JPH022391A - ヒトｍ―ｃｓｆ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬として有用なヒトのコロニー刺激因子（
Ｃｏ！ｏｎｙ−８ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ
　ＳＣＳ　Ｆ　）、殊に組換え型ヒトＭ−ＣＳＦ及びそ
の製造法に関する。

従来の技術 一般に、造血細胞の増殖、分化には特定の増殖及び分化
因子が必要とされており、最終的に成熟した各種の血球
、例えば赤血球、顆粒球、マクロファージ、好酸球、血
小板、リンパ球等になるまでの間には、数多くの分化、
増殖因子が関与している〔三浦恭定著、血液幹細胞、中
外医学社、１９８３年〕。之等の中で顆粒球系前駆細胞
及びマクロファージ系前駆細胞の増殖、分化を刺激する
ものとしてＣＳＦが知られており、かかるＣＳＦには、
顆粒球の形成に特異性を有するＧ型（Ｇ−ＣＳＦ）、マ
クロファージの形成に特異的なＭ型（Ｍ−ＣＳＦ）及び
顆粒球とマクロファージの両方の形成を促進するＧＭ型
（ＧＭ−ＣＳＦ）が知られている。また更に多能性幹細
胞に作用するＣＳＦとして、マルチＣＳＦ（Ｍｕｌｔｉ
−ＣＳＦ　：ＩＬ−３）も知られている。

上記ＣＳＦは、その生物活性に基づき、癌化学療法及び
放射線療法時の共通した欠点である白血球の減少を軽減
させるものと考えられ、この観点から臨床研究が行なわ
れている。

また、」二足ＣＳＦは白血球の機能を促進させる作用を
何することが知られており〔ロベツツら化ｏｐｅｚ、　
Ａ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．、　１
３１゜２９８３（１９８３）、ハンダムら（Ｉｌａｎｄ
ａｍ、Ｅ、ｃｔａｌ、）　、同１２２．１１３４　（１
９７９）及びバダスら（Ｖａｄａｓ、　Ｍ、Ａ、ｅｔ　
ａｔ、）、同１３０，７９５（１９８３））　、このこ
とから、種々の感染症の予防及び治療薬としての有効性
が確認されている。

更に、ＣＳＦは、その分化誘導作用〔メットカフら（Ｍ
ｃｔｃａｌｆ、　Ｄ、ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃ
ａｎｃｅｄｒ、３０゜７７３　（１９８２）’）に基づ
き、骨髄性白血病の治療剤として釘効性が認められてい
る。

しかして、ＣＳＦは例えば胎児細胞、胛細胞等の培養液
、人尿、種々の株化培養細胞の培養液等にその活性が認
められ、該活性画分として分離、利用されているが、い
ずれの起源のものも該起源に由来する類似した多量の夾
雑物質等の混在及びＣＳＦ自体の濃度の低さが障害とな
り、その製造面で問題を残しており、均質性、収量、操
作等の面から、医薬品としてのＣＳＦを産業的に継続し
て得る手段は、未だ見出されていない。

本発明者らは、先にＣＳＦを常時均質な状態で多量産生
することのできる、ヒト白血病Ｔ細胞由来の培養株化細
胞であるｒＡ　Ｇ　Ｒ−ＯＮＪを確立し、該細胞に係わ
る発明を特許出願した（特開昭５９−１６９４８９号公
報）。また、本発明者らは、」二足ＡＧＲ−ＯＮの産生
ずるＣＳＦにつき、更にその精製を重ねた結果、該ＣＳ
Ｆを純粋な形で簡単にしかも高収率で収得する方法を開
発し、またかくして得られるＣＳＦの構造的特徴及び生
化学的特徴を解明し、かかる物質としてのＣＳＦに係わ
る発明を完成し、特許出願した（特開昭６２−１６９７
９９号）。

上記光の発明に係わるＣＳＦは、Ｍ−ＣＳＦ。

即ち、正常骨髄細胞に作用してマクロファージの分化増
殖を促進させる活性を有する糖蛋白質であって、下記の
理化学的性質を有する点において特徴付けられるもので
、ｒＡＧＲ−ＯＮ−ＣＳＦＪと呼ばれた。

ａ）分子量： 非還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、３３０００〜４３０００ダルトンであり、 非辺元条件且つＳＤＳ存在下でのゲル濾過で、２３００
０〜４００００ダルトンである、ｂ）蛋白質部分のＮ端
アミノ酸配列： 次の一次構造式で表わされる配列を有する。

Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈ
ｌｓ−Ｍｅｔ−ｌ　１ｅ−Ｇｌｙ−８ｃｒ−Ｇｌｙ−１
１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−
Ｍｅｔ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｈｒ発明が解決しようとする課
題 本発明の主な目的は、遺伝子工学的手法を利用して、生
物活性なヒトＭ−ＣＳＦを製造する技術、及び該技術に
より製造され、殊に医薬としてより有用な新規なヒトＭ
−ＣＳＦを提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明によれば、下記式（１）のアミノ酸配列情報に基
づいた、生物活性のヒト開−ＣＳＦ分子をコードする遺
伝子を利用して製造された組換え型ヒトＭ−Ｃ５Ｆが提
供される。

Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｔｒｐ−Ｌｃｕ−
Ｇ　ｌ　ｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｃｕ−Ｌｅｕ
−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｈｌｓ−Ｍｅｔ−ｌ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＧＩｙ
−１ｆｉｓ−Ｌｅｕ−ＧＩ　ｎ−Ｓｅｒ−Ｌｎ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒ　１ｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｍｅｔ−５ｒｕ−Ｔｈｒ−８ｃｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ
−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃ１ｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−１１ｃｍＡｌａ−１１ｅ
−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｌｓ−しｙＳ−Ｌ
ｅＵ−１ｙｒ−Ｐｒｏ−ＬｙＳ−八Ｉａ−１１８−ｔ’
ｒＯ−Ｓｅｒ−′Ｓｅｒ−Ｌｃｕ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ｖａ　ｌ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｃ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａ　ｌ　ａ−Ｖａ　ｌ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒ
ｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ
　ｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉ　
ｎ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｓｃｒ−Ｐｒｏ
−Ｌｃｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−〔式中ＸはＴｙｒ又はＡｓｐを示す。

〕本明細書において、ペプチド及びアミノ酸の表示は、
Ｉ　ＵＰＡＣにより採択されているアミノ酸命名法にお
ける略号乃至当該分野で慣用されているそれに従うもの
とし、ＤＮＡ塩基配列及び核酸の表示も同様とする。

本発明のヒトＭ−ＣＳＦは、前記したごとく、その生物
活性に基づいて、例えば白血球減少を伴う疾病もしくは
病態の予防及び治療薬として、骨髄移植の補助剤として
、各種感染症の予防及び治療薬として、更に抗癌剤等と
して、医薬分野で有用である。

殊に本発明のヒトＭ−ＣＳＦは、遺伝子工学的手法によ
って製造された、組換え型のＭ−ＣＳＦであり、その均
質性より、特に上記分野において有用である。

本発明のヒｌ−Ｍ−ＣＳＦは、これをコードする遺伝子
（以下「本発明遺伝子」と略する）を利用し、該遺伝子
が宿主細胞中で発現されるような組換λＤＮＡを作成し
、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換株
を培養することにより製造される。

以下、本発明ヒトＭ−ＣＳＦの製造に用いられる上記本
発明遺伝子につき詳述する。

本発明遺伝子は、例えばＭ−ＣＳＦ産生能を有するヒト
細胞、より具体的且つ有利には前記ＡＧＲ−ＯＮより分
離されたｍ　ＲＮ　Ａから調製される。以下、この調製
の詳細をＡＧＲ−ＯＮを用いて説明するが、他の細胞で
も同様である。

起源細胞として利用されるＡＧＲ−ＯＮは、特開昭５９
−１６９４８９号公報に記載された特性を有するヒト白
血病Ｔ細胞由来のヒト培養株化細胞であり、これはアメ
リカン・タイプ・カルチャ・コレクション（ＡＴＣＣ）
にｒＡＴＣＣ受託Ｎｏ、ＣＲＬ−８１９９Ｊとして受託
されている。

上記ＡＧＲ−ＯＮからのｍＲＮＡの分離は、基本的には
通常の抽出操作に従い実施される。より詳しくは、上記
ＡＧＲ−ＯＮを、まず例えばＣＥＭ培地、ＣＭＲＬ−１
０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イーグルの最小必須培
地（Ｅａｇｌｅ“ＳＭＥＭ）　、フィッシャーの培地（
Ｆ　１ｓｈｅｒ’ｓＭｅｄｉｕｍ　）　、Ｆ−１０培地
、Ｆ−１２培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地
、ＲＰＭＩ−１６４０培地等又は必要に応じて牛胎児血
清（Ｆ　ＣＳ）等の血清やアルブミン等の血清成分を添
加した上記培地で、約Ｉ　Ｘ　１０’〜Ｉ　Ｘ　１０７
個／鵬の濃度範囲で、通常の培養法例えば炭酸ガス培養
法等に従い、約３０〜４０℃程度、好ましくは約３７°
Ｃ前後で１〜５日間を要して培養する。

次いで培養上清中にＡＧＲ−ＯＮ−ＣＳＦが生産蓄積さ
れる時期に、上記培養細胞を、適当な界面活性剤、例え
ばＳＤＳ、ＮＰ−４０、トリトンＸ１００、デオキシコ
ール酸等を用いて、或いはホモジナイザーを用いる方法
や凍結融解等の物理的方法によって、部分的又は完全に
破壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、ポリトロン（１
）ＯＬＹＴＲＯＮ　。

Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）等の
ミキサーもしくは注射筒を用い、ある程度せん断し、そ
の後、蛋白質と核酸分画とを分別して全ＲＮＡの抽出を
行なう。この抽出操作には、グアニジウム／セシウムク
ロライド法［Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　／　Ｃｅｓｉｕ
ｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅｍｅｔｈｏｄ、　Ｔ、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｐｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、　ｐ　１９４−１９６（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　　１９
８２　）や超遠心を用いるＣ５ＣＱ重層法〔チルブライ
ンら（Ｃｈｉｒｇｗｌｎ、Ｊ、Ｍ、、ｃｔ　ａｌ、）、
バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　　
１８．　５２９４　（１９７９）　）等が一般に用いら
れる。

また上記各方法においては、ＲＮ　ａｓｅによるＲＮＡ
の分解を防ぐために、ＲＮ　ａＳｆ３インヒビタ、例え
ばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネー
ト、バナジウム複合体等を添加使用することもできる。

上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからのｍＲＮＡの分
離、精製は、例えばオリゴｄＴ−セルロース［コラボレ
イティプ　リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｃ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、コ、ポリビーセファロース
［ファルマシア（Ｐ　ｈａｒ［［１ａｃｉａ）社コ等を
用いて吸着カラム法又はバッチ法により実施できる。

また目的のＭ−ＣＳＦに対するｍＲＮＡの精製濃縮及び
同定は、例えば得られたｍ　ＲＮ　Ａを蔗糖密度勾配遠
心等によって分画し、その分画につき、蛋白質の翻訳系
、例えばアフリカッメガエルの卵母細胞への注入やウサ
ギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋
白質に翻訳させ、その蛋白質のＭ−ＣＳＦ活性を調べる
ことにより実施できる。かくして目的とするｍＲＮＡの
存在を確認できる。更に、目的とするｍ　ＲＮ　Ａの確
認は、上記Ｍ−ＣＳＦの活性測定に代えて、Ｍ−ＣＳＦ
に対する抗体を用いる免疫法によっても行なうことがで
きる。

上記により得られる精製ｍＲＮＡは、通常不安定である
ため、これを安定なｃＤＮＡに変換し、目的遺伝子の増
幅を可能とするために微生物由来のレプリコンに接続す
る。インビトロでの、上記ｍ　ＲＮ　ＡのｃＤＮＡへの
変換、即ち本発明の目的遺伝子の合成は、−船釣な方法
、例えばオカヤマーバーグ法（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ　ａ
ｎｄ　Ｐ、Ｂｅｒｇ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃ
ｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、Ｂ、　　
ｐ　２８０（，１９８３））やダブラ−ホフマン法［Ｖ
、Ｇｕｂｌｅｒａｎｄ　Ｂ、Ｊ、ＩＩｏｆｆｍａｎ、　
Ｇｅｎｅ、　ｖｏｌ、２５．　　ｐ　２６３−２６９　
（１９８３’）Ｅ等に従い実施できる。より詳しくは、
まずオリゴｄＴをプライマーとしくこのプライマーはポ
リｄＴを付加したベクタープライマーであってもよい）
　、ｍＲＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰＳｄＣＴＰ又はｄＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素
を用いてｍ　ＲＮ　Ａからこれに相捕的な一本鎖ｃＤＮ
Ａを合成する。次のステップは、上記においてオリゴｄ
Ｔを用いたか、ベクタープライマーを用いたかにより、
それぞれ以下の如く異なる。

前者の場合、鋳型としたｍ　ＲＮ　Ａをアルカリ処理等
により分解して除去し、その後−本鎖ＤＮＡを鋳型とし
て逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼエを用いて二本鎖
ＤＮＡを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端を
エキソヌクレアーゼテ処理し、そのそれぞれに適当なリ
ンカ−ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複
数付加し、これを適当なベクター、例えばＥ　Ｋ系プラ
スミドベクターやλｇｔ系ファージベクター等に組込む
。

また、後者の場合、鋳型としたｍＲＮＡを残存させたま
ま、上記と同様のアニーリング可能な組合せの塩基を複
数付加した開環状プラスミドと、リンカ−ＤＮＡ　ｌば
しば動物細胞で自立複製できる領域とｍＲＮＡの転写プ
ロモーター領域を含むＤＮＡ断片が用いられる）とを、
アニーリングさせて閉環状とした後、ｄＴＮＰ存在下で
、ＲＮａｓｃＨとＤＮＡポリメラーゼ■とを共存させて
、ｍＲＮＡをＤＮＡ鎖に置換し、完全なプラスミドＤＮ
Ａを作成できる。

上記のごとくして得られるＤＮＡは、これをベクターの
宿主、例えばエシェリヒア　コリ（Ｅｓｈｃｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｔ）　、バチルス　ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、サツカロミセス　セレ
ビシアエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）等の適当な宿主内に導入して、これを形
質転換することができる。このＤＮＡの宿主への導入及
びこれによる形質転換の方法としては、一般に用いられ
ている方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集
め、ＣａＣＱ２処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい
状態にして、プラスミドを取り込ませる方法等を採用で
きる。上記方法においては、通常知られているように形
質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣＱ２やＲｂ
ＣＱを更に共存させることもできる。また、宿主細胞を
スフェロプラスト又はプロトプラスト化してから形質転
換させる方法も採用することができる。

上記により得られる形質転換株から、目的のＭ−ＣＳ　
ＦのｃＤＮＡを有する株を選出するには、例えば以下に
示す各秤方法を採用できる。

（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリ
ーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成しくこの場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（３２Ｐ又は３５Ｓでラベルする
）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションし、得ら
れたポジティブ株を検索して、これを選出する。

（２）動物細胞でＭ−ＣＳＦを産生させてスクリニング
する方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトシ（この場合、自己複製可
能でｍ　ＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミド
もしくは動物細胞染色体にインチグレートするようなプ
ラスミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋
白質を産生させ、その培養上清もしくは細胞抽出物のＭ
−ＣＳＦ活性を測定するか、又はＭ−ＣＳＦに対する抗
体を用いてＭ−ＣＳＦを検出することにより、元の形質
転換株より目的のＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを有
する株を選出する。

（３）Ｍ−ＣＳＦに対する抗体を用いて選出する方法 予め、ｃＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベ
クターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、Ｍ
−ＣＳＦに対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用
いて、〜１−ＣＳＦ産生株を検出し、目的株を得る。

（４）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トラン
スレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロース
フィルター等にプロットし、ＭＣＳＦ産生細胞からのｍ
　ＲＮ　Ａをハイブリダイゼーションさせた後、ｃＤＮ
Ａに対応するｍＲＮＡを回収する。回収されたｍＲＮＡ
を蛋白翻訳系、例えばアフリカッメガエルの卵母細胞へ
の注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の
無細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のＭ−ＣＳＦ
活性を調べるか、又はＭ−ＣＳＦに対する抗体を用いて
検出して、目的の株を得る。

得られた目的の形質転換株よりＭ−ＣＳＦをコードする
ＤＮＡを採取する方法は、公知の方法に従い実施できる
。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分
離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切り出す
ことにより行ない得る。

かくして得られるＤＮＡは、本発明遺伝子の一具体例で
あり、第３図に示される３７２のアミノ酸配列又は第５
図に示される５５４のアミノ酸配列、で特定されるヒト
Ｍ−ＣＳＦ前駆体をコードしている。

しかして、本発明遺伝子を利用して遺伝子工学的手法に
より得られる物質が、ヒトＭ−ＣＳＦの生物活性を発現
するためには、該遺伝子は必ずしも上記ＤＮＡ、即ちヒ
トＭ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列のすべてをコードす
るＤＮＡ配列を有するものである必要はなく、例えばそ
の部分配列であって、それがヒトＭ−ＣＳＦの生物活性
発現を可能とする限り、それらのＤＮＡもまた本発明遺
伝子に包含される。

