JPH02249489A - 外来遺伝子断片発現用ベクター - Google Patents
外来遺伝子断片発現用ベクターInfo
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- JPH02249489A JPH02249489A JP7043189A JP7043189A JPH02249489A JP H02249489 A JPH02249489 A JP H02249489A JP 7043189 A JP7043189 A JP 7043189A JP 7043189 A JP7043189 A JP 7043189A JP H02249489 A JPH02249489 A JP H02249489A
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- expressing
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- restriction enzyme
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遺伝子組換え技法において、任意の蛋白遺伝
情報を有する外来遺伝子断片を大腸菌のプラスミドベク
ター中に組み込むことにより、該蛋白とβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合蛋白を大腸菌に生産せしめることを可能
とする外来遺伝子断片発現用ベクターを提供するもので
ある。
情報を有する外来遺伝子断片を大腸菌のプラスミドベク
ター中に組み込むことにより、該蛋白とβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合蛋白を大腸菌に生産せしめることを可能
とする外来遺伝子断片発現用ベクターを提供するもので
ある。
［従来の技術］
組換えＤＮＡ技術が１９７０年初頭に発表されて以来、
所望の外来遺伝子産物を大腸菌等の微生物に産生させる
方法は飛躍的な進歩を遂げた。
所望の外来遺伝子産物を大腸菌等の微生物に産生させる
方法は飛躍的な進歩を遂げた。
しかしながう、所望の外来遺伝子を挿入したことを確か
める方法は、挿入遺伝子と類似の遺伝子を放射性元素で
マーカーし、ハイブリダイゼーションを行って、遺伝子
が挿入されたことを確認する等の方法を使用していた。
める方法は、挿入遺伝子と類似の遺伝子を放射性元素で
マーカーし、ハイブリダイゼーションを行って、遺伝子
が挿入されたことを確認する等の方法を使用していた。
しかしながら、挿入した後に挿入体を選択することは手
間がかかり、尚かつ類似の遺伝子がない場合には全く手
に負えない状況であった。
間がかかり、尚かつ類似の遺伝子がない場合には全く手
に負えない状況であった。
一方、生体内の異物の侵入に対する自己防御機構（所謂
免疫機構）の解明に伴い、その免疫現象を利用した測定
方法である所謂免疫測定方法が活発に行われるようにな
り、特に特定の抗原に対してのみ反応するモノクローナ
ル抗体を使った抗原の定量が活発に行われるようになフ
た。これに伴いモノクローナル抗体を大量に生産するた
め、所望の抗原を大量に生産する組み換えＤＮＡ技術を
用いた培養が種々の方法で行われるに至った。
免疫機構）の解明に伴い、その免疫現象を利用した測定
方法である所謂免疫測定方法が活発に行われるようにな
り、特に特定の抗原に対してのみ反応するモノクローナ
ル抗体を使った抗原の定量が活発に行われるようになフ
た。これに伴いモノクローナル抗体を大量に生産するた
め、所望の抗原を大量に生産する組み換えＤＮＡ技術を
用いた培養が種々の方法で行われるに至った。
このため、酵素蛋白合成制御を調節するオペロン内に外
来遺伝子を挿入させ、酵素活性を選択マーカとして利用
することにより外来遺伝子挿入体を選択し、発現した外
来遺伝子と酵素遺伝子との融合蛋白を抗原として利用す
る方法が提案されている。
来遺伝子を挿入させ、酵素活性を選択マーカとして利用
することにより外来遺伝子挿入体を選択し、発現した外
来遺伝子と酵素遺伝子との融合蛋白を抗原として利用す
る方法が提案されている。
例えば、大腸菌のラクトースオペロンの構造遺伝子の一
つから合成されるβ−ガラクトシダーゼは、そのアミノ
末端を他の蛋白質のアミノ末端で置換しても酵素活性を
保持しており、外来蛋白質の全体もしくはその一部を結
合したβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白として大腸菌を用
いて生産させることが可能となった。
つから合成されるβ−ガラクトシダーゼは、そのアミノ
末端を他の蛋白質のアミノ末端で置換しても酵素活性を
