JPH02242680A - 耐熱性グルコースイソメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はグルコースをフルクトースへ変換するＩ；めの
方法に関する。さらに詳しくは、本発明は高温で安定で
かつ好熱性の微生物によって生産される新種のグルコー
スイソメラーゼの使用方法に関する。

発明の背景 フルクトースは、一般によく用いられかつ容易に入手で
きる砂糖より甘いことが知られる最も甘い糖の１つであ
る。さらに望ましいフルクトースに変換するためのベー
スとして余り甘くなく、余り高価でない糖グルコースを
用いることが昔から知られている。

従来、一般に用いたある方法はアルカリ性触媒を用いる
ことによってグルコースをフルクトースに変換するもの
である。しかしながら、この種の異性化には多くの欠点
を伴う。アルカリ性触媒はあまり選択的でないため、着
色体のような望ましくない副生産物がフルクトースと同
時に生産され、必要としない生産物を除去するｔ；めに
必要なシロップの精製にはコストが高くかつ難しい処理
が含まれる。

現在、より好ましい異性化法として、グルコースイソメ
ラーゼ活性を有する酵素を用いてのグルコースからフル
クトースへの変換がある。

グルコースからフルクトースへの酵素変換方法の広範な
記載はハミルトン（ＨａｍｉｌＬｏｎ）ら、［グルコー
スイソメラーゼ、酵素−触媒処理技術の事例研究」、食
品中の固定化酵素および微生物処理（Ｉｍｍｏｂｉｌｉ
ｚｅｄ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ｉｎ　　Ｆｏｏｄ　　ａ
ｎｄ　　ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｃｅｓｓｅｓ）　Ｈ
オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら、ブレニューム・プレス（Ｐ
ｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州（Ｎｅ
ｗｙｏｒｋ）、（１９７４）、９４〜１０６ページ、１
１２．１１５〜１３７：アントリム（Ａｎｔｒｉｍ）ら
、「高フルクトースシロップのグルコースイソメラーゼ
による製造」、Ｖｏｌ、２、アカデミツク・プレス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＸ　ｌ　９７４　）；チェ
ン（Ｃｈｅｎ）ら、「グルコースイソメラーゼ（論評）
」、プロセス・バイオケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、（１９８０）、３６〜４１ページ
；ノーダールー、Ｚイ（Ｎｏｒｄａｈｌ、、Ａ、）ら、
「固定化グルコースイソメラーゼによるグルコースから
のフルクトースの製造」、ケミカル・アブストラクツ（
Ｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）、Ｖｏｌ、８２、（１
９７５）、アブストラクトＮｏ、１１０３１６ｈ；およ
びタカサキ（Ｔａｋａｓａｋｉ）、ｒグルコースイソメ
ラーゼによるフルクトース製造」、ケミカル・アブスト
ラクツ、Ｖｏｌ、８　Ｌ（１９７４）、アブストラクト
Ｎｏ、７６４７ａにおいて見られる。

異性化反応から得られるフルクトースの量は反応の平衡
に依存する。５０℃以上、好ましくは６０℃以上の温度
で反応を行うと、フルクトースの収率は大幅に改善でき
る。しかしながら、高収率のフルクトースの製造に有利
である高温はグルコースイソメラーゼを変性させる不適
当な作用を有するため、酵素の安定性および活性を減少
させる。

したがって、グルコースをフルクトースに変換するため
のグルコースイソメラーゼの使用をその最大限のポテン
シャルにまで利用するため、高い熱変性抵抗を有するタ
イプの酵素が必要である。

多くの微生物は公知のグルコース異性化酵素の生産者で
ある。これらの微生物のほとんどは中温菌、すなわち、
それらは略１８〜４５℃の好ましい増殖温度を有し、通
常、それらのグルコースイソメラーゼに機能するための
最適温度は相対的に低い。米国特許第４，３０８．３４
９号は、４５〜８５℃の温度で機能するが異性化反応の
ための好ましい温度が５０℃である酵素を生産するため
のアンプラリエラ（Ａｍｐｕ　Ｉ　ｊａｒ　ｉｅ　Ｉ　
ｌａ）属の使用について記載している。最適には５０℃
で活性であるが、７０℃でも幾らか活性を保つグルコー
スイソメラーゼを得るため、バチルス・リケニホルミス
（Ｂａｃｉ−Ｉｌｕｓ　１ｉｃｅｈｎｉｆｏｒ＋ｌ１ｉ
ｓ）（ＡＴＣＣ３１６０４、米国特許第４．３４８，４
８０号およびＡＴＣＣ３１６６７、米国特許環４．３５
５，１０３号）の少なくとも２つの菌株が報告されてい
る。フラボバクテリウム争アルボレセンス（Ｆｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）ｆｌ生
物のグルコースイソメラーゼも、約９０℃の温度で機能
するが、その好ましい温度域は６０〜７５℃であること
が公知である。

好熱性微生物、すなわち、通常５０℃またはそれ以上の
温度で増殖する微生物はさらに熱的に安定なグルコース
イソメラーゼを生産することが期待され、事実、多くの
このような微生物について報告がなされてきた。特開昭
４９−３０５８８号公報は、一般にそのすべてが少なく
とも５０〜６０℃の温度で増殖するサーモアクチノミセ
ス（Ｔｈｅｒｍｏａｅｔ　ｉｎｏｍｙｃｅｓ）属および
ブセウドノ力ルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ
）属からの一連の好熱性アクチノミセテス（ａｃｔ　ｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の使用について開示している。こ
れらの微生物により生産されたグルコースイソメラーゼ
が、１００℃で実質的な活性を保持しながら機能するこ
とついて報告されている。

バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈＮｕｓ）（米国特許環３
．８２６．７１４号）は通常５５℃で増殖し、８０℃ま
での温度で活性なグルコースイソメラーゼを生産する。

バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇ
ｕｌａｎｓ）（米国特許環３．９７９，２６１号）は最
適には６０〜６５℃で増殖し、そのグルコースイソメラ
ーゼは実質的な活性の損失なしに５５〜８５℃から使用
できる。

発明の開示 本発明により、いずれの前記酵素にも優る耐熱性を有し
、９０℃以上の温度で機能できる新種のグルコースイソ
メラーゼが発見された。このような酵素を生じる微生物
は種々の生態系から分離されてきた。このような領域と
しては、実質的に好気性で酸化的な代謝径路によって有
機物質が分解される独自の生態系が挙げられ、好熱性微
生物の作用により、時には８０℃の温度までの実質的な
熱を発生する。しかしながら、この時点まではグルコー
スイソメラーゼを生産する微生物は産地から全く報告さ
れたことがなかった。

本発明の微生物は、６０〜７０℃で容易に増殖し、その
自然状態でのグルコースイソメラーゼは少なくとも９０
〜１０５℃の温度で機能する。

本発明は少なくとも９３℃、好ましくは９４℃以上の温
度で２０分の半減期（Ｔ２０）を有することを特徴とす
るグルコースからフルクトースへの異性化が可能な酵素
を提供するものである。本発明は、また、少なくとも９
３℃の温度で２０分の半減期（Ｔ２０）を有し、不溶性
担体上に固定化されることを特徴とするグルコースから
フルクトースへの異性化が可能でかつバチルス（Ｂａａ
　ｉ　Ｉ　１ｕｓ）属の１種から分離できる酵素を提供
するものである。

他の具体例において、本発明は２０〜約６４１ｉ量％の
グルコースを含有するグルコース含有の供給液を、温度
約９０℃−１３０°ｃ１ｐＨ約３．５〜約８および接触
時間約ｌＯ秒〜約５時間でグリコースイソメラーゼに接
触させて該液体中に存在する少なくとも約５３〜６０重
量％のグルコースを実質的にプシコースを形成せずにフ
ルクトースに変換することからなり、少なくとも９３℃
の温度で２０分の半減期を有するグルコースイソメラー
ゼを用いることを特徴とするグルコースをフルクトース
に異性化するための方法を提供するものである。

さらに他の具体例において、本発明は少なくとも９３℃
で２０分の半減期（ＴＩ。）を有することを特徴とする
グルコースからイソメラーゼへの異性化が可能な酵素を
提供するものである。

以下、添付図面を参照して本発明をさらに具体的に説明
する。

図面の簡単な説明 第１図は米国特許環３．７８８．９４５号の異性化され
たグルコースイソメラーゼの安定性に対する温度の効果
を示すアレニウス・ダイヤグラムである。

第２図は第１図のデータに基き％ＬＴに対して温度をプ
ロットしたグラフである。

第３図は第２図のデータに基き、 （Ｉ　Ｔ／　Ｉ　ａＪ（Ｋ　＋ｓ＊／　Ｋ　ｌ？）に対
して温度をプロットしたグラフであり、温度と半減期の
関係を示す。

第４図（ａ）〜（ｅ）は本発明の微生物が発見された種
々の産地の地図である。

発明の詳細 な説明は高温でのグルコースからイソメラーゼへの変換
に有用な耐熱性のグルコースイソメラーゼを提供するも
のである。

前述のように、グルコースイソメラーゼによるグルコー
スの異性化により達成できるフルクトースのレベルは平
衡反応により限定される。６５℃では、反応の平衡は純
粋のデキストロースの出発物質から得た約５１重量％の
フルクトースである。

基質として精製したグルコース液（約６重量％までの単
糖類を含有）を用いて酵素反応容器内で適当な滞留時間
保持すると、約５０％フルクトースシロップ（乾量基準
）が前記方法により得ることができる最高フルクトース
量である。より高いフルクトース量のシロップを得るた
めには、分画系を用いなければならず、それは最終製品
のコストっを非常に増大させる。しかしながら、より高
温では、平衡がさらに有利になる。例えば、約９０〜１
３０℃の温度で操作できる酵素グルコースイソメラーゼ
処理を用い、乾量基準で５３〜６０重量％のフルクトー
スを含有する高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣ５
）を直接得ることができ、それにより、分画およびリサ
イクルの必要性が除去される。しかしながら、活性の著
しい減少を伴う熱変性を受ける公知のグルコースイソメ
ラーゼ系の傾向は、さらに高温の状態を利用してさらに
異性化の平衡をフルクトースの有利になるようにさせる
試みを非常に妨害する。

米国特許第４．４１０，６２７号、第４．４１１゜９９
６号および第４．５６７．１４２号は、特に、反応条件
の注意深い制御および酵素の化学的安定化によって約６
５重量％までのフルクトースを含有する製品を得ること
ができることを教示している。

達成できるグルコースからフルクトースへの最高変換率
は、グルコースおよびフルクトースの間の熱力学的平衡
により支配され、次に異性化が行なわれる温度に依存す
る。グルコースおよびフルクトースの平衡混合物の非常
に注意深い分析によって以下の関係が設定された。

Ｆ、−１００に／（Ｋ＋　１）　　　　　・・・（１）
ＩｎＫ−−７５５／（Ｔ＋２７３）＋２．３００５・・
・（２） ［式中、Ｆ、はグルコースおよびフルクトースの全量に
対する平衡時でのフルクトース％、Ｔは異性化が行なわ
れる温度（℃）、Ｋはグルコース中フルクトース平衡定
数であるｊ 一般に、反応容器中のグルコース含有シロップとイソメ
ラーゼの実際の接触時間は、固定化された形態のイソメ
ラーゼを含有する反応容器を用いる場合、以下の式を参
照して計算できる。

