JPH0223898A - 迅速且つ高感度低圧酵素検出及び測定係 - Google Patents
迅速且つ高感度低圧酵素検出及び測定係Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
■の に１１亘
本発明は、（１）免疫測定または核酸ハイブリダイゼー
ション測定用の検出系またはレボ−ティング系の一部と
して使用され、（２）生物試料中に存在し、（３）試料
中の微生物の検出のため微生物と関連し、そして（４）
微生物同定試験及び抗菌物質感受性試験の如き純粋培養
試験に使用される酵素の迅速且つ高域度の検出及び測定
のための方法及び装置に関する。
ション測定用の検出系またはレボ−ティング系の一部と
して使用され、（２）生物試料中に存在し、（３）試料
中の微生物の検出のため微生物と関連し、そして（４）
微生物同定試験及び抗菌物質感受性試験の如き純粋培養
試験に使用される酵素の迅速且つ高域度の検出及び測定
のための方法及び装置に関する。
征 の ′ｒとその。 占
有機化合物及び微生物の迅速で高域度で特異的な測定を
可能にする核酸ハイブリダイゼーション技術及び抗体免
疫測定技術が開発されてきた。最近の進歩は、生成され
る抗原−抗体複合体または核酸ハイブリッド形成の検出
またはレボ−ティングを増強することによりこれらの測
定系の感度及び特異性を改良することに向けられてきた
。これに関し、多くの試みがなされてきた。一つのこの
ような例は抗原、抗体または核酸プローブを酵素で多重
ラベルして非同位元素で高感度の診断試験を行なうこと
である。例えば、酵素の多重コピーがアビジンの分子に
化学的にカップリングし得る。
可能にする核酸ハイブリダイゼーション技術及び抗体免
疫測定技術が開発されてきた。最近の進歩は、生成され
る抗原−抗体複合体または核酸ハイブリッド形成の検出
またはレボ−ティングを増強することによりこれらの測
定系の感度及び特異性を改良することに向けられてきた
。これに関し、多くの試みがなされてきた。一つのこの
ような例は抗原、抗体または核酸プローブを酵素で多重
ラベルして非同位元素で高感度の診断試験を行なうこと
である。例えば、酵素の多重コピーがアビジンの分子に
化学的にカップリングし得る。
ついでアビジンは、抗体、抗原または核酸プローブに化
学的に連結されたビオチンに強く結合し得る。その結果
、生成された抗原−抗体複合体または核酸ハイブリッド
毎に酵素の多重コピーが存在する。核酸ハイブリダイゼ
ーション測定に使用される別の試みは、標的ゲノム上の
異なる配列にハイブリダイズする多重酵素ラベルされた
プローブの使用である。如何なる試みが生物シグナルを
増幅するのに使用されようとも、測定結果は通常視覚的
に、または装置により読みとられる明瞭な色または蛍光
の発生により測定される。
学的に連結されたビオチンに強く結合し得る。その結果
、生成された抗原−抗体複合体または核酸ハイブリッド
毎に酵素の多重コピーが存在する。核酸ハイブリダイゼ
ーション測定に使用される別の試みは、標的ゲノム上の
異なる配列にハイブリダイズする多重酵素ラベルされた
プローブの使用である。如何なる試みが生物シグナルを
増幅するのに使用されようとも、測定結果は通常視覚的
に、または装置により読みとられる明瞭な色または蛍光
の発生により測定される。
ハイブリダイゼーシヨンプローブの使用による特異的な
核酸配列の検出は良く確立された操作である。一つの普
通使用される方法は、固体担体（例えばニトロセルロー
ス、ジアゾベンジルオキシメチルセルロース、ナイロン
等）上の標的ポリヌクレオチド配列の固定化を伴う。つ
いで、固定化された核酸は、それが二本鎖である場合に
は、変性され、ひき続いて相補的プローブにハイブリッ
ド形成される。プローブ核酸配列は、通常３２ｐで同位
元素でラベルされるか、または酵素によりポリヌクレオ
チド配列の直接ラベル化により、もしくはビチオン−ア
ビジン系で間接的に非同位元素でラベルされる。
核酸配列の検出は良く確立された操作である。一つの普
通使用される方法は、固体担体（例えばニトロセルロー
ス、ジアゾベンジルオキシメチルセルロース、ナイロン
等）上の標的ポリヌクレオチド配列の固定化を伴う。つ
いで、固定化された核酸は、それが二本鎖である場合に
は、変性され、ひき続いて相補的プローブにハイブリッ
ド形成される。プローブ核酸配列は、通常３２ｐで同位
元素でラベルされるか、または酵素によりポリヌクレオ
チド配列の直接ラベル化により、もしくはビチオン−ア
ビジン系で間接的に非同位元素でラベルされる。
放射性同位元素でラベルされたプローブに対比゛して、
非同位元素系は安全性、比較的安いコスト、及び使用の
容易さという利点をもたらす。しかしながら、酵素検出
ではしばしばラベルされたプローブの固体担体への非特
異的な吸着からの高いハックグラウンド値が問題となる
。非特異的な吸着は多くの洗浄工程により減少し得るが
、これらは操作の長さ及び困難を付加する。
非同位元素系は安全性、比較的安いコスト、及び使用の
容易さという利点をもたらす。しかしながら、酵素検出
ではしばしばラベルされたプローブの固体担体への非特
異的な吸着からの高いハックグラウンド値が問題となる
。非特異的な吸着は多くの洗浄工程により減少し得るが
、これらは操作の長さ及び困難を付加する。
特異的なポリヌクレオチド配列を検出する異なる方法は
、パリ４ （Ｖａｒｙ）ら著、”Ｎｏｎ１ｓｏｔｏｐｉ
ｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５
ｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｓ５ａｙｓ
ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ″Ｃ１１ｎ、 Ｃｈ
ｅｍ、 ３２巻、１６９６〜１７０１頁（１９８６年）
の方法に従ってラベルされた核酸の置換を伴う。ラベル
されたポリヌクレオチド“シグナル鎖°“は、−層大き
な配列（”プローブ鎖゛°）でハイブリッド形成され、
これは注目の標的ポリヌクレオチド配列に相補的である
。標的配列とシグナル−プローブハイブリッドの相互作
用はハイブリッドからシグナル鎖の置換をもたらす。
、パリ４ （Ｖａｒｙ）ら著、”Ｎｏｎ１ｓｏｔｏｐｉ
ｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５
ｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｓ５ａｙｓ
ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ″Ｃ１１ｎ、 Ｃｈ
ｅｍ、 ３２巻、１６９６〜１７０１頁（１９８６年）
の方法に従ってラベルされた核酸の置換を伴う。ラベル
されたポリヌクレオチド“シグナル鎖°“は、−層大き
な配列（”プローブ鎖゛°）でハイブリッド形成され、
これは注目の標的ポリヌクレオチド配列に相補的である
。標的配列とシグナル−プローブハイブリッドの相互作
用はハイブリッドからシグナル鎖の置換をもたらす。
置換されたシグナル鎖をシグナル−プローブハイブリッ
ドから分離した後、シグナル鎖は：Ｉ２ｐの如き同位元
素ラベルまたは酵素の如き非同位元素ラベルを用いて測
定される。このような測定は非特異的吸着によるバック
グラウンドシグナルの減少のため潜在的に一層高怒度で
ある。
ドから分離した後、シグナル鎖は：Ｉ２ｐの如き同位元
素ラベルまたは酵素の如き非同位元素ラベルを用いて測
定される。このような測定は非特異的吸着によるバック
グラウンドシグナルの減少のため潜在的に一層高怒度で
ある。
二つの型の酵素免疫測定が普通使用される。サンドウィ
ッチ免疫測定は固相結合された抗体分子による溶液中の
抗原分子の捕捉を伴う。酵素でラベルされ異なる抗原決
定基に特異的である第二抗体分子が固相結合された抗原
−抗体複合体にひき続いて添加される。同様に、競合免
疫測定は、抗体結合部位に対する抗原の競合を伴う。酵
素ラベルされた抗原及び試料からのラベルされていない
抗原（注目の抗原）は固相結合された抗体上の結合部位
に対して競合する。これらの場合、固体担体上に残存す
る酵素の量は第一の例では試料中の抗原の量に比例し、
または第二の例では試料中の抗原の量に反比例する。
ッチ免疫測定は固相結合された抗体分子による溶液中の
抗原分子の捕捉を伴う。酵素でラベルされ異なる抗原決
定基に特異的である第二抗体分子が固相結合された抗原
−抗体複合体にひき続いて添加される。同様に、競合免
疫測定は、抗体結合部位に対する抗原の競合を伴う。酵
素ラベルされた抗原及び試料からのラベルされていない
抗原（注目の抗原）は固相結合された抗体上の結合部位
に対して競合する。これらの場合、固体担体上に残存す
る酵素の量は第一の例では試料中の抗原の量に比例し、
または第二の例では試料中の抗原の量に反比例する。
酵素免疫測定（ＥＩＡと称する）及びハイブリダイゼー
ション測定の感度を増大する試みは、ラベルされた酵素
分子の数を増大することにより生成された抗原−抗体複
合体またはハイブリッド当りの生成物の量を増加するこ
とにしばしば集中していた。酵素増幅は、時として増大
された非特異的な吸着による偽陽性反応の増大または相
補的なポリヌクレオチド配列による抗原及び抗体の結合
もしくはハイブリダイゼーションの抑制による偽陰性反
応の増大をもたらす。
ション測定の感度を増大する試みは、ラベルされた酵素
分子の数を増大することにより生成された抗原−抗体複
合体またはハイブリッド当りの生成物の量を増加するこ
とにしばしば集中していた。酵素増幅は、時として増大
された非特異的な吸着による偽陽性反応の増大または相
補的なポリヌクレオチド配列による抗原及び抗体の結合
もしくはハイブリダイゼーションの抑制による偽陰性反
応の増大をもたらす。
基質と反応する酵素により生じられる信号または“生成
物°°の測定を強化することにより、測定感度を増大す
ることに向けて殆ど努力はなされていなかった。しばし
ば、測定感度は大きいバックグラウンドシグナルのため
に減少される。極めて少量の着色された、または蛍光の
、酵素により生成された生成物の装置による測定は、時
として基質の固有の色または蛍光により損なわれる。こ
の問題は酵素の低い結合親和性を調節するための高濃度
の基質の普通の使用により更に悪化され得る。
物°°の測定を強化することにより、測定感度を増大す
ることに向けて殆ど努力はなされていなかった。しばし
ば、測定感度は大きいバックグラウンドシグナルのため
に減少される。極めて少量の着色された、または蛍光の
、酵素により生成された生成物の装置による測定は、時
として基質の固有の色または蛍光により損なわれる。こ
の問題は酵素の低い結合親和性を調節するための高濃度
の基質の普通の使用により更に悪化され得る。
また、バックグラウンドシグナルは、着色されたか、蛍
光性であるか、発光性であるか、あるいは電気化学的に
活性である測定成分及び試料成分に由来し得る。殆どの
場合、酵素で発生されたシグナルがバックグラウンドシ
グナルの２倍である時にのみ確信のある結果が報告され
る。
光性であるか、発光性であるか、あるいは電気化学的に
活性である測定成分及び試料成分に由来し得る。殆どの
場合、酵素で発生されたシグナルがバックグラウンドシ
グナルの２倍である時にのみ確信のある結果が報告され
る。
免疫反応及びハイブリダイゼーション反応を検出するた
めの酵素の使用の他に、試料中の′ｉｉ離酵素並びに微
生物により生成された酵素を検出するため測定感度を高
めることにつき殆ど進歩がなかった。生物試料中の遊離
酵素及び微生物酵素を測定、検出する分析は、一般に、
着色されたか、蛍光性であるか、発光性であるか、また
は電気化学的に活性である酵素で生成された生成物を生
成する基質を利用する。これらの測定の感度は試料成分
と基質を含む測定成分とからの大きいバックグラウンド
シグナルにより殆ど妨害される。
めの酵素の使用の他に、試料中の′ｉｉ離酵素並びに微
生物により生成された酵素を検出するため測定感度を高
めることにつき殆ど進歩がなかった。生物試料中の遊離
酵素及び微生物酵素を測定、検出する分析は、一般に、
着色されたか、蛍光性であるか、発光性であるか、また
は電気化学的に活性である酵素で生成された生成物を生
成する基質を利用する。これらの測定の感度は試料成分
と基質を含む測定成分とからの大きいバックグラウンド
シグナルにより殆ど妨害される。
酵素で生成された生成物の測定を強化するための一つの
試みはキウチ（Ｋｉｕｃｈｉ）らにより記載された（Ａ
Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔ
ｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ＧＭＩ−Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−Ｂ−Ｇａｌａｃｔｏ
ｓｉｄａｓｅ ｂｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒ
ｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ、 １９８４年、 ＡｎａｌＢｔｏｃｈｅｍ
、 １４０巻、１４６〜１５１頁を参照のこと）。
試みはキウチ（Ｋｉｕｃｈｉ）らにより記載された（Ａ
Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔ
ｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ＧＭＩ−Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−Ｂ−Ｇａｌａｃｔｏ
ｓｉｄａｓｅ ｂｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒ
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ｒａｐｈｙ、 １９８４年、 ＡｎａｌＢｔｏｃｈｅｍ
、 １４０巻、１４６〜１５１頁を参照のこと）。
これらの研究者らは高速液体クロマトグラフィー（ＩＩ
ＰＬｃと称する）系を利用しで増加したＮＡＤ１１濃度
を測定することにより粗組織試料中のＧＭｉ−ガングリ
オシド−β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。基質と
試料とのインキュベーションを含む、この操作の生物的
工程はＨＰＬＣ装置とは別の離れた容器中で行なわれた
。試料からの酵素と及び基質のインキュベーション続い
て、反応溶液は種々の測定成分を分離するＨＰＬＣ装置
中に注入された。この操作の欠点は多くの理論段数をも
つ通常のｌｌ Ｐ Ｌ Ｃカラムが成分を充分分離する
のに必要とされることである。これは、キウチらの分離
操作が長時間を要する操作であり時として３，０００ｐ
ｓｉ（２１１ｋｇ／ｃｆｆｌ）を越える高圧で流体を大
きなカラム中に移動させ得る嵩イ西なＨＰＬＣ装置の使
用を必要とすることを意味する。キウチらにより使用さ
れるカラムは４ ｍｍＸ ３００ｍｍの寸法を有し逆相
Ｃ１８粒子で充填される。
ＰＬｃと称する）系を利用しで増加したＮＡＤ１１濃度
を測定することにより粗組織試料中のＧＭｉ−ガングリ
オシド−β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。基質と
試料とのインキュベーションを含む、この操作の生物的
工程はＨＰＬＣ装置とは別の離れた容器中で行なわれた
。試料からの酵素と及び基質のインキュベーション続い
て、反応溶液は種々の測定成分を分離するＨＰＬＣ装置