ヒ）Ｍ−ＣＳＦの生物活性発現に、必ずしも前記式（１
）に示す全アミノ酸配列を必要としない事実は、例えば
上記前駆体の一方が、その３７２番目のアミノ酸（Ｐ　
ｒｏ）をＣ末端アミノ酸としていること、又は前記ＡＧ
Ｒ−ＯＮ−ＣＳＦが、その３５番目のアミノ酸（Ｖａｌ
）を、Ｎ末端アミノ酸としていること、ＡＧＲ−ＯＮ−
ＣＳＦ製造の際に副産物（マイナー成分）として、同３
３番目のアミノ酸（Ｇｌｕ）又は同３７番目のアミノ酸
（Ｇｌｕ）をそれぞれＮ末端アミノ酸とする生物活性の
Ｍ−ＣＳＦが得られること等からも明白である。更に他
のヘモポエチン間の一次構造上の類似性の知見から、同
２７番目のアミノ酸（Ａｌａ）をＮ末端アミノ酸とする
Ｍ−ＣＳＦも天然に存在すると考えられる［Ｊ、Ｗ、５
ｃｈｒａｄｃｒ、ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．、Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ｖｏｌ
、８３　、　ｐ、　２４５８−２４６２　（１９８６）
）。

また、後述する実施例に示す通り、前記式（１）に示す
アミノ酸配列における１６４番目のアミノ酸（Ｔ　ｒｐ
）以降のＣ末端側のアミノ酸配列は、ヒ）Ｍ−ＣＳＦの
生物活性発現には必ずしも必要でないことも確認されて
いる。

従って、本発明遺伝子は、式（１）に示されるアミノ酸
配列情報に基づいた、生物活性のヒ）Ｍ−ＣＳＦ分子を
コードする新規なりＮＡ配列を有することにより特徴づ
けられる。これには、より具体的には、式（１）に示す
全アミノ酸配列をコドするＤＮＡのほか、そのＮ末端側
アミノ酸配列の一部、例えばアミノ酸番号１〜２６．１
〜３２．１〜３４及び１〜３６の配列のいずれか、及び
／又はそのＣ末端側アミノ酸配列の一部、例えばアミノ
酸番号１６４以降の配列の全て又は−部、を欠失する各
々のアミノ酸配列をコードする各ＤＮＡ及び之等と実質
的に均等なりＮＡが包含される。

かかる本発明遺伝子は、上記情報に基づいて、例えばホ
スファイト　トリエステル法ＣＮａｔｕｒｅ。

３１０．１０５　（１９８４））等の常法に従い、核酸
の化学合成により製造することもでき、また第３図に示
される３７２の、又は第５図に示される５５４の、アミ
ノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡを原
料として、通常の方法に従い製造することもでき、特に
後者の方法は簡便であり好適である。

この３７２の又は５５４のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードするＤＮＡを原料とする方法において、
一部ＤＮＡの化学合成やＤＮＡ鎖の切断、削除、付加乃
至は結合を目的とする酵素処理やＤＮＡの単離、精製乃
至復製、選別等の各種操作乃至手段は、いずれも常法に
従うことができ、本発明遺伝子以外の遺伝子もしくはＤ
ＮＡ鎖について当該分野でよく知られている各種方法を
いずれも採用することができる。例えば上記ＤＮＡの単
離精製は、アガロースケル電気泳動法等に従うことがで
き、核酸配列のコドンの一部の改変は、サイト−スペシ
フィック　ミュータジエネンス（Ｓｉｔｅ−８ｐｅｃｉ
ｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｃｎｃｓｉｓ）　　［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８１．　５６６２−
５６６６（１９８４）３等に従うことができる。尚、」
二足において所望のアミノ酸に対応する遺伝暗号の選択
は、特に限定されるものではなく、利用する宿主細胞の
コドン使用頻度等を考慮して常法に従い決定できる。

また、上記方法に従い得られる本発明遺伝子のＤＮＡ配
列の決定及び確認は、例えばマキサムギルバート（Ｍａ
ｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）の化学修飾法（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、、　６５．４９９−５６０　（１９８０）
　〕やＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド
鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ
、Ｊ、、Ｇｃｎｃ、　１９゜２６９〜２７６　（１９８
２）　〕等により行なうことができる。

かくして得られる本発明遺伝子の利用によれば、遺伝子
組換え技術により、ヒトＭ−ＣＳＦを容易に且つ大量に
製造、収得することができる。

このヒトＭ−ＣＳＦの製造方法は、上記特定の本発明遺
伝子（ＤＮＡ）を利用することを必須として、基本的に
は遺伝子組換え技術に従うことができる〔５ｃｉｅｎｃ
ｅ、２２４．１４３１　（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　　Ｂ４ｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、ｙ　１
３０．　６９２（１９８５）　　；　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ。

８０．５９９０　（１９８３）、ＥＰ特許公開第１８７
９９１号公報、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ａｔ　　ａ！、、Ｃｏ１ｄ　
　Ｓｐｒｉｎｇ　　１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　　（１９８２）等参照〕。

より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる
ような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換株を培捉すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用いることができる。該真核生物の細胞には、を
椎動物、酵母等の細胞が含まれ、を准動物細胞としては
、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｙ、ＧＩｕｚｍ
ａｎ、　Ｃｅ１ｌ、２３．　１７５１８２　（１９８１
））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉
酸レダクターゼ欠損株［Ｇ、Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ
、Ａ、Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　７７、　４２１６−４
２２０（１９８０）：１等がよく用いられているが、之
等に限定される訳ではない。を椎動物細胞の発現ベクタ
ーとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置
するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデ
ニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用で
き、これは更に必要により複製起点を保有していてもよ
い。該発現ベクタの例としては、ＳＶ４０の初期プロモ
ーターを保有するｐ　Ｓ　Ｖ　２　ｄｈｆｒ　（Ｓ、Ｓ
ａｂｒａｍａｎｉ　、Ｒ，Ｍｕｌ　Ｉｉｇａｎａｎｄ　
Ｐ、Ｂｃｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　１
　、　８５４８６４　（１９８１））等を例示できるが
、之等に限定されない。

また、真核微生物としては酵母が一般によく用いられて
おり、その中でもサツカロミセス属酵母を釘利に利用す
ることができる。該酵母等の真核微生物の発現ベクター
としては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプ
ロモーターを有するｐ　ＡＭ８２　　（Ａ、Ｍｉｙａｎ
ｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８０．　１−５　
　（１９８３））等を好ましく利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌か一般によく
用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製可
能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本発
明遺伝子が発現できるように該遺伝子の１−流にプロモ
ーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルチーノ）塩基
配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡ
ＴＧ）を付与した発現プラスミドを使用することができ
る。」―記宿主菌としての大腸菌としては、エンエリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）　Ｋ
　１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐ
ＢＲ３２２がよく用いられるが、之等に限定されず、公
知の各種の菌株及びベクターをいずれも利用できる。

プロモーターとしては、例えばトリプトファン（ｔｒｐ
）・プロモーター、Ｉｐｐプロモーター、Ｉａｃプロモ
ーター、ＰＬプロモーター等を使用でき、いずれの場合
も本発明遺伝子を発現させることができる。

本発明遺伝子を利用してヒトＭ−ＣＳＦを製造するため
の一つの好ましい方法としては、宿主細胞としてＣＯＳ
細胞を用いる方法を例示できる。

この方法においては、発現ベクターとして、ＳＶ４０複
製起点を保有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能で
あり、更に転写プロモーター、転写終結シグナル及びＲ
ＮＡスプライス部位等を備えたもの、例えば後記実施例
に示すプラスミドｐｃＤＥを用いることができる。この
場合、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター下流に位置する
制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に、本発明遺伝子を連結するこ
とにより、目的とする発現プラスミドを得ることができ
る。かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞へ
の導入及びこれによる形質転換の方法としては、一般に
用いられている各種方法が採用でき、例えば−ト記プラ
スミドｐｃＤＥに目的遺伝子が挿入された発現プラスミ
ドは、ＤＥＡＥ−デキストラン法やリン酸カルシウム−
ＤＮＡ共沈澱法等によりＣＯＳ細胞に取込ませることが
でき、かくして所望の形質転換細胞を容易に得ることが
できる。

本発明遺伝子を利用してヒ）Ｍ−ＣＳＦを製造するため
の他の好ましい方法としては、宿主細胞としてチャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ
欠損細胞［ＣＨＯ−Ｄｕｋｄｈｆｒ］を用いる方法を例
示できる。

また本発明遺伝子を利用してヒ）Ｍ−ＣＳＦを製造する
ための他の好ましい方法としては、宿主細胞として大腸
菌等の原核生物を用い、シグナルペプチドの利用により
目的のＭ−ＣＳＦを細胞質膜外に分泌発現させる方法を
例示できる。ここで用いられるシグナルペプチドは公知
の各種のもの、例えばＬｐｐ　、　ＯｍｐＡ、　Ｏｎ＋
ｐＰ、円】ｏＥ等の外膜蛋白質やＰｈｏＡ、　Ｂｌａ　
、　ＰｓｔＳ等のペリプラズム蛋白質のいずれでもよ（
、特にＯｍｐＡが好ましい。

更に本発明遺伝子を利用してヒ）Ｍ−ＣＳＦを製造する
ための他の好ましい方法としては、宿主細胞として大腸
菌等の原核生物を用い、２・シストロン法によりＭ−Ｃ
ＳＦを発現させる方法を例示できる。この方法は連続す
る二つのシストロンよりなる遺伝子発現システムであり
、これによれば目的とするＭ−ＣＳＦを宿主細胞内に安
定してｎつ多量に生産蓄積させることができる。

該方法に従う本発明Ｍ−ＣＳＦの製造につき詳述すれば
、まずファーストシストロン（ｆｉｒｓｔｃｉｓｔｒｏ
ｎ　）としての適当なポリペプチドをコードする遺伝子
と、セカンドシストロン（ｓｅｃｏｎｄｃｉｓｔｒｏｎ
　）としての本発明遺伝子との二つのシストロンを含む
発現プラスミドを作成する。該プラスミドはまた、ファ
ーストシストロンの上流に該遺伝子の発現のためのプロ
モーター及びｓＤ配列が配置されていると共に、その下
流であって且つセカンドシストロンの上流に、セカンド
シストロンの発現のためのＳＤ配列とファーストシスト
ロンの’ｔ％止コドンとセカンドシストロンの開始コド
ンとを、この順序で含む合成リンカ−が配置されている
ことが重要である。

上記におけるファーストシストロンとしての遺伝子とし
ては、宿主によりこれが発現され得るものである限り、
合成遺伝子でも天然物由来のものでもよいが、その発現
により本発明Ｍ−ＣＳＦとは異なるポリペプチドが同一
系内に生産され、弓続き該ポリペプチドの分離が必要と
なることを考慮すれば、該ポリペプチドは疎水性であり
、また本発明のＭ−ＣＳＦとは充分に離れた分子量を何
するものであるのがよい。上記ファーストシストロンは
かかるポリペプチドをコードするものであるのが望まし
い。その具体例としては、例えばｒ　Ｌ−２、ＩＦＮ−
α、−β、−γ等をコードする遺伝子及びそれらの断片
であって、約５０〜１００のアミノ酸残基をコードする
ものであるのが好ましい。

上記ファーストシストロンの上流に配置させるプロモー
ター及びＳＤ配列としては、それぞれ従来公知の各種の
ものを使用でき、プロモーターとしては例えばｔｒｐプ
ロモーター、ｔａｃプロモータ、Ｐ　プロモーター、Ｐ
Ｒプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＯｍｐＡプロモ
ーター、Ｉａｃプロモーター等、特に好ましくはｔｒｐ
プロモーター　Ｐｔ。

プロモーター　ＰＲプロモーター等を例示できる。

またＳＤ配列としては原核細胞の１６８ｒＲＮＡの３′
末端と水素結合を形成できる３〜９塩基対の配列、例え
ばＧにＡＧ、　ＡＧＧＡ等を例示できる。

また上記ファーストシストロンとセカンドシストロンと
の間に介在させる合成リンカ−における開始コドン及び
終止コドンは、天然界に存在するすべてのものでよい。

之等はそれぞれ完全な形、例えばＴＧＡ及びＡＴＧ等と
して利用される必要はなく、両者の一部オーバーラップ
した形、例えばＴＧＡＴＧ　５ＴＡＡＴＧ等として利用
することもできる。

」二足２・シストロン法に利用される発現プラスミドの
構築は通常の方法に従い実施できる［Ｙ。

５ａｉｔｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
　１０１．　１２８１−１２８８　（１９８７）　　；
　Ｂ、Ｓ、５ｃｈｏｎｅｒ　Ｏｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８
３　、８５０６−８５１０　（１９８６）等参照〕。

特に好ましい一つの方法によれば、まず本発明のＭ−Ｃ
ＳＦ遺伝子を含むプラスミドを適当な制限酵素で切断し
て、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を含む断片を常法に従い単離精製
する一方、上記した合成リンカ−を常法に従い、例えば
ＤＮＡシンセサイザ等を用いて合成し、該リンカ−を上
記で得られた断片のＭ−ＣＳＦ遺伝子の上流側にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ等を用いて連結させ、次いで得られるＤＮ
Ａ断片を、ファーストシストロンを含みこれを発現可能
なプラスミドの所定位置に組込む方法を例示できる。ま
た上記方法により得られるセカンドシストロンと合成リ
ンカ−とを連結されたＤＮＡ断片のに流に、予めファー
ストシストロンを連結させた後、このＤＮＡ断片を適当
な蛋白質発現系を有するプラスミドに組込む方法によっ
ても所望の２・シストロン法に好適な発現プラスミドを
得ることができる。

上記で得られるプラスミドを適当な宿主細胞に導入して
これを形質転換させることにより、２・シストロン法に
よる所望の形質転換体を収得でき、該形質転換体の利用
によれば、ファーストシストロンに係わる蛋白質とセカ
ンドシストロンに係わる所望のＭ−ＣＳＦとをそれぞれ
別個に発現させ得、之等は通常の方法、例えばＳＤＳ−
ＰＡＧＥやウェスタンブロッティング法等により解析、
確認でき、また後記する各種の方法によりそれぞれ分離
、精製できる。

かくして得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養
でき、該培養により生物活性のヒトＭ−ＣＳＦが生産、
蓄積される。該培養に用いられる培地としては、採用し
た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択で
きる。例えば宿主細胞として大腸菌等を利用した形質転
換体の培養には、例えばＬＢ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地、
Ｍ６３培地等を使用でき、２等培地には更に必要に応じ
て通常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビ
タミン類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加するこ
ともできる。またＣＯＳ細胞等を宿主とする形質転換体
は、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベツコの修正イーグ
ル最小必須培地（Ｄｕｌｂｃｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉ
ｅｄ　Ｅａｇｌｏ’ｓ　ＨＥＭ　）等の培地に必要に応
じ牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ’）等の血清成分を添加したも
のを使用して培養できる。

」二記形質転換体の培養条件としては、宿主細胞の生育
に適した条件を採用でき、大腸菌の場合は例えばｐＨ約
５〜８、好ましくは７又はその付近、温度約２０〜４３
°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ又はその付近を採用できる。

」１記により、形質転換体の細胞内又は細胞外に目的と
する本発明Ｍ−ＣＳＦが生産、蓄積乃至分泌される。該
Ｍ−ＣＳＦはその物理的性質、化学的性質等を利用した
各種の分離操作（「生化学ブタ−ブックＩＩＪ、１１７
５〜１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日
、株式会社東京化学同人発行；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、　ｖｏｌ、２５．　Ｎｏ。

２５．８２７４−８２７７　（１９８６）；Ｅｕｒ、Ｊ
、１３ｉｏｃｈｅｍ、、１６３，３１３−３２１　（１
９８７）等参照）により、分離、精製できる。該方法と
しては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱
剤による処理、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破
砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）等の各種液体クロマト
グラフィー透析法、之等の組合せ等を例示できる。

特に好ましい分離方法においては、まず培養」二清より
予め目的とする物質を部分精製する。この部分精製は、
例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の塩析剤を
用いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を
用いる限外濾過処理等により行なわれる。之等の各処理
の操作及び条件は、通常のこの種方法のそれらと同様の
ものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、吸着クロマトグラフ
ィー、アフイニティクロマトグラフィーケル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等
に付すことにより、又は之等各操作の組合せにより、目
的物質の活性が認められる両分を収得し、かくして目的
物質を均質な物質として単離することができる。

上記吸着クロマトグラフィーは、例えばフェニル−セフ
ァロース、オクチル−セファロース等を担体として実施
できる。

アフィニティクロマトグラフィーは、場合により例えば
ＣｏｎＡ−セファロース、レンチルレクチン−セファロ
ース（ファルマシア社製）等の担体を利用したクロマト
グラフィーにより実施することもできる。

ゲル濾過は、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材として用いて実施でき
る。上記ケル濾過剤の具体例としては、セファデックス
Ｇタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社製）、セルロファイン（チッソ社
製）、バイオケルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオラド社
製）、ウルトロゲルＡｃＡ　（ＬＫＢ社製）、ＴＳＫ−
Ｇタイプ（トーソー社製）等の市販品を例示できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、例えばジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）等を交換基とする陰イオン交換体
を利用したクロマトグラフィーにより実施できる。

逆相クロマトグラフィーは、例えばＣ，、Ｃ３，０４等
のアルキル基、シアノプロピル基、フェニル基等の官能
基がシリカゲル等の基体に結合された担体を用いて実施
できる。より具体的には例えばＣ４ハイボア一逆相ＨＰ
ＬＣカラム（ＲＰ３０４、バイオラド社製）を用いて、
移動相としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（Ｔ　
Ｆ　Ａ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる
。

上記により、容易に高収率、高純度で所望のＭＣＳＦを
工業的規模で製造できる。

かくして得られる本発明Ｍ−ＣＳＦは、その製造のため
に利用される遺伝子や該遺伝子の発現のための発現系の
種類等に応じて、そのＮ−末端アミノ酸配列や分子量、
等電点等を若干穴にするが、いずれもＣＳＦ活性を有す
る点において共通している。之等Ｍ−ＣＳＦの内で特に
好ましいものは、後記各実施例で得られるものである。

