JPH0224558A - イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、測定精度が改善されたイムノアッセイに関
する。

［従来の技術］ イムノアッセイにおいては、種々の既知濃度の測定すべ
き抗原を含む標準検体（キャリブレータ−）を用いて検
量線を作製し、検体について測定された値を検量線にあ
てはめて検体中の測定すべき抗原の量を求める。従来の
イムノアッセイにおいては、検量線の作製のために用い
られるＩｌ？ｌＩ検体は精製された抗原を既知量含んで
いる。

一方、イムノアッセイにおいて、測定に供される検体は
血液等の体液であり、測定すべき抗原の他に多種雑多な
種々の物質を含んでいる。これらの種々の阻害物質が抗
原抗体反応を妨害するため、検量線に基づいて測定され
た抗原の測定値は実際の値よりも低くなる。換言すると
、検量線の直線性が悪化する。大量の検体についてイム
ノアッセイを行なう場合に、検体を希釈することなく原
液のままで測定できれば労力及び時間がかからず非常に
有利であるが、上記現象は抗原抗体反応を妨害する物質
が多く存在すればするほど顕著になるので、血液等の検
体を希釈せずに原液のままで測定する場合に特に問題に
なる。

この問題は、もし、検量線の作製に用いる標準検体とし
て、検体と同様な種々の阻害物質を含む系の液を用いて
検量線を作製すれば解決できるものと考＾られるが、こ
れらの阻害物質は通常単一のものではなく、これらを同
定して目的とする濃度に調製することは極めて困難であ
る。

［発明が解決しようとする問題点コ 従って、この発明の目的は、検体を希釈せずにＲ腋のま
まで測定した場合にも、測定値か実際の値よりも実質的
に低くならず、正確に実際の値を測定することができる
イムノアッセイを提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、検量線を作製する際
に、標準検体中に、測定すべき抗原に対応する抗体に対
する抗イディオ抗体を存在させると、抗原と抗イディオ
抗体とが競合することにより抗原抗体反応が妨害され、
実際の検体と同じような系が得られ、従って、抗原の測
定値が実際の値よりも小さくなることを防止することが
できることを見出しこの発明を完成した。

すなわち、この発明は、イムノアッセイにおいて、測定
すべき抗原と、該抗原に対する抗体に対する抗イディオ
抗体又はその可変領域フラグメントとを含む標準検体を
用いて検量線の作製を行なうことを特徴とする方法を提
供する。

［発明の効果］ この発明のイムノアッセイによると、測定すべき抗原と
それに対応する抗体との抗原抗体反応において、抗イデ
ィオ抗体が抗原と競合するのて、抗原抗体反応が妨害さ
れ、ａ定に供される血液等の検体と同じような系がもた
らされる。従って、イムノアッセイにより測定される抗
原の測定値が実際の値よりも小さくなることが防止され
、正確な抗原量を測定することができる。特に、従来の
イムノアッセイと比較して、検体を原液のまま測定する
場合に測定精度が大きく向上したので、大量の検体につ
いて測定を行なう場合に検体を希釈せずに測定すること
ができ、時間及び労力を節約することができ有利である
。

［発明の詳細な説明］ この発明のイムノアッセイは、検量線を作製する際に用
いる標準検体中に抗イディオ抗体又はその可変領域フラ
グメントを存在させることを特徴とする。抗イディオ抗
体は、抗原に対応する抗体の可変領域をエピトープとす
る抗体である。

従って、抗イディオ抗体は、抗原に対応する抗体の可変
領域と抗原抗体反応により結合する性質を有する。一方
、抗原もその対応する抗体の可変領域と抗原抗体反応に
より結合する。従って、抗原と抗イディオ抗体とは、抗
原に対応する抗体との抗原抗体反応において競合し、こ
のため、抗イディオ抗体は抗原に対して阻害物質として
働く、このようにして１種々の阻害物質か共存する現実
の検体と同様な系が得られ、実際の値と良く一致した、
直線性の優れた検量線を得ることができる。