中に注入された。この操作の欠点は多くの理論段数をも
つ通常のｌｌ Ｐ Ｌ Ｃカラムが成分を充分分離する
のに必要とされることである。これは、キウチらの分離
操作が長時間を要する操作であり時として３，０００ｐ
ｓｉ（２１１ｋｇ／ｃｆｆｌ）を越える高圧で流体を大
きなカラム中に移動させ得る嵩イ西なＨＰＬＣ装置の使
用を必要とすることを意味する。キウチらにより使用さ
れるカラムは４ ｍｍＸ ３００ｍｍの寸法を有し逆相
Ｃ１８粒子で充填される。
この型のカラムは典型的には最適線形効率で１５，００
０を越える理論段数を有する。
０を越える理論段数を有する。
ウェーマイヤー（讐ｅｔ＋ｍｅｙｅｒ）らは、反応溶液
中のフェノールをその他の成分から分離するため５０ｍ
ｍＸ２ｍｍの寸法をもつ小型肝ＬＣカラムによる酵素免
疫測定操作につき言及している。（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ
ｒ。
中のフェノールをその他の成分から分離するため５０ｍ
ｍＸ２ｍｍの寸法をもつ小型肝ＬＣカラムによる酵素免
疫測定操作につき言及している。（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ
ｒ。
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆＰｈｅｎｏｌ
ａｎｄ ＮＡＤＨｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ＋ １９８３年、 Ｊ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ６巻、 ２１４１〜５６
頁を参照のこと）。フェノールはフェニルホスフェート
の酵素開裂により生成される。キウチらの操作と同様に
、ウェーマイヤーらはＨＰ １．Ｃ装置とは別の容器中
で酵素免疫反応を行なった。この容器中の酵素及び基質
を充分な時間培養した後、反応溶液がＨＰＬＣ装置中に
注入された。ウェーマイヤーらはフェノールの充分な分
離を行なうのに長いＩＩＰＬｃカラムを必要とした。長
いＨＰＬＣカラムに関する問題は分析時間の延長及び長
いカラムの使用の結果として高圧で取扱い得るＨＰＬＣ
定格部品の必要とされる使用である。また、反応溶液中
の異物はフェノールと共溶用する可能性があり全測定感
度及び特異性の著しい低下をもたらす。
ｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆＰｈｅｎｏｌ
ａｎｄ ＮＡＤＨｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ＋ １９８３年、 Ｊ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ６巻、 ２１４１〜５６
頁を参照のこと）。フェノールはフェニルホスフェート
の酵素開裂により生成される。キウチらの操作と同様に
、ウェーマイヤーらはＨＰ １．Ｃ装置とは別の容器中
で酵素免疫反応を行なった。この容器中の酵素及び基質
を充分な時間培養した後、反応溶液がＨＰＬＣ装置中に
注入された。ウェーマイヤーらはフェノールの充分な分
離を行なうのに長いＩＩＰＬｃカラムを必要とした。長
いＨＰＬＣカラムに関する問題は分析時間の延長及び長
いカラムの使用の結果として高圧で取扱い得るＨＰＬＣ
定格部品の必要とされる使用である。また、反応溶液中
の異物はフェノールと共溶用する可能性があり全測定感
度及び特異性の著しい低下をもたらす。
従って、測定結果をレポートするため酵素を使用する非
同位元素免疫測定及び核酸ハイブリダイゼーション測定
の感度を高める方法及び装置に対する要望が当業界にあ
る。更に、試料中の微生物から、また純粋培養中の微生
物から遊離酵素を測定、検出する方法に対する要望が当
業界にある。
同位元素免疫測定及び核酸ハイブリダイゼーション測定
の感度を高める方法及び装置に対する要望が当業界にあ
る。更に、試料中の微生物から、また純粋培養中の微生
物から遊離酵素を測定、検出する方法に対する要望が当
業界にある。
ュ、占 η・′ るための手段
簡単に述べると、本発明は測定系中で免疫反応またはハ
イブリダイゼーション反応により生成された結合マーカ
ー酵素の検出を高める方法及び関連装置を開示する。末
法は、一般に（ａ）選択された溶液中の基質を、固相に
結合された（基質に対し）相補的なマーカー酵素を含む
第一カラムに添加し、（ｂ）第一カラムをインキュベー
トして基質を存在する酵素の量に比例する量の生成物に
酵素的に変換し、（Ｃ）生成物及び未反応基質を、５０
０以下の理論段数、好ましくは約１００の理論段数、最
も好ましくは約５０の理論段数の第二カラムであって選
択された溶液の存在下で生成物を選択的に結合し得る吸
着剤を含む第二カラムに移し、（ｄ）生成物を溶液から
選択的に溶出し、ついで（ｅ）生成物の存在または濃度
を検出することを含む。生成物は吸光度、蛍光、発光の
測定により、あるいは電気化学的活性により検出でき、
連続流またはストップ・フロー（ｓｔｏｐ ｆｌｏｗ）
サイクルの配置に適し得る。吸着剤は、極性もしくは非
極性の相互作用、イオン交換、親和性結合の如きその他
の特異的な分子相互作用またはこれらの組合せにより生
成物を選択的に保持し得る。末法はマニュアル・フォー
マットを用いて、あるいは連続流もしくは停止流（ｓｔ
ｏｐｐｅｄ ｆｌｏｗ）の配置による流体系を用いる装
置により行なわれてもよい。
イブリダイゼーション反応により生成された結合マーカ
ー酵素の検出を高める方法及び関連装置を開示する。末
法は、一般に（ａ）選択された溶液中の基質を、固相に
結合された（基質に対し）相補的なマーカー酵素を含む
第一カラムに添加し、（ｂ）第一カラムをインキュベー
トして基質を存在する酵素の量に比例する量の生成物に
酵素的に変換し、（Ｃ）生成物及び未反応基質を、５０
０以下の理論段数、好ましくは約１００の理論段数、最
も好ましくは約５０の理論段数の第二カラムであって選
択された溶液の存在下で生成物を選択的に結合し得る吸
着剤を含む第二カラムに移し、（ｄ）生成物を溶液から
選択的に溶出し、ついで（ｅ）生成物の存在または濃度
を検出することを含む。生成物は吸光度、蛍光、発光の
測定により、あるいは電気化学的活性により検出でき、
連続流またはストップ・フロー（ｓｔｏｐ ｆｌｏｗ）
サイクルの配置に適し得る。吸着剤は、極性もしくは非
極性の相互作用、イオン交換、親和性結合の如きその他
の特異的な分子相互作用またはこれらの組合せにより生
成物を選択的に保持し得る。末法はマニュアル・フォー
マットを用いて、あるいは連続流もしくは停止流（ｓｔ
ｏｐｐｅｄ ｆｌｏｗ）の配置による流体系を用いる装
置により行なわれてもよい。
この結果、バックグラウンド信号は大巾に減少され、ま
たは完全に排除される。また、酵素により生成された生
成物は大きい反応容量から小さい検出溶量に濃縮される
。更に、最小のカラム長さ及び理論段数をもつ吸着剤床
の使用は、低圧系、他の測定成分から生成物の迅速な分
離、及び試薬必要量の減少をもたらす。
たは完全に排除される。また、酵素により生成された生
成物は大きい反応容量から小さい検出溶量に濃縮される
。更に、最小のカラム長さ及び理論段数をもつ吸着剤床
の使用は、低圧系、他の測定成分から生成物の迅速な分
離、及び試薬必要量の減少をもたらす。
本発明の関連する面に於いて、装置は一般に（ａ）固体
担体に結合された酵素を含む第一カラム（酵素は免疫反
応または核酸ハイブリダイゼーション反応から存在する
）、及び（ｂ）第一カラムに直列に連結され５００以下
の理論段数、好ましくは約１００の理論段数、最も好ま
しくは約５０の理論段数の吸着剤床を含む第二カラムを
含み、吸着剤は第一カラム中の酵素に特異的な基質の添
加により生成された酵素的に生成された生成物を選択的
に結合し得る。装置の関連する面に於いて、第二カラム
から溶出された生成物の量を測定し得る検出装置が第二
カラムに直列に連結される。連結されたカラムの使用は
、別の容器中で酵素免疫測定またはハイブリダイゼーシ
ョン測定を行ないついで反応溶液を第二検出装置に注入
する必要を省く。
担体に結合された酵素を含む第一カラム（酵素は免疫反
応または核酸ハイブリダイゼーション反応から存在する
）、及び（ｂ）第一カラムに直列に連結され５００以下
の理論段数、好ましくは約１００の理論段数、最も好ま
しくは約５０の理論段数の吸着剤床を含む第二カラムを
含み、吸着剤は第一カラム中の酵素に特異的な基質の添
加により生成された酵素的に生成された生成物を選択的
に結合し得る。装置の関連する面に於いて、第二カラム
から溶出された生成物の量を測定し得る検出装置が第二
カラムに直列に連結される。連結されたカラムの使用は
、別の容器中で酵素免疫測定またはハイブリダイゼーシ
ョン測定を行ないついで反応溶液を第二検出装置に注入
する必要を省く。
本発明の更に関連する面に於いて、装置は５００以下の
理論段数、好ましくは約１００の理論段数、最も好まし
くは約５０の理論段数の吸着剤床を含む第二カラムを含
み、吸着剤は酵素的に生成された生成物を選択的に結合
でき、該生成物は試料中の注目の遊離酵素または試料中
もしくは純粋培養中の注目の微生物により生成された酵
素に特異的な基質の添加により生成される。関連する面
に於いて、第二カラムは吸着剤を含む第二カラムから溶
出された生成物の量を測定し得る検出装置に直列に連結
される。
理論段数、好ましくは約１００の理論段数、最も好まし
くは約５０の理論段数の吸着剤床を含む第二カラムを含
み、吸着剤は酵素的に生成された生成物を選択的に結合
でき、該生成物は試料中の注目の遊離酵素または試料中
もしくは純粋培養中の注目の微生物により生成された酵
素に特異的な基質の添加により生成される。関連する面
に於いて、第二カラムは吸着剤を含む第二カラムから溶
出された生成物の量を測定し得る検出装置に直列に連結
される。
本発明のこれらの面及びその他の面は、以下の詳細な説
明及び図面を参照して明らかになる。
明及び図面を参照して明らかになる。
発側！すｕ０硯（４哩
本発明は免疫測定または核酸ハイブリダイゼーション測
定の感度を高める方法及び装置を開示する。この装置は
カラム中の溶液の低圧移動を可能にする直列に連結され
た二つのカラムを含む。第一カラムは固相の免疫反応ま
たは核酸ハイブリダイゼーション反応を行なうのに使用
され、第二カラムは吸着剤粒子で充填される。第一カラ
ムは免疫反応またはハイブリダイゼーション反応を行な
うための装置または免疫反応もしくはハイブリダイゼー
ション反応が行なわれた際にラテックスビーズの如き固
体担体材料を捕捉するための装置を含む。同様に、第一
カラムの外側の溶液中で生成された免疫反応生成物（抗
原−抗体複合体）またはハイブリダイゼーション反応生
成物（プローブ標的二重ｔ３￥）は、膜の表面の如き物
理的手段により、あるいはアフィニティ膜（例えばウル
トラバインド（Ｕｌｔｒａｂｉｎｄ） （’７’ルマ
ン・サイエンシズ（Ｇｅｌｍａｎ ５ｃｉｅｎｃｅｓ）
、アンアーハ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、ミシガン州〕
）への共有結合、固体担体材料に被覆されたプロティン
Ａによる抗原−抗体複合体の非特異的結合、もしくは固
体担体材料上の抗原（またはハプテン）−抗体反応によ
るような化学的手段により第一カラム上に保持されても
よい。
定の感度を高める方法及び装置を開示する。この装置は
カラム中の溶液の低圧移動を可能にする直列に連結され
た二つのカラムを含む。第一カラムは固相の免疫反応ま
たは核酸ハイブリダイゼーション反応を行なうのに使用
され、第二カラムは吸着剤粒子で充填される。第一カラ
ムは免疫反応またはハイブリダイゼーション反応を行な
うための装置または免疫反応もしくはハイブリダイゼー
ション反応が行なわれた際にラテックスビーズの如き固
体担体材料を捕捉するための装置を含む。同様に、第一
カラムの外側の溶液中で生成された免疫反応生成物（抗
原−抗体複合体）またはハイブリダイゼーション反応生
成物（プローブ標的二重ｔ３￥）は、膜の表面の如き物
理的手段により、あるいはアフィニティ膜（例えばウル
トラバインド（Ｕｌｔｒａｂｉｎｄ） （’７’ルマ
ン・サイエンシズ（Ｇｅｌｍａｎ ５ｃｉｅｎｃｅｓ）
、アンアーハ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、ミシガン州〕
）への共有結合、固体担体材料に被覆されたプロティン
Ａによる抗原−抗体複合体の非特異的結合、もしくは固
体担体材料上の抗原（またはハプテン）−抗体反応によ
るような化学的手段により第一カラム上に保持されても
よい。
酵素が免疫反応またはハイブリダイゼーション反応の結
果として第一カラム上に存在すると、酵素に特異的な基
質が酵素及び基質を反応させて生成物を生成するのに充
分な時間及びインキュベーション条件下で第一カラムに
添加される。酵素反応の生成物は、免疫反応またはハイ
ブリダイゼーションの結果として存在する酵素の量に比
例して生成される。
果として第一カラム上に存在すると、酵素に特異的な基
質が酵素及び基質を反応させて生成物を生成するのに充
分な時間及びインキュベーション条件下で第一カラムに
添加される。酵素反応の生成物は、免疫反応またはハイ
ブリダイゼーションの結果として存在する酵素の量に比
例して生成される。
簡単に云えば、第一カラムは核酸ハイブリダイゼーショ
ン反応または免疫反応の結果として固体担体に結合され
た酵素を含む、酵素に特異的である基質であって、第二
カラム中の吸着剤への、酵素により生成された生成物の
実質的もしくは完全な保持を可能にする溶液中にある基
質が、第一カラムに添加されて適当な条件下でインキュ
ベーションされる。ついで、生成物及び未反応基質を含
む溶液は第２図に示されるような装置に暴く流れ系を用
いて、あるいは第３図に示されるようなマニュアル・フ
ォーマットを用いて第二カラム中に流される。第二カラ
ムはその中を流れる生成物を吸着剤の使用により結合す
る作用をする。基質はそのカラム中を実質的に通過する
ことが好ましい。
ン反応または免疫反応の結果として固体担体に結合され
た酵素を含む、酵素に特異的である基質であって、第二
カラム中の吸着剤への、酵素により生成された生成物の
実質的もしくは完全な保持を可能にする溶液中にある基
質が、第一カラムに添加されて適当な条件下でインキュ
ベーションされる。ついで、生成物及び未反応基質を含
む溶液は第２図に示されるような装置に暴く流れ系を用
いて、あるいは第３図に示されるようなマニュアル・フ
ォーマットを用いて第二カラム中に流される。第二カラ
ムはその中を流れる生成物を吸着剤の使用により結合す
る作用をする。基質はそのカラム中を実質的に通過する
ことが好ましい。
吸着剤が生成物を結合する能力は、生成物及び基質を運
ぶ溶液の化学的性質に依存する。これは生成物が第二カ
ラム内に含まれる吸着剤で濃縮されることを可能にする
。ひき続いての溶出は、基質及びその他の異物を実質的
に含まない生成物を、第二カラムに適用された溶液のも
との容量より一般に少ない容量へ濃縮することをもたら
す。カラムの長さ及び内径の関数として少ない理論段数
をもつ第二カラムの使用は、マニュアル・フォーマット
中または低圧装置を用いて迅速に行ない得る低圧診断試
験の使用を可能にする。装置用の検出器は、第２図に示
されるように第二カラムから下流に配置されてもよい。
ぶ溶液の化学的性質に依存する。これは生成物が第二カ
ラム内に含まれる吸着剤で濃縮されることを可能にする
。ひき続いての溶出は、基質及びその他の異物を実質的
に含まない生成物を、第二カラムに適用された溶液のも
との容量より一般に少ない容量へ濃縮することをもたら