上記で得られるＭ−ＣＳＦは、これを医薬として用いる
に当り、その有効量を、薬理的に許容される通常の無毒
性担体と共に含有する薬理組成物の形態に調製され該形
態に応じた各種投与経路で投与される。その製剤形態と
しては、液状形態例えば溶液、懸濁液、乳濁液等が通常
採用され、之等は一般に経口、静脈内、皮下、皮内、筋
肉内投与されるが、特に之等の形態及び投与経路に限定
されず、上記Ｍ−ＣＳＦは、他の通常採用される経口、
非経口投与等に適した各種の製剤形態に調製することも
でき、また使用前に適当な担体の添加により液状となし
得る乾燥品とすることもできる。各種形態の製剤の投与
量は、所望の薬理効果、疾病の種類、患者の年齢、性別
、疾患の程度等に応じて適宜決定され、特に限定はない
が、通常有効成分とするＭ−ＣＳＦを蛋白量として約０
．００１〜１　ｍｇ／　ｋｇ／口となる量で１０に１回
乃至数回に分けて投与すればよい。

実　　施　　例 以下、本発明遺伝子の製造及びその利用によるＭ−ＣＳ
Ｆの製造、その特徴等を、実施例として挙げて、更に詳
述する。

尚、６例で得られる試料のＣＳＦ活性は以下の方法によ
り測定されるものとする。

＜　ＣＳＦの活性測定法〉 牛胎児血清（Ｆｅ２）２０脱、α−培地３０脱及び２箔
製度α−培地２０ｍＱを混和して得られる溶液を３７℃
にて保温し、その２３．３ｍＱを予め５０°Ｃに保温し
た１％寒天（デイフコ社製）溶液１０ｍＱと混合して３
７℃に保温する。

一方Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ系マウマウス大腿骨採取した告
髄細胞（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、α−培
地にて細胞濃度が１０７個／鵬となるように調製し、そ
の１鵬を上記３７°Ｃに保温゛しである寒天培地に加え
、よく混和した後、３７°Ｃに保温し、次いでその０．
　５ｍＱを、予め５０μＱの供試試料を入れたウェル（
ティッシュカルチャークラスター１２、コスタ−社製）
に加えて手早く混和して室温に放置する。各ウェルの寒
天が固化するのを待って炭酸ガスインキュベーターに移
し、更に３７℃で７日間培養する。

かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を用いて計測し
、ＣＳＦ活性の指標とする。またＣＳＦ活性の単位（Ｕ
／ｒｒｖＱ）は、」１記コロニー数より、次式（ａ）に
従って算出した値を用いた。

ＣＳＦ活性単位（Ｕ／＋１１１２）　＝（コロニー数）
×（希釈倍率）÷１．　５　　（ａ）尚、上記で生じる
コロニーは、形態学的及び酵素化学的観察の結果、殆ん
どすべてがマクロファジコロニーであった。

実施例　１ 本発明遺伝子の製造 ■　ＡＧＲ−ＯＮ細胞の培養 ヒトＴ＋（ＩＩ胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮ（ＡＴＣＣ
受託Ｎｏ、ＣＲＬ−８１９９）を、１０％新生子牛血清
（ＮＣ３）　、２０ｍＭ　　Ｎ−２−ヒドロキンエチル
ピペラジン−Ｎ′　−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）　、１００μｇ　／ｌｌ１ｆ２ストレプトマイシン
、１００単位／Ｉｌ′Ｉ１２ペニシリンＧ１５０μｇ／
＋ｕＱゲンタマイシン、５Ｘ１０−５Ｍ　２メルカプト
エタノール及び１ｍＭグルタミンを禽むＲＰＭＩ−１６
４０培地［フローラボラトリー社製］にて、約１０５細
胞／閾の細胞濃度に調製した。そのＩＱを、２００或容
ティッシュ−カルチャーフラスコ［コーニング社製３５
本にて、３７°Ｃで７２時間培養した。

■　ｍ　ＲＮ　Ａの抽出 上記■で得たＡＧＲ−ＯＮ細胞約５Ｘ１０８細胞を、４
Ｍ−グアニジンチオシアネート溶液［４Ｍ−グアニジウ
ムイソチオシアネート、５０ｍＭトリス・ＨＣＱ　（ｐ
Ｈ７，６）　、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％ザルコンル（Ｓ
ａｒｋｏｓｙｌ）、１４０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル］　５０鯨に溶解後、６０℃に加温しながら、１８Ｇ
注射針をつけた５０醍注射筒を用いてＤＮＡをせん断し
た。

この溶液に６０°Ｃに加温した等量のフェノール、１／
２容量の１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）−１
０ｍＭトリス・Ｈ（１！　　（ｐＨ７，４）１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ溶液及び等量のクロロホルムイソアミルアルコ
ール（２４：　１）混合液を加え、６０°Ｃの水浴中で
１０分間振盪した後、４°Ｃにて３０００　ｒｐｍで１
５分間遠心分離した。水層を取り、フェノール−クロロ
ホルム抽出を２回、更にクロロホルム抽出を２回行なっ
た後、２容の冷エタノールを加えて、−２０°Ｃで６０
分間保持した。４℃にて３０００ｐｐｍで２０分間遠心
し、沈澱したＲＮＡペレットを、１００ｍＭ）’Ｊス・
ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）−５０ｍＭ　　ＮａＣＲ１０ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ−０，２％ＳＤＳ７８液５０鴫に溶解後
、プロテイナーゼＫ　［ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、メル
ク社製］を２００μｇ　／　ｍＡの濃度で加え、３７°
Ｃにて６０分間反応させた。６０℃にて、フェノルーク
ロロホルム抽出を２回、更にクロロホルム抽出を２回行
なった後、１／１０容の３Ｍ酢酸すトリウム（ｐＨ５，
２）及び２容の冷エタノルを加えて、−７０°Ｃにて６
０分間放置した。４°Ｃにて３０００ｒｐｍで２０分間
遠心し、沈澱したＲＮＡペレットを冷７０％エタノール
で洗浄後、ＴＥ溶液［１０ｍＭ！−リス・ＨＣ（２（ｐ
Ｈ７，５）及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ］に溶解させた。

かくしてＡＧＲ−ＯＮ細胞５Ｘ１０８細胞から全ＲＮＡ
的５ｍｇを得た。

次いで、上記で得られた全ＲＮＡからｍ　ＲＮ　Ａを取
得するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース［コラボレ
イティプリサーチ社製］を用いて、カラムクロマトグラ
フィーを行なった。ｍＲＮＡの吸着は、１０ｍＭトリス
−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，５）１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０，
５Ｍ　　ＮａＣＱ溶液を用いて行ない、カラムを同溶液
及び１０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）−１ｍＭ
　　ＥＤＴＡＯ，ＬＭ　　ＮａＣＱ溶液にて洗浄後、１
０ｍＭ１−リス・ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）　−１ｍＭ　
　ＥＤＴＡを用いてＲＮＡを溶出させた。

上記により、ｍＲＮＡ約１１０μｇを得た。

■　ｃＤＮ、Ａライブラリーの作製 上記■で得たｍＲＮＡ５．ｃｚｇから、ｃＤＮＡを、ｃ
ＤＮＡ合成システム［アマジャム社製］を利用して合成
した。

得られたｃＤＮＡ約０．６μｇを、減圧乾燥した後、５
０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）−１０ｍＭ　　
Ｅ、ＤＴＡ−５０ｍＭ　　ＤＴＴ−４０μＭＳ−アデノ
シルーし−メチオニン溶液２０μＱに溶解し、ＥｃｏＲ
Ｉメチラーゼ［ニューイングランドバイオラブ社製］　
１６単位を加え、３７°Ｃにて１５分間反応させた。

この反応液を７０℃で１０分間加熱し、反応を停止させ
た後、フェノール−クロロホルム抽出を行ない、抽出液
に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ　Ｈ５，２）及
び２．５容のエタノールを加え、−７０°Ｃにて１５分
間放置した。４°Ｃにて１５０００ｒｌ）ｆｆｌで１５
分間遠心し、沈澱させたＤＮＡペレットを、５０ｍＭト
リス−ＨＣＱ（ｐＨ７、５）　　　１０　ｍ　Ｍ　　Ｍ
　ｇ　ＣＱ　２　　１０ｍＭ　　ＤＴＴ−１ｍＭ　ＡＴ
Ｐ−１００μｇ／ＩＴＩＱＥｃｏＲＩリンカ−［宝酒造
社製、５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’　］溶液１０μ
Ｑに溶解後、これに７４ＤＮＡリガーゼ［宝酒造社製］
３５０単位を加え、１４°Ｃにて１６時間反応させた。

得られた反応液を７０°Ｃで１０分間加熱して反応を停
止させた後、１００ｍＭ　　ＮａＣＮａＣ９−５Ｏリス
・ＨＣＱ　　（ｐＨ７，５）−７ｍＭＭ　ｇ　ＣＱ　２
　１０　ｍ　Ｍ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ溶液１６μＲと、制限酵
素ＥｃｏＲＩ［宝酒造社製１４０単位とを加え、３７℃
にて３時間消化させた。

反応液に０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）０．８
μΩを加え、反応を停止させた後、バイオゲルＡ３０ｍ
　［バイオ−ラド社製コカラムクロマトグラフィーにて
、余剰のＥｃｏＲＩリンカ−を除去した。ｃＤＮＡ画分
に、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、アルカリフォスファ
ターゼにて、５′　−リン酸基を除去したλｇｔｌｌＤ
ＮＡ［プロトクロンＧ　Ｔ　（ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ　
Ｇ　Ｔ）　、プロメガバイオチク社製］１μｇ、１／１
０容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ　Ｈ５，２）及び２．
５容積のエタノールを加え、−７０°Ｃにて３０分間放
置した。４℃にて１５０００　ｒｐｍで１５分間遠心し
、沈澱させたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄
後、減圧乾燥し、水７μＱに溶解させた。

次に、５００ｍＭトリス・Ｈ（１！　　（ｐＨ７，５）
１００　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＱ　２溶液２ｕＱを加え
、４２°Ｃにて１５分間保温した後、室温に戻し、１０
０ｍＭ　　ＤＴＴ１μＱ、１０ｍＭ　　ＡＴＰ１μＱ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加え、１４°Ｃで１
６時間保温した。

次に、この反応液１０μＱにλフアージパッケージング
エクストラクト［Ｐａｃｋａｇｅｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ　
。

プロメガバイオチク社製］を加え、２２℃にて２時間保
温することにより、インビトロでリコンビナントファー
ジＤＮＡのパッケージングを行なった。この溶液にファ
ージ希釈緩衝液［１００ｍＭＮａＣＱ−１０ｍＭトリス
−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，９）１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２０］　０．５ｍＱ及びクロロホルム２５μＱを加え
４°Ｃで保存した。

■　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニンク゛■−１１
合成プローブの作製 ＡＧＲ，−ＯＮ培養上清から抽出単離されたＡＧＲ−Ｏ
ＮφＣＳＦのアミノ酸配列（Ｎ末端より２７残基）の情
報に基づいて、合成プローブとして、下記塩基配列を用
いた。

Ｖａｌ　　−Ｓｅｒ　　−Ｇｌｕ　　−Ｔｙｒ　　−Ｃ
ｙｓ５’　　ＧＴＧ　　ＴＣＧ　　ＧＡＧ　　ＴＡＣＴ
ＧＴ３’　　ＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡＴＧ　　ＡＣＡＳｃ
ｒ−Ｈｉｓ ＡＧＣＣＡＣ３’ ＴＣＧ　　　ＧＴＧ　　　５’ 上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列（最
下段に示す）を、Ｍ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを有
するリコンビナントファージの選出のためのプローブと
して利用するため、以下の方法により合成した。

即ち、Ｎ、Ｎ−ジアルキルメチルホスホロアミダイド誘
導体を、縮合ユニットとして用いた固相ホスファイトト
リエステル法〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　　３１
０．　１０５　（１９８４）　〕にて、自動合成機［３
８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザーアプライドバイオシス
テムズ社製］を用いて、目的とする完全保護ＤＮＡを合
成した。続いて該完全保護ＤＮＡを２８％アンモニア水
で５５℃で１０時間処理することにより５′末端のＯＨ
基に結合している保護基としてのＤＭＴｒ（ジメトキシ
トリチル）基以外の保護基（Ａ、ＧＳＣのアミノ基のア
シル基をさす）を脱保護させ、部分保護ＤＮＡ（ＤＭＴ
ｒ体とよぶ）を得た。次いでこのＤＭＴｒ体をＯＤＳ　
＜山村化学研究所社製）を担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により精製後、８０％酢
酸を用いて室温で２０分間処理して、粗オリゴヌクレオ
チドを得た。これをＯＤＳを担体とする逆相ＨＰＬＣに
より更に精製して、目的とするオリゴヌクレオチドを得
た。

上記で得たＤＮＡ０．８μｇを、反応液［５０ｍＭトリ
ス−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇ　ＣＱ　
２．１０ｍＭ　　２−メルカプトエタノル、　２００μ
Ｃｉ（γ　　　　Ｐ）　　−ＡＴＰ　コ　１００μＱ中
で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ［宝酒造コ１８単位
と、３７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端を３
２Ｐで標識した。標識されたＤＮＡと未反応の〔γ　　
Ｐ）ＡＴＰを分別するために、バイオゲルＰ−３０［バ
イオ−ラド社製コによるゲル清適を行なった。標識ＤＮ
Ａ画分をプールし一２０°Ｃで保存した。

得られたプローブの比放射活性は、１１０８ｃｐ／μｇ
ＤＮＡ以上であった。

■−２，プラークハイブリダイゼーションエシェリヒア
・コリＹ１０９０株を、５０Ｍｇ／戒アンピシリン及び
０．２％マルトースを含むＬＢ培地［バクトドリプトン
１０ｇ／Ｑ、バクトイ−スト抽出物５ｇ／Ｒ及びＮａＣ
Ｒ５ｇ／Ｑ］４０鵬に植菌し、３００脱フラスコにて３
７°Ｃで一夜振盪培養した。４°Ｃにて３０００　ｒｐ
ｍで１５分間遠心して菌体を回収し、菌体のペレットを
２０脱のＳ　Ｍ培地［１００ｍＭ　　ＮａＣＱ−５０ｍ
〜１トリス・ＨＣＲ（ｐＨ７，５）　−１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２０−０，０１％ゼラチンコに懸濁させ、４
℃で保存した。

次に、上記菌液０．３鯨に、前記■で得られたリコンビ
ナントファージ粒子液を８Ｍ培地にて３．５Ｘ１０５ｐ
ｆｕ　　（プラークフォーミングユニット）　／　１Ｔ
ＩＩ２に希釈したちの０．　１ｒｒＩＱを加え、３７℃
にて１５分間保温した。続いて、予め４７°Ｃに保温し
ておいたＬＢ軟寒天培地［バクトドリブトン１０　ｇ／
Ｑ、イースト抽出物５ｇ／Ｑ、ＮａＣＱ５ｇ／Ｑ及びア
ガロース７　ｇ　／　Ｑコア、５戒を加えて混和した後
、直径１５ｃｍのシャシに作ったＬＢ寒天プレート［バ
クトドリプトン１０ｇ／Ｑ、バクトイ−スト抽出物５ｇ
／ＬＮａＣＱ５ｇ／Ｒ及びバクト寒天１５ｇ／２］に重
層し、４２°Ｃにて一夜培養した。尚、同様の操作を合
計２０枚のシャーレで実施した。

プラークの出現した寒天プレート上に、直径１Ｂ２＋ｎ
ｍのナイロンフィルター［ＢＮＲＧ１３２、ポール社製
コを載せることによって、レプリカフィルターを作製し
た。寒天プレートはこれをマスタープレートとして４℃
に保存した。

フィルターを、０　、　５　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＯＨ−１、
５ＭＮａＣＱ、０．５Ｍ）リス−ＨＣΩ　（ｐ　Ｈ７，
５）１．５Ｍ　　ＮａＣＱ及び０．３Ｍ　　ＮａＣＱＯ
，０２Ｍ　　ＮａＨ２ＰＯａ　　（ｐＨ７，４）−０，
００２Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，４）にて順次処理し
、風乾後、真空下に８０℃で１時間ベーキングを行なっ
た。

ベーキング済みのフィルターを、０．７５ＭＮａＣΩ−
０，０７５Ｍクエン酸ナトリウム−１，０ｍｇ／脱フィ
コールー１．０ｍｇ／脱ポリビニルピロリドン−１，０
ｍｇ／ＩＩＩＱＢＳＡ−１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６，５）−０，２％ＳＤＳ−０，１ｍｇ／ｍＱサーモ
ンスパーム（Ｓ　ａｌｍｏｎＳｐｅｒｍ）　ＤＮＡ溶液
５０脱中で軽く振盪しながら、４２°Ｃにて６時間保温
した。次に、フィルターを１１０６ｃｐ／脱の濃度にプ
ローブを加えた同液に移し、４２°Ｃにて２０時間軽く
振盪しながら、ハイブリダイゼーションを行なった。

ハイブリダイゼーションの終わったフィルターを取り出
し、０．９Ｍ　　ＮａＣＱ−０，０９Ｍクエン酸ナトリ
ウムにて室温で３回洗浄し、その後、５６°Ｃで同溶液
にて５分間洗浄した。

フィルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線フィルム［Ｘ
Ｒ５、コダック社製］に、−７０°Ｃにて２０間オート
ラジオグラフィーを行なった。

フィルムを現像後、シグナル領域に符合するプラークを
マスタープレートよりかき取り、上記の方法を繰返して
ポジティブシグナルを有するプラークの純化を行ない、
最終的に、代表的なポジティブクローンλｃＭ５及びλ
ｃ　Ｍ　１１を単離した。

