JPH02247200A - メタロチオネイン類似タンパク - Google Patents
メタロチオネイン類似タンパクInfo
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- JPH02247200A JPH02247200A JP6359589A JP6359589A JPH02247200A JP H02247200 A JPH02247200 A JP H02247200A JP 6359589 A JP6359589 A JP 6359589A JP 6359589 A JP6359589 A JP 6359589A JP H02247200 A JPH02247200 A JP H02247200A
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- metallothionein
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- plant
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、メタロチオネインと類似な性質を有する新規
なタンパク質に関し、更に詳細には豆科植物の種子、根
端から抽出処理により得ることのできるメタロチオネイ
ン類似タンパクに関する。
なタンパク質に関し、更に詳細には豆科植物の種子、根
端から抽出処理により得ることのできるメタロチオネイ
ン類似タンパクに関する。
［従来の技術及びその課題］
重金属イオンは生体内において毒性を示すことが知られ
ているが、この毒性は、一般に重金属イオンがキレート
形成することにより遊離の場合よりも低下するとされて
いる。
ているが、この毒性は、一般に重金属イオンがキレート
形成することにより遊離の場合よりも低下するとされて
いる。
動物の生体内では、重金属の存在によりメタロチオネイ
ンが誘導合成され、そのキレート作用により重金属無毒
化の役割を果たすといわれている。
ンが誘導合成され、そのキレート作用により重金属無毒
化の役割を果たすといわれている。
メタロチオネインは、Ｃｄ、 Ｚｎ、 ＣｕＳＣｏ５Ａ
ｇ、 Ｈｇなど種々の金属を強固に結合することのでき
るアポタンパク質で、分子量約６，０００の誘導性タン
パク質である。
ｇ、 Ｈｇなど種々の金属を強固に結合することのでき
るアポタンパク質で、分子量約６，０００の誘導性タン
パク質である。
メタロチオネインは組成アミノ酸のｌ／３がシスティン
であり、かつ芳香族のアミノ酸を含まないという特徴を
有する。
であり、かつ芳香族のアミノ酸を含まないという特徴を
有する。
このメタロチオネインは、哺乳類、鳥類、甲殻類、魚類
、軟体動物、藻類、菌類なと広範囲の真核生物から分離
されているが、こればかりでなく藍藻等の一部原核生物
からも見出されている。しかしながら、高等植物からは
全く見出されていない。
、軟体動物、藻類、菌類なと広範囲の真核生物から分離
されているが、こればかりでなく藍藻等の一部原核生物
からも見出されている。しかしながら、高等植物からは
全く見出されていない。
メタロチオネインの物性等については現在まで種々報告
されており、重金属と結合して安定で可溶性の化合物を
形成する能力を有し、またシスティンの一８Ｈ基による
還元能力や反応性に富む等その特性に着目して、生体内
で有害重金属やフリーラジカル等有害物質の解毒剤、ま
た生体内への亜鉛等有用金属の供給源等としての応用が
期待されている。
されており、重金属と結合して安定で可溶性の化合物を
形成する能力を有し、またシスティンの一８Ｈ基による
還元能力や反応性に富む等その特性に着目して、生体内
で有害重金属やフリーラジカル等有害物質の解毒剤、ま
た生体内への亜鉛等有用金属の供給源等としての応用が
期待されている。
しかしながら、メタロチオネインの工業的な利用には、
動物中に存在するメタロチオネインが極めて微量であり
、かつその精製、分離が難しいという量的及び質的の両
面からの難点があり、その実現を困難なものとしている
。
動物中に存在するメタロチオネインが極めて微量であり
、かつその精製、分離が難しいという量的及び質的の両
面からの難点があり、その実現を困難なものとしている
。
そこで、メタロチオネイン若しくはこれと同等な作用を
有するタンパク質を、工業的に利用できる規模で提供さ
れることが望まれていた。
有するタンパク質を、工業的に利用できる規模で提供さ
れることが望まれていた。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なっ