す。カラムの長さ及び内径の関数として少ない理論段数
をもつ第二カラムの使用は、マニュアル・フォーマット
中または低圧装置を用いて迅速に行ない得る低圧診断試
験の使用を可能にする。装置用の検出器は、第２図に示
されるように第二カラムから下流に配置されてもよい。
別の態様に於いて、上記の測定系は、（ｉ）試料中の注
目の遊離酵素の検出、（ｉｉ ）試料中の注目の汚染微
生物の検出、及び（ｉｉｉ ）純粋壇養微生物の同定及
び抗菌性物質窓受性試験に使用される。
目の遊離酵素の検出、（ｉｉ ）試料中の注目の汚染微
生物の検出、及び（ｉｉｉ ）純粋壇養微生物の同定及
び抗菌性物質窓受性試験に使用される。
′ｔｆ離酵素の検出に関し、測定は試料を基質含有測定
溶液に添加し適当な温度でインキュベートすることによ
り行なわれる。遊離酵素は基質を特異的化学的に修飾し
て、吸着剤ベッドに保持し得る生成物を生成する。
溶液に添加し適当な温度でインキュベートすることによ
り行なわれる。遊離酵素は基質を特異的化学的に修飾し
て、吸着剤ベッドに保持し得る生成物を生成する。
生物試料中の遊離酵素測定の例は、液体ミルク中のアル
カリ性ホスファターゼの検出である。ミルク中のアルカ
リ性ホスファターゼの活性の損失は、液体ミルクの低温
殺菌の有効性を指示する。
カリ性ホスファターゼの検出である。ミルク中のアルカ
リ性ホスファターゼの活性の損失は、液体ミルクの低温
殺菌の有効性を指示する。
アルカリ性ホスファターゼ用の蛍光助剤基質、即ち４−
メチル−ランベリフェニルホスフェート（ＭＯＰと称す
る）が液体ミルクの試料に基質として添加される。アル
カリ性ホスファターゼ酵素が存在する場合には、それは
ＭＵＰを開裂して生成物メチルウンへりフェロン（ＭＵ
と称する）を生成する。ＭＵは、本明細書中で記載され
たように吸着剤床で濃縮され、ついで蛍光検出により測
定される。
メチル−ランベリフェニルホスフェート（ＭＯＰと称す
る）が液体ミルクの試料に基質として添加される。アル
カリ性ホスファターゼ酵素が存在する場合には、それは
ＭＵＰを開裂して生成物メチルウンへりフェロン（ＭＵ
と称する）を生成する。ＭＵは、本明細書中で記載され
たように吸着剤床で濃縮され、ついで蛍光検出により測
定される。
遊離酵素測定と同様に、試料中の微生物混在物質の検出
は、基質を含む測定溶液中の適温に於ける試料の保温を
伴う。この測定は、試料中の微生物により生成された酵
素の量を測定して微生物の量を検出、概算する。これら
の酵素は細胞内に存在してもよ（、細胞から放出されて
もよい。例えば、大腸菌群は酵素β−ガラクトシダーゼ
を生成し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は酵素グルクロニダ
ーゼを生成する。大腸菌群を含む試料による４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧＡＬ
と称する）の如き基質のインキュベーションまたはＥ、
ｃｏｌｉを含む試料による基質４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧと称する）のイン
キュベーションは、試料中のこれらの微生物の量に比例
して蛍光性生成物ＭＵを生成し得る。
は、基質を含む測定溶液中の適温に於ける試料の保温を
伴う。この測定は、試料中の微生物により生成された酵
素の量を測定して微生物の量を検出、概算する。これら
の酵素は細胞内に存在してもよ（、細胞から放出されて
もよい。例えば、大腸菌群は酵素β−ガラクトシダーゼ
を生成し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は酵素グルクロニダ
ーゼを生成する。大腸菌群を含む試料による４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧＡＬ
と称する）の如き基質のインキュベーションまたはＥ、
ｃｏｌｉを含む試料による基質４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧと称する）のイン
キュベーションは、試料中のこれらの微生物の量に比例
して蛍光性生成物ＭＵを生成し得る。
同定試験及び抗菌物質感受性試験は純粋培養分離株の懸
濁液に対して行ない得る。これらの純粋培養試験用の基
質その他の試薬は欧州特許ＥＰ−Ａ９１．８３７号に使
用されたもの及びスナイダー（Ｓｎｙｄｅｒ）及びワン
プ（Ｗａｎｇ）により使用されたもの（“ＲａｐｉｄＣ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｎ＋ｓ ｂｙ ＩｎｄｕｃｅｓＳｕｂｓｔ
ｒａｔｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ： Ａ Ｒｅｖ
ｉｅｗ” Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。
濁液に対して行ない得る。これらの純粋培養試験用の基
質その他の試薬は欧州特許ＥＰ−Ａ９１．８３７号に使
用されたもの及びスナイダー（Ｓｎｙｄｅｒ）及びワン
プ（Ｗａｎｇ）により使用されたもの（“ＲａｐｉｄＣ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｎ＋ｓ ｂｙ ＩｎｄｕｃｅｓＳｕｂｓｔ
ｒａｔｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ： Ａ Ｒｅｖ
ｉｅｗ” Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。
１ｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １巻、２２６〜２３０
頁、 １９８５年を参照のこと）及びスナイダーらによ
り使用されたちの （“Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ ＾ｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ Ｉｎ
Ｖｉｖ。
頁、 １９８５年を参照のこと）及びスナイダーらによ
り使用されたちの （“Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ ＾ｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ Ｉｎ
Ｖｉｖ。
Ｅｎｚｙｍｅ ５ｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ ｉｎＭｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＋Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、 ５１巻、９６９〜９７７頁を参
照のこと）と同様であってもよい。有用な基質は、イン
ドキシルアセテート、インドキシル−βＤ−グルコシド
、４ＭＵ−Ｄ−グルコシド、４ＭＵ−ホスフェート、イ
ンドキシルホスフェート、４−ＭＵ−Ｄガラクトシド、
Ｎ−メチルインドキシルアセテート、Ｎ−メチルインド
キシルミリステート、β−ナフチルアセテート、α−ナ
フチルアセテート、４ＭＵ−ヘプタノエート、４ＭＵア
セテート、５−クロモインドキシルアセテート、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−ホスフェート、３−インドキシ
ルホスフェート、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−
グルコシド、４ＭＵグルクロニド、７−ニトキシクマリ
ン、グリシル−Ｌ−フェニル−β−ナフチルアミド、β
−ナフチルスルフェート、３−インドキシルスルフェー
ト、ルミノール、レアサズリン（ｒｅａｓａｚｕｒｉｎ
）、蛍光性４メチルウンベリフエリル誘導体、７−アミ
ノ−４−メチルクマリンの誘導体、４−メチルランへり
フェリルホスフェートと４−メチルウンベリフェリル脂
肪酸エステル、例えばヘキサノエート、オクタノエート
、ノナエートまたはＣ６〜ＣＩ６の鎖長をもつその他の
脂肪酸エステルとの混合物、及び４−メチルウンベリフ
ェリルエステル、例えばホスフェートと７− （Ｎ）−
（アミノアシル−４−ペプチジル）−４−メチル−７−
アミノ−クマリン（例えば７−（Ｎ）−アラニル−４−
メチル７−アミノ−クマリン及び相当するレシチン誘導
体）との混合物を含む。有用な蛍光（ｆＩｕｏｒｏｇｅ
ｎ ｉｃ）基質ハウンベリフェロンのペプチド及びエス
テル（それら自体既知の物質）、４−メチルウンベリフ
ェロン、３−カルボキシ−７−ヒドロキシクマリン、３
−アセチル−７−ヒドロキシクマリン、３−カルボキシ
エチル−７−ヒドロキシ−クマリン、３−シアノ−７−
ヒドロキシクマリン、７−アミノ−４−メチル−クマリ
ン、７−アミノ−４トリフルオロメチルクマリン、２−
ナフチル−アミン、４−メトキシ−β−ナフチルアミン
、ナフトール−ＡＳ （３−ヒドロキシ−２−ナフトエ
酸アニリド）、Ｎ−メチルインドキシルアセテート及び
インドキシルアセテートを含むインドキシル１−（α）
−及び２−（β）−ナフトール誘導体、レゾルフィン、
１−メチル−７−ヒトロキシキノリニウムヨージド、及
び６−アミノ−キノリンを含む。
ｅｎｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ ｉｎＭｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＋Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、 ５１巻、９６９〜９７７頁を参
照のこと）と同様であってもよい。有用な基質は、イン
ドキシルアセテート、インドキシル−βＤ−グルコシド
、４ＭＵ−Ｄ−グルコシド、４ＭＵ−ホスフェート、イ
ンドキシルホスフェート、４−ＭＵ−Ｄガラクトシド、
Ｎ−メチルインドキシルアセテート、Ｎ−メチルインド
キシルミリステート、β−ナフチルアセテート、α−ナ
フチルアセテート、４ＭＵ−ヘプタノエート、４ＭＵア
セテート、５−クロモインドキシルアセテート、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−ホスフェート、３−インドキシ
ルホスフェート、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−
グルコシド、４ＭＵグルクロニド、７−ニトキシクマリ
ン、グリシル−Ｌ−フェニル−β−ナフチルアミド、β
−ナフチルスルフェート、３−インドキシルスルフェー
ト、ルミノール、レアサズリン（ｒｅａｓａｚｕｒｉｎ
）、蛍光性４メチルウンベリフエリル誘導体、７−アミ
ノ−４−メチルクマリンの誘導体、４−メチルランへり
フェリルホスフェートと４−メチルウンベリフェリル脂
肪酸エステル、例えばヘキサノエート、オクタノエート
、ノナエートまたはＣ６〜ＣＩ６の鎖長をもつその他の
脂肪酸エステルとの混合物、及び４−メチルウンベリフ
ェリルエステル、例えばホスフェートと７− （Ｎ）−
（アミノアシル−４−ペプチジル）−４−メチル−７−
アミノ−クマリン（例えば７−（Ｎ）−アラニル−４−
メチル７−アミノ−クマリン及び相当するレシチン誘導
体）との混合物を含む。有用な蛍光（ｆＩｕｏｒｏｇｅ
ｎ ｉｃ）基質ハウンベリフェロンのペプチド及びエス
テル（それら自体既知の物質）、４−メチルウンベリフ
ェロン、３−カルボキシ−７−ヒドロキシクマリン、３
−アセチル−７−ヒドロキシクマリン、３−カルボキシ
エチル−７−ヒドロキシ−クマリン、３−シアノ−７−
ヒドロキシクマリン、７−アミノ−４−メチル−クマリ
ン、７−アミノ−４トリフルオロメチルクマリン、２−
ナフチル−アミン、４−メトキシ−β−ナフチルアミン
、ナフトール−ＡＳ （３−ヒドロキシ−２−ナフトエ
酸アニリド）、Ｎ−メチルインドキシルアセテート及び
インドキシルアセテートを含むインドキシル１−（α）
−及び２−（β）−ナフトール誘導体、レゾルフィン、
１−メチル−７−ヒトロキシキノリニウムヨージド、及
び６−アミノ−キノリンを含む。
微生物同定に関し、培養懸濁液が、夫々異なる基質を含
む溶液に添加され適温でインキュベートされる。多重酵
素試験が一つの試験パネル中に配列されてもよい。微生
物の種類に応じて、或種の基質は微生物により生成され
た特異的な酵素により開裂されて特徴的なパターンを生
じる。酵素反応の生成物は、蛍光性であってもよく、着
色されてもよく、電気化学的に活性であってもよく、ま
た発光性であってもよい。７−アミノ−４−メチルクマ
リンの如き蛍光（ｆ Ｉｕｏｒｏｇｅｎ ｉｃ ）基質
は、アラニン、ロイシン及びバリンの如きアミノ酸また
は短鎖ペプチドもしくはタンパク質に誘導体化され、あ
るいは４−メチルウンベリフェロンはアセテート、プロ
ピオネート及びホスフェート、オレエート及びヘプタノ
エートの如き脂肪酸及びガラクトース、フコース、アラ
ビノース及びグルコースの如き糖のような化合物に誘導
体化される。これらの蛍光助剤基質が微生物酵素により
加水分解される時、４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ
）及び７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）が遊
離される。
む溶液に添加され適温でインキュベートされる。多重酵
素試験が一つの試験パネル中に配列されてもよい。微生
物の種類に応じて、或種の基質は微生物により生成され
た特異的な酵素により開裂されて特徴的なパターンを生
じる。酵素反応の生成物は、蛍光性であってもよく、着
色されてもよく、電気化学的に活性であってもよく、ま
た発光性であってもよい。７−アミノ−４−メチルクマ
リンの如き蛍光（ｆ Ｉｕｏｒｏｇｅｎ ｉｃ ）基質
は、アラニン、ロイシン及びバリンの如きアミノ酸また
は短鎖ペプチドもしくはタンパク質に誘導体化され、あ
るいは４−メチルウンベリフェロンはアセテート、プロ
ピオネート及びホスフェート、オレエート及びヘプタノ
エートの如き脂肪酸及びガラクトース、フコース、アラ
ビノース及びグルコースの如き糖のような化合物に誘導
体化される。これらの蛍光助剤基質が微生物酵素により
加水分解される時、４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ
）及び７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）が遊
離される。
生成物は蛍光性でありＣ１８吸着剤に強く結合する。Ａ
ＭＣ及びＭＵは１００％メタノールによりＣ１８吸着剤
から溶出され、蛍光測定装置で測定し得る。
ＭＣ及びＭＵは１００％メタノールによりＣ１８吸着剤
から溶出され、蛍光測定装置で測定し得る。
特定の微生物が生成する特定の酵素の認識は、純粋培養
分離株の同定を可能にする。抗菌物質怒受性パターンは
、或種の抗菌性化合物の存在下で純粋培養分離株により
生成された酵素の量の減少を測定することにより得るこ
とができる。純粋培養分離株により生成された酵素の量
の減少は、抗菌剤に対するその微生物の感受性に直接関
係する。
分離株の同定を可能にする。抗菌物質怒受性パターンは
、或種の抗菌性化合物の存在下で純粋培養分離株により
生成された酵素の量の減少を測定することにより得るこ
とができる。純粋培養分離株により生成された酵素の量
の減少は、抗菌剤に対するその微生物の感受性に直接関
係する。
４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭｔｌＰと
称する）、４−メチルウンベリフェリルノナノエート（
ＭＵＮと称する）及びＬ−アラニル−７−アミド−４−
メチルクマリン（八ＡＭＣと称する）の如き蛍光（ｆ
１ ｕｏｒｏｇｅｎ ｉｃ ）基質が抗菌物質感受性試
験に使用し得る。酵素による開裂から生成された蛍光性
生成物、即ちＭＵ及びＡＭＣの量の減少は、抗菌剤によ
る微生物抑制に関連する酵素の量の減少を示す。
称する）、４−メチルウンベリフェリルノナノエート（
ＭＵＮと称する）及びＬ−アラニル−７−アミド−４−
メチルクマリン（八ＡＭＣと称する）の如き蛍光（ｆ
１ ｕｏｒｏｇｅｎ ｉｃ ）基質が抗菌物質感受性試
験に使用し得る。酵素による開裂から生成された蛍光性
生成物、即ちＭＵ及びＡＭＣの量の減少は、抗菌剤によ
る微生物抑制に関連する酵素の量の減少を示す。
これらの場合の夫々に於いて、インキュベーション溶液
が吸着剤を含む第二カラムに添加される。
が吸着剤を含む第二カラムに添加される。
第二カラムは、多くとも５００の理論段数、好ましくは
約１００の理論段数、最も好ましくは約５０の理論段数
の吸着剤を含む。第二カラムは生物試料による基質のイ
ンキュベーションにより生成された生成物を結合する作
用をする。基質から生成物の分離は、本明細書中に記載
されたように行なわれる。
約１００の理論段数、最も好ましくは約５０の理論段数
の吸着剤を含む。第二カラムは生物試料による基質のイ
ンキュベーションにより生成された生成物を結合する作
用をする。基質から生成物の分離は、本明細書中に記載
されたように行なわれる。
上記の如く、免疫反応またはハイブリダイゼーション反
応は、第一カラム内のラテックスビーズまたはセファク
リルビーズまたはラテックスで被覆されたフリットの如
き固体担体上で行ない得る。
応は、第一カラム内のラテックスビーズまたはセファク
リルビーズまたはラテックスで被覆されたフリットの如
き固体担体上で行ない得る。
また、免疫反応またはハイブリダイゼーションは固体担
体系で第一カラムの外側で行なうことができ、第一カラ
ムは免疫反応またはハイブリダイゼーション反応の完結
後に固体担体を保持するのに使用される。更に、免疫反
応生成物（抗原−抗体複合体）またはハイブリダイゼー
ション反応（ハイブリッド二重鎖）は、物理的手段また
は化学的手段により第一カラムでインキュベートし得る
。
体系で第一カラムの外側で行なうことができ、第一カラ
ムは免疫反応またはハイブリダイゼーション反応の完結
後に固体担体を保持するのに使用される。更に、免疫反
応生成物（抗原−抗体複合体）またはハイブリダイゼー
ション反応（ハイブリッド二重鎖）は、物理的手段また
は化学的手段により第一カラムでインキュベートし得る
。
抗原、抗体または核酸プローブに直接化学的に連結され
るか、または例えばアビジン−ビオチン結合を用いて測
定反応体の一部に間接的にラベルされる酵素ラベルの使
用により、検出系が提供される。免疫反応またはハイブ
リダイゼーション反応が第一カラムの外側で完結される
場合には、酵素は抗原−抗体複合体またはハイブリッド
二重鎖の一部である。第一カラムの外で溶液中または固
体担体上で行なわれる免疫反応またはハイブリダイゼー
ション反応は、試薬の逐次添加、保温及び洗浄を含む多
段階の手動の工程を伴い得る。これらの工程は、プログ
ラミングされた装置により自動的に行なわれてもよい。
るか、または例えばアビジン−ビオチン結合を用いて測
定反応体の一部に間接的にラベルされる酵素ラベルの使
用により、検出系が提供される。免疫反応またはハイブ
リダイゼーション反応が第一カラムの外側で完結される
場合には、酵素は抗原−抗体複合体またはハイブリッド
二重鎖の一部である。第一カラムの外で溶液中または固
体担体上で行なわれる免疫反応またはハイブリダイゼー
ション反応は、試薬の逐次添加、保温及び洗浄を含む多
段階の手動の工程を伴い得る。これらの工程は、プログ
ラミングされた装置により自動的に行なわれてもよい。
例えば、固相担体系への試薬の添加工程、洗浄工程及び
保温工程は、全てマイクロプロセッサ−で制御された流
体系により行なわれてもよい。
保温工程は、全てマイクロプロセッサ−で制御された流
体系により行なわれてもよい。
固体担体上で行なわれる免疫反応の場合には、抗原また
は抗体は固体担体の表面に共有結合されるか、あるいは
受動的に吸着される。抗体が表面に結合される場合には
、反応試料中の注目の抗原が競合免疫反応またはサンド
イッチ免疫反応により検出し得る。競合免疫反応の場合
には、酵素でラベルされた抗原（抗原は関係のある抗原
と同一である）が試験される試料中に混合される。つい
で、この混合物は抗体で被覆された表面に通され、ここ
でラベルされていない抗原と酵素でラベルされた抗原が
固相の表面の結合部位に対して競合する。固体担体表面
上に残存する酵素の量は試料中のラベルされていない分
析対象即ち注目の抗原の量の定量測定を与える。
は抗体は固体担体の表面に共有結合されるか、あるいは
受動的に吸着される。抗体が表面に結合される場合には
、反応試料中の注目の抗原が競合免疫反応またはサンド
イッチ免疫反応により検出し得る。競合免疫反応の場合
には、酵素でラベルされた抗原（抗原は関係のある抗原
と同一である）が試験される試料中に混合される。つい
で、この混合物は抗体で被覆された表面に通され、ここ
でラベルされていない抗原と酵素でラベルされた抗原が
固相の表面の結合部位に対して競合する。固体担体表面
上に残存する酵素の量は試料中のラベルされていない分
析対象即ち注目の抗原の量の定量測定を与える。
溶液中で行なわれる競合免疫反応の場合には、ラベルさ
れていない抗原及び標準量の酵素でラベルされた抗原が
測定溶液中の標準濃度の抗体と混合される。酵素でラベ
ルされた抗原及び抗体の濃度は抗原決定基的抗体結合部
位の比がほぼｌ：１となるように標準化されるべきであ
る。免疫反応が完結した後、測定溶液は、プロティンＡ
で被覆された固体担体材料を含むカラムｌに導入される
。
れていない抗原及び標準量の酵素でラベルされた抗原が
測定溶液中の標準濃度の抗体と混合される。酵素でラベ
ルされた抗原及び抗体の濃度は抗原決定基的抗体結合部
位の比がほぼｌ：１となるように標準化されるべきであ
る。免疫反応が完結した後、測定溶液は、プロティンＡ
で被覆された固体担体材料を含むカラムｌに導入される
。
プロティンＡは抗体分子のＦＣ部分に結合し、溶液中に
形成された免疫複合体を保持する。プロティンＡ固体担
体に結合されて残存する酵素の量は、試料中の関係のあ
るラベルされていない抗原の量に反比例する。
形成された免疫複合体を保持する。プロティンＡ固体担
体に結合されて残存する酵素の量は、試料中の関係のあ
るラベルされていない抗原の量に反比例する。
サンドインチ型免疫反応に於いて、固体担体表面上の抗
体分子は試験される試料中の注目の特異的な抗原に結合
する。ついで、未反応抗原及び異物は洗浄工程により除
去される。抗原分子の異なる抗原決定基に対し時として
特異的な第二抗体分子は、酵素でラベルされ固相系に添
加される。固相−抗体−抗原複合体は抗体−酵素を結合
する。
体分子は試験される試料中の注目の特異的な抗原に結合
する。ついで、未反応抗原及び異物は洗浄工程により除
去される。抗原分子の異なる抗原決定基に対し時として
特異的な第二抗体分子は、酵素でラベルされ固相系に添
加される。固相−抗体−抗原複合体は抗体−酵素を結合
する。
この機構により、酵素ラベルは抗体−抗原−抗体サンド
インチ型複合体の一部として固体担体に結合される。洗
浄後、固相に結合されて残存する酵素の量は注目の試料
中の抗原の量に比例する。固体担体は第一カラムの一部
であってもよい。また、固体担体は免疫反応の完結後に
第一カラム中で後で回収されるラテックスビードであっ
てもよい。
インチ型複合体の一部として固体担体に結合される。洗
浄後、固相に結合されて残存する酵素の量は注目の試料
中の抗原の量に比例する。固体担体は第一カラムの一部
であってもよい。また、固体担体は免疫反応の完結後に
第一カラム中で後で回収されるラテックスビードであっ
てもよい。
ハイブリダイゼーション反応の場合には、標的ＤＮＡま
たはＲＮＡに対し特異的であり相補性であるオリゴヌク
レオチド鎖が、固相の表面に共有結合される。好ましく
はオリゴヌクレオチド鎖が、オリゴヌクレオ鎖の一端で
固相に連結される。サンドインチ型ハイブリダイゼーシ
ョンが行なわれる場合には、試験される微生物またはそ
の他の源からのＤＮＡまたはＲＮＡが化学的または機械
的に遊離され、変性され、ついで適当な溶液条件下で固
相上の鎖にハイブリッド形成される。捕捉された標的配
列の異なる塩基配列に特異的に反応する、酵素でラベル
された核酸プローブは、ついで標的鎖の相補性核酸鎖に
ハイブリッド形成される。
たはＲＮＡに対し特異的であり相補性であるオリゴヌク
レオチド鎖が、固相の表面に共有結合される。好ましく
はオリゴヌクレオチド鎖が、オリゴヌクレオ鎖の一端で
固相に連結される。サンドインチ型ハイブリダイゼーシ
ョンが行なわれる場合には、試験される微生物またはそ
の他の源からのＤＮＡまたはＲＮＡが化学的または機械
的に遊離され、変性され、ついで適当な溶液条件下で固
相上の鎖にハイブリッド形成される。捕捉された標的配
列の異なる塩基配列に特異的に反応する、酵素でラベル
された核酸プローブは、ついで標的鎖の相補性核酸鎖に
ハイブリッド形成される。
この酵素でラベルされたプローブは固相上の標的核酸配
列により捕捉され、固相上の標的鎖の存在をレポートす
る作用をする。それ故、ハイブリダイゼーション反応に
より、固相に結合された酵素の存在は、注目の特異的な
核酸の存在または不在を示す役目を果す。
列により捕捉され、固相上の標的鎖の存在をレポートす
る作用をする。それ故、ハイブリダイゼーション反応に
より、固相に結合された酵素の存在は、注目の特異的な
核酸の存在または不在を示す役目を果す。
競合核酸ハイブリダイゼーション反応は、固相上の核酸
の鎖に相補的である酵素でラベルされた核酸プローブを
使用することにより行なわれる。
の鎖に相補的である酵素でラベルされた核酸プローブを
使用することにより行なわれる。
また酵素でラベルされたプローブは、生物試料からのポ
リヌクレオチド鎖の注目の標的配列と同じであるか、ま
たは実質的に類似する核酸配列を含む。酵素でラベルさ
れた核酸プローブは、注目の試料からの標的核酸と混合
される。ラベルされた標的配列及びラベルされていない
標的配列の両者が、固相に結合された相補性配列に対し
競合してハイブリッド形成する。固相上に残存する酵素
の量は、関係のある試料中の標的核酸配列の量に反比例
する。
リヌクレオチド鎖の注目の標的配列と同じであるか、ま
たは実質的に類似する核酸配列を含む。酵素でラベルさ
れた核酸プローブは、注目の試料からの標的核酸と混合
される。ラベルされた標的配列及びラベルされていない
標的配列の両者が、固相に結合された相補性配列に対し
競合してハイブリッド形成する。固相上に残存する酵素
の量は、関係のある試料中の標的核酸配列の量に反比例
する。
また、ハイブリダイゼーション反応は、溶液中で行なわ
れてもよく、ハイブリッドが第一カラム中に捕捉される
。−例は、第一カラム中の抗原及び抗体反応による溶液
中に生成された核酸ハイブリッドの捕捉である。この場
合、標的ポリヌクレオチド鎖の二つの特定の配列に相補
的であり特異的である二つのポリヌクレオチドプローブ
が使用される。これらのプローブの一つは酵素でラベル
され、第二のプローブはハプテンでラベルされる。
れてもよく、ハイブリッドが第一カラム中に捕捉される
。−例は、第一カラム中の抗原及び抗体反応による溶液
中に生成された核酸ハイブリッドの捕捉である。この場
合、標的ポリヌクレオチド鎖の二つの特定の配列に相補
的であり特異的である二つのポリヌクレオチドプローブ
が使用される。これらのプローブの一つは酵素でラベル
され、第二のプローブはハプテンでラベルされる。
プローブは、適当な測定条件下で標的鎖とハイブリッド
を形成する。ハイブリダイゼーション反応が完結された
後、ハイブリダイゼーション複合体を含む測定溶液が、
ハプテンに対し特異的である抗体で被覆された固体担体
材料を含む第一カラム中に導入される。抗体はハイブリ
ダイゼーション複合体を保持する。これは第一カラム上
の酵素の存在をもたらす。
を形成する。ハイブリダイゼーション反応が完結された
後、ハイブリダイゼーション複合体を含む測定溶液が、
ハプテンに対し特異的である抗体で被覆された固体担体
材料を含む第一カラム中に導入される。抗体はハイブリ
ダイゼーション複合体を保持する。これは第一カラム上
の酵素の存在をもたらす。
第二の例は、ＤＮＡ ： ＤＮＡハイブリッドまたはＲ
ＮＡ ： ＤＮＡハイブリッドと特異的に反応する抗体
の使用を伴う。この場合、相補性鎖の一つは酵素により
ラベルされる。上記の如く、溶液中のハイブリダイゼー
ションが完結された後、ハイブリッドを含む測定溶液が
、ＤＮＡ ： ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ ：
ＤＮＡハイブリッドの抗体で被覆さした固体担体を含む
第一カラムに導入される。ＤＮＡ ： ＤＮＡハイブリ
ッドまたはＲＮＡ ： ＤＮＡハイブリ・ンドのこの保
持は、第一カラム中の酵素の存在をもたらし、第一カラ
ム中に存在する酵素の量は関係する試料中の標的核酸の
量に比例する。
ＮＡ ： ＤＮＡハイブリッドと特異的に反応する抗体
の使用を伴う。この場合、相補性鎖の一つは酵素により
ラベルされる。上記の如く、溶液中のハイブリダイゼー
ションが完結された後、ハイブリッドを含む測定溶液が
、ＤＮＡ ： ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ ：
ＤＮＡハイブリッドの抗体で被覆さした固体担体を含む
第一カラムに導入される。ＤＮＡ ： ＤＮＡハイブリ
ッドまたはＲＮＡ ： ＤＮＡハイブリ・ンドのこの保
持は、第一カラム中の酵素の存在をもたらし、第一カラ
ム中に存在する酵素の量は関係する試料中の標的核酸の
量に比例する。
簡単に上記されたように、第一カラムは免疫反応または
ハイブリダイゼーション反応が行なわれて結合されたマ
ーカー酵素を生成する固相材料を含んでもよい。また、
第一カラムは、第一カラムの外で行なわれてマーカー酵
素を捕捉する免疫反応またはハイブリダイゼーション反
応から固相材料を保持するのに使用されてもよい。第一
カラム中の固相材料の保持は、第一カラムの一つの開口
部でフリットまたは膜の如き物理的バリヤーを用いて行
ない得る。更に、第一カラムは抗体−抗原複合体または
プローブ−標的オリゴヌクレオチド二重鎖を捕捉する作
用をすることができ、両者は第一カラムの外側の溶液中
で生成された酵素を含む。上記の代替手段の夫々は、関
係する分子、抗原、核酸、または微生物に直接比例して
、あるいは反比例して、固相材料に結合されたレボ−テ
ィング酵素の存在をもたらす。
ハイブリダイゼーション反応が行なわれて結合されたマ
ーカー酵素を生成する固相材料を含んでもよい。また、
第一カラムは、第一カラムの外で行なわれてマーカー酵
素を捕捉する免疫反応またはハイブリダイゼーション反
応から固相材料を保持するのに使用されてもよい。第一
カラム中の固相材料の保持は、第一カラムの一つの開口
部でフリットまたは膜の如き物理的バリヤーを用いて行
ない得る。更に、第一カラムは抗体−抗原複合体または
プローブ−標的オリゴヌクレオチド二重鎖を捕捉する作
用をすることができ、両者は第一カラムの外側の溶液中
で生成された酵素を含む。上記の代替手段の夫々は、関
係する分子、抗原、核酸、または微生物に直接比例して
、あるいは反比例して、固相材料に結合されたレボ−テ
ィング酵素の存在をもたらす。