保持しており、外来蛋白質の全体もしくはその一部を結
合したβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白として大腸菌を用
いて生産させることが可能となった。
このような融合蛋白の外来蛋白部分は一般に本来の抗原
性をも保持しているので、抗体の製造や検出に応用が可
能となるため、通常の方法では微量にしか得られない天
然の蛋白質の抗体を効率よく得ることが可能となった。
性をも保持しているので、抗体の製造や検出に応用が可
能となるため、通常の方法では微量にしか得られない天
然の蛋白質の抗体を効率よく得ることが可能となった。
遺伝子断片発現用ベクターとは、外来遺伝子断片をアミ
ノ末端部分をコードする遺伝子部分とアミノ末端を欠失
しているβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）間の
適当な制限酵素部位を有するリンカ一部位（クローニン
グ部位）に挿入し、３部分の遺伝子断片からコードされ
る融合蛋白として発現させるもので、外来遺伝子断片を
単にリンカ一部位に挿入するだけで、目的の融合蛋白を
発現させることができる。
ノ末端部分をコードする遺伝子部分とアミノ末端を欠失
しているβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）間の
適当な制限酵素部位を有するリンカ一部位（クローニン
グ部位）に挿入し、３部分の遺伝子断片からコードされ
る融合蛋白として発現させるもので、外来遺伝子断片を
単にリンカ一部位に挿入するだけで、目的の融合蛋白を
発現させることができる。
これまで知られている外来遺伝子断片発現用ベクターと
しては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）のア
ミノ末端近くにクローニング部位を挿入し、この部位に
外来遺伝子断片を挿入して融合蛋白として発現させるも
の（Ｋｏｅｎａｎら、ＥＭＢＯＪ、１，５０９−５１２
１９８２； Ｍｕｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 ＾ｃａｄ。
しては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）のア
ミノ末端近くにクローニング部位を挿入し、この部位に
外来遺伝子断片を挿入して融合蛋白として発現させるも
の（Ｋｏｅｎａｎら、ＥＭＢＯＪ、１，５０９−５１２
１９８２； Ｍｕｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 ＾ｃａｄ。
Ｓｃｉ、、’７９．６８５２−８８５５Ｈ５ｈｕｌｔｘ
ら、Ｃｅ１ｌ ３１，２２７−２３５１９８２） 、
アミノ末端をコードする遺伝子として大腸菌ＯｍｐＦ遺
伝子を用いるもの（Ｖｆｅｉｎｓｔｏｃｋら、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾８０，４４３２
−４４３６１９８３゜Ｅｌｆａｓｓｌ ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、 、８３．２２１９−２
２２２．１９８６ ） 、大腸菌ファージλのｃｌ遺伝
子（Ｇｒａｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃ
ｉ、Ｕｓ＾７９，６５９８−６６０２１９８２； Ｍａ
ｌｌｏｎら、Ｇｅｎｅ、４２；２４１−２５１，１９８
６ ；Ｃｈａｎｇ ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８．９
３−９６．１９８５）を用い、これとクローニング部位
を含むポリリンカーおよびアミノ末端を欠＜ １ａｃ
Ｚ遺伝子から成るものなどがあった。
ら、Ｃｅ１ｌ ３１，２２７−２３５１９８２） 、
アミノ末端をコードする遺伝子として大腸菌ＯｍｐＦ遺
伝子を用いるもの（Ｖｆｅｉｎｓｔｏｃｋら、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾８０，４４３２
−４４３６１９８３゜Ｅｌｆａｓｓｌ ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、 、８３．２２１９−２
２２２．１９８６ ） 、大腸菌ファージλのｃｌ遺伝
子（Ｇｒａｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃ
ｉ、Ｕｓ＾７９，６５９８−６６０２１９８２； Ｍａ
ｌｌｏｎら、Ｇｅｎｅ、４２；２４１−２５１，１９８
６ ；Ｃｈａｎｇ ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８．９