た結果、大量に栽培されている大豆等の豆科植物の種子
及び機端中には、メタロチオネインと免疫的に交叉し、
かつ、亜鉛に対する親和性、耐熱性等メタロチオネイン
と極めて類似するタンパク質が含まれていることを見出
した。
た結果、大量に栽培されている大豆等の豆科植物の種子
及び機端中には、メタロチオネインと免疫的に交叉し、
かつ、亜鉛に対する親和性、耐熱性等メタロチオネイン
と極めて類似するタンパク質が含まれていることを見出
した。
また、このタンパク質は抽出により容易に豆科植物中か
ら分離できることを見出した。
ら分離できることを見出した。
すなわち本発明は、豆科植物の種子または根端より抽出
されるメタロチオネイン類似タンパクを提供するもので
ある。
されるメタロチオネイン類似タンパクを提供するもので
ある。
本発明のメタロチオネイン類似タンパクを調製するため
に用いられる豆科植物としては、特に限定はなく一般の
豆科植物を利用することができる。
に用いられる豆科植物としては、特に限定はなく一般の
豆科植物を利用することができる。
具体的には、大豆、小豆、インゲン豆等を例示すること
ができるが、量的及び原材料の入手性等の点から大豆が
特に好ましい。また、より多くのメタロチオネイン類似
タンパクを得るためには、Ｃｕ蓄積性の豆科植物を用い
ることが好ましく、更に、本発明メタロチオネイン類似
タンパクをより効率良く誘導するためには、一定濃度の
Ｃｕ等重金属イオンの存在下で栽培したものを用いるこ
とが好ましい。重金属イオンは、経時的に順次加えてい
くことが好ましいが、例えばＣｕ蓄積性の大豆に銅イオ
ンを添加する場合、最終的にその濃度として４００ｐｐ
ｂ程度とすればよい。
ができるが、量的及び原材料の入手性等の点から大豆が
特に好ましい。また、より多くのメタロチオネイン類似
タンパクを得るためには、Ｃｕ蓄積性の豆科植物を用い
ることが好ましく、更に、本発明メタロチオネイン類似
タンパクをより効率良く誘導するためには、一定濃度の
Ｃｕ等重金属イオンの存在下で栽培したものを用いるこ
とが好ましい。重金属イオンは、経時的に順次加えてい
くことが好ましいが、例えばＣｕ蓄積性の大豆に銅イオ
ンを添加する場合、最終的にその濃度として４００ｐｐ
ｂ程度とすればよい。
原材料である豆科植物からメタロチオネイン類似タンパ
クを得るには、まず、当該植物の種子または根端を細断
し、適当量の還元剤とＣｕ２＋等重金属イオンの存在下
、適当な緩衝液中でホモシュネートする。
クを得るには、まず、当該植物の種子または根端を細断
し、適当量の還元剤とＣｕ２＋等重金属イオンの存在下
、適当な緩衝液中でホモシュネートする。
好ましい還元剤としては、２−メルカプトエタノール等
が挙げられ、また、Ｃｕ２＋は、例えば硫酸銅として添
加すれば良い。これらの還元剤、重金属イオンの添加量
はそれぞれ２−メルカプトエタノールは０．０３５％（
ｗ／ｖ）及びＣｕ２＋は１００ｍｇ／ｆｆ程度である。
が挙げられ、また、Ｃｕ２＋は、例えば硫酸銅として添
加すれば良い。これらの還元剤、重金属イオンの添加量
はそれぞれ２−メルカプトエタノールは０．０３５％（
ｗ／ｖ）及びＣｕ２＋は１００ｍｇ／ｆｆ程度である。
また、緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ
２ （ｐＨ８、０）等を例示することができる。
２ （ｐＨ８、０）等を例示することができる。
次いで、ホモシュネートにより得られた均質物を濾過し
、濾液を遠心分離する。遠心分離は、１００００〜１５
．０００ｒｐｍで１０〜２０分程度行なうことが好まし
い。
、濾液を遠心分離する。遠心分離は、１００００〜１５
．０００ｒｐｍで１０〜２０分程度行なうことが好まし
い。
メタロチオネイン類似タンパクは、遠心分離により得ら
れる上清に含まれているので、得られた上清をそのまま
用いることもできるが、必要に応じて上清をタンパク質
分離の常法で処理し、精製されたメタロチオネイン類似
タンパクを得ることもできる。
れる上清に含まれているので、得られた上清をそのまま
用いることもできるが、必要に応じて上清をタンパク質
分離の常法で処理し、精製されたメタロチオネイン類似
タンパクを得ることもできる。
かくして得られた本発明のメタロチオネイン類似タンパ
クは以下のような性質を有する。
クは以下のような性質を有する。
（１）免疫学的性質
ＲＩＡ法を用いて、本発明タンパク質と、ラット肝に存
在するメタロチオネインポリクローナル抗体［ＭＴ−１
（大塚製薬■）］との交叉反応性を検討した。