本発明は、バックグラウンドシグナルを減少することに
より、且つ生成物を一層小さい検出容量に濃縮すること
により、酵素により生成された信号を増幅する方法及び
装置を開示する。
より、且つ生成物を一層小さい検出容量に濃縮すること
により、酵素により生成された信号を増幅する方法及び
装置を開示する。
上記の如く、酵素ラベルが一旦固体担体に結合されると
、酵素により生成された生成物の完全結合を可能にする
溶液中の特異的な基質が第一カラムに添加される。基質
は結合された酵素と反応し、これにより生成物を生成す
る。適当な反応条件、例えば時間、温度及びｐｌ＋が関
与される特定の酵素の特性に従って調節される。基質は
、（ａ）最適酵素活性、（ｂ）酵素により生成された生
成物を吸着剤に完全に結合すること、及び（Ｃ）基質を
吸着剤に殆ど、または全く結合しないことを可能にする
溶液中に存在することが好ましい。多くの酵素が、０．
０１〜０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６〜８）、０．
００１〜０．１ Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ
６〜８）、０．００１〜０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ６〜９）、または０．００１〜０，１Ｍの重炭酸塩緩
衝液（ｐＨ７〜９）の如き緩衝溶液中で高活性を示す。
、酵素により生成された生成物の完全結合を可能にする
溶液中の特異的な基質が第一カラムに添加される。基質
は結合された酵素と反応し、これにより生成物を生成す
る。適当な反応条件、例えば時間、温度及びｐｌ＋が関
与される特定の酵素の特性に従って調節される。基質は
、（ａ）最適酵素活性、（ｂ）酵素により生成された生
成物を吸着剤に完全に結合すること、及び（Ｃ）基質を
吸着剤に殆ど、または全く結合しないことを可能にする
溶液中に存在することが好ましい。多くの酵素が、０．
０１〜０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６〜８）、０．
００１〜０．１ Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ
６〜８）、０．００１〜０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ６〜９）、または０．００１〜０，１Ｍの重炭酸塩緩
衝液（ｐＨ７〜９）の如き緩衝溶液中で高活性を示す。
吸着剤及び反応溶液に関する酵素で生成された生成物の
保持の説明が以下に示される。
保持の説明が以下に示される。
インキュベーションの後、基質と結合マーカー酵素との
反応から生成された生成物及び未反応基質を含む溶液は
、第二カラムに移される。カラム間の溶液移動のための
流体設計は、透過性装置により・またはカラム間の導管
により、あるいは溶液を第一カラムから第二カラムに移
動させ得るマイクロプロセッサ−で制御された流体装置
により、二つの分離カラムの直接接触を可能にする。
反応から生成された生成物及び未反応基質を含む溶液は
、第二カラムに移される。カラム間の溶液移動のための
流体設計は、透過性装置により・またはカラム間の導管
により、あるいは溶液を第一カラムから第二カラムに移
動させ得るマイクロプロセッサ−で制御された流体装置
により、二つの分離カラムの直接接触を可能にする。
第二カラムは、溶液中の基質から生成物を実質的に分離
する作用をする。第二カラムは、未反応基質及びその他
の混在物質に対して酵素により生成された生成物を保持
することによりこの分離を行なう吸着剤を含む。この分
離は第一カラム中で固体担体に結合された極少量の酵素
の検出を増強する。
する作用をする。第二カラムは、未反応基質及びその他
の混在物質に対して酵素により生成された生成物を保持
することによりこの分離を行なう吸着剤を含む。この分
離は第一カラム中で固体担体に結合された極少量の酵素
の検出を増強する。
吸着剤は、生成物を基質から分離し得るいずれの物質で
あってもよい。好適な吸着剤は一般に生成物との極性、
非極性またはイオンの相互作用によりこの分離を行なう
。基質を殆ど、または全く保持せずに、酵素により生成
された生成物の特別な吸着剤による完全な保持は、吸着
剤の種類、生成物及び基質の化学的性質、及び酵素反応
を行なうのに使用される溶液に依存する。表１はこれら
の成分の相互依存を示す。
あってもよい。好適な吸着剤は一般に生成物との極性、
非極性またはイオンの相互作用によりこの分離を行なう
。基質を殆ど、または全く保持せずに、酵素により生成
された生成物の特別な吸着剤による完全な保持は、吸着
剤の種類、生成物及び基質の化学的性質、及び酵素反応
を行なうのに使用される溶液に依存する。表１はこれら
の成分の相互依存を示す。
酵素により生成された生成物の保持のための非極性吸着
剤の記載が、説明のために示される。結合されたＣ８〜
Ｃ２□シリカの如き非極性吸着剤が使用されることが好
ましい。非極性吸着剤がＣ１８シリカ吸着剤、Ｃ１８ス
チレン／ジビニルベンゼンまたはＣ１Ｂアルミナである
ことが最も好ましい。
剤の記載が、説明のために示される。結合されたＣ８〜
Ｃ２□シリカの如き非極性吸着剤が使用されることが好
ましい。非極性吸着剤がＣ１８シリカ吸着剤、Ｃ１８ス
チレン／ジビニルベンゼンまたはＣ１Ｂアルミナである
ことが最も好ましい。
非極性吸着剤は疎水性の相対程度の差に基いて生成物を
基質から分離する。０８〜Ｃ１８非極性吸着剤は、表面
から延びる種々の長さの炭素差をもつ活性シリカまたは
アルミナを用いて普通つくられる。例えば、Ｃ８〜Ｃ１
８の略称の数字は、鎖中の炭素原子の数を云う。炭素鎖
は結合シリカのまわりの非極性領域を形成する。性質が
実質的に非極性である化合物、または非極性領域を含む
化合物が、水の如く出来る限り極性である溶液中の吸着
剤ベッドに添加される。極性溶媒の状況下で、実質的に
非極性の化合物が吸着剤の非極性領域と会合する。非極
性溶媒が使用される場合には、酵素により生成された生
成物及び基質は、実質的に極性である溶媒により第二カ
ラム中の吸着剤ベッドに移されるべきである。
基質から分離する。０８〜Ｃ１８非極性吸着剤は、表面
から延びる種々の長さの炭素差をもつ活性シリカまたは
アルミナを用いて普通つくられる。例えば、Ｃ８〜Ｃ１
８の略称の数字は、鎖中の炭素原子の数を云う。炭素鎖
は結合シリカのまわりの非極性領域を形成する。性質が
実質的に非極性である化合物、または非極性領域を含む
化合物が、水の如く出来る限り極性である溶液中の吸着
剤ベッドに添加される。極性溶媒の状況下で、実質的に
非極性の化合物が吸着剤の非極性領域と会合する。非極
性溶媒が使用される場合には、酵素により生成された生
成物及び基質は、実質的に極性である溶媒により第二カ
ラム中の吸着剤ベッドに移されるべきである。
化合物が吸着剤よりも溶出溶媒に一層引きつけられる時
に、化合物は吸着剤ベッドから溶出される。特別な生成
物及び基質の吸着剤及び溶媒は、溶出溶媒が第二カラム
に添加されるまで生成物が吸着剤ベッドに保持されるよ
うに選ばれる。増大された測定感度は、吸着剤ベッドか
ら極めて歩容量の溶媒中への生成物の溶出により実現さ
れる。
に、化合物は吸着剤ベッドから溶出される。特別な生成
物及び基質の吸着剤及び溶媒は、溶出溶媒が第二カラム
に添加されるまで生成物が吸着剤ベッドに保持されるよ
うに選ばれる。増大された測定感度は、吸着剤ベッドか
ら極めて歩容量の溶媒中への生成物の溶出により実現さ
れる。
基質及び生成物の化学的性質は、使用される吸着剤及び
溶媒または反応溶液の適切な種類を指示する。例えば、
下記の表２は酵素及び基質及び生成された生成物の例を
列記する。また表２は、生成物を基質から分離するのに
使用し得る、吸着剤及び溶出溶媒の適切な組合せを列記
する。
溶媒または反応溶液の適切な種類を指示する。例えば、
下記の表２は酵素及び基質及び生成された生成物の例を
列記する。また表２は、生成物を基質から分離するのに
使用し得る、吸着剤及び溶出溶媒の適切な組合せを列記
する。
ピルベートキナーゼ酵素により生成される生成物、即ち
ＡＴＰは酵素ルシフェリナーゼと混合されるか、あるい
は固定化ルシフエリナーゼを含むカラムに通されて光を
発し、この光がフロー・ルミノメータ−（ｆｌｏｗ Ｉ
ｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）により測定される。
ＡＴＰは酵素ルシフェリナーゼと混合されるか、あるい
は固定化ルシフエリナーゼを含むカラムに通されて光を
発し、この光がフロー・ルミノメータ−（ｆｌｏｗ Ｉ
ｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）により測定される。
特定の種類の吸着剤に関し、基質−酵素組合せ及び反応
溶液（溶媒）の適切な選択が、本発明の実施に必須であ
る。基質及び酵素は、吸着剤に強く保持され、しかも検
出装置〔蛍光測定装置、分光光度計、ルミノメーター（
ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ） 、電気化学的検出器］によ
り測定可能な生成物を生成する。更に、酵素は、基質と
実質的に化学的に異なる生成物を生成する。例えば、基
質は極性基及び非極性基の両者を含む。この化合物の酵
素による開裂は、性質が実質的に非極性である測定可能
な生成物を生成する。この基質−酵素組合せの例は、非
極性基（メチルランへりフエリル基）及び極性基（Ｄ−
ガラクトース）の両者を有する基質４−メチルウンベリ
フェリルβ−Ｄ−ガラクトシドである。この化合物は酵
素β−ガラクトシダーゼによる酵素処理で開裂されてガ
ラクトース及びメチルウンベリフェロンを生成する。メ
チルウンベリフェロン基は非極性であり蛍光性である。
溶液（溶媒）の適切な選択が、本発明の実施に必須であ
る。基質及び酵素は、吸着剤に強く保持され、しかも検
出装置〔蛍光測定装置、分光光度計、ルミノメーター（
ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ） 、電気化学的検出器］によ
り測定可能な生成物を生成する。更に、酵素は、基質と
実質的に化学的に異なる生成物を生成する。例えば、基
質は極性基及び非極性基の両者を含む。この化合物の酵
素による開裂は、性質が実質的に非極性である測定可能
な生成物を生成する。この基質−酵素組合せの例は、非
極性基（メチルランへりフエリル基）及び極性基（Ｄ−
ガラクトース）の両者を有する基質４−メチルウンベリ
フェリルβ−Ｄ−ガラクトシドである。この化合物は酵
素β−ガラクトシダーゼによる酵素処理で開裂されてガ
ラクトース及びメチルウンベリフェロンを生成する。メ
チルウンベリフェロン基は非極性であり蛍光性である。
同様に、基質は実質的にイオン性（正または負に荷電さ
れる）であってもよく、一方酵素作用により生成された
生成物は基質と反対の電荷を有するか、または電荷をも
たない。この生成物はイオン交換吸着剤により基質から
分離し得る。
れる）であってもよく、一方酵素作用により生成された
生成物は基質と反対の電荷を有するか、または電荷をも
たない。この生成物はイオン交換吸着剤により基質から
分離し得る。
非極性吸着剤に関し、酵素により生成された生成物が実
質的に非極性である場合には基質は実質的に極性である
ことが好ましい。
質的に非極性である場合には基質は実質的に極性である
ことが好ましい。
基質が実質的に充分極性である場合には極性環境中に存
在する基質は非極性吸着剤に保持されず流動流により吸
着剤カラムから除去される。幾つかの非極性領域を有す
る基質分子は、−理非極性にされる溶液の使用を必要と
することがあり、その結果基質分子は吸着剤ベッドに保
持されない。
在する基質は非極性吸着剤に保持されず流動流により吸
着剤カラムから除去される。幾つかの非極性領域を有す
る基質分子は、−理非極性にされる溶液の使用を必要と
することがあり、その結果基質分子は吸着剤ベッドに保
持されない。
溶液は、例えば水にメタノール、アセトニトリルまたは
テトラヒドロフランの添加により一層非極性にし得る。
テトラヒドロフランの添加により一層非極性にし得る。
非極性生成物は、未反応基質が保持されない、Ｃ１８の
如き非極性吸着剤に保持される。
如き非極性吸着剤に保持される。
ついで生成物はメタノールの如き非極性溶出溶媒を用い
て吸着剤から溶出される。
て吸着剤から溶出される。
更に詳細には、本発明の一態様に於いて、固体担体に結
合された抗体または核酸鎖のいずれかを含む第一カラム
は開放端部のカラム中に置かれる。
合された抗体または核酸鎖のいずれかを含む第一カラム
は開放端部のカラム中に置かれる。
第一カラムは、試料及び試薬がカラム中を流されて固体
担体表面に接することを可能にするような流れ系中に置
かれる。サンドイッチ型の免疫反応またはハイブリダイ
ゼーション反応が行なわれる場合には、例えば試料が担
体に通され、標的抗体または標的核酸鎖が捕捉される。
担体表面に接することを可能にするような流れ系中に置
かれる。サンドイッチ型の免疫反応またはハイブリダイ
ゼーション反応が行なわれる場合には、例えば試料が担
体に通され、標的抗体または標的核酸鎖が捕捉される。
酵素レボター分子は固相上で特異的な物質と反応させら
れて、物質が捕捉されているかを測定する。この操作は
、以下の工程を必要とする。（ａ）固体担体を洗浄して
未反応物質を除去する工程、（ｂ）酵素でラベルされた
抗体またはポリヌクレオチドプローブを添加する工程、
（Ｃ）固体担体を洗浄して全ての結合されない酵素でラ
ベルされた試薬を除去する工程、（ｄ）酵素ラベルに特
異的な基質を添加する工程、及び（ｅ）基質及び酵素を
適当な条件で保温する工程。
れて、物質が捕捉されているかを測定する。この操作は
、以下の工程を必要とする。（ａ）固体担体を洗浄して
未反応物質を除去する工程、（ｂ）酵素でラベルされた
抗体またはポリヌクレオチドプローブを添加する工程、
（Ｃ）固体担体を洗浄して全ての結合されない酵素でラ
ベルされた試薬を除去する工程、（ｄ）酵素ラベルに特
異的な基質を添加する工程、及び（ｅ）基質及び酵素を
適当な条件で保温する工程。
酵素が固相上に結合されて残る場合には、酵素は基質の
一部を生成物に変換する。生成物の生成量は固相上にあ
る酵素の量に比例する。
一部を生成物に変換する。生成物の生成量は固相上にあ
る酵素の量に比例する。
流れ系に於いて、第二カラムは第一カラムから固定距離
の位置に配置される。流れ系がマイクロプロセンサーで
制御された装置の一部である場合には、切換弁が二つの
カラムの間に配置されてもよい。これは第２図に示され
た二つのカラム設計である。また、カラムは単一の単位
装置としてつくられてもよいが、固体担体材料及び吸着
剤ベッドは導管により固定距離で連結され、あるいはフ
リットもしくは膜フィルターの如きバリヤーにより分離
される。これは第１図に示されたような連続式の設計で
ある。
の位置に配置される。流れ系がマイクロプロセンサーで
制御された装置の一部である場合には、切換弁が二つの
カラムの間に配置されてもよい。これは第２図に示され
た二つのカラム設計である。また、カラムは単一の単位
装置としてつくられてもよいが、固体担体材料及び吸着
剤ベッドは導管により固定距離で連結され、あるいはフ
リットもしくは膜フィルターの如きバリヤーにより分離
される。これは第１図に示されたような連続式の設計で
ある。
二つのカラム設計または連続式の設計のいずれかを使用
する時、基質は第一カラムの固体担体に添加されて、上
記のようにインキュベートされる。
する時、基質は第一カラムの固体担体に添加されて、上