この発明のイムノアッセイにおいて用いられる抗イディ
オ抗体は、モノクローナル抗体であることか好ましい。

標準検体中に抗原と共に含まれるものは抗イディオ抗体
自身てあってもよいし、Ｆｍｂフラグメント等の可変領
域のフラグメントてあってもよい 検量線を作製するための標準検体中の抗イデイオ抗体の
濃度は、特に限定されないが、通常１　ｎｇ／ｍｌない
し１００　ｐＨ／ｍｌ程度であり、好ましくは１０　ｎ
ｇ／■１　ないしＩＯ７ｚｇ　／１１程度である。また
、標準検体中に抗イディオ抗体の可変領域フラグメント
が含まれる場合には、その濃度は通常ｌ　ｎｇ／ｌない
し１００　μｇ／ｌａｌであり、好ましくは１０ｎｇ／
ｍｌ　　ないし１０弘ｇ／■１　程度である。

この発明のイムノアッセイに用いられる抗体は従来と同
様であり、測定精度の観点からモノクローナル抗体であ
ることが好ましい。

この発明のイムノアッセイにより測定される抗原は、い
かなる抗原であってもよい。

この発明のイムノアッセイはいかなる様式のものであっ
てもよく、従って、１１１合法でもサンドイフチ法でも
よい、また、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ラテックス凝集
法等、いかなる種類のイムノア・シャイであってもよい
。

［実施例］ 以下、この発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、
この発明は下記実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において、ＧＴ−ＩＩ（ガラクトース転移
酵素イソ酵素−■）を測定するためのエンザイムイムノ
アッセイにおける本発明の例について述べる。

抗イディオモノクローナル抗体ＭＡｂ　３８７２は特開
昭６２−１７４１００号に記載の方法により作製され。

これを産生するハイブリドーマがＡＴＣＣに寄託されて
おり、その受託番号はＩＩ８８９４５である。−方、Ｍ
Ａｂ　３８７２に対する抗イディオモノクローナル抗体
ＭＡり　５７１４は特願昭６２−４９１４８号記載の方
法により作製され、これを産生ずるハイブリトーマか微
工研に寄託され、その受託番号は微工研条寄第１７５９
号である。　ＭＡｂ　５７１４のＦＩｌｂフラグメント
は。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎ口ｂｏｄｉｅＳ：　　Ｐ
ｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　　ａｎｄＰｒａｃＬｉｃｅ　、　
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｌｒ＋ｒ：、第１２
０頁に記載された方法により調製された。

施例１．ｌ ａ）標準検体の調製 癌患者腹水より精製されたＧＴ−ＩＩを５％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）及び１００　ｎｇ／ｍｌのＭＡｂ　
５７１４　　Ｆ　ａｈフラグメントを含むリン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ）に、所定濃度（０，２０，５０，−１５
０ＩＩ／ｍｌ）に溶解し、標準検体とした（実施例１）
。

一方、比較のため、　ＭＡｂ　５７１４　　Ｆ−ｂフラ
グメントを含まない５％ＢＳＡ含有ＰＢＳに同濃度のＧ
　Ｔ　−１１を溶解し、標準検体とした（比較例１）、
さらに、対照として、ＧＴ−■を含まない正常人プール
血清に上記濃度のＧＴ−ＩＩを溶解して標準検体とした
（対照）。

ｂ）ＧＴ−■エンザイムイムノアッセイ精製したＭＡｂ
　：１８７２１０　ＪＬｇ／腸１１００■緘炭酸バツフ
アー（ｐＨ９，５）中、１７４インチのプラスチックビ
ーズを４℃、ｌ昼夜固定化した。ＰＢＳで３回洗浄後、
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、３７℃、２日間放置し、安定
化した。