ｔ、＝（ＣＶ／ｋＡ］ｎ（（Ｆ　、　−Ｆ　、ＸＦ　、
　−Ｆ））・・・（３） ［式中、（、：実際の接触時間 Ｃニゲルコースおよびフルクトースの濃度Ｖ：反応容器
中の流体の自由体積（反応容器の体積−固定化酵素粒子
により占有さ れた体積 Ｆ、：異性化温度における平衡時でのグルコース＋フル
クトース混合物中のフル クトース分画 Ｆ、二反応容器入口でのフルクトース分画（Ｇ十Ｆに対
する） Ｆ：反応容器内に存在する溶液中のフルクトース分画（
Ｇ＋Ｆに対する） ｋ：異性化条件での異性化反応速度 Ａ：反応容器中でのイソメラーゼの活性である〕 固定化イソメラーゼのに値は９０〜１４０℃の温度で約
０．０７〜５ｇｈｒ−’である。この関係により、単位
体積当たりの高活性の充填ベツド（ｂｅｄ）を用いて高
温での接触時間を最小にする必要があることが示される
。

しかしながら、商業的実際面においては、フルクトース
含有シロップは純粋のグルコースから製造されない。む
しろ、グルツース源としてデンプン氷解物（前記引例で
調製された）が用いられ、これらの不変物はデンプンの
不完全な加水分解およびグルコースの復帰から得られた
非グルコースおよび非グルコ−ス糖（約５までのり、Ｐ
、を有するオリゴ糖として後述する）を含有する。典型
的に、これらはデンプン加水分解により得られる３％〜
８％の全乾燥重量を有する糖から構成される。

したがって、異性化が行なわれる温度で計算する場合、
グルコース液中に含有される任意のオリゴ糖並びに達成
される乾量基準の全フルクトース量、プシコースおよび
他の非グルコースの形成、およびグルコース液とイソメ
ラーゼの効果的な接触時間中での非フルクトース生産物
を考慮する必要がある。異性化温度の計算のための関係
式を以下に示す。

Ｔ−７５５／（２，３００５−＋口Ｋ）−２７３・・・
（４） Ｋ−Ｆ、／（１００−Ｆ、）　　　　　　　・・・（５
）Ｆ、−１０，０００（Ｍ＋Ｃ）／（ｌ　０ＯＱ−ＰＱ
）・・・（６） ［式中、Ｔ：異性化温度（”Ｏ） Ｆ、：温度Ｔでの平衡フルクトース量（全グルコース＋
フルクトース％に対し） Ｍ：異性化された生産物中で必要なフルクトース％（乾
量基準） Ｃ：効果的な接触時間の間に形成されたプシコース＋他
の減成生産物％ Ｑ；異性化反応中に得られた平衡％ Ｐニゲルコース液のオリゴ糖％１ 典型的に、１％以下、好ましくは屹５％のプシコースお
よび他の減成生産物が形成され、９９゜５％の平衡が達
成できた。したがって、５５．０％のフルクトース（乾
量基準）を有するシロップを調製するため、後記のオリ
ゴ糖量を有するグルコース液に対して以下の異性化温度
が必要である。

グルコース液中の　　　　　異性化温度オリゴ糖（乾量
基準％）　　　　　　（’Ｃ）０　　　　　　　　　　
９５．７ １　　　　　　　　　　９９．１ ２　　　　　　　　　１０４．３ ３　　　　　　　　　１０８．９ ４　　　　　　　　　１１３．８ ６　　　　　　　　　１２４．３ ８　　　　　　　　　１３６．１ 得られた製品は平均で５５．０％フルクトース（乾量基
準）を含有する。これは、このフルクトース・レベルで
は、高フルクトース会コーンシロツ７’（ＨＦＣ５）は
乾量基準での重量のスクロースと同じレベルを達成する
からである。さらに、５５％フルクトース量のＨＦＣ５
が製品として確立され、それは多くの食品および特に炭
酸飲料において、すべてまたは部分的にスクロースに取
って替わるべ（交換可能に用いられる。ＨＦＣ５を食品
に加え、供給し、計量提供し、配合するのに固有の複雑
さのため、異なった供給源からの製品は交換可能でかつ
同時に使用できるような各ＨＦＣ５メーカーからの製品
の均一性に対する万国共通の要求がある。したがって、
５５〜５６％乾量基準のフルクトース・レベルにより、
ＨＦＣ５メーカーと提携した技術における目標レベルと
して特別の意義が達成された。

前述のように、種々のパラメータが異性化処理を改良す
るための目標であるが、酵素自体に関しては処理改良の
ための主な焦点、特に耐熱性は変わらない。第１図は、
通常異性化で用いられる条件下、すなわち、最適ｐＨ（
６，５〜７．５）、グルコース＋フルクトース濃度５０
％、２１ＩＩＭＭｇ−および２〜３　ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｈ
Ｓ　Ｏ３、グルコースイソメラーゼ（米国特許環３，７
８８．９４５号の教示によるＤＥＡＥ上で固定化された
ストレプトミセス・ルビギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ））の安定性に及ぼす
温度の効果を示すアレニウス・プロットを示す。これら
の安定性のデータは固定化された形態での典型的な先行
技術のグルコースイソメラーゼである。該プロットは半
減期と温度の関係を示し、異なった温度範囲では２つの
異なった不活性化処理が重要であることを示している。

約８０℃以下では、はとんど完全に不活性化は、温度が
１０℃上昇する毎に４倍の加速度（例えば、Ｑ２０＝４
）を示す化学処理の温度依存特性を有する化学減成反応
による。約８０℃〜９５℃の範囲は、約９５℃以上では
不活性化速度が温度によって異常に加速され、Ｑ　＋ｃ
が１８００の著しく高い値に達するような異なった不活
性化処理が行なわれる領域へのトランジシヨンを示す。