記のようにインキュベートされる。
第一カラム内の基質の温度は、最適の酵素活性を得るた
めに第一カラムのまわりの加熱ジャケットまたはブロッ
クにより調節されることが好ましい。
めに第一カラムのまわりの加熱ジャケットまたはブロッ
クにより調節されることが好ましい。
２分〜約２時間以上まで変化し得るインキュベーション
時間の後、酵素により生成された生成物は第一カラムの
固相から流れ系により第二カラムの吸着剤ベッドに移動
させられる。
時間の後、酵素により生成された生成物は第一カラムの
固相から流れ系により第二カラムの吸着剤ベッドに移動
させられる。
また、本発明は結合された酵素及び吸着剤を含む固体担
体系を含む単一容器を用いて構成されてもよい。約５０
０以下の理論段数の吸着剤が酵素を含む固体担体系と混
合される。基質が添加される。
体系を含む単一容器を用いて構成されてもよい。約５０
０以下の理論段数の吸着剤が酵素を含む固体担体系と混
合される。基質が添加される。
基質、結合された酵素及び吸着剤が一緒にインキュベー
トされる。酵素−基質反応が吸着剤に優先的に結合する
生成物を生成する。インキュベーション完結時に、吸着
剤に結合されない基質その他の物質が洗い出され、つい
で結合された生成物が吸着剤から溶出され、回収されて
適当な検出操作により生成物の量が測定される。
トされる。酵素−基質反応が吸着剤に優先的に結合する
生成物を生成する。インキュベーション完結時に、吸着
剤に結合されない基質その他の物質が洗い出され、つい
で結合された生成物が吸着剤から溶出され、回収されて
適当な検出操作により生成物の量が測定される。
基質が第一〇カラムの固相に添加され、酵素とのインキ
ュベーションを可能にする様式は、最大限の酵素活性が
得られるよういろいろと工夫されている。そして、基質
の添加およびインキュベーションを行う態様が、生成物
が第二〇カラムの吸着剤ベッドにもたらされる上記の様
式を左右する。
ュベーションを可能にする様式は、最大限の酵素活性が
得られるよういろいろと工夫されている。そして、基質
の添加およびインキュベーションを行う態様が、生成物
が第二〇カラムの吸着剤ベッドにもたらされる上記の様
式を左右する。
以下の４つの例が挙げられる。
１、基質の動的（ｄｙｎａｍｉｃ）添加およびインキュ
ベーション この態様では、基質が連続流によって第一〇カラムに添
加される。この第一のカラムからの流出物は、基質およ
び生成物を含み、第二〇カラムの吸着系に連続流として
運ばれる。連続流の一定時間が経過して基質の一定量が
第一〇カラムに添加された後、基質の添加を終了する。
ベーション この態様では、基質が連続流によって第一〇カラムに添
加される。この第一のカラムからの流出物は、基質およ
び生成物を含み、第二〇カラムの吸着系に連続流として
運ばれる。連続流の一定時間が経過して基質の一定量が
第一〇カラムに添加された後、基質の添加を終了する。
これらのカラムを非溶出液で洗浄し、すべての基質を２
つのカラムの系から実質的に除去することもできる。こ
の生成物を溶出溶媒によって第二〇カラムから取り出る
。続いて、濃縮産物を、分光光度計、蛍光分析器、燐光
分析器または電気化的検出器といった適当な検出器によ
って測定する。動的添加およびインキュベーション利点
は、固相での酵素活性と関連した拡散抑制が最小限に抑
えられ、酵素のフィードバック阻害を起こすような、第
一〇カラム中での産物の蓄積が除かれることである。
つのカラムの系から実質的に除去することもできる。こ
の生成物を溶出溶媒によって第二〇カラムから取り出る
。続いて、濃縮産物を、分光光度計、蛍光分析器、燐光
分析器または電気化的検出器といった適当な検出器によ
って測定する。動的添加およびインキュベーション利点
は、固相での酵素活性と関連した拡散抑制が最小限に抑
えられ、酵素のフィードバック阻害を起こすような、第
一〇カラム中での産物の蓄積が除かれることである。
２、 単一ストップトフローサイクル。
この態様では、基質が第一〇カラムの固相に添加されて
、流れが停止される。基質と酵素とのインキュベーショ
ンは、静的に行われる。適当なインキュベーション時間
の後、基質および溶媒中の生成物は、流れ系によって第
二のカラムの吸着系に移動する。この生成物は結合して
吸着剤ベッドに留まり、基質は除去される。生成物を、
適当な溶出溶媒で吸着剤ベッドから除去することができ
る。
、流れが停止される。基質と酵素とのインキュベーショ
ンは、静的に行われる。適当なインキュベーション時間
の後、基質および溶媒中の生成物は、流れ系によって第
二のカラムの吸着系に移動する。この生成物は結合して
吸着剤ベッドに留まり、基質は除去される。生成物を、
適当な溶出溶媒で吸着剤ベッドから除去することができ
る。
３、 多岐ストップトフローサイクル。
一定時間の静的インキュベーションの後、固相支持カラ
ムには、溶媒中の新しい基質がさらに補充される。この
「インキュベーションされた」基質は、流れ系によって
第二〇カラムの吸着剤ベンド中に、または吸着系方向へ
の移動が生じる。この流れ系は閉鎖系であるため、その
インキュベーション基質および生成物は、基質溶液の継
続的添加にともなって、第二のカデムの吸着系から第一
〇カラムに移動する。生成物は吸着系に保持されるが、
基質は実質的に保持されない。基質の添加が終了したと
き、残存する基質および生成物は、吸着カラム中に移動
し、そこを通過する。続いて、生成物は、第二〇カラム
への溶出溶媒の添加によって吸着カラムから溶出可能で
ある。重複ストップトラロー法では、生成物による酵素
活性のフィードバック阻害を最小限にすることができる
。さらに、この生成物は、基質の容量に比べて少ない容
量に濃縮される。
ムには、溶媒中の新しい基質がさらに補充される。この
「インキュベーションされた」基質は、流れ系によって
第二〇カラムの吸着剤ベンド中に、または吸着系方向へ
の移動が生じる。この流れ系は閉鎖系であるため、その
インキュベーション基質および生成物は、基質溶液の継
続的添加にともなって、第二のカデムの吸着系から第一
〇カラムに移動する。生成物は吸着系に保持されるが、
基質は実質的に保持されない。基質の添加が終了したと
き、残存する基質および生成物は、吸着カラム中に移動
し、そこを通過する。続いて、生成物は、第二〇カラム
への溶出溶媒の添加によって吸着カラムから溶出可能で
ある。重複ストップトラロー法では、生成物による酵素
活性のフィードバック阻害を最小限にすることができる
。さらに、この生成物は、基質の容量に比べて少ない容
量に濃縮される。
４、 基質のリサイクル。
この態様では、基質は、第一〇カラムの固体支持層に添
加され、第一〇カラムを連続的に再流通して、基質と固
相上の酵素との流動的インキュベーションが生じる。対
照として、この再流通を、第二のカラムの溶出液からも
起こすことができる。
加され、第一〇カラムを連続的に再流通して、基質と固
相上の酵素との流動的インキュベーションが生じる。対
照として、この再流通を、第二のカラムの溶出液からも
起こすことができる。
この方法では、基質は、第二のカラムに直列した第一〇
カラムへ添加される。基質および産物を含む溶媒の流れ
は、第一〇カラムを通って第二〇カラムに連続的に生じ
、後者において産物が吸着床に捕獲される。基質は、第
二〇カラムを通過し、酵素との反応のために第一〇カラ
ムに戻される。
カラムへ添加される。基質および産物を含む溶媒の流れ
は、第一〇カラムを通って第二〇カラムに連続的に生じ
、後者において産物が吸着床に捕獲される。基質は、第
二〇カラムを通過し、酵素との反応のために第一〇カラ
ムに戻される。
この再流通系は、基質が高価な場合に有利といえる。さ
らに、連続的循環によって、固体支持層表面上で酵素活
性に関連した拡散抑制が最小限に抑えられる。適当な時
間の再流通の後、生成物を、適切な溶出溶媒を用いて第
二〇カラムから溶出する。
らに、連続的循環によって、固体支持層表面上で酵素活
性に関連した拡散抑制が最小限に抑えられる。適当な時
間の再流通の後、生成物を、適切な溶出溶媒を用いて第
二〇カラムから溶出する。
上記のような、基質の添加およびインキュベーション法
のいかんに拘らず、すべての態様において、より高感度
の検出のために、酵素的に生じた生成物の基質からの分
離および生成物の濃縮が行われる。
のいかんに拘らず、すべての態様において、より高感度
の検出のために、酵素的に生じた生成物の基質からの分
離および生成物の濃縮が行われる。
以下の実施例、すなわち実施例１において核酸ハイブリ
ダイゼーション法に使用される場合、実施例２において
イムノアッセイに使用される場合で、この発明の装置を
用いたその方法を例示する。
ダイゼーション法に使用される場合、実施例２において
イムノアッセイに使用される場合で、この発明の装置を
用いたその方法を例示する。
実施例３では、この発明が微生物の夾雑を検出するため
に利用される例を、そして実施例４では、試料中の遊離
酵素を検出するために利用される例を示す。
に利用される例を、そして実施例４では、試料中の遊離
酵素を検出するために利用される例を示す。
以下の各実施例は、例示のために提供されるものであっ
て、制限を受けるものではない。
て、制限を受けるものではない。
夫施拠土
この実施例では、大腸菌の腸内毒性Ｃｅｎ ｔｅｒｔｏ
ｘｉｇｅｎｉｃ）株のＬＴ遺伝子中に完全に含まれる配
列に相補性のある酵素標識プローブを用いた、ハイブリ
ダイゼーションのサンドインチ法を記載する。酵素標識
したＤＮＡプローブは、１本鎖の２６量体オリゴヌクレ
オチドプローブ上の酵素標識としてβ−ガラクトシダー
ゼを用いて調製した。
ｘｉｇｅｎｉｃ）株のＬＴ遺伝子中に完全に含まれる配
列に相補性のある酵素標識プローブを用いた、ハイブリ
ダイゼーションのサンドインチ法を記載する。酵素標識
したＤＮＡプローブは、１本鎖の２６量体オリゴヌクレ
オチドプローブ上の酵素標識としてβ−ガラクトシダー
ゼを用いて調製した。
このβ−ガラクトシダーゼは、Ｊａｂｌｏｎｓｋｉらの
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｃｅａｒｃｈ
１４ ： ６１１５−２８）によって上記プローブに
結合させた。この酵素プローブに相補的な２６量体は、
その５′末端をＧｈｏｓｈらの方法（Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｃｅａｒｃｈ １５ ： ５３５３−７２．１９８７）
によって、５量体ポリアデニレート・リンカ−を介して
カルボキシ修飾型ラテックスビーズ（０，９７ｎｌ＝Ｉ
ｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓから入手）に
連結した。このラテックスビーズ懸濁液５０μｌを、様
々な濃度の酵素標識プローブとハイブリダイズさせた。
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｃｅａｒｃｈ
１４ ： ６１１５−２８）によって上記プローブに
結合させた。この酵素プローブに相補的な２６量体は、
その５′末端をＧｈｏｓｈらの方法（Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｃｅａｒｃｈ １５ ： ５３５３−７２．１９８７）
によって、５量体ポリアデニレート・リンカ−を介して
カルボキシ修飾型ラテックスビーズ（０，９７ｎｌ＝Ｉ
ｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓから入手）に
連結した。このラテックスビーズ懸濁液５０μｌを、様
々な濃度の酵素標識プローブとハイブリダイズさせた。
ハイブリダイゼーション条件は、０．１％の５ＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム）を含む５ Ｘ５ＳＰＥ（４，３
５％ＮａＣｌ ； ０．６９％ＮａｚｌｌｚＰＯ４；
０．１８５％ＥＤＴＡ 。
デシル硫酸ナトリウム）を含む５ Ｘ５ＳＰＥ（４，３
５％ＮａＣｌ ； ０．６９％ＮａｚｌｌｚＰＯ４；
０．１８５％ＥＤＴＡ 。
ｐＨ７、４） ０．５ ｍｌ中にて３７°Ｃで１時間と
した。ラテックスビーズは、１０分間の低速遠心により
ビーズを沈降させ、続いてＯ２１％ＳＤＳを含む２×５
ＳＣ（０，７５％ＮａＯＨ； ０．８８％クエン酸ナト
リウム；ｐｌ＋７．４）で洗浄することによって、２回
洗った。
した。ラテックスビーズは、１０分間の低速遠心により
ビーズを沈降させ、続いてＯ２１％ＳＤＳを含む２×５
ＳＣ（０，７５％ＮａＯＨ； ０．８８％クエン酸ナト
リウム；ｐｌ＋７．４）で洗浄することによって、２回
洗った。
ラテックスビーズは、ハイブリダイゼーションが第一の
カラムで既に行われていなければ、第一のカラムに添加
する。基質のメチルウンベリフェリル−β−ガラクトシ
ダーゼ（ＭＵＧＡＬ）は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７）に０．５μｇ／ｒｔｄｌの濃度で溶解して第一のカ
ラムに添加し、３７°Ｃで２０分間静的にインキュベー
ションした。結合したマーカー酵素のβ−ガラクトシダ
ーゼとＭｔｌＧＡＬとのインキュベーションによって、
生成物としてメチルウンベリフェロン（ＭＵ）が生じた
。
カラムで既に行われていなければ、第一のカラムに添加
する。基質のメチルウンベリフェリル−β−ガラクトシ
ダーゼ（ＭＵＧＡＬ）は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７）に０．５μｇ／ｒｔｄｌの濃度で溶解して第一のカ
ラムに添加し、３７°Ｃで２０分間静的にインキュベー
ションした。結合したマーカー酵素のβ−ガラクトシダ
ーゼとＭｔｌＧＡＬとのインキュベーションによって、
生成物としてメチルウンベリフェロン（ＭＵ）が生じた
。
インキュベーションの後、上記の基質および生成物（Ｍ
ＵＧＡＬおよびＭＵ）は、３０％のメタノール水溶液に
溶解して、流れ系によって第二〇カラムに移動した。流
れ系の流速は０．５ ｍｌ ７分とした。
ＵＧＡＬおよびＭＵ）は、３０％のメタノール水溶液に
溶解して、流れ系によって第二〇カラムに移動した。流
れ系の流速は０．５ ｍｌ ７分とした。
第二〇カラムはＣ１８非極性吸着剤ＰＰＰ−１（Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎ）を含み、それが、理論段数約５０ないし２
００である０、０７４（内径）Ｘｏ、５フインチ（長さ
）カラムに充填された。水を溶媒とした場合、ＭＵ生成
物は、吸着剤ベッドに保持されるが、より極性の強いＭ
ＵＧＡＬは吸着剤に保持されないはずである。第二のカ
ラムからＭＵ生成物の溶出および濃縮は、１００％メタ
ノールを用いて実施した。ＭＵの濃度は、流動蛍光測定
器を用いて検出した（Ｋｒａｔｏｓ＋５ｐｅｃｔｒｏ
ｆｌｏｗ ９８０） ｅ産生したＭＵＩは、固体支持層
上に捕捉された試料中の標識ＤＮＡ量に正比例した。
ｉｌｔｏｎ）を含み、それが、理論段数約５０ないし２
００である０、０７４（内径）Ｘｏ、５フインチ（長さ
）カラムに充填された。水を溶媒とした場合、ＭＵ生成
物は、吸着剤ベッドに保持されるが、より極性の強いＭ
ＵＧＡＬは吸着剤に保持されないはずである。第二のカ
ラムからＭＵ生成物の溶出および濃縮は、１００％メタ
ノールを用いて実施した。ＭＵの濃度は、流動蛍光測定
器を用いて検出した（Ｋｒａｔｏｓ＋５ｐｅｃｔｒｏ
ｆｌｏｗ ９８０） ｅ産生したＭＵＩは、固体支持層
上に捕捉された試料中の標識ＤＮＡ量に正比例した。
裏施炭Ｉ
この実施例では、蛍光測定法を用いて、チロキシン（Ｔ
４）との不均一競争的酵素免疫反応について記載する。
４）との不均一競争的酵素免疫反応について記載する。