在するメタロチオネインポリクローナル抗体［ＭＴ−１
（大塚製薬■）］との交叉反応性を検討した。
すなわち、予めフェリチン、α−フェトプロティン、グ
ルタチオン、マウスのメタロチオネインの一部配列（６
〜１０ ａ−ａ配列）等との間で交叉反応性が認められ
ず、ラット肝メタロチオネイン以外の抗原に対して交叉
反応性がないことが確認されているＭＴ−１を標準希釈
液に溶解して１次抗体とした。
ルタチオン、マウスのメタロチオネインの一部配列（６
〜１０ ａ−ａ配列）等との間で交叉反応性が認められ
ず、ラット肝メタロチオネイン以外の抗原に対して交叉
反応性がないことが確認されているＭＴ−１を標準希釈
液に溶解して１次抗体とした。
この１次抗体と、標準のラットのメタロチオネインおよ
び放射標識を施したメタロチオネインとをインキュベー
トし、これに２次抗体液としてメタロチオネイン類似タ
ンパクを加え、生成した沈澱の放射活性を計測した。こ
の結果、本発明のメタロチオネイン類似タンパクはラッ
ト肝メタロチオネインとの交叉反応性が明らかに認めら
れた。
び放射標識を施したメタロチオネインとをインキュベー
トし、これに２次抗体液としてメタロチオネイン類似タ
ンパクを加え、生成した沈澱の放射活性を計測した。こ
の結果、本発明のメタロチオネイン類似タンパクはラッ
ト肝メタロチオネインとの交叉反応性が明らかに認めら
れた。
（２） ５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量決定ラエムリの
方法［Ｌａｅｍｍｌｉ、 ｔｌ、に、 Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄ−ｏｎ） 、 ２２７．６８０−６８５ （
１９７０） ］に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
方法［Ｌａｅｍｍｌｉ、 ｔｌ、に、 Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄ−ｏｎ） 、 ２２７．６８０−６８５ （
１９７０） ］に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
常法により染色した後、本発明のメタロチオネイン類似
タンパクの分子量を求めたところ、約１７，０００であ
った。
タンパクの分子量を求めたところ、約１７，０００であ
った。
（３）ＥＩＡ法による染色及びウェスタンブロッティン
グ法による分子量測定 本発明のメタロチオネイン類似タンパクのＳＨ基をカル
ボキシメチル化し、結合膜として２フツ化ポリビニルを
用い、電気泳動によりその分子量を測定したところ約１
７，０００であった。
グ法による分子量測定 本発明のメタロチオネイン類似タンパクのＳＨ基をカル
ボキシメチル化し、結合膜として２フツ化ポリビニルを
用い、電気泳動によりその分子量を測定したところ約１
７，０００であった。
（４）亜鉛に対する親和性
亜鉛に対する親和性をＺｎプロティングの手法（Ｌｅｓ
ｌｉｅ Ａ、 ５ｃｈｉｆｆ、 Ｍａｘ Ｌ、 Ｎ１ｂ
ｅｒｔ、 ａｎｄ Ｂｅｒｎ−ｏｒｄ Ｎ、 Ｆｉｅｌ
ｄｓ； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ８５゜４１９５−４１９９． Ｊｕｎｅ （
１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により評価し
た。この結果、本発明のメタロチオネイン類似タンパク
は、亜鉛に対し高い親和性を示した。
ｌｉｅ Ａ、 ５ｃｈｉｆｆ、 Ｍａｘ Ｌ、 Ｎ１ｂ
ｅｒｔ、 ａｎｄ Ｂｅｒｎ−ｏｒｄ Ｎ、 Ｆｉｅｌ
ｄｓ； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ８５゜４１９５−４１９９． Ｊｕｎｅ （
１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により評価し
た。この結果、本発明のメタロチオネイン類似タンパク
は、亜鉛に対し高い親和性を示した。
（５）耐熱性
本発明のメタロチオネイン類似タンパクを１００°Ｃで
５分間処理したときの活性の低下はなく、熱処理によっ
て夾雑タンパクの一部が沈殿するために全タンパクあた
りのメタロチオネイン量は４０％増大した。
５分間処理したときの活性の低下はなく、熱処理によっ
て夾雑タンパクの一部が沈殿するために全タンパクあた
りのメタロチオネイン量は４０％増大した。
［発明の効果］
本発明のタンパクは、メタロチオネインと同様に生体内
