酵素活性を上記記載（５）の方法により
測定した．結果を第１２図に示す． 図中、一●一はエンドセリンＩの標準曲線を、また一〇
−はエンドセリン■の標準曲線を表わす．以上の結果か
ら、該サンドイッチ法一ＥＩＡは、エンドセリンＩと反
応することなく、ヒトエンドセリン■を約４ｐｇ／ｍＱ
、９０　ａ　ｍｏｌｅ／　ｗｅｌｌまで検出し得ること
が明らかとなった． （１８）ヒト血漿中のエンドセリン■およびエンドセリ
ン■免疫活性の測定 ｉ）血漿の採取 ヒト全血を肘静脈より採取し、ただちに、３００ＫＩＥ
／　ｍ　Ｑ　（最終濃度）のトリプシンインヒビター（
アンタゴサン、ヘキスト社製）と２　■／ＩＩＩＱのＥ
ＤＴＡを加え．　１，５００　ｘ　ｇで１０分間遠心分
離し、血漿を得た．血漿は−８０℃で保存した．ｉｆ）
血漿の前処理 血漿（０．５〜１ｍＱ）に、最終濃度３％になるよう４
％酢酸を添加し、あらかじめ前処理（スキーム１参照）
したＳｅｐ−ｐａｋ　Ｃ１８　（ウォルターズ社製）カ
ートリッジに通した．蒸留水で洗浄後、吸着画分を４％
酢酸を含む８６％エタノールで溶出し、溶出液を常圧，
窒素気流下で濃縮乾固した．濃縮物をバッファ−Ｅ２５
０μ２に溶解し、不溶物を遠心除去後、エンドセリン■
あるいはエンドセリン■測定用サンドイッチ法一ＥＩＡ
に供した．ｍ）血漿試料を用いたエンドセリン■および
エンドセリン■の添加回収実験 ヒト血漿（０．５〜１ｍｌ２）に，エンドセリン■を２
５，　６０，および２００　Ｐｇ乙ｉあるいは、ヒトま
たはブタエンドセリン■を５０　ｐｇ／鴎Ｑ　添加し，
上記（１ｇ）　ｉｔ）記載の方法に従い、血漿を前処理
したのち、サンドイッチ法−ＥＩＡで測定した．結果を
第１表および第２表に示す．エンドセリンＩの回収率は
８０％以上，ヒトおよびブタエンドセリン■の回収率は
それぞれ６３％および７７％であり、良好であった．こ
の結果は、血漿の前処理の方法が妥当であることを示し
ている．ｉｖ）ヒト健常人血漿中のエンドセリンＩおよ
びエンドセリン■免疫活性の測定 第３表に、男性２４例，女性２３例の血漿エンドセリン
■　（表中ＥＴと略す），およびエンドセリン■（表中
ｂｉｇ　−　Ｅ　Ｔと略す）レベルの平均値を示した．
血中レベルはエンドセリン■がエンドセリン■より約２
倍高値を示した． Ｖ）心筋梗塞患者の血漿エンドセリンＩの推移急性心筋
梗塞発病患者（男性，６７才）の血漿エンドセリンレベ
ルを測定した（第１５図）。発病直後から血中エンドセ
リン■レベルは高値を示し，徐々に正常レベルへと減少
した．このことは、血中エンドセリンＩレベルを測定す
ることにより、心筋梗塞の予後管理が可能であることを
示している． 次に示す図式は、血漿の前処理の方法を、第１表および
第２表は，エンドセリンｌおよびエンドセリン■をヒト
血漿に添加した際の回収率を，第３表は健常人血漿中の
エンドセリンＩおよびエンドセリン■の平均値を示す． 血漿中のエンドセリンの抽出方式１） セップバック（Ｓｅｐｐａｋ）Ｃ−１８カートリッジの
前処理第１表　血漿検体に添加されたエンドセリンの回
収３ｍｌの４％酢酸を用いる，血漿（０．５もしくは１
．０■ｌ）酸性化 カートリッジへの負荷 １０ｎ＋１の蒸留水での洗浄 ４％酢酸含有８６％エタノール４ｍｌでの溶出３５℃で
のチッ素ガス気流下での濃縮 ０．２５ｍｌのバッファ一Ｅでの再構成↓ サンドイッチＥＩＡ １）　ロスマレンエフ（Ｒｏｓｍａｌｅｎ　Ｆ）等，　
（１９８７）クリニック　ヒミカアクタ３３１−３４０ ｐｇ／１１１のエンドセリンが添加され、４％酢酸３ｍ
ｌで酸性化された．この溶液をセップパックＣ１８カー
トリッジに付し、吸着分画はサンドインチＣＩＡに付し
た． ２）平均±ＳＤ 第２表　ヒト血漿に添加されたビッグエンドセリンの回
収４％酢酸３ｍｌで酸性化された．この溶液をセップパ
ツクＣｌ８カートリッジに付し、吸着分画はサンドイン
チＥＩＡに付した． ２）平均±ＳＤ 第３表　ヒト末梢静脈血漿における免疫原性エンドセリ
ンおよびビッグエンドセリン １）平均±ＳＤ 〔発明の効果〕 本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
はエンドセリンに対して高い結合能を有し、エンドセリ
ンおよびその一部の免疫学的測定法による検出や精製に
有利に使用することができる。特にエンドセリンの一部
領域との結合能を有する抗体およびその一部領域とは異
なる領域との結合能を有する抗体を用いる、サンドイン
チ法による免疫学的測定法により、エンドセリンＩ，Ｉ
Ｉを極めて高感度に分別定量することができる．