Ｔ４に対するモノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、 Ｔｏｍ Ｒｉｖｅｒ＋ Ｎ、Ｊ、）を、
Ｑｕａｓｈらの方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２ ： １６５−７４＋１９８７
）によって、カルボジイミドを用いたカップリングで
カルボキシ型ラテックスビーズに共有結合させた。固体
支持層（ラテックスビーズ）を、第一〇カラムに添加し
た。固体支持層の抗体と反応する、アルカリホスファタ
ーゼ標識Ｔ４抗原の標準量を、０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７）中の未標識抗原を含む試料と混合した。標識お
よび未標識Ｔ４を含む試料は、抗体コート・ラテックス
ビーズを含む第一〇カラムに導入した。標識および未標
識Ｔ４抗原は、抗体結合部位に対して競争した。
ｅａｒｃｈ、 Ｔｏｍ Ｒｉｖｅｒ＋ Ｎ、Ｊ、）を、
Ｑｕａｓｈらの方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２ ： １６５−７４＋１９８７
）によって、カルボジイミドを用いたカップリングで
カルボキシ型ラテックスビーズに共有結合させた。固体
支持層（ラテックスビーズ）を、第一〇カラムに添加し
た。固体支持層の抗体と反応する、アルカリホスファタ
ーゼ標識Ｔ４抗原の標準量を、０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７）中の未標識抗原を含む試料と混合した。標識お
よび未標識Ｔ４を含む試料は、抗体コート・ラテックス
ビーズを含む第一〇カラムに導入した。標識および未標
識Ｔ４抗原は、抗体結合部位に対して競争した。
固体支持層表面に残存する表面抗原の量は、試料中の未
標識抗原の量に逆比例していた。未反応物質を、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いた洗浄によって、第一
〇カラムから除去した。基質である０、５ｉ／ｄのメチ
ルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）は、０．１
Ｍ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ塩化マグネシウムととも
に０．１ Ｍ ）リス緩衝液に溶解し、この溶液を第一
〇カラムに添加して、３７°Ｃにて５〜２０分間インキ
ュベーションした。固体支持層上で酵素と基質のインキ
ュベーションによって、生成物のメチルランへりフエロ
ン（ＭＵ）が生じた。インキュベーションの後、基質と
生成物の溶液を、流体系によって第二のカラムに移動さ
せた。
標識抗原の量に逆比例していた。未反応物質を、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いた洗浄によって、第一
〇カラムから除去した。基質である０、５ｉ／ｄのメチ
ルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）は、０．１
Ｍ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ塩化マグネシウムととも
に０．１ Ｍ ）リス緩衝液に溶解し、この溶液を第一
〇カラムに添加して、３７°Ｃにて５〜２０分間インキ
ュベーションした。固体支持層上で酵素と基質のインキ
ュベーションによって、生成物のメチルランへりフエロ
ン（ＭＵ）が生じた。インキュベーションの後、基質と
生成物の溶液を、流体系によって第二のカラムに移動さ
せた。
第二〇カラムにはＣ１８非極性吸着剤ＰＰＰ−１が含ま
れており、これは０．０７４（内径）ｘｏ、７５インチ
（長さ）のカラムに充填されていた。これによって、理
論段数約５０のカラムが得られた。生成物はＣ１８吸着
剤に保持されたが、基質は疎水性の差のために保持され
なかった。ＭＵは、１００％メタノールの溶出溶媒を用
いて第二〇カラムから除去し、流動螢光分析器（Ｋｒａ
ｔｏｓ、 Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｏｗ ９８０）で測定し
た。
れており、これは０．０７４（内径）ｘｏ、７５インチ
（長さ）のカラムに充填されていた。これによって、理
論段数約５０のカラムが得られた。生成物はＣ１８吸着
剤に保持されたが、基質は疎水性の差のために保持され
なかった。ＭＵは、１００％メタノールの溶出溶媒を用
いて第二〇カラムから除去し、流動螢光分析器（Ｋｒａ
ｔｏｓ、 Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｏｗ ９８０）で測定し
た。
尖詣開↓
試料中における微生物の検出および評価食品、水、廃水
、乳製品、臨床検査および薬物の試料といった様々な型
の試料中に夾雑する微生物は、実質的にこの発明の酵素
的検出法を用いて調べることができる。夾雑微生物には
、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの
特異的微生物、大腸菌型細菌などの微生物群、糞便菌、
独立もしくは従属栄養細菌、酵母、およびカビが挙げら
れる。これらの微生物の検出および評価は、それらが産
生ずる１種類または複数の酵素を測定することによって
行われる。新規な溶媒を使用すれば、（ｉ）カラム中の
吸着床を用いて、酵素反応の生成物を基質ならびに可溶
性試料成分から分離する、および（ｉｉ ）測定溶液か
らの生成物を少ない検出容量に濃縮することによって、
最初の試験結果が得られる。
、乳製品、臨床検査および薬物の試料といった様々な型
の試料中に夾雑する微生物は、実質的にこの発明の酵素
的検出法を用いて調べることができる。夾雑微生物には
、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの
特異的微生物、大腸菌型細菌などの微生物群、糞便菌、
独立もしくは従属栄養細菌、酵母、およびカビが挙げら
れる。これらの微生物の検出および評価は、それらが産
生ずる１種類または複数の酵素を測定することによって
行われる。新規な溶媒を使用すれば、（ｉ）カラム中の
吸着床を用いて、酵素反応の生成物を基質ならびに可溶
性試料成分から分離する、および（ｉｉ ）測定溶液か
らの生成物を少ない検出容量に濃縮することによって、
最初の試験結果が得られる。
大腸菌型細菌は乳糖を利用するためのβ−ガラクトシダ
ーゼを産生ずるが、この酵素に関連した活性の検出法お
よび測定法は、食品などの試料中のこれら細菌の濃度を
迅速に検出および評価するために利用される。これは、
食品試料（２５ｇ）を、蛍光基質の４−メチルウンベリ
フェリル−βＤ−ガラクトシダーゼ（間−ＧＡＬ）を約
５０〜１００羅／ ｍｌの濃度で添加した肉汁培地（２
２５ｍｊり中に加えることによって実施した。肉汁の選
択培地は、大腸菌型細菌の増殖を可能にするが、非大腸
菌型細菌の増殖は阻害または抑制するものであって、そ
の例として、赤紫胆汁肉汁（Ｅｎｄｏ ｂｒｏｔｈ）も
しくは硫酸ラウリル肉汁、またはＣＭ（寒天非添加）（
Ｆｉｒｓｔｅｎｂｅｒｇ−Ｅｄｅｎ、 Ｒ，Ｆｔ Ｋｌ
ｅｉｎ＋ Ｃ，Ｓ、、 Ｊ、ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ
４８ ： １３０７．１９８３）などの非汎用性製品が
挙げられる。蛍光基質のＭＵ−ＧＡＬは、細胞中酵素の
β−ガラクトシダーゼによって分解され、メチルウンベ
リフェロンおよびガラクトシドを生じる。
ーゼを産生ずるが、この酵素に関連した活性の検出法お
よび測定法は、食品などの試料中のこれら細菌の濃度を
迅速に検出および評価するために利用される。これは、
食品試料（２５ｇ）を、蛍光基質の４−メチルウンベリ
フェリル−βＤ−ガラクトシダーゼ（間−ＧＡＬ）を約
５０〜１００羅／ ｍｌの濃度で添加した肉汁培地（２
２５ｍｊり中に加えることによって実施した。肉汁の選
択培地は、大腸菌型細菌の増殖を可能にするが、非大腸
菌型細菌の増殖は阻害または抑制するものであって、そ
の例として、赤紫胆汁肉汁（Ｅｎｄｏ ｂｒｏｔｈ）も
しくは硫酸ラウリル肉汁、またはＣＭ（寒天非添加）（
Ｆｉｒｓｔｅｎｂｅｒｇ−Ｅｄｅｎ、 Ｒ，Ｆｔ Ｋｌ
ｅｉｎ＋ Ｃ，Ｓ、、 Ｊ、ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ
４８ ： １３０７．１９８３）などの非汎用性製品が
挙げられる。蛍光基質のＭＵ−ＧＡＬは、細胞中酵素の
β−ガラクトシダーゼによって分解され、メチルウンベ
リフェロンおよびガラクトシドを生じる。
３５°Ｃで一定時間（１〜６時間が好ましい）のインキ
ュベーションの後、培養液のアリコートを逆相Ｃ１８吸
着剤充填カラムにかけた。このメチルウンベリフェロン
は逆相吸着剤に強く結合するが、試料成分および残存基
質は適当な溶液条件では実質的に結合しなかった。吸着
剤上に残存するメチルウンベリフェロンは、適当な溶出
溶媒で吸着剤から溶出し、蛍光分析器を用いて測定した
。蛍光量は、インキュベーション後の試料中の細菌数に
比例していた。大腸菌型細菌の濃度は、（ｉ）−定イン
キュヘーション時間における細菌の初期濃度に対する相
対蛍光単位、または（ｉｉ）細菌の初期濃度に対する蛍
光の測定時間（ｈｒ）をプロットした標準曲線から評価
した。
ュベーションの後、培養液のアリコートを逆相Ｃ１８吸
着剤充填カラムにかけた。このメチルウンベリフェロン
は逆相吸着剤に強く結合するが、試料成分および残存基
質は適当な溶液条件では実質的に結合しなかった。吸着
剤上に残存するメチルウンベリフェロンは、適当な溶出
溶媒で吸着剤から溶出し、蛍光分析器を用いて測定した
。蛍光量は、インキュベーション後の試料中の細菌数に
比例していた。大腸菌型細菌の濃度は、（ｉ）−定イン
キュヘーション時間における細菌の初期濃度に対する相
対蛍光単位、または（ｉｉ）細菌の初期濃度に対する蛍
光の測定時間（ｈｒ）をプロットした標準曲線から評価
した。
実施例↓
試料中における遊離酵素の検出
試料中の遊離酵素の検出および測定法は、食品および乳
製品の安全性および品質の試験から臨床診断用試験に及
ぶ様々な用途に使用される。食品および乳製品中のｍ離
酵素の測定例には、（ｉ）ミルク、その他の乳製品中の
アルカリホスファターゼ活性の測定による滅菌の完全性
、（ｉｉ ）プロテアーゼ酵素群、トリメチルアミンオ
キシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、またはチトクロ
ームｂ５などのチトクローム系酵素といった酵素の活性
測定による腐敗性（製品の半減期）の決定が含まれてい
る。臣ｎ床診断試験には、心筋の損傷を測るクレアチン
キナーゼ活性の測定法、肝胆嚢ならびに骨疾患における
血清中のアルカリホスファターゼ活性の測定法、および
組織の損傷を決定する脳を髄液ならびに血清中の乳酸脱
水素酵素活性の測定法が挙げられる。
製品の安全性および品質の試験から臨床診断用試験に及
ぶ様々な用途に使用される。食品および乳製品中のｍ離
酵素の測定例には、（ｉ）ミルク、その他の乳製品中の
アルカリホスファターゼ活性の測定による滅菌の完全性
、（ｉｉ ）プロテアーゼ酵素群、トリメチルアミンオ
キシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、またはチトクロ
ームｂ５などのチトクローム系酵素といった酵素の活性
測定による腐敗性（製品の半減期）の決定が含まれてい
る。臣ｎ床診断試験には、心筋の損傷を測るクレアチン
キナーゼ活性の測定法、肝胆嚢ならびに骨疾患における
血清中のアルカリホスファターゼ活性の測定法、および
組織の損傷を決定する脳を髄液ならびに血清中の乳酸脱
水素酵素活性の測定法が挙げられる。
滅菌が適当であれば、アルカリホスファターゼは活性化
されない。従って、ミルクのアルカリホスファターゼを
試験することによって、滅菌効率の測定が可能である。
されない。従って、ミルクのアルカリホスファターゼを
試験することによって、滅菌効率の測定が可能である。
ミルク試料は、蛍光基質の４−メチルウンベリフェリル
ホスフェート（ＭＯＰ）を添加した炭酸マグネシウム緩
衝液に加えた。アルカリホスファターゼがＭＵＰを分解
し、メチルウンベリフェロンおよびリン酸塩を生じた。
ホスフェート（ＭＯＰ）を添加した炭酸マグネシウム緩
衝液に加えた。アルカリホスファターゼがＭＵＰを分解
し、メチルウンベリフェロンおよびリン酸塩を生じた。
この溶液を適当な条件下でインキュベーションし、アリ
コートを、Ｃ１８逆相吸着剤充填の本発明のカラムにか
けた。メチルウンベリフェロンはＣ１８吸着剤上に保持
されたが、試料成分および残存基質は適当な条件下では
保持されなかった。このメチルウンベリフェロンは、適
当な溶媒を用いて吸着剤から溶出し、蛍光を測定した。
コートを、Ｃ１８逆相吸着剤充填の本発明のカラムにか
けた。メチルウンベリフェロンはＣ１８吸着剤上に保持
されたが、試料成分および残存基質は適当な条件下では
保持されなかった。このメチルウンベリフェロンは、適
当な溶媒を用いて吸着剤から溶出し、蛍光を測定した。
その蛍光量は、試料中のアルカリホスファターゼ量に比
例していた。
例していた。
実施貫ｊ
この実施例では、チリパウダー中の微生物の夾雑を検出
するこの発明の装置および方法を説明する。チリパウダ
ー２ｇを、基礎培地２０ｄに添加した。この基礎培地は
、ＫＩＩｚＰＯ４１ｇ 、 ＫＺＩＩＰＯ４３，５ｇ
１（Ｎｌ＋４）２ＳＯ４０，５ｇ 、、ＭｇＣＩｚ ０
．０５ｇ 、カゼイン氷解物１．２５ｇおよび水５００
戚から成り、さらに０．０２％のイソプロピルβ−Ｄ−
チオガラクトピラノシドおよび５ ｎ ／ ｄの４−メ
チルウンベリフェリルβ−ガラクトシド（ＭＵＧＡＬ）
を含むものであった。
するこの発明の装置および方法を説明する。チリパウダ
ー２ｇを、基礎培地２０ｄに添加した。この基礎培地は
、ＫＩＩｚＰＯ４１ｇ 、 ＫＺＩＩＰＯ４３，５ｇ
１（Ｎｌ＋４）２ＳＯ４０，５ｇ 、、ＭｇＣＩｚ ０
．０５ｇ 、カゼイン氷解物１．２５ｇおよび水５００
戚から成り、さらに０．０２％のイソプロピルβ−Ｄ−
チオガラクトピラノシドおよび５ ｎ ／ ｄの４−メ
チルウンベリフェリルβ−ガラクトシド（ＭＵＧＡＬ）
を含むものであった。
細胞濃度がＯ（対照）、７．５Ｘ１０３、および４．６
Ｘ１０’細胞／ ｍｌｌのＥ、 ｃｏｌｉをチリパウダ
ー溶液に接種した。この溶液を３７°Ｃで２時間インキ
ュベーションした。インキュベーション終了時、最も確
率の高い数（ＭＰＮ）の測定を、Ｏｂｌｉｎｇｅｔの記
載した方法（ｒＴｈｅ Ｍｏ５ｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ
Ｎｕｍｂｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、食品中の微生物
分析概説 第６章、５ｐｅｃＪ、ｉｉ集、第２版、９９
−１１１頁、Ａｍｅｒ、 ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ
Ａｓ５ｏｃ、、 Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ、Ｃ，（
１９８４） ）に従って、各溶液に対して実施した。
Ｘ１０’細胞／ ｍｌｌのＥ、 ｃｏｌｉをチリパウダ
ー溶液に接種した。この溶液を３７°Ｃで２時間インキ
ュベーションした。インキュベーション終了時、最も確
率の高い数（ＭＰＮ）の測定を、Ｏｂｌｉｎｇｅｔの記