において有害重金属やフリーラジカル等の有害物質の解
毒剤あるいは生体内への亜鉛等の有用金属の供給源とし
て有用である。そして、本発明タンパクは食品として供
されているダイズなどのマメ科植物から効率的に単離す
ることができる。
において有害重金属やフリーラジカル等の有害物質の解
毒剤あるいは生体内への亜鉛等の有用金属の供給源とし
て有用である。そして、本発明タンパクは食品として供
されているダイズなどのマメ科植物から効率的に単離す
ることができる。
［実施例コ
以下実施例を挙げ、本発明をより詳しく説明する。
実施例 １
（１） タンパク質の抽出：
抽出材料としてイネ根、各種ダイズ根及びダイズトヨス
ズ種子を用い、メタロチオネイン類似タンパクの抽出試
験を行なった。
ズ種子を用い、メタロチオネイン類似タンパクの抽出試
験を行なった。
根からメタロチオネイン類似タンパクを抽出するために
、まず、Ｃｕ蓄積性のイネ（品種：統一）及びＣｕ蓄積
性のダイズ（品種：トヨスズ）を発芽させ、発芽３日後
にこれらの幼植物を水耕栽培液（春日井式液）に移した
。水耕栽培の初めの１週間は基本培養液組成の１７４濃
度で育て、２週間口からは２００ｐｐｂのＣｕ２＋を加
えた基本組成に換え、２週間培養した。その後、イネは
そのまま、ダイズはＣｕ濃度を４００ｐｐｂとして更に
１週間培養し、それらの根を根部試料とした。
、まず、Ｃｕ蓄積性のイネ（品種：統一）及びＣｕ蓄積
性のダイズ（品種：トヨスズ）を発芽させ、発芽３日後
にこれらの幼植物を水耕栽培液（春日井式液）に移した
。水耕栽培の初めの１週間は基本培養液組成の１７４濃
度で育て、２週間口からは２００ｐｐｂのＣｕ２＋を加
えた基本組成に換え、２週間培養した。その後、イネは
そのまま、ダイズはＣｕ濃度を４００ｐｐｂとして更に
１週間培養し、それらの根を根部試料とした。
上記で得た根部試料及びダイズ（トヨスズ）の種子試料
のそれぞれを生重量で２．０ｇ量り取り、細断後、水冷
下で４Ｔｎｒｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣＩＩＩ緩衝液
（ｐＨ８，８） 、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、
１１００ｐｐのＣｕ” （ＣｕＳ０４として）と混合し
てホモジュナイズした。この均質物を濾過したのち、濾
液を１００．０００ ｇで１時間超遠心し、その上清と
してタンパク抽出液４ｍ１ｌを得た。
のそれぞれを生重量で２．０ｇ量り取り、細断後、水冷
下で４Ｔｎｒｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣＩＩＩ緩衝液
（ｐＨ８，８） 、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、
１１００ｐｐのＣｕ” （ＣｕＳ０４として）と混合し
てホモジュナイズした。この均質物を濾過したのち、濾
液を１００．０００ ｇで１時間超遠心し、その上清と
してタンパク抽出液４ｍ１ｌを得た。
（２）耐熱性試験：
タンパク抽出液のうち、根部試料からのものは２等分し
その一方について耐熱性試験を行なった。
その一方について耐熱性試験を行なった。
すなわち、一方のタンパク抽出液を１００℃で５分間保
持し、熱処理しないタンパク抽出液との間でそのタンパ
ク含量、メタロチオネイン類似タンパク（以下、ｒＭＴ
様タンパク」という）含量を比較した。
持し、熱処理しないタンパク抽出液との間でそのタンパ
ク含量、メタロチオネイン類似タンパク（以下、ｒＭＴ
様タンパク」という）含量を比較した。
タンパク質含量はプロティンアッセイキット（バイオラ
ッド社製）を用い、ＭＴ様タンパク含量はポリクローナ
ル抗体であるＭＴ−１を用いるＲＩＡ法により測定した
。この結果を第１表に示す。
ッド社製）を用い、ＭＴ様タンパク含量はポリクローナ
ル抗体であるＭＴ−１を用いるＲＩＡ法により測定した
。この結果を第１表に示す。
１〇 −
第１表
第１表から明らかなように、イネ根からはＭ Ｔ様タン
パク質が検出されなかったがダイズの根部試料及び種子
からはＭＴ様タンパク質が得られた。
パク質が検出されなかったがダイズの根部試料及び種子
からはＭＴ様タンパク質が得られた。
また、ダイズ根試料では、加熱後の全タンパク中のＭＴ
様タンパク質量割合は０．０３８％であるのに対し非加
熱試料中の割合は０．０２６％であり、ＭＴ様タンパク
質は加熱に対して安定であることが示された。なお、得
られた試料はいずれも一８０℃で凍結乾燥した。