■　クローンの構造解析 λｃＭ５のｃＤＮＡの制限酵素地図を作製した。

その結果を第１図に示す。

第１図より、ｃＤＮＡは全長的２．５キロベース（ｋｂ
）であり、その中にはＢｓｔＥＩＩ［ニューイングラン
ドバイオラブ社］、ＮｃｏＩ［宝酒造社］、ＳｍａＩ［
宝酒造社コ、ＫｐｎＩ［宝酒造社］、ＥｃｏＲＩ［宝酒
造社］及びＮｄｅＩ　［ニューイングランドバイオラブ
社］により切断される個所がそれぞれ１個所、また５ｃ
ａＩ［宝酒造社コ、５ｔｕＩ［宝酒造社］及びＢａｍＨ
Ｉ［宝酒造社］により切断される個所がそれぞれ２個所
ずつ存在することが確認された。

次に、上記ｃＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバート
の化学修飾法及びＭ１３ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法にて決定した。

その結果を第２図（第２図−１〜第２図−４）に示す。

第２図より、合成プローブと相捕的な領域が、５′末端
より２２７番目〜２４７番目に存在（図に下線を付して
示す）した。

また、λｃ　Ｍ　５のｃＤＮＡ中の最長のリーディング
フレーム（ｒｅａｄｆｎｇ　ｆｒａｍｅ　）を検索した
ところ、これは５′末端より１２５番口から１２４０２
４０番口にあり、そのコドンのフレームによる２２７番
目〜３０７番目の塩基配列に対応するアミノ酸配列は、
ＡＧＲ−ＯＮφＣＳＦのＮ末端２７アミノ酸と完全に同
一であった。このことは、λｃ　Ｍ　５のｃＤＮＡがＭ
−ＣＳＦ前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡであること
を示している。

以上の結果より、決定されたλｃＭ５のコードするＭ−
ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白−次構造を第３図（第３図−
１〜第３図−２）に示す。

また」１記と同様にして決定されたλｃＭｌｌｃＤＮＡ
の塩基配列を第４図（第４図−１〜第４図−４）に、そ
のコードするＭ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白−次描造を
第５図（第５図−１〜第５図−３）にそれぞれ示す。

実施例２ 組換えＭ−ＣＳ　Ｆ　（ｒ　−ＭＣＳ　Ｆ）の製造■　
ＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥの作製この例に利用し
たＣ０８−１細胞とは、増殖開始点ＣＯｒｉ）欠損の５
Ｖ４０ＤＮＡで、サルの腎細胞ＣＶ１をトランスフオー
ムさせることによって、ＳＶ４０初期遺伝子を発現し、
Ｔ抗原陽性となった細胞である〔セル（Ｃｅｌｌ）、　
　２３．　１７５−１８２　（１９８１）参照〕。

まず、プラスミドｐｃＤＶ１　　［オカヤマら（１１゜
Ｏｋａｙａｍａ、Ｐ、Ｂｅｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、、　３．　２８０−２８９　（１９８３））
を、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、次いで３′末端の突出
部分をＴ４ＤＮＡポリメラーセ［ＢＲＬ社］で削り平滑
末端とした。

一方、ＥｃｏＲＩリンカ−（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−
３’）［宝酒造社コの５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによりリン酸化し、これを先の平滑末端とし
たＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡノガーゼを用いて連結した
。連結物を制限酵素ＥｅｏＲＩで切断し、更に制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、得られた反応物をアガロース
ゲル電気泳動に付して、２５９０ベースペアー（ｂｐ）
のＥｃｏＲＩＨｉｎｄｍＤＮＡ断片を単離精製した。

また他方、プラスミドｐＬ１　（オカヤマら（ＩＩ　。

Ｏｋａｙａｍａ、Ｐ、Ｂｃｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃｃｌｌ、
Ｂｉｏｌ、、　３．　２８０−２８９　（１９８３））
を、制限酵素ＰｓｔＩ　［宝酒造社コで切断後、３′末
端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端とし、こ
のＤＮＡ断片に、上記と同様にしてＥｃｏＲＩリンカ−
を連結させ、得られるＤＮＡ断片を制限酵素Ｈ１ｎｄＩ
ＩＩにて切断し、反応物をアガロースケル電気泳動に付
して、５８０ｂｐのＥｃｏＲＴ−Ｈｉｎｄ　ｌｌｌＤＮ
Ａ断片を単離精製した。

得られたＤＮＡ断片と先に調製したＥｃｏＲＩＨｉｎｄ
ＩＩＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結させて、所望のプラスミドｐｃＤＥを得た。

以りの概略を第６図に示す。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣＤＭ−ＣＳＦの作製 λｃ　Ｍ　５　Ｄ　Ｎ　Ａを、制限酵素ＥｃｏＲＩで部
分消化させ、得られる反応物をアガロースゲル電気泳動
に付し、ｃＤＮＡ部分（約２．　５ｋｂ）をＥｃｏＲ■
部分消化断片として単離精製した。

上記■で得られたＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥを制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、これを上記で調製したｃＤ
ＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させて、所
望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦを得た。

かくして得られたプラスミドを、エシェリヒア・コリＨ
Ｂ　１０１株にトランスフオームさせて、目的のトラン
スフォーマントを、アルカリ溶菌法〔マニアティス（Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、　ｐ　９０　、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｖｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　（
１９８２）　）によって、得られるプラスミドＤＮＡの
制限酵素分析により選択した。

以上の概略を第７図に示す。

■　ｒ　−ＭＣＳ　Ｆの製造 上記■で得たｐｃＤＭ−ＣＳＦを、ＤＥＡＥデキストラ
ン法ＣＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、
ＵＳＡ、。

Ｖｏｌ、８１．ｐ１０７０　（１９８４）］　にてｃＯ
８−１細胞にトランスフェクトし、該細胞におけるｒ−
ＭＣ５Ｆの生産を以下の通り試験した。

即ち、まずＣ０８−１細胞を、１０％牛脂児血清（Ｆｅ
２）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、約２．５Ｘ１０
５細胞／−の細胞濃度に調製し、これをティッシュカル
チャークラスター６［コースタ−社製］に、１ウェル当
り２ｍ１２となる量で入れて、３７℃で一夜、炭酸ガス
インキュベータにて培養した。

次いで培地を除去し、ＲＰＭＩ−１６４０にて細胞を２
回洗浄後、上記■で調製したｐｃＤＭ・ＣＳＦＩＯμｇ
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍ１２［５０ｍＭ）リ
ス・ＨＣＱ（ｐＨ７，４）及び４００μｇ　／　ｍＱ　
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ・デキストラン（ファルマシア社製）を
含む］を加え、炭酸ガスインキュベーター内に４時間放
置した。更に培地を除去した後、ＲＰＭＩ−１６４０に
て細胞を２回洗浄し、これに１５０μＭクロロキン［シ
グマ社製コを含むＲＰＭＩ−１６４０培地３ｒｌｌ１２
を加え、３時間培養した。次に培地を除去し、細胞をＲ
ＰＭ１１６４０にて洗浄後、１０％ＦＣ８を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地にて、３７°Ｃで７２時間、炭酸ガス
インキュベーター内で培養した。

かくして得られた細胞培養物より培養上清及びその抽出
物を回収して、之等につき、それぞれの希釈倍率でのＣ
ＳＦ活性を測定した。

得られた結果を下記第１表に示す。

尚、第１表には、コントロールとしてｐｃＤＭ・ＣＳＦ
に代えて、ｐｃＤＥを用いて」１記と同−Ｌ′φ作を行
なった結果を併記する。また各活性測定試験は、同一試
料につき各２回行なった。

第１表 尚、第１表における数値は、プレート当りのコロニー数
（平均値）を示す。以降のＣＳＦ活性を示す表において
も特記しない限り同様とする。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣＤＭ−ＣＳＦ−１８
５の作製 上記■で得たプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦを利用して、
サイト−スペシフィック　ミュータジエネシス（Ｓｉｔ
ｅ−８ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｃｎｃｓｉｓ）　　
［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８１．　５６６２−
５６６６（１９８４））の方法に従って、第３図におけ
るアミノ酸番号１８６のアミノ酸（Ｌ　ｙｓ）をコード
するコドン（ＡＡＧ）を、終止コドン（ＴＡＧ）に置換
して、第３図におけるアミノ酸番号１８５のアミノ酸（
Ｔ　ｈｒ）をＣ末端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ発
現プラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ−１８５を得た。

その詳細は次の通りである。

即ち、まずプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦよりＥｅｏＲＩ
−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片（大きさ１．　８ｋｂ）を切り
出し、これをＭ１３ｍａｌｌファージ（ＲＦ）のＥｃｏ
ＲＩとＥｃｏＲＩの制限酵素サイトにクローニングし、
これから−本鎖（ｓｓ）　ＤＮＡ（Ｍ１３−ＣＳＦ）を
得、これをミュータジェネシスの鋳型とした。

一方、合成オリゴヌクレオチド［５’　−ＧＴＧＧＴＧ
ＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＴＴ−３’　　（プライマー）
コを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでノン酸化した後
、上記５ｓＤＮＡ　（Ｍ１３−ＣＳＦ）とハイブリダイ
ズしてアニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下に、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）及びＴ４ＤＮＡリガー
ゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキュベートした
。

得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント細胞にトラン
スフオームし、生じたコロニーの内５０コロニーを寒天
プレート上に植菌し３７℃で１８時間培養した。生育し
たコロニーを含むフィルターを通常の方法によりアルカ
リ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキング処理した
。このフィルターをプレハイブリダイズした後、このも
の−と上記ブライマーの５′末端を”２Ｐ−ｒ−ＡＴＰ
でラベルした３２Ｐ−ブローベとを、室温でハイブリダ
イズさせた。ハイブリダイズさせたフィルターを、６　
ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（ｓａｌｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔ
ｒａｔｅ）で、室温で１０分間、次いで５６°Ｃで４分
間各々洗浄し、乾燥させた後、−７０℃で１８時間オー
トラジオグラフィーを行なった。

変異したクローンの内から、Ｍ１３−ＣＳＦ−１８５を
選び、これをＪＭ１０５に感染させて培養して、ｓｓＤ
　Ｎ　Ａ及びＲＦ　　ＤＮＡを調製した。

上記で得られた５ｓＤＮＡのＭ１３ジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法により、目的とする遺伝子の変異を確認し
た。

また上記ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ　　ＤＮＡよりＥ
ｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ断片を調製し、これを上記■と
同様にして発現プラスミドに組込んで、所望のプラスミ
ドｐｃＤＭ−ｃｓＦ−１８５を得た。

このプラスミドを用いて、上記■と同様にして、ＣＯ３
−１細胞でｒ−ＭＣＳＦを発現させた。

その結果を第２表に示す。

第２表 第３表 ■　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ発現プラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１
７７の作製 ブライマーとして５’　−ＧＣＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＡ
ＧＣＣＡＡ−３’を用いて、上記■と同様にして、第３
図におけるアミノ酸番号１７８のアミノ酸（Ｃｙｓ）を
コードするコドン（ＴＧＣ）を終止コドン（ＴＧＡ）に
置換して、第３図におけるアミノ酸番号１７７のアミノ
酸（Ｇｌｕ）をＣ末端アミノ酸とする所望のＭ−ＣＳＦ
発現プラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ−１７７を得た。

このプラスミドを用いて、上記■と同様にして、Ｃ０８
−１細胞でｒ−ＭＣＳＦを発現させた結果を同様にして
第３表に示す。

上記第２表及び第３表に示す結果より、本発明遺伝子を
保有するプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ−１８５及び同ｐ
ｃＤＭ−ＣＳＦ−１７７の利用によれば、それぞれＭ−
ＣＳＦの生物活性を示す所望のｒ−ＭＣＳＦを発現でき
ることが判る。

このことから、少なくとも式（１）に示すアミノ酸配列
におけるアミノ酸番号１７８以降のＣ端側のアミノ酸配
列は、目的とする生物活性を有するＭ−Ｃ５Ｆ分子の発
現には、実質的に影響を及ぼさないことが明らかである
。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦｌｌの
作製 一ト記■において、λｃ　Ｍ　５　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの代
わりにλｃＭ１１　ｃＤＮＡを用いて、プラスミドｐｃ
ＤＭ−ＣＳＦ１１を得た。該プラスミドを用いて、上記
■に従ってｒ　−ＭＣＳ　Ｆを製造し、略同様の結果を
得た。

即ち、λｃＭ１１ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩで部分
消化させ、得られる反応物をアガロースゲル電気泳動に
付し、ｃＤＮＡ部分（約２．　５ｋｂ）をＥｃｏＲＩ部
分消化断片として単離精製した。

前記■で得られたＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥを制
限酵素ＥｅｏＲｒで切断し、これを」１記て調製したｃ
ＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させて、
所望のプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦＩＩを得た。

か（して得られたプラスミドを、エシェリヒア・コリＨ
８１０１株にトランスフオームさせて、目的のトランス
フォーマントを、アルカリ溶菌法によって、得られるブ
ラスミｌ”ＤＮＡの制限酵素分析により選択した。

また、上記λｃＭ１１ＤＮＡのｃ　ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ
部分消化断片）を、クローニングベクターｐＵｃ１９Ｄ
ＮＡ　（宝酒造）のＥｃｏＲＩクロニング部位に挿入し
て、プラスミド ｐＵＣＭＣＳＦ・１１を得た。該プラスミドをエシェリ
ヒア・コリＨ８１０１株にトランスフオームさせた形質
転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＨＢ１
０１／ｐＵＣＭＣＳＦ・１１なる名称で、１９８７年７
月１６０に工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第１４０９号（ＦＥＲＭＢＰ−１４０９）として寄託
されている。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦｌｌ−
１８５の作製 プラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１を制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＢｓｔＥＩＩで消化し、約６７０ｂｐのＥｃｏＲＩ
　−ＢｓｔＥ　ＩＩ　Ｄ　ＮＡ断片を単離精製した。

このＤＮＡ断片のＢｓｔＥＩＩ切断側に、５′末端をＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼにてリン酸化した合成りＮ
Ａクリンカ； 第４表 ５−ＧＴＧＡＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧ−３３−
ＧＡＣＴＡＴＴＣＣＴＡＧＧＣＴＴＡＡ−５を連結して
得られたＤＮＡ断片と、前記したプラスミドｐｃＤＥの
ＥｃｏＲＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し
て、所望のプラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦ１１−１８５を
得だ。該プラスミドは、上記合成リンカ一部位に翻訳終
止コドンＴＧＡＴＡＡをもち、従ってプラスミドｐｃＤ
Ｍ・ＣＳＦ１１がコードする第５図に示されるポリペプ
チドにおいて、その１８５番目のアミノ酸（Ｔ　ｈｒ）
をＣ末端アミノ酸とするＭ−ＣＳＦをコート′する。

以−Ｌの概略を第８図に示す。

該プラスミドを用いて、」１記■と同様にして発現させ
た結果を第４表に示す。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣＤＭ−ＣＳＦ１１−
１７７の作製 上記■で得たプラスミドｐＣＤＭ−ＣＳＦ１１−１８５
を用い、上記■に従って第５図におけるアミノ酸番号１
７８のアミノ酸（Ｃｙｓ）をコードするコドン（ＴＧＣ
）を終止コドン（ＴＧＡ）に置換して、第５図における
１７７番目のアミノ酸（Ｇｌｕ）をＣ末端アミノ酸とす
る所望のＭＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭφＣＳＦＩＩ
−１７７を得た。該プラスミドを用いて上記■と同様に
して発現させた結果を第５表に示す。

第５表 ■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦｌｌ−
１６３の作製 上記■で得たプラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦ１１１８５を
用い、プライマーとして５’　−ＡＡＧＧＡＣＴＧＡＡ
ＡＴＡＴＴＴＴＣ−３’　を用イテ、前記■と同様にし
て、第５図におけるアミノ酸番号１６４のアミノ酸（Ｔ
　ｒｐ）をコードするコドン（ＴＧＧ）を終止コドン（
ＴＧＡ）に置換して、第５図におけるアミノ酸番号１６
３のアミノ酸（Ａ　ｓｐ）をＣ末端アミノ酸とする所望
のＭ−ＣＳＦ発現フラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦｌｌ−１
６３を得た。

このプラスミドを用いて、前記■と同様にして、ＣＯ３
−１細胞でｒ　−ＭＣＳ　Ｆを発現させた結果、その上
清のＣＳＦ活性は、１２コロニー／プレートであった。

かかる結果より、少なくとも式（１）に示すアミノ酸配
列におけるアミノ酸番号１６４以降のＣ端側のアミノ酸
配列は、目的とする生物活性を釘するＭ−ＣＳＦ分子の
発現には実質的に影響を及ぼさないことが明らかである
。

［株］　Ｍ−ＣＳＦ分泌発現プラスミドｐ　Ｉ　Ｎ−ｍ
（ｌｐｐｐ−５）−０ｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１５
１の作製 プラスミドｐｃＤＭ拳ＣＳＦ１１−１８５ＤＮＡを、Ｅ
ｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化してＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ　　ＤＮＡ断片（約６８０　ｂｐ）を単離精製し、
これを分泌型発現ベクターｐｌＮ−ＩＩＩ−ＯｍｐＡ３
　（ＥＭＢＯＪ、、３．２４３７〜２４４２　（１９８
４）　〕のＥｃｏＲＩ　ＳＢａｍＨ１クローニングサイ
トに挿入して、プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ−ＯｍｐＡ３
−ＭＣＳＦ１１−１８５を得た。

該プラスミドＤＮＡをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し
てＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片（約７７０ｂｐ
）を単離精製し、これを−本鎖ＤＮＡ調製用のクローニ
ングベクターｐＵｃ１１８ＤＮＡ　［宝酒造］のＸｂａ
Ｉ　ＳＢａｍＨＩクローニングサイトに挿入シテ、プラ
スミドｐＵｃ１１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦＩＩ−１８
５を得た。