一般に、熱変性の活性化エネルギー（Ｅ本）は約９０〜
３００ｋｃａ１１モルである。この領域では、温度が１
’０上昇すするだけで不活性化速度が２倍以上になる。

通常、温度に関するこのような挙動は酵素において見ら
れ、それは熱効果によって活性立体配座が失われる変性
や物理的処理を受ける酵素（タンパク質）の傾向による
と考えられる。

グルコースイソメラーを用いてグルコースをフルクトー
スへ変換することができる効率はイソメラーゼ半減期に
正比例するため（不活性速度に反比例する）、温度はこ
の目的のためのグルコースイソメラーゼの有用性におい
て最も重要であると認められる。このため、本発明は、
通常用いる固定化イソメラーゼ反応容器内での微生物汚
染を回避するのに可能な最低温度でのイソメラーゼの使
用に重点を置く傾向にある。したがって、異性化は１０
００〜２０００時間のイソメラーゼ半減期が観察される
５５〜６０℃で一般に行なわれる。

これに対し、第１図に示す先行技術のイソメラーゼの半
減期は９５℃で２９分にすぎず、１００℃では僅か１分
である。したがって、異性化処理では熱変性が最も有力
な因子となる温度を回避すべきであり、さらに、熱変性
範囲での僅かな温度上昇でも半減期および酵素の効率に
は非常に臨界的であることは明らかである。

府述のように、米国特許第４．４１０．６２７号、第４
．４１１，９９６号および第４．５６７．１４２号はダ
イレクトな異性化処理による５５％フルクトースを得る
ためのグルコースの高温異性化に対する最小基準につい
て開示している。それらには、５５％フルクトース（乾
量基準）を有するシロップ組成物を得るための重要性に
ついて議論されている。グルコース／フルクトースの熱
力学的平衡に及ぼす温度の影響のため、純粋のグルコー
スから出発して平衡点まで反応を行なうことにより５５
％の変換を達成するために８７℃の最小温度を使用しな
ければならない。平衡は理論上でのみアプローチされ、
純粋なグルコースはこのような反応に対する出発材料と
しては非実用的であるため、前記特許に記載のように、
ダイレクトな異性化による５５％フルクトースを達成す
るｔ；めの最小温度は約９０℃であり、好ましくは約ｌ
ＯＯ℃である。５５％以上のフルクトースのためのグル
コースイソメラーゼの有用性の決定において、種々の異
性化技術および／または化学的修飾が、イソメラーゼの
能力を増大でき、変性が酵素不活性化の最も有力なメカ
ニズムとなる臨界温度範囲を数℃高い温度に引き上げる
ような熱変性に抵抗することを認めるべきである。熱変
性に抵抗するという酵素の傾向の測定基準として’Ｔ！
＠Ｊコンベンション（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）を採用し
た。Ｔｔｏとは、２０分の半減期が観察される温度（℃
）を表す。グルコースイソメラーゼのＴ２０の決定方法
を以下に示す。以下に開示のストレプトミセス・ルビギ
ノサス（Ｓ。

ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）Ｃ−３イソメラーゼのＴｗｏ
は８９゜７℃である。ＤＥＡＥ−セルロース上で固定化
した後、Ｔ２０は９６℃に増大する。熱変性に対する酵
素の抵抗を増大させるための他の対策は米国特詐第４，
４１１．９９６号および第４．５６７．１４２号で議論
されている。このような酵素を安定化する方法は、Ｔ２
０の効果の点から教示される安定化の程度に関して限定
されるということを認識することが重要である。したが
って、前記のようにＴ２０が僅か１℃増大しても半減期
が２倍になるため、実質的により耐熱性があって数’０
（Ｔ２０に関して）でも開始する（その第１１第２およ
び第３のタンパク質構造により）グルコースイソメラー
ゼは、９０℃およびそれ以上での操作のための高温異性
化反応を構成するために、実質的な安定性の低い酵素に
関して多大な利点を有する。第１表は先行技術のグルコ
ースイソメラーゼの耐熱性を示す。これらのうち、最も
耐熱性の低いものはＴ２０が僅か８４．２℃である。最
も広範に使用されるグルコースイソメラーゼ（ストレプ
トミセス（ＳＬｒｅ−ｐｔｍｙｃｅｓ）種、バチルスコ
アグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、
アルトロバクター（ＡｒＬｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種およ
びアクチノプラネス・ミッソウリエンシス（Ａｃｔｉｎ
ｏｐｌａｎｅｓ　ｍ１ｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）からの
）は狭い範囲の値（８９，３〜９１．７℃）のＴ２０を
示す。先行技術からの最も耐熱性のあるイソメラーゼは
９２．８℃のＴ２０を有するアンプラリエラ（Ａｍｐｕ
ｌｌａｒｉｅｒａ）種からのイソメラーゼである。

好熱性のバチルス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　１ｕｓ）種からの
幾つかのグルコースイソメラーゼは前に開示したいずれ
の先行技術のイソメラーゼより大きい耐熱性を有するこ
とが判明した。これは、多種多様の微生物源（チェン（
Ｃｈｅｎ）、Ｗ　　Ｐ　ｓ　プロセス・バイオケミスト
リー（Ｐｒｏｃ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１月／６月、１９
８０．３０〜４１ページ参照）から示されたいままでの
多数のグルコースイソメラーゼを考慮すると非常に驚く
べきことである。例えば、見積もってみても６０個もの
グルコースイソメラーゼがいままで発見された。バチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）源から得られたイソメラーゼの
中には後記第１＋表に示す３つの先行技術の酵素がある
。これらの内の２つは非常に耐熱性がある酵素として記
載された（米国特許第３．８２６．７１４号および英国
特許第１，４５７．１７７号参照）。ここに示されるよ
うに、これらの酵素は定義的なＴ２０基準によって測定
された耐熱性を通常示すのみであり、事実、それらは本
発明のイソメラーゼより耐熱性が低い。