様タンパク質量割合は０．０３８％であるのに対し非加
熱試料中の割合は０．０２６％であり、ＭＴ様タンパク
質は加熱に対して安定であることが示された。なお、得
られた試料はいずれも一８０℃で凍結乾燥した。
（３） ５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定実施例１で
得られたタンパク抽出液（ダイズ根からのもの；非加熱
）１０μ、２に、６０ｍＭ Ｄ Ｔ Ｅ （２３−ジハ
イドロキシー１，４−ジチオールブタン）、４０ｍＭ
ＥＤＴＡ、４％ ＳＤＳ、２５％グリセロールを含む１
００ｍＭ ）リス−ＨＣｆｆ （ｐＨ８，８）溶液を１
０μｍ加え、５分間煮沸した。１２．ＯＯＯｒｐｍで２
分間遠心し、これに１．０ｍＭヨード酢酸を含む１．２
５ｍＭＮａＯＨ溶液を４μｆ加え、５０℃で１５分間イ
ンキュベートした。これをふたたび１２．００Ｏｒｐｍ
の遠心に２分間付し、得られた上清をカルボキシメチル
化タンパク抽出液とした。
得られたタンパク抽出液（ダイズ根からのもの；非加熱
）１０μ、２に、６０ｍＭ Ｄ Ｔ Ｅ （２３−ジハ
イドロキシー１，４−ジチオールブタン）、４０ｍＭ
ＥＤＴＡ、４％ ＳＤＳ、２５％グリセロールを含む１
００ｍＭ ）リス−ＨＣｆｆ （ｐＨ８，８）溶液を１
０μｍ加え、５分間煮沸した。１２．ＯＯＯｒｐｍで２
分間遠心し、これに１．０ｍＭヨード酢酸を含む１．２
５ｍＭＮａＯＨ溶液を４μｆ加え、５０℃で１５分間イ
ンキュベートした。これをふたたび１２．００Ｏｒｐｍ
の遠心に２分間付し、得られた上清をカルボキシメチル
化タンパク抽出液とした。
５ＤＳ−ＰＡＧＥはラエムリの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｕ、 Ｋ。
Ｕ、 Ｋ。
Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）、 ２２７．６８０−
６８５（１９７０））に従い行なった。またゲルは、そ
の組成が全アクリルアミド１７．５％、ビスアクリルア
ミド２，２３％、分離ゲルサイズが縦１３×横１５ｃｍ
のものを用いた。
６８５（１９７０））に従い行なった。またゲルは、そ
の組成が全アクリルアミド１７．５％、ビスアクリルア
ミド２，２３％、分離ゲルサイズが縦１３×横１５ｃｍ
のものを用いた。
なお、ゲル厚は０．５．１及び２ｍｍのものを目的に応
じて使い分けた。
じて使い分けた。
プロッティングは、次の様にして行なった。すなわち、
プロッティング装置としてザルトリウス社、ザルドブロ
ット■（セミドライ式）を、プロッティング溶液として
緩衝液Ａ Ｃ０，３Ｍ ）リス−ＨＣ１１，２０％メタ
ノール（ｐＨ１０，４）） 、緩衝液Ｂ （２５ｍＭト
リス−Ｈｌ、２０％メタノール（ｐＨ９、５）および緩
衝液Ｃ（２５ｍＭ ）リス−はう酸、２０％メタノール
（ｐＨ９，５））を、プロッティングフィルターとして
はポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリ
ポアーイモピロン）をゲルの大きさに切断し、メタノー
ルに数秒間浸した後、上記緩衝液Ｃに５分以上振盪して
用いた。プロッティングは、前処理として泳動後、ゲル
を緩衝液Ｃに浸し、１５分間振盪せしめ、陰極電極上に
緩衝液Ｃに浸した濾紙２枚、緩衝液Ａに浸した濾紙２枚
、陽極電極を順に重ね２ 、５ｍＡ／Ｃｍ’の電流密度
で２０分行なった（ゲル厚２ ｍｍの時は４０分）。
プロッティング装置としてザルトリウス社、ザルドブロ
ット■（セミドライ式）を、プロッティング溶液として
緩衝液Ａ Ｃ０，３Ｍ ）リス−ＨＣ１１，２０％メタ
ノール（ｐＨ１０，４）） 、緩衝液Ｂ （２５ｍＭト
リス−Ｈｌ、２０％メタノール（ｐＨ９、５）および緩
衝液Ｃ（２５ｍＭ ）リス−はう酸、２０％メタノール
（ｐＨ９，５））を、プロッティングフィルターとして
はポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリ
ポアーイモピロン）をゲルの大きさに切断し、メタノー
ルに数秒間浸した後、上記緩衝液Ｃに５分以上振盪して
用いた。プロッティングは、前処理として泳動後、ゲル
を緩衝液Ｃに浸し、１５分間振盪せしめ、陰極電極上に
緩衝液Ｃに浸した濾紙２枚、緩衝液Ａに浸した濾紙２枚
、陽極電極を順に重ね２ 、５ｍＡ／Ｃｍ’の電流密度
で２０分行なった（ゲル厚２ ｍｍの時は４０分）。
プロッティング後は、ＰＶＤＦ膜を２５ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む１０ｍＭはう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，