該プラスミドを用いて、前記のサイト　スペシフィック
　ミュークジエネシスの方法に従い、ＯｍｐＡシグナル
ペプチドのＣ末端アミノ酸（Ａｌａ）をコードするコド
ン（ＧＣＣ）に、第５図に示すポリペプチドの３５番目
のアミノ酸（Ｖ　ａりをコードするコドン（ＧＴＧ）が
連結して位置するように改変して、プラスミドｐＵＣ１
１８−ＯｍｐＡ−ＭＣＳ　Ｆ　１１−ＮＶ　１５１を得
た。

即ち、プラスミドｐＵｃ１１８−○ｍ　ｐ　Ａ　３−Ｍ
ＣＳＦＩＩ−１８５ＤＮＡにてトランスフオームした大
腸菌ＪＭ１０５に、ヘルパーファージに０７［宝酒造コ
を感染させ、３７°Ｃで１４時間振盪培養し、−本鎖（
ｓｓ）ｐＵｃ１１８−ＯｍｐＡ３−ＭＣＳＦＩＩ−１８
５ＤＮＡを得、これをミュータジエネシスの鋳型として
用い、またプライマーとして５’　−ＴＡＣＣＧＴＡＧ
ＣＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡＧ
Ｃ３′を用いて、上記■と同様にして所望のブラスミ　
　ド　ｐＵｃ１１８−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦＩＩ　　−Ｎ
Ｖ１５１を得た。

該プラスミドＤＮＡをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し
てＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片（約５４０ｂｐ
）を単離精製し、これを発現ベクターｐＩＮ−ｍ　（ｌ
ｐｐ　ｐ−５）　−Ａ　３　（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、、１３゜３１０１−３１１０　（１９８５））
のＸｂａＩ　−ＢａｍＨＩサイトに挿入して、第５図に
おける３５番口のアミノ酸（Ｖａｌ）から１８５８５番
口ミノ酸（Ｔ　ｈｒ）までからなるポリペプチド発現用
の、所望の分泌型発現プラスミドを得た。これをｐｉＮ
−ｍ　（Ｉｐｐ　ｐ−５）　−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ　１
１ＮＶ１５１という。

以上の概略を第９図−１，２及び３に示す。

また、上記分泌型発現プラスミドにコードされるアミノ
酸配列を第１０図に示す。第１０図中、下線を付した配
列はＯｍｐＡシグナルペプチドを、↓はプロセッシング
部位をそれぞれ示す。

■　Ｍ−ＣＳＦの分泌発現 上記［相］テ得たｐＩＮ−ＩＩＩ（ｌｐＩ）ｐ５）　−
ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦＩＩ−ＮＶ１５１を、大腸菌ＨＢ１
０１及びＪＭ１０９にトランスフオームして分泌生産を
行ない、ペリプラズム画分としてＣＳＦ活性を示す上清
を回収した。

即ち、上記のＭ−ＣＳＦ分泌型発現ベクターを保有する
菌株を２２容フラスコにて、５０μｇ／脱アンピシリン
を含有するＬＢ培地５００１ＴＩＩ２にて３７℃で１４
時間振盪培養した後、遠心（５０００ｒｐｍ　、５分間
、室温）して菌体をペレットとした。

この菌体ペレットを、５０ｒｎＭ）リス・Ｈ（１（ｐＨ
８，０）−２５％シュークロース溶液５０脱に再浮遊さ
せ、更に２５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を１．
２５ｍＱ加えた後、ゆっくりと振盪しながら室温に３０
分間装いた。同様に遠心して得られた菌体ペレットを、
氷冷した蒸留水２５或に再浮遊させ、ゆっくりと振盪し
ながら、３０分間水冷し、４°Ｃにて、１０１００００
ｒｐ分間遠心して、ペリプラズム画分として上清を回収
した。

＠Ｍ−ＣＳＦ分泌型発現プラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ（ｌ
ｐｐ　ｐ−５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１ＮＶ１４３の
作製 上記［相］において、ｐＣＤＭ−ＣＳＦ１１１８５の代
りにｐｃＤＭ−ＣＳＦＩＩ−１７７を用いることにより
、第５図における３５番口のアミノ酸（Ｖａｌ）から同
１７７番目のアミノ酸（Ｇｌｕ）までからなるポリペプ
チド発現用の所望のＭ−ＣＳＦ分泌型発現プラスミド、
ｐＩＮ−ＩＩＩ（ｌｐｐ　ｐ−５）　−０ｍｐ’Ａ−Ｍ
ＣＳＦ　１１−ＮＶ１４３を得た。

該プラスミドにコードされるアミノ酸配列を第１１図に
示す。第１１図中、下線を付した配列はＯｍｐＡシグナ
ルペプチドを、↓はプロセッシング部位をそれぞれ示す
。該プラスミドを上記■と同様にして大腸菌にトランス
フオームさせて、該大腸菌よりペリプラズム画分として
ＣＳＦ活性を示す上清を得た。

ＣＭ−ＣＳＦのＨＰＬＣ 上記■、■、■及び■で得た各上清を、下記条件のＨＰ
ＬＣに付した。

カラム：　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（６０ｃｍＸ７
．５ｍｍ直径、トーソー社製） 溶離液：０．００５％ポリエチレングリコール及び０．
１５Ｍ　　Ｎａ（１！含有 ＢＳ− 流速＝０．８醇／分 フラクション容積：０．８脱／チユ一ブ／分分子量マー
カー（グルタミン酸膜水素酵素＝２９万、乳酸脱水素酵
素：１４．２万、エノラゼ：６．７万、アデニル酸キナ
ーゼ：３．２万、チトクロムＣ：１．２４万）を基準と
して、各サンプルにつき、以下の結果を得た。

０サンプル：前記■で得た培養上清の４脱をセントリコ
ン−１０（アミコン社製）に て約１５０μＱに濃縮したもの。

分子量３２〜７０万（平均４８万）に相当する範囲の溶
出画分にＣＳＦ活性を認めた。

○サンプル：前記■で得た培養上清４脱を上記と同様に
処理したもの。

分子量６，６万から８，６万（平均７，６万）に相当す
る範囲の溶出画分にＣＳＦ活性を認めた。

０サンプル二前記■で得た培養上清４或を上記と同様に
処理したもの。

分子量５，２万から８．６万（平均６，７万）に相当す
る範囲の溶出画分にＣＳＦ活性を認めた。

０サンプル：前記■で得たペリプラズム画分の上清２閾
を上記と同様にして約１１０ μＱに濃縮したもの。

分子量３〜４万（平均３．５万）に相当する位置にＣＳ
Ｆ活性を認めた。

ｏ　Ｍ−ＣＳＦ（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前記■、■又は
■で得た培養上清の１０戒を、１誰のＣｏｎＡ−セファ
ロースを充填したカラムに供した後、ＰＢＳ−（５脱）
にて洗浄後、０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシド含＃
ＰＢＳ−（１０＋ｎＱ）にて溶出した。得られた溶出液
の４ｍｌをセントリコン−１０にて濃縮し、これを下記
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。

また、前記■で得たペリプラズム画分の上清は、これを
そのまま、同サンプルとした。

Ｍ−ＣＳＦの検出は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをウェ
スタンブロッティングに供し、常法に従い製造したＭ−
ＣＳＦに対する家兎抗血清を使用することにより行なっ
た。

即ちＳＤＳ−ＰＡＧＥはレムリ化ａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に
、）の方法（Ｎａｔｕｒｅ、２７７．６８０　（１９７
０））に従い、ミニスラブ（ゲル濃度１５％）を用い、
またウェスタンブロッティングはバイオラッド社のトラ
ンスプロットセルを用いて行なった。トランスファーさ
れたニトロセルロース膜を１％牛血清アルブミン含有Ｐ
ＢＳ−にてブロッキング後、Ｍ　−ＣＳ　Ｆに対する上
記家兎抗血清と反応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ウサギ抗体（バイオラッド社製）を作用させた。Ｍ
−ＣＳＦバンドの検出は、かくして得られたニトロセル
ロース膜と発色基質である４−クロロ−１−ナフトール
液を反応させることにより行なった。

結果を第６表に示す。

第６表 ＠Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１−ｄ
ｈｆｒの作製 プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｄｈｆｒ　［Ｍｏ１．Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、。

１．８５４　（１９８１））を、制限酵素Ｈ１ｎｄＩＩ
ＩとＢａｍＨＩにより２つの断片に切断して、ジヒドロ
葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む断片を単離精製
した。

次にプラスミドｐ　ＲＳ　Ｖ　−ＣＡ　Ｔ　（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　７９．　６７７７　
（１９８１）　）を、同じ＜ＨｉｎｄＩＩｒとＢａｍＨ
Ｉとで切断して、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）のＬ
ＴＲ（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）部分
を含む断片を単離精製した。

上記で精製された２種の断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
反応させることにより連結させた。

この反応物を大腸菌ＨＢＩＯＩコンピテントセル（宝酒
造）にトランスフオームし、得られたアンピシリン耐性
を示すコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵
素地図を作成して、目的のプラスミドｐＲ８Ｖ−ｄｈｆ
ｒを得た。

該プラスミドｉ、１Ｒ８Ｖ（７）ＬＴＲ部分、ＤＨＦＲ
遺伝子、ＳＶ４０由来の介在配列とｐｏｌｙＡ付加シグ
ナル、更に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開
始点とアンピシリン耐性遺伝子を含有し、上記ＬＴＲ部
分に含有されるプロモーターのコントロール下にＤＨＦ
Ｒを発現するものである。

このプラスミドｐ　ＲＳ　Ｖ−ｄｈｆｒをＮｄｅＩ’と
ＢａｍＨＩとで２つの断片に切断して１、ＤＨＦＲ遺伝
子を含む断片を単離精製した。得られたＤＮＡ断片を、
ＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウ　フラグメント）で処
理して両末端を平滑末端とした。

一方、前記■で得たプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦＩＩを
、５ａｌＩで切断後、この切断部位を同様にＤＮＡポリ
メラーゼエで処理して平滑末端とした。

以上により得られた両断片を、Ｔ４ＤＮＡリガゼを用い
て連結させ、この反応物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテン
トセルにトランスフオームした。

得られたアンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミ
ドＤＮＡを調製し、制限酵素地図を作成して、目的のＭ
−ＣＳＦ（！＝ＤＨＦＲの両遺伝子の発現プラスミドｐ
　ｃＤＭ−ＣＳＦ　１１−ｄｈｆｒを得た。

該プラスミドは、Ｍ−ＣＳＦ発現に係わるＳＶ４０由来
の初期プロモータ一部分（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ）、介
在配列（ＳＶ４０１ｎｔｒｏｎ）　、Ｍ　−ＣＳ　Ｆ遺
伝子、ｐｏｌｙＡ付加シグナル（ＳＶ４０　ｐｏｌｙ　
Ａ）　、Ｄ　ＨＦ　Ｒ発現に係わるＲ８ＶのＬＴＲ部分
（Ｒ８Ｖ−ＬＴＩン）、ＤＨＦＲ遺伝子（ｄｈｆｒ）、
ＳＶ４０由来の介在配列（ＳＶ４０１ｎｔｒｏｎ）、ｐ
ｏｌｙＡ付加シグナル（ＳＶ４０　ｐｏｌｙ　Ａ）を合
釘し、更に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開
始点（Ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子（Ａ＋ｎｐ
ｒ）を含有する。該プラスミドをエシェリヒア・コリＨ
８１０１株にトランスフオームさせた形質転換体は、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１／　ｐ
　ｃ　ＤＭ−ＣＳ　Ｆ　１１−ｄｈｆｒ’なる名称で、
１９８８年１２月２６日に工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第２２２４号（ＦＥＲＭＢＰ−２２２
４）として寄託されている。

以上の概略を第１２図−１及び−２に示す。

［相］　ｒ　−ＭＣＳ　Ｆの製造 上記で得たプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１−ｄｈｆｒ
を用いて、前記■に従って、ｒ−ＭＣＳＦを製造した。

その結果、培養上清のＣＳＦ活性は、プレート当たりの
コロニー数（平均値）として６８（プラスミドｐｃＤＥ
を用いた対照は０）であった。

＠ＣＨＯ細胞によるｐｃＤＭ◆ＣＳＦ１１−ｄｈｆｒの
発現 ７５０ｍ２培養フラスコ（コスタ−社製）を用い、１０
％胎児牛血清、１０ｍＭピルビン酸すトリウム１０ｒｒ
Ｉ！Ｑ、非必須アミノ酸１０１ｒｌＱ、ペニシリンＧ１
０万単位、ストレプトマイシン２００　ｍｇ、ゲンタマ
イシン８０ｍｇ及び７％炭酸水素ナトリウム５３脱をＩ
Ｑ中に含むダルベツコ改良最小必須培地（ＤＭＥＭ培地
、ＧＩＢＣＯ社製）４０脱に対して約２×１０６個のチ
ャイニーズハムスター卵巣ｄｈｒｒ欠損細胞（ＣＨＯ−
Ｄｕｋ　ｄｈｆｒ−細胞：　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、、ＵＳＡ、、　７７．４
２１６（１９８０））を、６〜８日間培養後、細胞培養
上清を集めてＣＨＯ培養上清液を調製した。

また上記ＣＨＯ−Ｄｕｋ　ｄｈｆｒ−細胞をトリプシン
（フローラボラトリー社製）処理し、同ＤＭＥＭ培地に
て懸濁、洗浄後、培地を除いて調製した細胞を、ＤＮＡ
注入溶液（０，２５Ｍマンニトール０．１ｍＭ　　Ｃａ
Ｃ９２会２Ｈ２００，１ｍＭ　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
−０，２ｍＭトリスＨＣＱ、ｐＨ７，２、和光純薬工業
社製）に懸濁させた。

前記［相］で得たＭ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ−
ＣＳＦＩ　１−ｄｈｆｒを、ＣＩａＩにより切断し、線
状化した後、ＤＮＡ注入溶液に溶解させた。

上記の細胞懸濁液２００μＱ　（２Ｘ１０６細胞）とＤ
ＮＡ溶液２００μＱ（３０μｇＤＮＡ）を混合し、融合
チャンバーＣＨ−２（、島原製作所社製）に入れ、電気
融合装置５ＳＨ−１（島原製作所社製）に接続して、４
．２ＫＶ／ｃｍ２パルスを１秒間隔で２回繰返し、電気
的に、細胞内にＤＮＡを導入した。

ＤＮＡを導入した細胞を１０％透析牛脂児血清−１％非
必須アミノ酸溶液（フローラボラトリーズ社製）　　２
９６ＨＴ溶液（同上社製）−ＤＭＥＭ培地に懸濁させ、
２４穴プレート（コスタ−社製）にて培養した。

４８時間培養後、培地を選択培地（１０％透析牛脂児血
清及び１％非必須アミノ酸溶液を含むＤＭＥＭ培地）に
交換し、その後、３〜４０毎に培地を新鮮なものと交換
した。

１０〜１４日間培養して得られた約２００クロンの形質
転換細胞より５０クローンを選び、トリプシン処理後、
新しい２４穴プレートに移した。

ＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、高濃度のメトトレキセート（
ＭＴＸ）に対する耐性を与え（Ｊ、　　Ｂ。

Ｃ，，２５３，１３５７（１９７８））　、これと同時
に形質転換された近接の遺伝子はＭＴＸにより増幅を示
す（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１５９．６０１（１９８
２））。

上記５０クローンの形質転換細胞を、２０膜ＭＭＴＸを
含む選択培地で培養し続け、増殖のみられた耐性クロー
ンをトリプシン処理後、５０膜ＭＭＴＸを吉む選択培地
に懸濁させて培養を行なった。同様に増殖のみられた耐
性クローンを、１１００ｎ　　ＭＴＸを自む選択培地で
培養し続け、最終的に４００ｎＭ　　ＭＴＸ！、：耐性
を示すクローンを得た。

これらの耐性クローンの培養上清のＣＳＦ活性を下記第
７表に示す。

第７表 上記で得たＣＨＯ細胞培養」二清を、そのまま、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥのサンプルとして、前記＠と同様にして、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の検討を行なった。

その結果、非還元条件下で９万、還元条件下で４．４万
に相当する位置にＭ−ＣＳＦのバンドが検出された。

（ＪＣＨＯΦＭ　−ＣＳ　Ｆの分離・精製１０膜胎児牛
血清、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム１０或、非必須
アミノ酸１０購、ペニンリンＧＩＯ万単位、ストレプト
マイシン２００　ｍｇ。

ゲンタマイシン８０ｍｇ及び７％炭酸水素ナトリウム５
ＢＩＴｌ１２をＩＱ中に含むダルベツコ改良最小必須培
地（ＤＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ社製）を調製し、７５ｃ
ｍ２カルチヤーフラスコ（コーニング社製）にて、該培
地４０或に対して約２Ｘ１０６個の割合で、前記■で得
たＣＨＯ細胞クローンＮｏ、２゜３−８を加え、６〜８
日間培養した。

かくして得た培養上清液より、下記精製工程により目的
の均質なヒトＭ−ＣＳＦ　（ＣＨＯΦＭ−ＣＳＦ）を得
た。

尚、以下の工程において目的蛋白は前記ウェスタンブロ
ッティング法に従い検出した。

（１）　　ＣｏｎＡ−セファロースアフィニティータロ
マドグラフィー 上記で調製したＣＨＯ細胞培養上清液６５０脱に対して
、１　、　　ＯＭ　　Ｎ　ａ　ＣＱ　ａ’ｋ　５０　ｍ
　Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）６５０ｍＱ
を加えて攪拌してサンプル溶液を調製する。