前述のように、酵素の活性化速度に及ぼす温度の効果は
熱変性が有力な温度範囲で非常に大きい。

変性の活性化エネルギー１００〜３００キロカロリー１
モルはここで研究したグルコースイソメラーゼの標準で
ある。一方、異性化速度に及ぼす温度の効果は化学反応
に見られる通常のパターンにしたがい、最も典を的には
グルコースイソメラーゼ触媒反応に対して１３キロ力ロ
リー１モルである。変性速度の温度に対する極端な感受
性（触媒作用速度の相対不感性に対立するものとして）
を、温度目盛り上で耐熱性をランク付けるためのベース
として用いた。

系は、一般にグルコースイソメラーゼに対して有効な以
下の反応速度論に基く。

ｄｉ／ｄＴ−ｋＥ（１，−ｔ）／ｃ　　　　　・・・（
７）ｄＥ／ｄＴ＝　−０，６９３Ｅ／ｌａｕ　　　・”
（８）［式中、■＝異性化度（グルコースイソメラーゼ
に対するフルクトースのモル分画） 夏、：平衡時の１ に：異性化に対する反応速度定数 Ｅ：イソメラーゼの濃度 Ｃニゲルコース＋フルクトースの全濃度ｔａｕ　：イソ
メラーゼ半減機 ｄ　Ｉ　／ｄｔ：異性化速度 ｄＥ／ｄｔ：イソメラーゼ不活性化速度１式（７）およ
び（８）を組み合わせて積分すると、以下の式が得られ
る。

Ｌｔ　　＝（ｋｔＥ、　ｔ／ＣＸ（１０，５”）／（０
，６９３ｎ））・・・（９） １式中、Ｌｔ＝Ｉｎ（Ｉ　、／（１、−Ｉ　Ｊ）・・・
（１０） ＬＴ−式（１０）により定義される温度Ｔの活性関数 Ｅ、：加熱時の初期の酵素濃度 【：加熱時間 ｎ畠ｔ／１ａｕｌ 第２図は、加熱時間が４０分である第１図に示すデータ
に基＜Ｌｔと温度の関係のプロットを示す。臨界温度範
囲に達するまで温度が増加するにつれて異性化は増大し
、その後、イソメラーゼ変性が優勢になり、異性化速度
は僅か５℃の範囲で零近くに減少する。変性が優勢であ
る臨界範囲以下の温度では（例えば、第２図中の約９０
℃以下）では、式（９）中の二重括弧内は１（ｔａｕｔ
）に等しい。したがって、基準温度は、 Ｌえ−ｋｌＥ、ｔ／Ｃ・・・（１１） のような臨界範囲以下で選択される。

式（９）を式（１１）で除すると以下の式が得られる。

Ａ、−Ｌ７にヨ／ＣＬ＊　ｋア） −（（１−０，５°）／（０，６９３ｎ））・（１２）
［式中、Ａ、：相対活性］ 以上より、Ａ、が加熱時間りおよび酵素半減期のみの関
数であることが示される。

したがって、臨界温度範囲内のＡ、と温度の関係のプロ
ット（例えば、第２図における約９５〜約１００°０）
により、温度と半減期の関係が得られる。第２図のデー
タに対して、Ｌ−４０分、Ｅ。

”０．５１　Ｇ　Ｉ　Ｕ／ｍｌ、ｉｅ□０．５６５、Ｃ
−０，２ｇ／ｍｌとした場合の倒を第３図に示す。

ｎ　−２（Ｌａｕ＝　２０分）の場合の温度はプロット
を内挿することによって得られ、その値はＴ２０の旺価
として用いた。

特に、ここで議論したイソメラーゼのＴ２０の決定方法
は以上のとおりである。

■、緩衝溶液およびグルコース溶液を蒸留水中で以下の
ように調製する。

緩衝溶液：　マレイン酸ナトリウム緩衝液２５ｍＭ、、
Ｍｇ５Ｏ＊　　ｌ　ＯｍＭ、ｐＨ６，５に調整する。

グルコース基質溶液：　グルコース（試薬）４００ｇ／
Ｌ、マレイン酸ナトリウム緩衝液２５ｍＭ、Ｍｇ５Ｏａ
　　ｌ　Ｏ＋ａＭ、特定濃度の安定化剤（例えば、Ｆｅ
″＋、Ｍｎ”＋またはｃｏ＋＋）、ｐＨ６，５に調整す
る。

２．２ｇの収穫した湿潤セルケーキ（ｃｅｌｌ　ｃａｋ
ｅ）を２ｍｌの緩衝液中に懸濁させ、ブランソン（Ｂｒ
ａｎｓ−ｏｎ）ソニケーター（Ｗ−３５０）を用いて１
５秒バースト（ｂｕｒｓｔ）で合計７５秒間、音波処理
する。

音波処理した細胞を遠心分離し、１．２ミクロンのゲル
マン（Ｇｅｌｍａｎ）フィルター（アクロディスク（Ａ
ｃｒｏｄｉｓｃ）Ｃａｔ、Ｎｏ、　４１９０）で濾過す
る。

３、ロイド（Ｌｌｏｙｅｄ）ら、［シリアル・ケミスト
リー（Ｃｅｒｅａｌ　ＣｈｅＩｌｌ、）、４９．５４４
〜５５４（１９７２）１に記載された方法により、細胞
抽出物中のグルコースイソメラーゼ活性を検定し、１．
０〜１．５１ＧＩＵ／■ｌの濃度に調整する。