０）に浸し、５分間振盪した後、蒸留水に浸し５分間振
盪した。
ウムを含む１０ｍＭはう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，
０）に浸し、５分間振盪した後、蒸留水に浸し５分間振
盪した。
タンパク質の検出は、ＰＶＤＦ膜を０．１％ＣＢＢ−Ｇ
２５０ （Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ
Ｂｌｕｅ Ｇ２５０）を含む蒸留水−メタノールー酢酸
（５：５：２（ｖ／ｖ））混液に５分間浸した後、５０
％メタノール（Ｖ／Ｖ）に１分間浸してバックグランド
を脱色し、蒸留水で軽く洗った後風乾して行なった。ま
たプロッティング後のゲルは、２５％ＣＣＢ−Ｇ２５０
を含む蒸留水−エタノール−酢酸（６５０：２５０・８
０（Ｖ／Ｖ））混液に数時間浸し、バックグランドを脱
色し乾燥した。
２５０ （Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ
Ｂｌｕｅ Ｇ２５０）を含む蒸留水−メタノールー酢酸
（５：５：２（ｖ／ｖ））混液に５分間浸した後、５０
％メタノール（Ｖ／Ｖ）に１分間浸してバックグランド
を脱色し、蒸留水で軽く洗った後風乾して行なった。ま
たプロッティング後のゲルは、２５％ＣＣＢ−Ｇ２５０
を含む蒸留水−エタノール−酢酸（６５０：２５０・８
０（Ｖ／Ｖ））混液に数時間浸し、バックグランドを脱
色し乾燥した。
（５）エンザイムイムノ アッセイ（ＥＩＡ）：上記（
４）のプロッティングの終わったＰＶＤＦ膜をＴ Ｂ
Ｓ （２０ｍＭ ）リス、５００ｍＭ Ｎａ＋４ （ｐ
Ｈ７，５））に１０分間浸し、振盪する。ブロワキンダ
液（ＴＢＳに３％ゼラチンを加えたもの）に膜を浸し、
５分間振盪する。これをもう−度繰り返した後、ＴＴＢ
Ｓに１％ゼラチンを加えた抗体希釈液で３，０００倍に
希釈した一次抗体液（抗うットＭＴウサギＩｇＧ抗体の
抗体希釈液）に膜を浸し一晩振盪した。ＴＴＢＳ液（Ｔ
ＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたもの）に膜
を浸し、５分間振盪した。この操作をもう一度繰返した
後、ＧＡＲ−ＨＲＰ二次抗体液（山羊抗ウサギＩｇＧ抗
体、ホースラディシュベルオキシダーゼコンジュゲート
の抗体希釈液による３、０００倍希釈液）に膜を浸し、
１時間以上振盪した。ＴＴＢＳに膜を浸し、５分間振盪
する操作を２回繰返した後、ＴＢＳ液に膜を浸し、５分
間振盪する操作を１回繰返した。基質液（６０ｍｇの基
質を含む２０ｍｆｌ氷冷メタノールと、３０％Ｈ２Ｏ２
を６０μｐ含む１００ｍσＴＢＳを使用直前に混合して
調製）に膜を浸し、４５分間振盪した。蒸留水に膜を浸
し、軽く洗い、風乾した後写真をとり、イムノアッセイ
を行なった。
４）のプロッティングの終わったＰＶＤＦ膜をＴ Ｂ
Ｓ （２０ｍＭ ）リス、５００ｍＭ Ｎａ＋４ （ｐ
Ｈ７，５））に１０分間浸し、振盪する。ブロワキンダ
液（ＴＢＳに３％ゼラチンを加えたもの）に膜を浸し、
５分間振盪する。これをもう−度繰り返した後、ＴＴＢ
Ｓに１％ゼラチンを加えた抗体希釈液で３，０００倍に
希釈した一次抗体液（抗うットＭＴウサギＩｇＧ抗体の
抗体希釈液）に膜を浸し一晩振盪した。ＴＴＢＳ液（Ｔ
ＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたもの）に膜
を浸し、５分間振盪した。この操作をもう一度繰返した
後、ＧＡＲ−ＨＲＰ二次抗体液（山羊抗ウサギＩｇＧ抗
体、ホースラディシュベルオキシダーゼコンジュゲート
の抗体希釈液による３、０００倍希釈液）に膜を浸し、
１時間以上振盪した。ＴＴＢＳに膜を浸し、５分間振盪
する操作を２回繰返した後、ＴＢＳ液に膜を浸し、５分
間振盪する操作を１回繰返した。基質液（６０ｍｇの基
質を含む２０ｍｆｌ氷冷メタノールと、３０％Ｈ２Ｏ２
を６０μｐ含む１００ｍσＴＢＳを使用直前に混合して
調製）に膜を浸し、４５分間振盪した。蒸留水に膜を浸
し、軽く洗い、風乾した後写真をとり、イムノアッセイ
を行なった。
（６）ドツトプロットは、ダイズ（トヨスズツルコガネ
）根タンパク粗抽出液とラッＩ・メタロチオネイン溶液
とを前記に従い各々カルボキシメチル化し、１．０．１
．００１μｇ／μｐにそれぞれ希釈し、これらをニトロ
セルロース膜（ポアサイズは０．２μｍ）に各１μｐの
せ、１時間風乾の後ＥＩＡ法によりＭＴ様タンパクの存