【図面の簡単な説明】

第１図は免疫原（１）に対するウサギ抗血清中の抗体価
を示し、第２図は免疫Ｊ７Ｋ（ＩＩ）に対するウサギ抗
血清中の抗体価を，第３図は免疫原（ｍ）に対するウサ
ギ抗血清中の抗体価を、第４図は免疫原（夏）に対する
マウス抗血清中の抗体価を示す． 第５図は免疫原（１）に対するポリクローナル抗体を用
いる競合法酵素免疫測定法におけるエンドセリンＩ、ペ
プチドＣｙｓ　Ｈｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　ＩＩ
ｓＴｒｐおよびアンジオテンシンー■の標準曲線を示す
。 第６図は免疫原（ＩＩ）に対するポリクローナル抗体を
用いる競合法酵素免疫測定法におけるエンドセリンＩお
よびペプチドＣｙｓ　Ｈｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＩＩｓ
ＩＩｓ　Ｔｒρの標準曲線を示す． 第７図はモノクローナル抗体ＡｗＥＴＮ４０ａを用いる
競合法に酵素免疫測定法におけるエンドセリン！および
ペプチドＣｙｓ　＋Ｉｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＩＩｓ　
ＩＩｓＴｒｐの標準曲線を示す． 第８図は免疫原（ＩＩＩ）に対するポリクローナル抗体
を用いる競合法酵素免疫測定法におけるヒトエンドセリ
ンｎ（一●−）、ブタエンドセリン■（−０−）．およ
びヒトエンドセリン■Ｃ端ペプチド（一▲一）の標準曲
線を示す． 第９図はモノクローナル抗体ＡｗＥＴＮ４０ａおよび抗
エンドセリンＩｃ端ペプチド抗体を用いるサンドインチ
法酵素免疫測定法におけるエンドセリンＩの標準曲線を
示した図であり、第１０図はその高感度化を計り、かつ
エンドセリン■との反応性を調べたものである． 第１１図は、第９図および第ｌＯ図と抗体の配置を逆に
したサンドイッチ法一ＥＩＡにおけるエンドセリン■の
標準曲線を示した図である．また、第１２図はモノクロ
ーナル抗体ＡｗＥＴＮ４０ａおよび抗エンドセリン■　
Ｃ端ペプチド抗体を用いるサンドイッチ法一酵素免疫測
定法におけるエンドセリン■のおよびエンドセリン■の
標準曲線を示した図である． 第１３図はブタエンドセリン■のアミノ酸配列、第１４
図はヒトエンドセリン■のアミノ酸配列を示す． 第１５図は心筋梗塞患者の血中エンドセリン１レベルの
推移を調べた結果を示す．

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）エンドセリンに結合性を有するポリクローナル抗
   体。
2. （２）エンドセリンが 【遺伝子配列があります】 のアミノ酸配列を有するものである、請求項１記載のポ
   リクローナル抗体。
3. （３）エンドセリンが 【遺伝子配列があります】 のアミノ酸配列を有するものである、請求項１記載のポ
   リクローナル抗体。
4. （４）エンドセリンが 【遺伝子配列があります】 のアミノ酸配列を有するものである、請求項１記載のポ
   リクローナル抗体。
5. （５）【遺伝子配列があります】 で表わされるペプチドに結合性を有する請求項１記載の
   ポリクローナル抗体。
6. （６）【遺伝子配列があります】 で表わされるペプチドに結合性を有する請求項１記載の
   ポリクローナル抗体。
7. （７）【遺伝子配列があります】 で表わされるペプチドに結合性を有する請求項１記載の
   ポリクローナル抗体。
8. （８）エンドセリンに対するモノクローナル抗体。
9. （９）エンドセリンに結合性を有し、かつ 【遺伝子配列があります】 で表わされるペプチドと反応しない請求項８記載のモノ
   クローナル抗体。
10. （１０）エンドセリンに結合性を有し、かつ【遺伝子配
    列があります】または 【遺伝子配列があります】 で表わされるペプチドと反応しない請求項８記載のモノ
    クローナル抗体。
11. （１１）エンドセリンに対するモノクローナル抗体を産
    生するハイブリドーマ細胞。
12. （１２）ＡｗＥＴＮ４０で標示される請求項１１記載の
    ハイブリドーマ細胞。
13. （１３）エンドセリンに対する抗体と、被検液および標
    識化エンドセリンとを競合的に反応させ、該抗体に結合
    した標識化エンドセリンの割合を測定することを特徴と
    する、被検液中のエンドセリンの定量法。
14. （１４）担体上に不溶化したエンドセリンに対する抗体
    に被検液を接触させた後、標識化されたエンドセリンに
    対する抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を
    測定することを特徴とする、被検液中のエンドセリンの
    定量法。
15. （１５）担体上に不溶化したエンドセリンに対する抗体
    および標識化されたエンドセリンに対する抗体の一方が
    エンドセリンのＣ端ペプチドに結合性を有するポリクロ
    ーナル抗体であり、他方がエンドセリンに結合性を有す
    るが、上記エンドセリンのＣ端ペプチドとは反応しない
    モノクローナル抗体である、請求項１４記載の定量法。