４．１００μｌの薄肉毛管ガラスミクロピペット（ＶＷ
ＲＣａｔ、＃５３４３２−９２１）をクロム酸溶液で洗
浄し、脱イオン水で洗浄し、乾燥して底端を封かんした
。

５、調整したグルコースイソメラーゼ溶液を約１℃に急
冷し、等量のグルコース溶液と混合しく１℃で）１００
μ監の毛管ミクロピペットに小分けし、次いで、その頂
端を封かんしく１’Ｏ）、加熱浴中、所定の温度で４０
分間インキュベートする。該加熱浴は±Ｏ，ｌ”Ｏで温
度を保持できる。酵素の臨界温度範囲以上でピＣ間隔で
加熱浴の温度を設定する（例えば、第３図中では、これ
は９３〜１００℃である）。所望により、ある浴をＴ２
０の約１０℃以下の温度に設定する。

６、緩衝液をグルコース溶液と１＝１の割合で混合し、
毛管ミクロピペットに封かんし、酵素サンプルのように
同じ加熱浴中で４０分間インキュベートしてブランクを
調製する。

７、該ミクロピペットを０℃の塩−氷浴中に浸漬するこ
とにより反応を停止させる。ついで、ミクロピペットを
解放し、各ミクロピペットからの６５μｌにＩＮ　ＭＣ
Ｉを２μ！添加し、ＨＰＬＣによってグルコースおよび
フルクトース濃度を検定するまでイソメラーゼ量を安定
化させる。

異性化度（１７）を各温度で計算する。

Ｉｔ−Ｆ／（Ｆ＋Ｇ）　　　　　　　・・・（１３）１
式中、Ｆ：サンプル中のフルクトース％−ブランク中の
フルクトース％、Ｇ：サンプル中のグルコース％］ 各温度での活性機能を計算する（Ｌｔ）。

Ｌｔ−ｉｎ（［−／（Ｉｍ−ｔｔ））　　　　−（ｔ　
４）【式中、１．−に／（Ｋ＋１）　　　　　　・・・
（１５）１ｎＫ　＝　−７５５／　（Ｔ　＋２７３）＋
２．３００５・・・（１６） Ｔ：温度（’Ｏ）］ 各試験温度での相対活性（Ａ、）を計算する。

Ａ　、　−（ｔ　ｖ／　Ｌ　＊Ｘｋ＊／ｋｙ）　　　　
　・・・（１７）式中、Ｌ７：温度Ｔでの活性機能 Ｌｔ：ａ度Ｒでの活性機能 に、：照合温度Ｒでの異性化速度定数 ｋＴ：試験温度Ｔでの異性化速度定数］以下の式を用い
て異性化速度定数を計算する。

ＩｎＫ　＝　−６６５４／（Ｔ　＋２７３）＋１５．９
５７−（１８）第３図に示すように、相対活性を温度と
ともにプロットし、Ａ、−０，５４１１（ｎ−２）の座
標から内挿してＴ８．を求めた。

本発明を実施するために有用な菌株 ここに記載の新規特性を有するグルコースイソメラーゼ
を生産する細菌の菌株は、至る所にはないが、確かに全
世界的なものである。その微生物はテキサス、モンタナ
、カリフォルニア、ペンシルバニア、プエルトリコ等の
種々の産地から回収できる。ある種の土壌状態の存在に
より、ある程度までこれらの微生物の存在を予知される
。これらの細菌の増殖のための好適な土壌特性として、
高湿度、約５．５〜８のｐＨおよび高い表面温度が挙げ
られ、また低含量の酵素不活性化有機物および低含量の
カルシウムが重要である。第１１１表は微生物が発見さ
れた産地のタイプの表を示す。当業者はここに記載の産
地を考慮して細菌の他のポテンシャル源を容易に確認で
きよう。

一且、収集すると、土壌サンプルは耐熱性のグルコース
イソメラーゼ生産微生物の存在下、以下のプロトコルに
従ってふるい分ける。

キシロース ０．５％（オートクレーブ減 菌を単独に行った） コーン浸漬液 （４８％固体） ペプトン ａＣ１ 酵母抽出物 Ｍｇ５Ｏ，’７Ｈ，０ ＣｏＣ１゜ 寒天 に、ＨＰＯ。

ＫＨ，ＰＯ。

ｐＨ １次スクリーニング 固体サンプル ０．５％ ０．２％ ０．１％ ０．０２４％ ０．００２４％ ２．５％ １．１％ ０．６％ ６．８％ １％ 大きいキシロース寒天プレートを土壌懸濁液で接種し、
５５℃で１６時間インキュベートした。

単一コロニーを採取してペトリ皿（１００ｘ１５ｍｍ）
上に画線し、５５℃で１６時間インキュベートした。こ
れらの画線から発育する単一コロニーは純粋であること
が判明した。

↓ １次スクリーニングおよび維持のために純粋の分離物を
キシロース寒天斜面上で接種した。

２次スクリーニング 該斜面上の分離物をキシロース寒天ペトリ皿上で画線し
、５５℃で１６時間インキュベートした。

↓ １．５ｎ＋１のマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）を含
む試験管中に各分離物からの増殖物を削り落とし、１０
秒間音波処理した。ついで、前記の４０％グルコース基
質溶液を１．５＋１１添加し、混合して試験管を９８℃
で１時間インキュベートした。

過膜を用いて濾過した。

インキュベーション後、ｌＮＨＣｌを１００μｍ添加す
ることにより試験管内の異性化反応を停止させ、サンプ
ルのフルクトースを検定した。

↓ フルクトースの検定はテクニコン（Ｔｅｃｈｎ　１ｃｏ
ｎ）自動分析器を用いて行った。フルクトースをシステ
ィン−カルバゾール硫酸試薬と反応させ、比色計および
記録計を用いて比色反応を測定した（ロイド（Ｌｌｏｙ
ｄ）、エヌ・イー（Ｎ、Ｅ、）ら、シリアル・ケミスト
リー（Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ、）、４９．５４４−５
５４（１９７２））。