在を認めた。−次抗体は１，０００倍希釈液を用いた。
）根タンパク粗抽出液とラッＩ・メタロチオネイン溶液
とを前記に従い各々カルボキシメチル化し、１．０．１
．００１μｇ／μｐにそれぞれ希釈し、これらをニトロ
セルロース膜（ポアサイズは０．２μｍ）に各１μｐの
せ、１時間風乾の後ＥＩＡ法によりＭＴ様タンパクの存
在を認めた。−次抗体は１，０００倍希釈液を用いた。
タンパク質のバンドは、銀染色法により染色した。染色
試薬は、第一化学薬品社製銀染色試薬「第一」を用い、
ｌ）Ｂ Ｍｏｒｅｎｏらの方法（Ｄａ Ｍｏｒｅｎ。
試薬は、第一化学薬品社製銀染色試薬「第一」を用い、
ｌ）Ｂ Ｍｏｒｅｎｏらの方法（Ｄａ Ｍｏｒｅｎ。
Ｍ、Ｒ，Ｓｍ１ｔｈ Ｊ、Ｆ、 ａｎｄ Ｓｍ１
ｔｈ Ｒ，Ｖ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉ。
ｔｈ Ｒ，Ｖ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉ。
ｃｈｅｍ、、 １５１．４６６−４７０（１９８５））
に準じて、クマシーブリリアントブルーで染色した。
に準じて、クマシーブリリアントブルーで染色した。
なお、標準タンパク質としては、分子量２５１０．６２
１０．８１６０．１４，４００及び１６，９５０のもの
を用いた。
１０．８１６０．１４，４００及び１６，９５０のもの
を用いた。
その結果、分子［１６，９５０付近にバンドが検出され
たことより、本発明タンパクの分子量は約１７ 、００
０と判断した。
たことより、本発明タンパクの分子量は約１７ 、００
０と判断した。
（７）亜鉛親和性の判定
Ｚｎ２＋プロツテイングはレスリーシッフの方法（Ｌｅ
ｓｌｉｅ Ａ、 ５ｃｈｉｆｆ、 Ｍａｘ Ｌ、 Ｎ１
ｂｅｒｔ ａｎｄ Ｂｅｒｎｏｒ−ｄ Ｎ、 Ｆｉｅｌ
ｄｓ； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ
、 ＵＳＡ、 ８５゜４１９５−４１９９． Ｊｕｎｅ
（１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に従い行
なった。すなわち、プロッティングの終わったＰＶＤＦ
膜を還元液（１０ｍＭ ）リス−ＨＣｆ１．０．５％２
−ＭＥ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ６，８））に浸し、１時
間振盪した。
ｓｌｉｅ Ａ、 ５ｃｈｉｆｆ、 Ｍａｘ Ｌ、 Ｎ１
ｂｅｒｔ ａｎｄ Ｂｅｒｎｏｒ−ｄ Ｎ、 Ｆｉｅｌ
ｄｓ； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ
、 ＵＳＡ、 ８５゜４１９５−４１９９． Ｊｕｎｅ
（１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に従い行
なった。すなわち、プロッティングの終わったＰＶＤＦ
膜を還元液（１０ｍＭ ）リス−ＨＣｆ１．０．５％２
−ＭＥ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ６，８））に浸し、１時
間振盪した。
膜を緩衝液（１０ｍＭ ）リス−Ｈ（Ｑ （１）Ｈ６、
８））に浸し、１時間振盪した。更に、膜上に”ＺｎＣ
Ｑ２溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣＱ（ｐＨ６，８）、１
μｃｉ／ｍ１６５ＺｎＣＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｆｆ
２．２ 、５ｍＭ ＣａＣ１１２，０，１Ｍ ＫＣＱ）
を１５顧のせ、１０分間静置した。膜を洗液（１０ｍＭ
）リス−ＨＣｒ１（ｐＨ６，８）、０．１ｍＭ ＫＣ
ｌ２）に浸し、１分間振盪した後、膜を２度洗った。当
該膜を間接法によるオートラジオグラフィー（コダック
ＸＯｍａｔ ＡＲ又はＰＲ）に−７０℃で１０時間か
けた。その結果、分子量１７，０００に相当する部分に
強いバンドが検出され、本発明タンパクが亜鉛に対し親
和性を有することが判った。
８））に浸し、１時間振盪した。更に、膜上に”ＺｎＣ
Ｑ２溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣＱ（ｐＨ６，８）、１
μｃｉ／ｍ１６５ＺｎＣＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｆｆ
２．２ 、５ｍＭ ＣａＣ１１２，０，１Ｍ ＫＣＱ）