載した方法（ｒＴｈｅ Ｍｏ５ｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ
Ｎｕｍｂｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、食品中の微生物
分析概説 第６章、５ｐｅｃＪ、ｉｉ集、第２版、９９
−１１１頁、Ａｍｅｒ、 ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ
Ａｓ５ｏｃ、、 Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ、Ｃ，（
１９８４） ）に従って、各溶液に対して実施した。
トルエン３滴および０．１％デオキシコレート３滴を各
溶液に添加した。すべての溶液を、３７°Ｃで１５分間
ＭＭＵてから、それぞれ３７°Ｃで４５分間インキュベ
ーションした。
溶液に添加した。すべての溶液を、３７°Ｃで１５分間
ＭＭＵてから、それぞれ３７°Ｃで４５分間インキュベ
ーションした。
インキュベーションの後、各溶液を０．４５ｇｍの濾紙
に通過させた。各濾液（試料）８０μｌは、流体系の試
料ループに移し、ＰＰＰ−１（非極性Ｃ１８吸着剤）０
．０１２０ｇを充填したカラムにかけた。水を、ポンプ
によって流速０．５ｍｇ／ｍｉｎで３分間カラムに通し
た。この結果、ＭｔｌＧＡＬおよびＭＵが吸着剤に保持
された。チリパウダーの成分は、このカラムに保持され
なかった。
に通過させた。各濾液（試料）８０μｌは、流体系の試
料ループに移し、ＰＰＰ−１（非極性Ｃ１８吸着剤）０
．０１２０ｇを充填したカラムにかけた。水を、ポンプ
によって流速０．５ｍｇ／ｍｉｎで３分間カラムに通し
た。この結果、ＭｔｌＧＡＬおよびＭＵが吸着剤に保持
された。チリパウダーの成分は、このカラムに保持され
なかった。
３分後、６５％（Ｖ／Ｖ）のメタノール／水を、ポンプ
によって流速０．５■／ｍｉｎでカラｌ、に通した。測
定を開始してから、７分後にＭＵＧＡＬが、ｌ００５分
後にＭＵが溶出した。
によって流速０．５■／ｍｉｎでカラｌ、に通した。測
定を開始してから、７分後にＭＵＧＡＬが、ｌ００５分
後にＭＵが溶出した。
第３表に示した測定結果によれば、添加したＥ、ｃｏｌ
ｉに対して、３〜５倍高いＭｔＪ濃度を示している。
ｉに対して、３〜５倍高いＭｔＪ濃度を示している。
男−バし一表
Ｅ、ｃｏｌｉ 蛍光ピークの面積（μｖ／５ｅｃ）お
よび溶出時間（分）
よび溶出時間（分）
第１図は、二つのカラムの種々の配置を示す。
カラムｌ（第一カラム）は、核酸ハイブリダイゼーショ
ン反応または免疫反応が行なわれる際に固体担体材料を
保持するのに使用される。カラム２（第二カラム）は吸
着剤物質を含むのに使用される。二つのカラムは、第１
ａ図に示されるようにカラ広間に配置された切換弁で分
離されてもよく、あるいはこれらのカラムは第１ｂ図で
示されるように単一の単位装置中に存在してもよいがフ
リットまたは膜の如きバリヤーで分離される。多重カラ
ム配置がカラム間にフローコネクターを備えた射出成形
プラスチック単位装置（第１Ｃ図）に形成されてもよい
。流体がカラム及びコネクター中を流れる通路はプラス
チック単位装置から外側に配置された切換弁により決定
される。 第２図は加圧ガスを利用して試薬及び試料を移動させる
、マイクロプロセンサーで制御された装置の系設計を詳
細に示す。計量ポンプが加圧ガスに代えて使用し得る。 第２図は第１ｃ図に示されたプラスチック単位装置の使
用を示し、切換弁がプラスチック単位装置の外側に配置
されてカラム中に流れを導く。 第３図は、酵素検出及び測定用の二個のカラムの配置を
もつ手動のプラスチックの使い捨て装置を示す。この場
合、二つのカラムはフリットにより分離される。カラム
中の流体の二方向の移動は、受は器の中及び外にカラム
を含むプラスチック部分の手動による移動により行なわ
れる。カラムを備えた単位装置の挿入端部に配置された
ゴムの０リングは、受は器と共にシールを形成する。 ご而の１゛ｙ軒内容に変更なし） ＦＩＧ。２ 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ 事件の表示 平成１年特許願第７７９３３号 発明の名称 迅速且つ高感度低圧酵素検出及び測定系補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 バイオコントロール システムズ°。 インコーホレイティド ４、代理人 住所 〒１０５ 東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号 ５、補正命令の日付 平成１年７月４日 く発送臼） ６、補正の対象 （１）Ｍ書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）明細書 （４）図面 ７６ 補正の内容 ＋１１ （２１別紙の通り （３）明細書の浄書（内容に変更なし）（４）図面の浄
書（内容に変更なし） 添附書類の目録 ＋１１ 訂正願書 （２）委任状及び訳文 （３）浄書明細書 （４）浄書図面 １通 各１通 １通 １通
ン反応または免疫反応が行なわれる際に固体担体材料を
保持するのに使用される。カラム２（第二カラム）は吸
着剤物質を含むのに使用される。二つのカラムは、第１
ａ図に示されるようにカラ広間に配置された切換弁で分
離されてもよく、あるいはこれらのカラムは第１ｂ図で
示されるように単一の単位装置中に存在してもよいがフ
リットまたは膜の如きバリヤーで分離される。多重カラ
ム配置がカラム間にフローコネクターを備えた射出成形
プラスチック単位装置（第１Ｃ図）に形成されてもよい
。流体がカラム及びコネクター中を流れる通路はプラス
チック単位装置から外側に配置された切換弁により決定
される。 第２図は加圧ガスを利用して試薬及び試料を移動させる
、マイクロプロセンサーで制御された装置の系設計を詳
細に示す。計量ポンプが加圧ガスに代えて使用し得る。 第２図は第１ｃ図に示されたプラスチック単位装置の使
用を示し、切換弁がプラスチック単位装置の外側に配置
されてカラム中に流れを導く。 第３図は、酵素検出及び測定用の二個のカラムの配置を
もつ手動のプラスチックの使い捨て装置を示す。この場
合、二つのカラムはフリットにより分離される。カラム
中の流体の二方向の移動は、受は器の中及び外にカラム
を含むプラスチック部分の手動による移動により行なわ
れる。カラムを備えた単位装置の挿入端部に配置された
ゴムの０リングは、受は器と共にシールを形成する。 ご而の１゛ｙ軒内容に変更なし） ＦＩＧ。２ 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ 事件の表示 平成１年特許願第７７９３３号 発明の名称 迅速且つ高感度低圧酵素検出及び測定系補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 バイオコントロール システムズ°。 インコーホレイティド ４、代理人 住所 〒１０５ 東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号 ５、補正命令の日付 平成１年７月４日 く発送臼） ６、補正の対象 （１）Ｍ書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）明細書 （４）図面 ７６ 補正の内容 ＋１１ （２１別紙の通り （３）明細書の浄書（内容に変更なし）（４）図面の浄
書（内容に変更なし） 添附書類の目録 ＋１１ 訂正願書 （２）委任状及び訳文 （３）浄書明細書 （４）浄書図面 １通 各１通 １通 １通
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、選択された溶液中の基質を固相に結合した酵素を含
む第一のカラムに添加し； 該基質を酵素的に転化して酵素の存在量に比例する量の
生成物を得るために該第一のカラムをインキュベートし
； 該生成物および未反応基質を、理論段数が５００以下で
あって該選択された溶液の存在下で該生成物に選択的に
結合し得る吸着剤を含む第二のカラムに移し、 該生成物を吸着剤から選択的に溶出し；そして該生成物
の存在および濃度を検出する； 工程を含んで成る、反応系において生じる結合した酵素
の検出を増強する方法。 ２、免疫反応または核酸反応から得られる、固相に結合
したマーカー酵素を含む第一のカラム；理論段数が５０
０以下の吸着剤ベッドを含む、前記第一のカラムに直列
に連結された第二のカラム（該吸着剤は酵素的に生じた
生成物と選択的に結合可能であり、該生成物は該酵素に
特異的な基質の添加によって生じたものである）；およ
び前記第二のカラムに直列に連結されており、該第二の
カラムから溶出した生成物の存在または量を測定し得る
検出装置； を有する反応系において生じる結合した酵素の検出装置
。 ３、前記第二のカラム中の吸着剤が、非極性、極性、カ
チオン性、またはアニオン性の官能基を有する不活性吸
着剤であって、該非極性官能基が、オクタデシル、オク
チル、エチル、シクロヘキシル、フェニル及びこれらの
組み合わせから成る群より選ばれた基であり、該極性官
能基が、シアノプロピル、ジオール、アミノプロピル、
Ｎ−プロピルエチレンジアミン及びこれらの組み合わせ
から成る群より選ばれた基であり、そして該カチオン性
またはアニオン性官能基が、ベンゼンスルホニルプロピ
ル、スルホニルプロピル、カルボキシメチル、ジエチル
アミノプロピル、トリメチルアミノプロピル及びこれら
の組み合わせから成る群より選ばれた基であることを特
徴とする、請求項２記載の装置。 ４、微生物の夾雑が見込まれる試料を、検出可能な酵素
に特異的な基質を含む液体媒体の選択された溶液に添加
し； 前記検出可能な酵素と基質との反応による生成物を産生
させるために該液体媒体の選択された溶液中で該試料お
よび基質をインキュベートし；該液体媒体の選択された
溶液中の該試料、生成物ならびに基質を、理論段数が５
００以下であって、該液体媒体の選択された溶液の存在
下で該生成物と選択的に結合し得る吸着剤を含むカラム
に移し；該吸着剤から該生成物を選択的に溶出し；そし
て 該生成物の存在または濃度を検出する； ことを特徴とする、検出可能な酵素を含む微生物の夾雑
レベルの検出および評価法。 ５、遊離酵素の含有が見込まれる試料を、該遊離酵素に
特異的な基質を含む選択された溶液に添加し； 該選択された溶液中の試料および基質をインキュベート
して生成物を生じさせ； 該選択された溶液に含まれる試料、生成物及び基質を、
理論段数が５００以下であって、該選択された溶液の存
在下で該生成物と選択的に結合し得る吸着剤を含むカラ
ムに移し； 該吸着剤から該生成物を選択的に溶出し；そして 該生成物の存在または濃度を検出する； ことを特徴とする、遊離酵素の検出および測定方法。 ６、酵素を含有する抗原・抗体複合体またはプローブ標
的オリゴヌクレオチド二重鎖を産生させるために溶液中
で免疫反応またはハイブリダイゼーションを行い； 該抗原・抗体複合体またはプローブ標的オリゴヌクレオ
チド二重鎖を含む該溶液を、該抗原・抗体複合体または
プローブ標的オリゴヌクレオチド二重鎖を保持する手段
を有する第一のカラムに移し； 選択された溶液中の基質を該第一のカラムに添加し； 該基質を酵素的に転化して酵素の存在量に比例する量の
生成物を得ために第一のカラムをインキュベートし； 該生成物および未反応基質を、理論段数が５００以下で
あって該選択された溶液の存在下で該生成物と選択的に
結合し得る吸着剤を含む第二のカラムに移し； 該生成物を吸着剤から選択的に溶出し；そして該生成物
の存在および濃度を検出する工程、を含んで成る、反応
系において生じる結合した酵素の検出を増強する方法。 ７、前記抗原・抗体複合体またはプローブ標的オリゴヌ
クレオチド二重鎖を保持する手段が、物理的手段、抗体
成分の非特異的結合、オリゴヌクレオチド成分の非特異
的結合、抗体の特異的結合、およびオリゴヌクレオチド
の特異的ハイブリダイゼーションから成る群より選ばれ
ることを特徴とする、請求項６記載の方法。 ８、抗原・抗体複合体またはプローブ標的オリゴヌクレ
オチド二重鎖を保持する手段を含む第一のカラム； 理論段数が５００以下の吸着剤ベッドを含む、第一のカ
ラム（該吸着剤は酵素的に生じた生成物と選択的に結合
可能であり、該生成物は該酵素に特異的な基質の添加に
よって生じる）に直列に連結された第二のカラム；およ
び 第二のカラムに直列に連結されており、該第二のカラム
から溶出した生成物の存在または量を測定し得る検出装
置； を有する、反応系において生じる結合した酵素の検出装
置。 ９、純粋培養物からの懸濁液のアリコートを、各溶液が
単一の且つ異なる基質を含む複数の溶液に添加し； 微生物酵素に特異的な基質から生成物を該微生物酵素に
よって生じさせることができるように該溶液をインキュ
ベートし； 該基質および生成物を含有する各溶液を、理論段数が５
００以下であって、該溶液の存在下で該生成物と選択的
に結合し得る吸着剤を含むカラムに移し； 該吸着剤から該生成物を選択的に溶出させ；そして 該産物の存在を検出する； ことを特徴とする、微生物酵素を同定することによる純
粋培養物中の微生物の同定方法。 １０、抗菌性物質によって処理した培養単離物を、検出
可能な酵素に特異的な基質を含む選択された溶液に添加
し； 検出可能な酵素と基質との反応による生成物を生じさせ
るために該選択された溶液中の微生物培養単離物および
基質をインキュベートし； 該溶液、基質及び生成物を、理論段数が５００以下であ
って、該選択された溶液の存在下で該生成物と選択的に
結合し得る吸着剤を含むカラムに移し； 該吸着剤から該生成物を選択的に溶出させ；そして 該生成物の存在または濃度を検出する（該生成物の濃度
が微生物の抗菌性物質感受性に逆比例する） ことを特徴とする、検出可能な酵素を含む微生物培養単
離物の抗菌性物質感受性試験法。 １１、前記生成物を、吸光、蛍光、燐光、または電気化
学的手段によって検出することを特徴とする、請求項１
、４、５、９または１０のいずれかに記載の方法。 １２、前記吸着剤が、非極性相互作用、極性相互作用、
イオン交換相互作用、およびそれらの組み合わせから成
る群より選ばれた相互作用的手段を介して生成物へ選択
的に結合することを特徴とする、請求項１、４、５、６
または９のいずれかに記載の方法。 １３、酵素が、プロテイナーゼ、エステラーゼ、リパー
ゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダク
ターゼ、トリメチルアミンオキシダーゼ、キサンチンオ
キシダーゼ、チトクローム系酵素、リアーゼ、およびオ
ルニチンデカルボキシラーゼから成る群より選ばれるこ
とを特徴とする、請求項１、２、４、５、６、８、９ま
たは１０のいずれかに記載の方法または装置。 １４、結合した酵素が連結された固体支持系及び理論段
数５００以下の吸着剤を内包した容器；並びに 溶液が実質的に溶媒ならびに基質から成り、該酵素が該
基質を生成物に転化可能であって、該吸着剤が溶液中の
該生成物と結合可能である、該容器に含まれる溶液、 を含んで成る、測定によって生じた結合した酵素の検出
装置。 １５、選択された溶液中の基質を、固体支持系に結合し
た酵素及び５００以下の理論段数の吸着剤を含む容器に
添加し； 該基質と酵素との反応によって生じる生成物が吸着剤へ
選択的に結合するように該基質、結合した酵素及び吸着
剤をインキュベートし；そして該吸着剤から生成物を溶
出しそして溶出液中の生成物濃度を測定することにより
吸着剤に結合した生成物を検出する； ことを含んで成る、反応系において生ずる結合した酵素
の検出方法。
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