３次スクリーニング ２次スクリーニングで得られた最良の分離物をキシロー
ス寒天ベトツユ上で画線し、５５℃で１６時間インキュ
ベートした。

↓ 増殖物を２ｍｌのマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）中
に削り落とし、４５秒間音波旭環上く１５秒バースト）
、遠心分離し、ついで１．２ミクロンの線番 かくして得られた細胞抽出物のフルクトースについて、
テクニコン法を用いてグルコースイソメラーゼ活性を検
定した。

■ 分離されｔニゲルコースイソメラーゼを前記の毛管ミク
ロピペットにより評価した。９８℃で４０分間インキュ
ベートした後、酸により反応を停止させ、ＨＰＬＣによ
りグルコース−フルクトース含量を検定した。

サンプルをＨＰＬＣ中に自動的に注入し、移動相として
アセトニトリル／水（８０／２０）を用い、炭水化物カ
ラム（＃８４０３８、ウォーター・アソシエーシ町ン社
（Ｗａｔｅｒ　Ａｓ５ｏｃ、　Ｉｎｃ、）製）により３
０℃で糖を分離した。

検出器としてウォーターズＲ−４０１型の示差屈折計を
用い、プリンター／プロッターとしてＭ−３７０型のデ
ータ・モジュールを用いた。結果をブランク（酵素なし
）と比較し、活性を示す分離物をさらに評価した。１４
．０００以上の分離物について研究を行い、選択した培
地を前記のＴ２０試験で評価すると、その多くが任意の
先行技術のイソメラーゼを越えるＴ２０値を示した（第
Ｖ表参照）。

９３°０を越えるＴ２０値を有する酵素は本発明に有用
である。特に有用なものは、少なくとも９３’ｃ（また
は９４℃）〜約１２５℃の酵素である。また、特に有用
なものは、約９４℃〜約１１５℃の酵素である。

以下の表は、本発明の多くの好熱性分離物の適切な分類
特性の概要を示すものであり、それにより、それらがバ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属であることが示される。

＋ ＋ 種 ｑコ ｑコ ＋　＋ 今を ｑコ　（％Ｊ 本発明の微生物はキシロース／コーン浸漬液培地中で増
殖される。グルコースイソメラーゼの生産のため、該培
地中にはキシロースが存在しなければならない。また、
微生物の増殖を促進させるため、培地にマグネシウムを
添加することが好ましい。微生物は約２４℃〜７０℃の
温度で増殖することができるが、最適な増殖は５０℃〜
６２℃で生じる。このような条件下でのグルコースイソ
メラーゼの収率は約０．５〜ｌ−６１ＧＩＵ／ｍｌであ
る。

微生物が増殖する高温により、一般に比較的短時間のイ
ンキュベーションを可能とする利点が付与される。通常
、６〜１０時間が酵素を満足のいくレベルで生産するた
めに十分な時間である。

増殖用培地は以下のように調製される。

キシロース　　　　０．５％（濾過殺菌しｔ；）酵母抽
出物　　　　０．１％ コーン浸漬液（ＣＳＬ）　１％ （４８％固体） ＮａＣ１Ｏ，２％ カザミノ酸　　　　１％ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，００，０３％ に！ＨＰＯ４１，１％ ＫＨｚＰＯ４０，６％ プルロニックＬ８１　　１滴 表面活性剤（ＢＡＳＦワイアンドット社）ｐ）（ａ、ｏ
％ 微生物を浸とうフラスコ中、２００ＲＰＭ、温度５５℃
で増殖し、ついで、実験室規模の発酵槽中、ｌ　：　１
　ｖ／ｖの通気、温度５５℃、６００ＲＰＭの撹拌で成
育する。

かくして生産された酵素は広範囲の温度で操作できる。

しかしながら、その本質は、公知の微生物より高い温度
で最適活性が生じることである。

さらに、該酵素は、例えば米国特許第４．４１１゜９９
６号および第４．４１０．６２７号に記載の方法のよう
に固定化状態で用いてもよい。異性化が行なわれる条件
は変化するが、５〜６０重量％、好ましくは約３０〜５
０重量％のグルコース含有溶液の場合に最良の結果が得
られる。グルコース含有溶液のｐＨは６．０〜７．０に
維持するべきである。グルコース含有溶液には、マグネ
シウム、鉄またはコバルトあるいはそれらの組合せのよ
うな種々のイオン活性剤および／または安定化剤を含有
してもよい。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、それらに限定されるものではない。

実施例１ 本実施例は本発明を実施するのに有用な耐熱性グルコー
スイソメラーゼの精製および固定化を示すものである。

分離物６６５３の部分的精製 （抽出）冷凍細胞を、ｐＨ６，５の５０ｍＭマレイン酸
塩、２０ｍｇリソチーム／４ｍｌ、塩化ベンズアルコニ
ウム（ＢＴＣ）のような２００ＰＰＭの第四アミンを含
有する溶液中、Ｉｇ細胞／４ｍｌの濃度で懸濁させた。

得られた懸濁液を４５℃で４時間勢いよく撹拌し、遠心
分離により細胞性の異物を除去した。

↓ （熱剋理）抽出物を８℃に加熱し、１０分間保持した後
、遠心分離により大量の白色沈澱を除去した。

↓ （限外濾過）透明にした抽出物を限外濾過し、ｔｏ、ｏ
ｏｏ分子量カット（Ｃｕｔ−Ｏｆｆ）膜で透析濾過（ｄ
ｉａｌ　１ｌｔｅｒ）　Ｌ／た。酵素は残留した。

↓ （ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー）２５ｍＭ
トリス緩衝液でｐＨ７に平衡化されたＤＥＡＥ−セルロ
ースカラムに限外濾過濃縮物を適用した。約０．２６Ｍ
のＮａＣ１で酵素を溶離するようなＮａＣ１勾配を適用
した。活性分画をプールし、５０．０００　ＭＷＣＯ膜
上で脱塩した。