を１５顧のせ、１０分間静置した。膜を洗液（１０ｍＭ
）リス−ＨＣｒ１（ｐＨ６，８）、０．１ｍＭ ＫＣ
ｌ２）に浸し、１分間振盪した後、膜を２度洗った。当
該膜を間接法によるオートラジオグラフィー（コダック
ＸＯｍａｔ ＡＲ又はＰＲ）に−７０℃で１０時間か
けた。その結果、分子量１７，０００に相当する部分に
強いバンドが検出され、本発明タンパクが亜鉛に対し親
和性を有することが判った。
以上
出願人 株式会社日本抗体研究所
Claims (1)
- （１）豆科植物の種子または根端より抽出され、以下に
示す性質を有するメタロチオネイン類似タンパク。 ［１］ラットの肝に存在するメタロチオネインに特異性
を有するポリクロナール抗体と交叉反応性を有する。 ［２］ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１７
，０００である。 ［３］亜鉛に対して親和性を有する。 ［４］１００℃５分間の加熱処理に対しても安定である
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6359589A JP2727216B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | メタロチオネイン類似タンパク |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6359589A JP2727216B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | メタロチオネイン類似タンパク |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02247200A true JPH02247200A (ja) | 1990-10-02 |
| JP2727216B2 JP2727216B2 (ja) | 1998-03-11 |
Family
ID=13233780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6359589A Expired - Lifetime JP2727216B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | メタロチオネイン類似タンパク |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2727216B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993014748A1 (en) | 1992-02-03 | 1993-08-05 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Remedy for dermatopathy and metallothionein inducer |
| JP2010276567A (ja) * | 2009-06-01 | 2010-12-09 | Kowa Co | 有害金属測定試薬及び測定方法 |
| CN107056935A (zh) * | 2016-09-27 | 2017-08-18 | 济南米铎碳新能源科技有限公司 | 金属硫蛋白的制备方法 |
-
1989
- 1989-03-17 JP JP6359589A patent/JP2727216B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993014748A1 (en) | 1992-02-03 | 1993-08-05 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Remedy for dermatopathy and metallothionein inducer |
| JP2010276567A (ja) * | 2009-06-01 | 2010-12-09 | Kowa Co | 有害金属測定試薬及び測定方法 |
| CN107056935A (zh) * | 2016-09-27 | 2017-08-18 | 济南米铎碳新能源科技有限公司 | 金属硫蛋白的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2727216B2 (ja) | 1998-03-11 |
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