このビーズ１偏に上記標準検体５０＃Ｉ及び２００　ｍ
Ｍ炭酸バッフ　ｙ　　（ｐＨ９，５）　２００ｐ　Ｉを
加え、室温で１８時間放置した。３回ＰＢＳでビーズを
洗浄した後、１ｇｇ／ｍｌの１ｌｌａｂ　３８７２−Ｉ
ＩＲＰ　（ホースラデイツシュペルオキシダーゼ）結合
体溶液（１％ＢＳＡ含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　）　２００ルＩを
加え、室温で２時間放置した。

ＰＢＳて４回ビーズを洗浄後、０〜フエニレンジアミン
３　　ｍｇ／ｍｌクエン酸バッファー（ｐＨ５，ｏ）５
００ｕＬｌを加え室温て３０分間発色反応させた。

ＩＮ硫酸２鱈を加えて反応を停止させた後、４９０ｎ−
の吸光度を分光光度計により測定した。結果を表１に示
す。

表１ 以上の結果から、抗イディオ抗体を含む標準検体を用い
た本発明の実施例１の測定結果が実際の血清を用いて調
製した対照の標準検体を用いた場合の結果と非常によく
一致し・ており、一方、抗イディオ抗体を含まない標準
検体を用いた比較例１における測定結果は、実際の血清
を用いた対照の結果からかなりずれていることがわかる
。従って、本発明の方法によると、血清等の実際の検体
を測定した場合により正確な結果が得られることがわか
る。

実施例２、比較例２ 希釈試験 阻害物質による阻害効果は、検体の希釈倍率を大きくす
ればするほど阻害物質が希釈されるので弱まり、測定結
果は真の値に近づく、逆に、希釈倍率が低い場合には、
阻害物質の影響を大きく受け、測定値は真の値よりも低
くなる。従って、検体を種々の希釈倍率で希釈して抗原
量を測定し、その結果を希釈倍率を横軸にとってプロッ
トした場合に、低希釈倍率における測定結果か、高希釈
倍率の領域の直線を外挿した直線から大きくずれている
ほど真の値と測定された値との誤差か大きいことになり
、そのアッセイの請度が低いことを示す、この例では、
これを調べるために希釈試験を行なつた。

実施何重及び比較例１のそれぞれの機準検体を用いて検
量線を描き、希釈試験を行なフた。検体はＧ　Ｔ　−Ｉ
Ｔ高値の癌患者血清を用い、希釈液としてはそれぞれの
ＯＵ／Ｗｌを用いた。結果を図に示す。

図から明らかなように、本発明の実施例２では低希釈倍
率における測定値が、高希釈倍率における測定値を外挿
した直線上にほぼのりているのに対し、比較例２ではこ
の直線よりもかなり下にある。従ワて、この発明の方法
は比較例の方法に比べて精度が大きく優れていることが
わかる。

実施例３．　較例３ 添加回収試験 実施例１及び比較ｌにおけるそれぞれのａｌｌ準検体を
用いて、以下の添加回収試験を行なった。

３つの検体Ａ、Ｂ又はＣ１重量部に対し、下記表２及び
３に示す濃度の標準検体１重量部を添加し、試料を作製
した。イムノアッセイ操作は実施例１と同様にして行な
った。「回収率（％）」は実測値／理論値ｘ　１００　
（ｚ）て与えられ、これが１００％に近いほど測定が正
確であることを示す、結果を下記表２（比較例３）及び
表３（実施例３）に示す。

表２及び３から、本発明の実施例３では、比較例３に比
べて回収率がはるかに１００％に近く、従って精度が高
いことがわかる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の実施例２及び比較例２についての希釈試験
の結果を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. イムノアッセイにおいて、測定すべき抗原と、該抗原に
   対する抗体に対する抗イディオ抗体又はその可変領域フ
   ラグメントとを含む標準検体を用いて検量線の作製を行
   なうことを特徴とする方法。