↓ （ゲル濾過クロマトグラフィー）濃縮したＤＥＡＥセル
ロース溶出液の一部をＴＳＫ　ＨＷ−３５（メルック（
Ｍｅｒｃｋ）、好熱性ビニル樹脂）カラムに適用し、２
５ｍＭのリン酸緩衝液で溶離しｔ；。

各精製工程中の精製のおおよその評価は以下のとおりで
ある。

比活性 細胞　　　　２〜５１ＧＩυ／ｇ湿潤細胞ペースト抽出
　　　　０．１７１０ＩＵ／ｍｇタンパク質熱処理　　
　０．６〜０．８１ＧＩＬＩ／ｍｇタンパク質限外濾過
　　１−１．２１ＧＩＵ／ロＩｇタンパク質ＤＥＡＥ−
セルロース　２．７１ＧＩＵ／ｍｇタンパク質ゲル濾過
　　ｎ、ｄ。

一旦、精製すると、グルコースイソメラーゼを米国特許
筒４．３５５．７１７号の方法にしたがって固定化し、
以下のごとく耐熱性を試験した。

４０ｍ１の部分的に精製した全活性４７４！Ｇ［Ｕ（ｌ
　ｌ　、８５１　Ｇ　Ｉ　Ｕ／ｍｌ）を有するグルコー
スイソメラーゼをｐＨ７，２に調整し、６．６１ｇのｄ
、ｂＤＢＣ（顆粒状の誘導化されたセルロース（ＤＥＡ
Ｅ））を酵素に添加し、０．０２％のアジドナトリウム
中、室温で１９時間混合した。酵素が１００％吸者され
ると、固定化された酵素活性は７２１ＧＩＵ／ｉｃ（乾
量基準）であることが判明した。

０　、５１　ｇ／ｍｌの基質（グルコース）、１０ｍＭ
のＭｇＳＯ４、ｌ０ｍＭのＮａＨＳ　Ｏ、および０．５
ｍＭのＦｅ３Ｏ３を用い、フルクトース濃度用脚光計で
溶離液をモニターすることにより、固定化されたグルコ
ースイソメラーゼ（ＧＤＣＩ）の９８℃および１００℃
での耐熱性を試験した。結果は、半減期が１００℃で１
６．８分、９８℃で３３．６分、Ｅａが１００ｋｃａ１
１モルであツタ。

【図面の簡単な説明】

第１図は米国特許筒３，７８８，９４５号の異性化され
たグルコースイソメラーゼの安定性に対する温度の効果
を示すアレニウス・ダイヤフラム、月 第２図は第１図のデータに基き、ＬＴｌ皆て温　１−度
をプロットしたグラフ、 第３図は第２図のデータに基き、 （Ｉｔ／ｒ２０ＸＫＩＢ。／　Ｋ　ｌ□）に対して温度
をプロットしたグラフ、 第４図（ａ）〜（ｅ）は本発明の微生物が発見された種
々の産地の地図である。 特許出願人　ナビスコ・ブラツグ・インコーホレイテッ
ド 代　理　人　弁理士　青　山　　葆　はか１名ＦＩＧ、
　１ グルコースイソメラーゼの鵡不活性化のためのアレニウ
スダイヤグラムへ− ＦＩＧ、４（ｄ＞ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　４（ｅ） 手んタネ市１１−ミソシ （ブｊ、ｒＥ　）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも９３℃の温度で２０分の半減期（Ｔ＿
   ２＿０）を有することを特徴とするグルコースからフル
   クトースへの異性化が可能な酵素。
2. （２）該Ｔ＿２＿０が約９４℃〜約１２５℃である請求
   項（１）記載の酵素。
3. （３）該酵素が不溶性担体上に固定化される請求項（１
   ）または（２）記載の酵素。
4. （４）該不溶性担体が顆粒状のジエチルアミノエチルセ
   ルロース（ＧＤＣ）である請求項（３）記載の酵素。
5. （５）該酵素がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の１種
   から分離できる請求項（１）〜（４）いずれか１項記載
   の酵素。
6. （６）２０〜約６４重量％のグルコースを含有するグル
   コース含有の供給液を、温度約９０℃〜１３０℃、ｐＨ
   約３．５〜約８および接触時間約１０秒〜約５時間でグ
   ルコースイソメラーゼと接触させて該液体中に存在する
   少なくとも約５３〜６０重量％のグルコースを実質的に
   プシコースを形成せずにフルクトースに変換することか
   らなり、少なくとも９３℃の温度で２０分の半減期を有
   するグルコースイソメラーゼを用いることを特徴とする
   グルコースをフルクトースに異性化するための方法。
7. （７）該Ｔ＿２＿０が約９４℃〜約１２５℃である請求
   項（６）記載の方法。
8. （８）該グルコースイソメラーゼが化学的に安定化され
   ているかまたは該グルコースイソメラーゼが不溶性担体
   上に固定化されている請求項（６）または（７）記載の
   方法。
9. （９）該不溶性支持体が顆粒状のジエチルアミノエチル
   セルロース（ＧＤＣ）である請求項（８）記載の方法。
10. （１０）該グルコースイソメラーゼがバチルス（Ｂａｃ
    ｉｌｌｕｓ）属の１種から分離される請求項（１）〜（
    ９）いずれか１項記載の方法。
11. （１１）少なくとも９３℃の温度で２０分の半減期（Ｔ
    ＿２＿０）を有することを特徴とするグルコースからフ
    ルクトースへの異性化が可能な酵素を生産する生物学的
    に純粋な形態の微生物。
12. （１２）該微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の
    １種である請求項（１１）記載の微生物。