一方、予めＣｏｎＡ−セファロースゲルを充填（ゲル容
積３５０ｍＱ）Ｌ、０．５〜ｉ　　ＮａＣＱ含有５含有
５ポ で平衡化した５Ｘ６０ｃｍのカラムに、−、Ｌ記すンプ
ル溶液をアプライし、同緩衝液にて充分洗浄した後、０
．５〜１メチル−（Ｚ　−　Ｄ−マンノシドを含む同緩
衝液にて溶出を行なった。

得られた溶出パターンよりＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦはすべて
溶出部分に検出された。

（２）　　ＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体クロマ
トグラフィー 上記（１）で得た０．５Ｍメチル−αーＤーマンノンド
溶出画分をＹＭ−１０膜を用いて限外滑過濃縮し、５０
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透
析を行ない、４回に別けて、以下の条件で陰イオン交換
高速波体クロマトゲラフイーを実施した。

カラム：　ＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷ（２１，５ｍｍ
１．Ｄ、Ｘ　１５ｃｍ、　　）−ソー社製） 溶離液Ａ：５％メタノール含有５０ｍＭ；ｔつ酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ８，０） 溶離液Ｂ：１．ＯＭ　　ＮａＣＱ及び５％メタノール含
有５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩 衝液（ｐＨ８，０） 流　速：３．０或／分 フラクション容積：６ｒｒｖＱ／チューブ／２分濃度勾
配：　　時間（分）　　％Ｂ 上記溶出の結果、ＣＨＯ−Ｍ、−ＣＳＦはフラクション
Ｎｏ、３４〜３８　（０，２３〜０．２５ＭＮａＣＱ）
に溶出された。これを集めてプールし、以下の方法に供
した。尚、フラクショネーションはサンプル注入直後よ
り開始した。

（３）ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー上記（２）
で得たＣＨＯ・Ｍ−ＣＳＦ部分をＹＭ−１０膜を用いて
限外濾過濃縮後、６回に分けて以下の条件で、ゲル濾過
高速液体クロマトグラフィーを行なった。

カラム：　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（６０ｃｍＸ２
１　、　５　ｍｍ１．Ｄ、、トーソー社製）溶離液：０
．３Ｍ　　ＮａＣ（２含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６，８） 流速：３．０ｍ１２／分 フラクション容積：６１Ｔ１１２／チユ一ブ／２分−ヒ
記の結果、ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦはフラクションＮｏ、２
３〜２６に溶出された。

また上記において、ゲル濾過ＨＰＬＣ用標準蛋白（オリ
エンタル酵母社製）の溶出位置から、ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳ
Ｆの分子量は１１４０００と推定された。

（４）逆相高速液体クロマトグラフィ （ＲＰ−ＨＰＬＣ） 」−記（３）で得たＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦ溶出部分につき
、ＹＭ−１０膜を用いて限外濾過濃縮後、以下の条件で
ＲＰ−ＨＰＬＣを行なった。

カラム；Ｃ４ハイボア逆相カラム（ＲＰ３０４、バイオ
ラッド社製、４．　６ｍｍ１、Ｄ、　Ｘ　２５０　［１
１［［＋）溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ 溶離液Ｂニアセトニトリル：１％ＴＦＡ（９：流　速：
１脱／分 フラクション容積＝２脱／チューブ／２分ｌ農度勾配：
　　時間（分）　　％Ｂ 上記Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣの結果、ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦは
フラクションＮｏ、３１及び３２（５２〜５３％Ｂ）に
溶出された。これを集めて、２００ｍＭホウ酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８，０）を加えて中和させた後、コンセ
ントレータ−（トミー精工社製）にて減圧濃縮を行なっ
た。

（５）ＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体
クロマトグラフィー 上記（４）で得たＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦ画分につき、以下
の条件でＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液
体クロマトグラフィーを行なった。

カラム：ＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷ　（７，５ｍｍ１
．Ｄ、Ｘ　７５ｍｍ、　　トーソー社製）溶離液Ａ：５
％メタノール含有５含有５木溶離液Ｂ：１．ＯＭ　　Ｎ
ａＣＱ及び５％メタノール含有５０ｍＭホウ酸ナトリウ
ム緩 衝液（ｐＨ８．０） 流速：１．０ｍ１２／分 フラクション容積＝１脱／チューブ／分濃度勾配二　　
時間（分）　　％Ｂ 」１記溶出結果を第１３図に示す。

図において縦軸は２８Ｏｒ＋ｍにおける蛋白の吸光度（
Ａ２８ｏ）及びＮａＣＱ濃度（Ｍ）を、横軸はフラクシ
ョンＮｏ．を示す。また図中、横線側矢印（−）は、ウ
ェスタンブロッティングにより検出されたＣＨＯ−Ｍ−
ＣＳＦ溶出位置を示す。

該図より、ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦはフラクションＮｏ．３
９及び４０に溶出、検出される。

この溶出部分を分取し、コンセントレータ−にて減圧濃
縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、単一の蛋
白バンドが検出され、これは上記ウェスタンブロッティ
ングのバンド位置に一致し、かくしてＣ　Ｈ　Ｏ　−　
Ｍ　−　Ｃ　Ｓ　Ｆの単離、精製を確認した。

（６）ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦのＮ末端酸アミノ酸配列 上記で得たＣＨＯ−Ｍ−Ｃ５ＦのＮ末端酸アミノ酸配列
を、気相シークエンサー（アプライドバイオシステムズ
社製）を用いて決定した。

その結果、ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦのＮ端１０個のアミノ酸
配列は、以下の通りであることが確認された。

Ｇ　ｌｕ　−　Ｇ　ｌｕ　−　Ｖａｌ　−　Ｓ　ｅｒ　
−　Ｇ　Ｉｕ　−　Ｔｙｒ　−　Ｘ’Ｓ　Ｃｒ　−　Ｈ
　ｉｓ　−　Ｍｅｔ　−尚、サイクル７におけるアミノ
酸（Ｘ′）は、同定し得ず、遺伝子構造からＣｙｓであ
ると推定された。

（７）ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥレムリの
方法（Ｌａｅｍｍｌｉ．Ｕ．に、、　Ｎａｔｕｒｅ．　
　２　７　７。

６８０　（１９７０）］に従い、上記（５）で得たＣＨ
Ｏ−Ｍ−ＣＳＦの濃縮液をレムリのサンプルバッファー
［２−メルカプトエタノールを含むもの（２−ＭＥ＋）
及び含まないもの（２−ＭＥ−）の両者］のそれぞれに
溶解し、９５℃で５分間加熱処理した後、以下の条件で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した。

ゲル：厚さ１．５ｍｍの１２％ポリアクリルアミドゲル
を使用。

電気泳動装置ニブロチアン（バイオラッドラボラトリー
ズ社製） 泳動条件：定電流でスタッキングゲル２０ｍＡ、セパレ
イティングゲル３０ｍＡで約４ 時間泳動させる。

染色ニジルバースティンキット（和光紬薬社製）を使用
。

分子量マーカー：プレスティントマーカー（バイオラッ
ド社製）を用いた。

上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７）結果ヨｌ’）、ＣＨＯ−Ｍ
〜ＣＳＦは２−ＭＥ−状態では分子量約７６０００、２
−ＭＥ＋状態では分子量約３８０００であると推定され
、この位置に単一バンドとして泳動された。

（８）ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦの等電点 上記（２）で得られた部分精製品を使用して、ＣＨＯ・
Ｍ−ＣＳＦの等電点のｆｆ１ｌ定を以下の通り行なった
。

即ち、ゲルとしてｐＨ３，５〜９．５用ゲル（ＬＢＫア
ンフオラインＰＡＧゲル）を使用し、」１記部分精製品
を１００μＱアプライし、１０Ｗ１２時間泳動させた。

泳動後、ゲルを５ｍｍ間隔で切り出し、５０ｍＭホウ酸
ナトリウム（ｐＨ８，０）ｌｒｒｖＱ中にいれ、２４時
間溶出を行ない、活性を測定した。また、ｐＨは１ｃ［
１１間隔でゲルを切り、蒸留水５００μＱ中にて２４時
間放置した後、測定した。

上記の結果を第１４図に示す。図において、縦軸はｐＨ
及び総括性（Ｕ）を、横軸はカソードからの距離（ｃｍ
）を示す。

該図より、ＣＨＯ・Ｍ−ＣＳＦの等電点はｐＨ４，５５
であることが判る。

＠ｒ　　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ争ｃｓＦ１
１−１８５−ｄｈｆｒの作製 前記［相］により作製されたプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳ
ＦＩＩ−ｄｈｆｒを、制限酵素ＸｈｏＩにより２つの断
片に切断して、ＤＨＦＲ遺伝子を含む断片を単離精製し
た。

別に、前記■により作製されたプラスミドｐＣＤＭ−Ｃ
ＳＦＩ　１−１８５を、制限酵素ＸｈｏＩにより２つの
断片に切断して、Ｍ−ＣＳＦＩ１１８５ｃＤＮＡを含む
断片を単離精製した。

−上記により得られた２種の断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結反応させ、この反応物を大腸菌ＨＢＩＯＩ
コンピテントセル（宝酒造）にトランスフオームした。

得られたアンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミ
ドＤＮＡを調製し、制限酵素地図を作製して、目的のプ
ラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１−１８５−ｄｈｆｒを得
た。

該プラスミドは、ｐｃＤＭ−ｃｓＦｌｌ−ｄｈｆｒプラ
スミドのＭ−ＣＳＦ１１ＤＮＡがＭ−ＣＳＦ１．１−１
８５ＤＮＡに変換されたプラスミドであって、それ以外
は、該ｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１ｄｈｆｒと完全に一致して
いる。

該プラスミドをエシェリヒア・コリＨＢ　１０１株にト
ランスフオームさせた形質転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１　／　ｐ　ｃ　ＤＭ　
−ＣＳ　Ｆ　１１−１８５−ｄｈｆｒなる名称で、１９
８８年１２月２６日に工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研条寄第２２２３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２２２
３）として寄託されている。

［相］　ＣＨＯ細胞での発現 −ｈ記０で得たプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１１８５
−ｄｈｆｒを、前記＠に示した方法に従い、ＣＨＯ−Ｄ
ｕｋ　ｄｈｆｒ−細胞に導入し、導入細胞を培養し、最
終的に４００ｎＭのＭＴＸに耐性を示すクローン５０ク
ローンを得た。

之等の耐性クローンのうちから６クローンを選び、之等
につき培養上清のＣＳＦ活性を測定した。

結果を下記第８表に示す。

第８表 但し、ＣＳＦ活性単位（Ｕ／鵬）は前記式（ａ）にて算
出した。

上記で得たＣＨＯ細胞（クローンＮｏ、４−１２）を前
記■と同様の方法により培養し、精製（ＣｏｎＡ−セフ
ァロースクロマトグラフィー、ＴＳＫゲルケルＡＥ−５
ＰＷイオン交換ＨＰＬＣ，ゲル枦過ＨＰＬＣ１逆相ＨＰ
ＬＣ及びＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷ　　ＨＰＬＣ）し
た。

尚、上記各精製工程における目的蛋白質であるＭ　−Ｃ
Ｓ　Ｆの検出は、前記ウェスタンブロッティング法によ
った。

上記精製の最終工程で得られたＭ−ＣＳＦ画分につき、
前記■と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ウェ
スタンブロッティング法により分子量の検討を行なった
。

また前記■の（８）と同様にして等電点電気泳動を行な
った後、クマーシーブリリアントブルＲ２５０を用いた
染色法と、１０％メタノールを含む１％酢酸溶液をトラ
ンスファーバッファーとしたウェスタンブロッティング
法とにより、ＭＣＳＦの検出を行なった。

その結果、該Ｍ−ＣＳＦの分子量は、非還元条件では４
２０００．４６０００であり、マイナー成分として３９
０００の分子種も認められた。また還元条件下では、主
成分の分子量は２２０００及び２７０００であり、マイ
ナーな成分として１６０００にもバンドが検出された。

また該Ｍ−ＣＳＦの等電点（ｐｉ）は、３．５〜４，６
であり、主として５種類の分子種よりなることが確認さ
れた。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＲ８ＶＳ−ＭＣＳ　Ｆ
　１１−ｄｈｆｒの作製 前記［有］で得たＤＨＦＲ発現プラスミドｐＲ８Ｖｄｈ
ｆｒを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌｌｌとで切断し
てＤＨＦＲ遺伝子部分を除き、得られる断片の両末端を
５ａｌＩリンカ−（宝酒造社）を用いて５ａｌｌ末端に
変換した後、これを７４ＤＮＡリガーゼにより連結して
プラスミドｐＲ８Ｖ−８を得た。

次いで得られたプラスミドｐＲ８Ｖ−８を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩにより切断後、末端をＤＮＡポリメラーゼにより
平滑末端とし、更に制限酵素ＮｄｃＩで切断して、Ｒ５
Ｖ−ＬＴＲを含むＤＮＡ断片を単離精製した。

一方、プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　２−ｄｈｆｒ　（Ｍｏ１
．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、１，８５４　（１９８１））を、制限酵素
ＥｃｏＲＩにより切断した後、Ｃ１ａＩリンカ−（宝酒
造社）によりＣＩａＩ切断部位を加えてプラスミドｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒ−ＥＣを作製し、該プラスミドを制限酵
素ＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩにより切断して、ＤＨＦＲ遺
伝子を含むＤＮＡ断片を単離精製した。

上記で精製された２種のＤＮＡ断片を Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結して、プラスミドｐ　
ＲＳ　Ｖ　Ｓ　　ｄｈｆｒを得た。

また、別個に前記［相］で作製したプラスミドｐｃＤＭ
−ＣＳＦＩＩ−ｄｈｆｒを、制限酵素ＥｃｏＲＩにより
切断してＭ−ＣＳＦ遺伝子を分離後、その両末端を５ａ
ｌＩリンカ−（宝酒造社）を用いてＳａｔ■末端に変換
し、これを上記で得たプラスミドｐ　ＲＳ　Ｖ　５−ｄ
ｈｆｒの５ａｌＩ部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、この連結物を大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造社）に
トランスフオームした。

かくして得られたＭ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＲ３ＶＳ
−ＭＣＳＦ　１１−ｄｈｆｒを、制限酵素によりマツピ
ングして、目的のプラスミドであることを確認した。

その構造を第２２図に示す。

第２２図に示す通り、上記プラスミドはＭ−ＣＳＦ発現
に係わるＲ８ｖのＬＴＲ部分（Ｒ３Ｖ−ＬＴＩ？）　、
Ｍ−ＣＳ　Ｆ遺１云子（’Ｍ−Ｃ８Ｉ’）　、Ｓ　Ｖ　
４０由来の介在配列（ＳＶ４０１ｎｔｒｏｎ）　、ｐｏ
ＩｙＡ付加シグナル（ＳＶ４０　ｐｏｌｙＡ）、ＤＨＦ
Ｒ発現に係ワル初朋７’　。

モータ一部分（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ）、ＤＨＦＲ遺伝
子（ｄｈｆｒ）、ＳＶ４０由来の介在配列（ＳＶ４０１
ｎｔｒｏｎ）、ｐｏｌｙＡ付加シグナル（ＳＶ４０　ｐ
ｏｌｙＡ）を含有し、更に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２
２山来の複製開始点（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）及びアンピ
シリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を含有する。

Φ　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｓＶ２ｓＭＣＳ　Ｆ　
１１−ｄｈｆｒの作製 上記■で作製したＤＨＦＲ発現ベクターｐＳＶ２−ｄｈ
ｆｒ−ＥＣを、制限酵素Ｈ１ｎｄＩｆｆ及びＢｇｌＩＩ
により切断し、ＤＨＦＲ遺伝子を除き、更にその両末端
を５ａｌＩリンカ−を用いて５ａｌＩ末端とした後、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させて、プラスミドｐＳ
Ｖ２−８を得た。

一方、プラスミドｐ　ＲＳ　Ｖ　−ｄｈｆｒを制限酵素
ＮｄｅＩにより切断し、ＢａｍＨＥリンカ−（宝酒造社
）により両末端をＢａｍＨＩ末端とし、更に制限酵素Ｂ
ａｍＨＴにより切断して、ＤＨＦＲ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を単離、精製した。

得られたＤＮＡ断片を上記プラスミドｐｓＶ２−８のＢ
ａｍＨＩ部位に７４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させて
、プラスミドｐＳＶ２Ｓ　−ｄｈｆｒを作製した。

別個に、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐ　ｃ　Ｄ　Ｍ　命
ＣＳＦＩＩ−ｄｈｆｒを、制限酵素ＥｃｏＲＩにより切
断して、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を分離後、その両末端を５ａ
ｌＩリンカ−を用いて５ａｌＩ末端とし、これを上記プ
ラスミドｐＳＶ２Ｓ−ｄｈｆｒの５ａｌＩ部位にＴ　４
．　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて連結し、連結物を大腸
菌ＨＢＩＯＩにトランスフオームした。

か（して得られたプラスミドは、制限酵素マツピングに
より、目的とするプラスミドｐｓＶ２ｓ−ＭＣＳ　Ｆ　
１１−ｄｈｆｒであることが確認された。

その構造を第２２図に示す。

第２２図に示す通り、上記プラスミドは、ＳＶ４０由来
の初期プロモータ一部分（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ）、Ｍ
−ＣＳＦ逍伝子（Ｍ−ＣＳＦ）　、Ｓ　Ｖ　４０山来の
介在配列（ＳＶ４０１ｎｔｒｏｎ）　、ｐｏｌｙＡ付加
シグナル（ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ）、Ｒ３ＶのＬＴＲ部分
（Ｒ８Ｖ−ＬＴＲ）、ＤＨＦＲ遺伝子（ｄｈｆｒ）、Ｓ
Ｖ４０由来の介在配列（ＳＶ４０１ｎｔｒｏｎ）　、ｐ
ｏｌｙＡ付加シグナル（ＳＶ４０　ｐｏｌｙＡ）を含有
し、更に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２山来の複製開始
点（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子
（Ａｐ’　）を含有する。

■　Ｍ−Ｃ５Ｆ発現プラスミドｐＣＤＭ−ＣＳＦ１１−
ｄｈｆｒＲＯの作製 ＤＨＦＲ発現ベクターｐ　ＲＳ　Ｖ　−ｄｈｆｒを制限
酵素ＢａｍＨＩにより切断し、切断部位を５ａｉＩリン
カ−を用いて５ａｌＩ末端とし、更に制限酵素ＮｄｃＩ
により切断し、切断部位をＣ１ａＩリンカ−を用いてＣ
１ａＩ末端として、プラスミドｐＲ８Ｖｄｈｆｒ　−Ｃ
Ｓを作製した。

このプラスミドを制限酵素Ｃ１ａＩ及び５ａｌＩにより
切断して、ＤＨＦＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離、精
製した。

別個に、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦＩ
Ｉを制限酵素Ｃ１ａＩ及び５ａｌＩにより切断して、Ｍ
−ＣＳＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離、精製し、これ
に上記で得られたＤＨＦＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、連結物を大腸菌Ｈ
Ｂ　１０１にトランスフオームした。

かくして得られたプラスミドより、制限酵素マツピング
によりＭ−ＣＳＦ遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子との転写方向
が逆向きであることを確認し、目的とするプラスミドｐ
ｃＤＭ−ｃｓＦ１１−ｄｈｆｒＲＯを得た。

その構造を第２２図に示す。

第２２図に示す通り、上記プラスミドは、ＳＶ４０由来
の初期プロモータ一部分（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ）、介
在配列（ＳＶ４０１ｎｔｒｏｎ）　、Ｍ　−ＣＳ　Ｆ遺
伝子（Ｍ−ＣＳＦ）　、ｐｏｌｙＡ付加シグナル（ＳＶ
４０　ｐｏｌｙＡ）と共に之等とは転写方向が逆向きに
Ｒ８ＶのＬＴＲ部分（Ｒ８Ｖ−ＬＴＲ）　、Ｄ　ＨＦ　
Ｒ遺伝子（ｄｈｆｒ）、ＳＶ４０由来の介在配列（ＳＶ
４０１ｎｔｒｏｎ）　、ｐｏｌｙＡ付加シグナル（ＳＶ
４０　ｐｏｌｙＡ）を含有しており、更に大腸菌プラス
ミドｐＢＲ３２２山来の複製開始点（ｐＢＲ３２２ｏｒ
ｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を含有して
いる。

［相］　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドのＣＨＯ細胞への導
入とＭ−ＣＳＦの発現 前記［相］、■、■、■及び［相］で作製したそれぞれ
のＭ−ＣＳＦ発現プラスミドを、ＣＨＯ細胞に導入して
、Ｍ−ＣＳＦを発現させた。

宿主として用いたＣＨＯ細胞はＣＨＯ−ｄｈｆｒ−ＤＧ
４４細胞（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、１２　（６）　、　５
５５　（１９８６）　）である。

プラスミドの導入、ＣＨＯ細胞の培養、ＭＴＸによる遺
伝子増幅の各方法は、前記＠に記載の方法に従った。

各々のプラスミドを導入した細胞を４００　ｎ　ＭＭＴ
Ｘを含む選択培地で培養して得られた耐性クローンを、
引続いて１μＭ　　ＭＴＸを含む同培地で培養し、該培
地で増殖の認められた細胞株を更に３μＭ　　ＭＴＸを
含む同培地で培養して、耐性クローンを得た。

かくして得られた３μＭ　　ＭＴＸ耐性クローンを、２
４ウエルプレート（コースタ−社製）にて培養し、培養
面全面に細胞が増殖した時点で、細胞を回収し、その細
胞懸濁液の１１５容量を、ＭＴＸを含まず、１０％牛脂
児血清を含むＤＭＥＭ培地１脱を入れた２４ウエルプレ
ートに、新たに接種して６日間培養した後、培養」１清
を回収した。

得られた培養上清のすべてにつき、ウェスタンブロッテ
ィング法によりＭ−ＣＳＦ産生の有無を、産生されたＭ
−ＣＳＦの分子量測定により調べ、著量のＭ−ＣＳＦ産
生の認められる検体につき、それらＭ−ＣＳＦの活性測
定を行なった。

その結果を、下記第９表に示す。

第９表 用いたすべてのＭ−ＣＳＦ発現プラスミドは、ＣＨＯ細
胞においてＭ−ＣＳＦの発現が見られた。

また、ウェスタンブロッティング法により確認されたＭ
−ＣＳＦの分子量は、すべて前記＠に記載のＣＨＯ−Ｄ
ｕｋ　ｄｈｆｒ−細胞を宿主とした場合に得られるＭ−
ＣＳＦ　（ＣＨＯ・Ｍ−ＣＳＦ）のそれと同等であった
。

実施例３ ２・シストロン法による組換えＭ−ＣＳＦ（ｒＭＣＳ　
Ｆ）の製造 ■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｔｒｐｌＬ−２Ｘ・Ｍ
−ＣＳＦＩＯＩの作製 前記実施例２の■で得たプラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦＩ
　１−１８５を、制限酵素５ｃａＩ及びＢａｍＨＩて消
化してＳｃａＩ−ＢａｍＨｉ　　ＤＮＡ断片（約４５０
ｂｐ）を、アガロースゲル電気泳動にて単離精製した。

次いで、得られたＤＮＡ断片の５ｃａＩ切断端に、下記
合成リンカ−（Ｉ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結させ、５ｃａＩ切断端側に制限酵素ＸｂａＩの切断端
を有するＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片（約４８０
ｂｐ）を得た。

合成リンカ−（Ｉ）： ２ｎｄ　　ＳＤ　　　　　　　　ｔｅｒｂａ　１ ｔａｒｔ （Ｂｏｘ） ＧＡＡ　Ｔ　−３゜ かくして得られたＤＮＡ断片を、ヒトＩ　Ｌ−２発現プ
ラスミドｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｄ８Δ（特開昭６３−１２
９５８号公報参照）のＸｂａＩ、　ＢａｍＨＩ切断部位
に挿入して、所望のプラスミドｐｔｒｐＩＬ−２Ｘ−Ｍ
−ＣＳＦＩＯＩを得た。

該プラスミドをエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ株にトラ
ンスフオームさせた形質転換体は、Ｅｓｅｈｃｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１／　ｐｔｒｐ　Ｉ　Ｌ−
２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦＩＯＩなる名称で、１９８８年１２月
２６日に工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄
第２２２６号（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　Ｂ　Ｐ　−２２２６）
として寄託されている。

かくして得られたプラスミドｐ　ｔｒｐ　Ｉ　Ｌ　−２
Ｘ・Ｍ　−ＣＳ　Ｆ　１０１は、大腸菌トリプトファン
プロモーター支配下の転写ユニット内に、２種類のポリ
ペプチドがコードされている。その一つは翻訳開始のメ
チオニン、ヒトＩ　Ｌ−２７ミノ末端側６０アミノ酸及
びインタージストロニック（ｉｎｔｃｒｃｉｓｔｒｏｎ
ｉｃ）配列にコードされる４アミノ酸からなる６５アミ
ノ酸のポリペプチドであり、他の一つは翻訳開始のメチ
オニン及び第５図における３５番目のアミノ酸（Ｖ　ａ
ｌ）から１８５番目のアミノ酸（Ｔｈｒ）までの１５１
アミノ酸のヒトＭ・ＣＳＦからなる合計１５２アミノ酸
のポリペプチドである。

かかる２・シストロン（ｔｗｏ−ｃｉｓｔｒｏｎ）発現
システムにおいて、セカンドシストロン（２ｎｄ　ｃｉ
ｓｔｒｏｎ）の翻訳は、インタージストロニック配列内
に置かれた第２のＳＤ配列にリポソームが結合すること
により開始される。

以北の２・シストロン発現システムの構造の概略を第１
５図に示す。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｘ・
Ｍ−ＣＳＦ１０２の作製 上記■において合成リンカ−として、下記のリンカ−（
ＩＩ）を用いる以外は同様にして、インタジストロニッ
ク配列のみが異なる、所望のプラスミドｐｔｒｐ　　Ｉ
Ｌ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０２を得た。

上記の構造を第１６図に示す。

合成リンカ （■）　： 合成リンカ−（■）： ２ｎｄ　　５Ｄ ｔｅｒ　ｔｅｒ　５ｔａｒｔ（Ｂｏｘ）２ｎｄ　　ＳＤ ｔｅｒ ■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｔｒｐｌＬ−２Ｘ・Ｍ
　−ＣＳ　Ｆ　１０３の作製 １ユ記■において、合成リンカ−として下記リンカ−（
ＩＩＩ）を用いる以外は同様にして、所望のプラスミド
ｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｘ舎ＭφＣＳＦ１０３を得た。

（ＢＯＸ） ＧＴＡ　ＴＣＡ　にＡＡ　Ｔ　−３ ＣＡＴ　ＡＧＴ　ＣＴＴ　Ａ ｅａ　Ｉ 該プラスミドは、そのセカンドシストロンに、翻訳開始
のメチオニン及び第５図における３３番目のアミノ酸（
Ｇｌｕ）から１８５番目のアミノ酸（Ｔ　ｈｒ）までの
１５３アミノ酸のヒトＭ−ＣＳＦからなる合計１５４ア
ミノ酸のポリペプチドがコードされていることにより特
徴付けられる。

−上記の構造を第１７図に示す。

■　Ｍ−Ｃ５Ｆ発現プラスミドｐｔｒｐｌＬ−２Ｘ−Ｍ
−ＣＳＦ１０４、同ｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｘ・Ｍ−ＣＳＦ
１０５及び同ｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０６
の作製 上記■〜■において、プラスミドｐｃＤＭ・Ｃ’５ＦＩ
Ｉ−１８５の代りに、前記実施例２の■で得たプラスミ
ドｐｃＤＭ−ＣＳＦ−１８５を用いて、同様にして下記
各所望プラスミドを得た。

０プラスミドｐｔｒｐ　　ＩＬ−２Ｘ慟ＭφＣＳＦ１０
４　［合成リンカ−としてリンカ−（Ｉ）を使用した。

その構造を第１８図に示す］、○プラスミドｐｔｒｐ　
ＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０５［合成リンカ−としてリ
ンカ−（ＩＩ）を使用した。その構造を第１９図に示す
］及びＯプラスミドｐｔｒｐ　ｌＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ
１０６［合成リンカ−としてリンカ−（ｍ）を使用した
。その構造を第２０図に示す］。

＋Ｚ記プラスミドｐｔｒｐ　　Ｉ　Ｌ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳ
Ｆ１０４をエシェリヒア・コリＨ８１０１株にトランス
フオームさせた形質転換体は、Ｅ　５ｃｈｃｒｉｃｈｉ
ａｃｏ１１／ｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０４
なる名称で、１９８８年１２月２６０に工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研条寄第２２２５号（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ’−２２２５）として寄託されている。

■　Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドの大腸菌への導入及び形
質転換体の培養 上記■〜■で得られたプラスミドのそれぞれを、大腸菌
５Ｇ２１０５８株（Ｊ、Ｂａｃｔｃｒｉｏｌ、、　１６
４゜１１２４−１１３５　（１９８５））に、形質転換
法により導入して、生産される蛋白質をＳＤＳＰＡＧＥ
及びウェスタンブロッティング法にて解析した。

即ち、上記各プラスミドを保有する大腸菌５Ｇ２１０５
８を３００或容フラスコにて、１％カサミノ酸、０．４
％グルコース、５μｇ／閾塩酸チアミン、２０μｇ／ｍ
ＱＬ−システィン及び５０μｇ　／　ｒｒｖＱアンピシ
リンを加えたＭ９培地５０鵬にて、３７°Ｃで８時間振
盪培養後、遠心（５０００ｒｐｍ　、５分間、室温）し
て菌体を回収し、生産された蛋白質の解析を行なった。

尚、ＳＤＳＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング法に
よるＭ　−ＣＳ　Ｆの検出は、前記実施例２の０に準じ
て行なった。

−に記■のプラスミドで形質転換された大腸菌の培養の
場合、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色像
では、分子量的８ｋｄ及び１７ｋｄのポリペプチドの著
量生産が確認された。これら２種類のポリペプチドは、
前者がファーストシストロン（１ｓｔ　ｃｉｓｔｒｏｎ
）、後者がセカンドシストロンにそれぞれコードされる
ポリペプチドの予想される分子量に一致した。

抗ヒトＩ　Ｌ−２抗体及び抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体を使用
したウェスタンブロッティング法による解析から、上記
８ｋｄのポリペプチドが、Ｉ　Ｌ−２のＮ末端側６０ア
ミノ酸を含むファーストシストロン翻訳物であり、同１
７ｋｄのポリペプチドがＭ−ＣＳＦを含むセカンドシス
トロン翻訳物であることが確認された。

また、上記■〜■の各プラスミドで形質転換された大腸
菌の培養物について、上記と同様にして解析を行なった
結果、いずれもセカンドシストロン翻訳物（Ｍ−ＣＳＦ
）の生成を確認することができた。

■　Ｍ−ＣＳＦの分離、精製 （１）大腸菌からのＭ−ＣＳＦ画分の調製上記■で得た
プラスミドｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｘ−Ｍ・ＣＳＦＩＯＩを
保持する大腸菌１．５ｇ（湿重量）に、０．５Ｍショ糖
を倉む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｒ
ＷＱを加え、充分に攪ｒＥした。次にリゾチーム２ｍｇ
／ｍｆ２を６戒、続けて０．１４Ｍ　　ＥＤＴＡ４ｍＱ
を加え、４℃で１５分間攪拌処理し、処理後、１０００
０回転／分で２０分間遠心分離を行なった。

上清はすて、沈渣を同緩衝液（０，５Ｍショ糖を含む５
０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，０）にて洗浄し、同じ＜　
１００００回転／分で２０分間遠心操作を行なって、沈
渣としてスフ二ロプラストを得た。次いで、これに５０
ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，０）５０ｍＱを加えて懸濁さ
せ、超音波処理を２０ＫＨｚ、１０分間行ない、その後
１００００回転／分で２０分間遠心分離を行ない、同緩
衝液（５０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，０）にて洗浄後、
同条件で再度遠心分離を行なって、沈渣としてＭ−ＣＳ
Ｆ画分を得た。

（２）Ｍ−ＣＳＦ画分からＭ−ＣＳＦの再構成」二足（
１）の操作により得られたＭ−ＣＳＦ画分に、７．０Ｍ
塩酸グアニジンを含む５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，０
）１００或を加え、４℃で１時間スターラーにて攪拌し
て溶解させた。この溶解液を、予め１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８，５）３００脱の入ったビーカー（スターラー
にて攪拌）中に徐々に滴下し、滴下終了後、１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ８，５）に対して４°Ｃで充分に透析を
行ない、その後、１００００回転／分で２０分間遠心分
離を行ない、沈澱を除去して上清を得た。

かくして得られた上清中には、再構成したＭ−ＣＳＦが
存在している。

（３）Ｍ−ＣＳＦの精製 」二足（２）で得られたＭ−ＣＳＦの精製を、前記実施
例２の［相］に示した方法に準じて、以下の通り行なっ
た。

（３−１）　　ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー上
記（２）で得た遠心上清を限外濾過器（アミコン社製、
メンブラン：　ＹＭ−１０膜、アミコン社製）を用いて
濃縮し、濃縮液を０．４５μｍミリポアーフィルターに
通した後、以下の条件で、ゲル濾過高速液体クロマトグ
ラフィーを行なった。

カラム：　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（６０膜ｍＸ２
１、　５＋ｎｍ１．Ｄ、、トーソー社製）溶出液：０．
３Ｍ　　ＮａＣＱ含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６，８） 流　速＝３．０閾／分 フラクション容積：６＋１１Ｑ／チユ一ブ／２分上記に
おいて、ゲル濾過ＨＰＬＣ用標準蛋白（オリエンタル酵
母社製）の各溶出位置、即ちグルタメート・デバイドロ
ゲナーゼ（分子量２９００００）　、ラクテート・デバ
イドロゲナーゼ（分子量１４２０００）　、エノラーゼ
（分子量６７０００）及びアデニレート・キナーゼ（分
子量３２０００）から判断して、Ｍ−ＣＳＦの分子量は
３２０００と推定された。

上記活性部分を分取し、上記限外濾過器にて４０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム（ｐＨ８，０）に対して溶媒交換を行な
った。

（３−２）　　Ｔ　Ｓ　ＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷイオン
交換高速液体クロマトグラフィー 上記（３−１）で得た活性溶出画分を、以下の条件でＴ
ＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体クロマト
グラフィーにかけた。

カラム：ＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷ　（７，５ｍｍ１
．Ｄ、Ｘ７５ｍｍ、　　トーソー社製）溶離液Ａ：５％
メタノール含有４含有４小溶離液Ｂ：１．ＯＭ　　Ｎａ
ＣＱ及び５％メタノール含有４０ｍＭホウ酸ナトリウム
緩 衝液（ｐＨ８．０） 流速＝１．０或／分 フラクション容積：１．０ｍ１２／チユ一フ／分濃度勾
配二　　時間（分）　　　％Ｂ 上記ＴＳＫゲルケルＡＥー５ＰＷイオン交換高速液体ク
ロマトグラフィーの結果（溶出パターン）を第２１図に
示す。図において、縦軸は２　８　０　ｎｍにおける蛋
白の吸光度（Ａ２８ｏ）及びＮａＣＱ濃度（Ｍ）を示し
、横軸はフラクションＮｏ．を示す。

また図中横線側矢印（−）はＭ−ＣＳＦ活性を示す。

」二足図より、フラクションＮｏ．４２〜４３（０．２
３〜０．２５Ｍ　　ＮａＣＱ濃度）に認められるピーク
がＭ−ＣＳＦに相当する。

該ピークを集めることにより、大腸菌からＭ−ＣＳＦを
得た。

（３−３）　　Ｍ−ＣＳＦのＮ末端酸アミノ酸配列前記
実施例２の［相］の（６）と同様にして、上記で得たＭ
−ＣＳＦのＮ末端酸アミノ酸配列を決定した。

その請果、次の通りであることが確認された。

Ｍｅｔ　−　Ｖ　ａｌ　−　Ｓ　ｅｒ　−　Ｇ　Ｉｕ　
−　Ｔ　ｙｒ　−（４）Ｍ−ＣＳＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ レムリの方法に従い、上記（３−２）で得たＭＣＳＦの
濃縮液をレムリのサンプルバッファー［２−ＭＥ＋及び
２−ＭＥ−の両者］のそれぞれに溶解し、９５°Ｃで５
分間加熱処理した後、以下の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを
実施した。

ゲル：厚さ１．５ｍｍの１２％ポリアクリルアミドゲル
を使用。

電気泳動装置ニブロチアン（バイオラッドラボラトリー
ズ社製） 泳動条件：定電流でスタッキングゲル２０ｍＡ。

セパレイティングゲル３０ｍＡで約 ４時間泳動させる。

染色ニジルバースティンキット（和光紬薬社製）を使用
。

分子量マーカー：電気泳動キャリブレーションキッド（
ファルマシア社製） を用いた。

上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、Ｍ−ＣＳＦｉ、ｔ　
２−Ｍ　Ｅ−状態テハ分子量約２９５００，２−Ｍ　Ｅ
＋状態では分子量的１７４００と推定され、これらの位
置にそれぞれ単一バンドとして泳動された。

（５）　　Ｍ−ＣＳＦの再構成 上記■で得たプラスミドｐｔｒｐ　ＩＬ−２Ｘ−Ｍ・Ｃ
ＳＦ１０１を保持する大腸菌７．５ｇ（湿重量）に、０
．５Ｍショ糖を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，０）を加えて１００閾とし、充分に攪拌した。次にリ
ゾチーム２４ｍｇ／＋ｎＱを６閾、続けて０．１４Ｍ　
　ＥＤＴＡ４厩を加え、４°Ｃで１５分間攪拌処理し、
処理後、１００００回転／分で２０分間遠心分離を行な
った。

上清はすて、沈渣を同緩衝液（０，５Ｍショ糖を含む５
０ｍＭ）−リス塩酸、ｐＨ７，０）にて洗浄し、同じ＜
　１００００回転／分で２０分間遠心操作を行なって、
沈渣としてスフ上口プラストを得た。

次いでこれに５０ｍＭ）リス塩酸（ｐ　Ｈ７，０）１０
０１ＴＩＩ２を加えて懸濁させ、超音波処理（２００Ｋ
Ｈｚ、２分間、２００Ｗ）を行ない、その後、１０００
０回転／分で２０分間遠心分離を行なった。得られた沈
渣を２％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ）リス塩酸
（ｐ　Ｈ７，５）にて充分洗浄後、同条件で再度遠心分
離を行なって、沈渣としてＭ−ＣＳＦ画分を得た。

かくして得られたＭ−ＣＳＦ画分に、７．０Ｍ塩酸グア
ニジン及び２５ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）２０閾を加えて室温で４時
間攪拌して、蛋白質を還元、変性及び溶解させた。この
溶解液を、０．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ
酸化型グルタチオン及び２ｍＭ尿素を含む４０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８，５）２０００鵬の入ったビーカー中に
、スターラーにて攪拌しながら、徐々に滴下して１００
倍に希釈した。滴下終了後、４℃にて１〜２日間放置し
て、再構成したＭ−ＣＳＦを得た。

（６）　　Ｍ−ＣＳＦの等電点電気泳動上記（５）で得
たＭ−ＣＳＦの等電点の測定を以下の通り行なった。

即ち、ゲルとしてｐＨ３，５〜９．　０用ゲル（ＬＫＢ
社製アンフオラインＰＡゲル）を使用し、Ｍ−ＣＳＦを
１００μＱアプライし、ゲル幅１ｃｍにつきＩＷで泳動
を開始し、電流が一定になった後、更に３０分間泳動さ
せた。泳動中湿度はクーラー（クールフローＣＦＴ−２
５、ネスラブ社製）にて１０°Ｃに保った。

上記泳動後、ゲルを５ｍｍ間隔で切出し、５０ｍＭホウ
酸ナトリウム（ｐＨ８，０）１ｍＱ中に入れ、２４時間
溶出を行ない、溶出物のＣＳＦ活性を測定した。

また、上記ゲルを１ｃｍ間隔で切り、蒸留水１ｒｒｌＱ
中にて２４時間振盪後、ｐＨメーターにてそのｐＨを測
定した。

上記の結果、Ｍ−ＣＳＦの等電点はｐＨ４，８であるこ
とが確認された。

図面の簡単な説明 第１図は、λｃＭ５のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。

第２図（第２図−１〜第２図−４）は、マキサム−ギル
バートの化学修飾法及びＭ１３ファージを用いるジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法にて決定された上記λｃ　Ｍ
　５のｃＤＮＡの塩基配列を示す。

第３図（第３図−１〜第３図−２）は、上記ｃＤＮＡに
よりコードされているＭ−ＣＳＦ前駆体蛋白質の蛋白−
次構造を示す。

第４図（第４図−１〜第４図−４）は、λｃＭ１１のｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。

第５図（第５図−１〜第５図−３）は、λｃＭ１１のｃ
ＤＮＡによりコードされているＭ−ＣＳＦ前駆体蛋白質
の蛋白−次措造を示す。

第６図は、ＣＯＳ細胞発現ベクターｐｃＤＥの作製の概
略図を示す。

第７図は、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
の作製の概略図を示す。

第８図は、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ・ＣＳＦ
ＩＩ−１８５の作製の概略図を示す。

第９図（第９図−１〜第９図−３）は、Ｍ−ＣＳＦ発現
プラスミドｐ　Ｉ　Ｎ−ｍ　（ｌｐｐ　”　−５）−Ｏ
ｍｐＡ−ＭＣＳＦ１ｉ　　ＮＶ１５１の作製の概略図を
示す。

第１０図は、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ｍ　（
ｌｐｌ）　ｐ−５）−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ１１−ＮＶ１
５１によりコードされるアミノ酸配列を示す。

第１１図は、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＩＮ−ｍ　ｃ
ｌｐｐ　ｐ−５）　−ＯｍｐＡ−ＭＣＳＦ　ｉ　１−Ｎ
Ｖ１４３によりコードされるアミノ酸配列を示す。

第１２図（第１２図−１及び第１２図−２）は、ＣＳＦ
発現プラスミドｐｃＤＭ−ｃｓＦｌｌ−ａｈｒｒの作製
の概略図を示す。

第１３図は、ＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷイオン交換高
速液体クロマトグラフィーによるＣＨＯ・Ｍ　−ＣＳ　
Ｆの溶出パターンを示す。

第１４図は、ＣＨＯ−Ｍ−ＣＳＦの等電点測定結果を示
すグラフである。

第１５〜２０図は、実施例３の■〜■に従う２シストロ
ン発現システムの各構造をそれぞれ示す。

第２１図は、ＴＳＫゲルケルＡＥ−５ＰＷイオン交換高
速液体クロマトグラフィーによるＭＣＳＦの溶出パター
ンを示す。

第２２図は、Ｍ−ＣＳＦ発現プラスミドｐｃＤＭ　φＣ
Ｓ　Ｆ　１１−ｄｈｆｒＲＯ，同ｐＳＶ２Ｓ−ＭＣＳ　
Ｆ　１１−ｄｈｆｒ及び同ｐＲ８ＶＳ−ＭＣＳＦ１１−
ｄｈｆｒのそれぞれの構造を示す。

（以　上） 第２−１図 ＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＡＣ
ＴＧＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡ　　ＧＧＧＧＡＧＴＡ
ＧＴ第２−２図 ＴＴＣＧＧτＧＡＧＧ　　ＡＧＣＣＣＧＣＡＣＧ　　Ａ
ＣＧＧＧＡＡＣＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴ
ＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＴ　ＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣ
ＣＣＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡ　ＣＣＡＧ
ＣＭＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＣτＡ　ＧＣＣＴＣＣＴＣＧ
Ｇ　　ＧＧＣＧＴＣτＣＧＧ　ＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ　
ＧＧＴＣＧＴＴＣＡＣ第２−５図 エバＣ７ＡもしヒＡＴＣＧＧＧＡＧＧＧＴＣハ　ＡＣハ
ＣＧＧハＧＧＡ　　ＣＧＴＧＴＡ、八ＣＴＡ　　ＣＴＣ
ＡＣＧＧＡＣＧ第２−４図 ＡＴＡＴＡＧＴＴＡＡ　ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＴ　ＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴ第３−２図 第３−１図 Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−τｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−５ｅ
ｒ−Ｍｅし−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−ＬｅＩＪ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−第４−
１図 ＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＧＧＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＡＣ
ＴＧＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡ　　もらＧＧＡＧＴＡ
Ｇ丁第４−２図 ＴＣＣＴＣＣτＣＧＴ　　ＧＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＴＣ
ＣＴＣＧＧＧＧ　　ＣＧＴＣＴＣＧｌｊＴＣＴ’ｌ’Ｕ
ＵＴ１．；Ｕ’Ａｕｕ第４−４図 ＡＡＣＣＧＡＴＴＡＴ　　ＣＡＴＡＴＡＧＴＴＡ　　Ａ
ＡＣＧＴＧＡＡＴＴ　　ＴＴＴＴＴ’！−１’ＴＴＴ　
　’Ｌ°’Ｌ”Ｋ’↓ＴＴ’Ｌ−に’に’Ｌ第４−３図 ＣＴ、ＡＡＴＴＣＴＧＴ　ＣＡＴＣＴＣＣＧＴＡ　ＧＣ
ＣＣＴＣＣＣＡＧ　ＴＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡ
ＴＴＧＡＧＡτＴＡＡＧＡＣＡ　ＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴ
　ＣＧＧＧＡＧにＧＴＣＭＣＡＣＧＧＡＧＧ　ＡＣＧＴ
ＧＴ品ＣＴ第５−１図 Ｌｅ＋ｑ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−Ｍｅし−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−Ｖａ上−ハ↓ａ−Ｇ工ｙ−Ｌｅｕ−’ｒｎｒ−
Ｔｒｐ−Ｇｆｕ−ＡＳｐ−第５−２図 第５−３図 ５ｅｔ−ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ａｒ９−ｔＪ上ｎ−Ｖａｆ−（ｊｆｕ−４，ｌ！
ｕ−に’ｒＯ−’／ａＱ−−−−−５ｅ　ｒ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓ　ｐ−Ｐ　ｒｏ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｐ　ｒｏ−Ｇｌ　ｙ−５ｅ　ｔ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ａｒ　ｇ　−Ｉ　ｌ　ｅ　−ＴＣＡ、ＴＣＡ、ＣＣ
Ｇ、ＣＧＣ，ＣＣＣ，ＣＡＧ、ＧＧＣ，ＣＴＣ，ＡＧＣ
，ＡＡＣ，ＣＣＣ，ＴＣＣ，ＡＣＣ，ＣＴＣ，ＴＣＴ。

Ｓ　ｅ　ｒ　−Ｓ　ｅ　ｒ　−Ｐ　ｒ　ｏ−Ａ　ｒ　ｑ
　−Ｐ　Ｉ：Ｏ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　Ｉ　Ｙ　−Ｌｅ　
ｕ　−Ｓｅ　ｒ　−Ａ　Ｓｎ　−Ｐ　ｒ　Ｏ−Ｓｅ　ｒ
　−Ｔｈ　ｒ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｓ　ｅ　ｒ　−ｒ’　
ｒ　Ｏ−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｇ　Ｉ　Ｙ　−Ｇ　１．　ｕ　
−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　ｒ　
ｑ　−Ａ　ｒ　９−　Ｓ　ｅ　ｒ　−Ｔ　ｈ　ｒ　−Ａ
　ｒ　９−　Ａ　Ｓ　ｐ−Ａ　ｒ　ｑ　−Ａ　ｒ　９−
第 図 第 ア 図 第１０図 第１１図 Ｇｌｙ−Ｓｅ　ｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉ　５−Ｌｅｕ−Ｇ　１
ｎ−９ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉ
　１ｅ−Ａｓｐ−５ｅ　ｒ−Ｇｌｎ　−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　
１ｕ−Ｔｈｒ−！ｌｉｅ　ｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ　１
　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｌ’＋ｅ−Ｇ　ｎｕ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇ　１　ｎ−Ｌｅ　ｕ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ　−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（ｌｅ−ＭｅセーＧ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｍｅ七−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ−Ｘ　１ｅ−Ａｌａ　−Ｘ　１ｅ−Ｖａ　１−Ｇｉｎ
−Ｌｅｕ−ＧＩ　ＩＩ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−４ｊｅ　ｒ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−５ｅ　ｒ−Ｃｙｓ−
Ｐｈｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙ　ｒ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ　−ＨＬｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ　−Ｃｙ
　ｓ　−Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｙ　
ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈ　ｒ　−Ｐ　ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ　−％’ａ　ｌ　
−Ｌｙ　５−Ａｓ　ｎ−Ｖａ　１−Ｐｈ　ｅ−Ａｓ　ｎ
−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙ　５−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓ　ｐ−ＬｙＳ　−Ａｓ　ｐ−Ｔ　ｒ　ｐ−Ａｓ
　ｎ　−１１ｅ−Ｐｈｅ−５ｅ　ｒ−Ｌｙｓ−Ａｓ　ｎ
−Ｃｙｓ−Ａｓ　ｎ−Ａｓ　ｎ−５ｅ　ｒ−Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ　−ｃｉｓ　−９ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＴｈｒＧｌｙ−６ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａ’ｉｐ−５ｅｒ−Ｇｌｎ
−ＭｅヒーＧｌｕ−Ｔｈｒ−５ｅ　ｒ−Ｃｙ　ｓ−Ｇ　
ｌｎ−Ｘ　ｌ　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｈ
　ｅ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ｇ　１ｎ−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｖａｌ　
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
Ｐｈ　ｅ−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ　−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−１１ｅ−ＭｅセーＧｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｍｅ
ｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−
Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−５
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｃｙ
ｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−八１ａ−Ｃｙ　５
−Ｖａｌ−Ａｒ　ｇ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙ　ｒ−Ｇ
　ｌ　ｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｙｓ　・−Ｖａｌ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−Ｔｒｐ−八５ｎ−Ｘｌｅ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−第１２−１図 第 図 カソードリ・５の距離（ｃｍ） 第 図 第 図 ＡＴＧ、ＧＣＪＬＣＣＴ＋ ＡＡＴ、ＧＴＣ−ＴＴＴ、ＡＡＴ、ＧＡＡ、ＡＣＡ、Ａ
ＡＧ、ＡＡＴ、ＣＴＣ，ＣＴＴ、ＧＡＣ−ＡＡＧ−ＧＡ
Ｃ，ＴＧＧ、ＡＡＴ−ＧＬｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
−Ｔ！′Ｉｒ　　辷ｅｒ　　セｅｒ間−Ｃ５Ｆ−＋１ Ｇｉｉ−Ａｓｐ−’７ａ上−Ｖａ上−ＴＩ’ｌｒ　　ｔ
ｅｒ　　ｔｅｒ邑−ＣＳＦ　−４ 第１９ 図 邑−１：’：Ｆ　−一吋− ＡＴＧ　＋ＧＣＡ　＋ＣＣＴ＋

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　下記式（１）の全アミノ酸配列又はその一部を欠損
   した部分アミノ酸配列をコードするヒトＭ−ＣＳＦ遺伝
   子を発現させて得られる、生物活性な組換え型ヒトＭ−
   ＣＳＦ。 式（１）： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 〔式中ＸはＴｙｒ又はＡｓｐを示す。〕 （２）下記理化学的性質を有する請求項（１）記載の組
   換え型ヒトＭ−ＣＳＦ。 イ、分子量： ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２−メルカプト エタノール存在下で約３８０００、非存在下で約７６０
   ００である。 ロ、等電点：ｐＨ４．５５である。 ハ、アミノ末端域のアミノ酸配列： Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−で
   ある。 （３）下記理化学的性質を有する請求項（１）記載の組
   換え型ヒトＭ−ＣＳＦ。 イ、分子量： ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２−メルカプト エタノール存在下で約２２０００及び約 ２７０００、非存在下で約４２０００及び ４６０００である。 ロ、等電点：ｐＨ３．５〜４．６である。 ハ、アミノ末端域のアミノ酸配列： Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−で
   ある。 （４）下記理化学的性質を有する請求項１記載の組換え
   型ヒトＭ−ＣＳＦ。 イ、分子量： ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２−メルカプト エタノール存在下で約１７０００、非存在下で約３００
   ００である。 ロ、等電点：ｐＨ４．８である。 ハ、アミノ末端域のアミノ酸配列： （Ｍｅｔ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−〔但し
   （Ｍｅｔ）は欠失されている場合を含む〕である。 （５）請求項（１）記載のヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子を含み
   、生物活性なヒトＭ−ＣＳＦを発現可能な発現プラスミ
   ドを保有する形質転換体を培養し、生産されるヒトＭ−
   ＣＳＦを採取する組換え型ヒトＭ−ＣＳＦの製造方法。 （６）形質転換体がＣＨＯ細胞を宿主とするものである
   請求項（５）記載の方法。 （７）形質転換体がＣＯＳ細胞を宿主とするものである
   請求項（５）記載の方法。 （８）形質転換体が大腸菌を宿主とするものである請求
   項（５）記載の方法。 （９）ヒトＭ−ＣＳＦの発現が２・シストロン法による
   ものである請求項（８）記載の方法。