３−９６．１９８５）を用い、これとクローニング部位
を含むポリリンカーおよびアミノ末端を欠＜ １ａｃ
Ｚ遺伝子から成るものなどがあった。
また上記従来の外来遺伝子断片発現用ベクターのプロモ
ーターとしてはｌａｃオペロンのｌａｃプロモーター（
ｌａｃＰ）、 Ｏｍｐ Ｆ遺伝子のＯｍｐ Ｆプロモー
ターおよびλファージのλＰ、が使われていた。
ーターとしてはｌａｃオペロンのｌａｃプロモーター（
ｌａｃＰ）、 Ｏｍｐ Ｆ遺伝子のＯｍｐ Ｆプロモー
ターおよびλファージのλＰ、が使われていた。
［発明が解決しようとする課題］
しかしながら、 ＱｔｓｐＦプロモーターは浸透圧など
の環境因子によって発現が制御されており、そ９発現に
はＯｍｐＢｃｓ変異株（温度変異株）を用いる必要があ
り、使用におのずと制限があった。またλＰＬはＣＩ遺
伝子リプレッサーの制御下にあり、ＣＩ ｔｓ１５５７
のような高温（４２℃）で用いる必要があったため、自
ずと用途に制限があること等の欠点があった。また、１
ａｃＰプロモーター等はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（以下、ＩＰＴＧと記す）により抑制が解除
されるが、プロモータ活性が脆弱であった（発現させる
外来蛋白によって融合蛋白の産生量は変動すると考えら
れるが、β−ガラクトシダーゼを用いた融合蛋白の場合
には収量は全蛋白の１％以下である。）。
の環境因子によって発現が制御されており、そ９発現に
はＯｍｐＢｃｓ変異株（温度変異株）を用いる必要があ
り、使用におのずと制限があった。またλＰＬはＣＩ遺
伝子リプレッサーの制御下にあり、ＣＩ ｔｓ１５５７
のような高温（４２℃）で用いる必要があったため、自
ずと用途に制限があること等の欠点があった。また、１
ａｃＰプロモーター等はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（以下、ＩＰＴＧと記す）により抑制が解除
されるが、プロモータ活性が脆弱であった（発現させる
外来蛋白によって融合蛋白の産生量は変動すると考えら
れるが、β−ガラクトシダーゼを用いた融合蛋白の場合
には収量は全蛋白の１％以下である。）。
本発明では、実用性の高い外来遺伝子断片発現用ベクタ
ーを製作することを目的とする。
ーを製作することを目的とする。
Ｃ’Ｊ題を解決するための手段Ｊ
本発明の第１発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクター
では、宿主細菌内で発現可能な複製開始領域と、宿主細
菌に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子領域と
、酵素蛋白合成制御を調節するオペロンと、該オペロン
内に配置された外来遺伝子を挿入するポリリンカー部分
とを有し、外来遺伝子挿入を前記酵素活性により判別す
るベクターにおいて、 プラスミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモ
ーターと１ａｃＬＩＶｓプロモーターからなる合成プロ
モータである ｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と
、 プラスミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ
構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは
複数の制限酵素部位を有する前記ポリリンカー部分と、 プラスミドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β
−ガラクトシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とを
複製方向に沿って順に配置したものである。
では、宿主細菌内で発現可能な複製開始領域と、宿主細
菌に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子領域と
、酵素蛋白合成制御を調節するオペロンと、該オペロン
内に配置された外来遺伝子を挿入するポリリンカー部分
とを有し、外来遺伝子挿入を前記酵素活性により判別す
るベクターにおいて、 プラスミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモ
ーターと１ａｃＬＩＶｓプロモーターからなる合成プロ
モータである ｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と
、 プラスミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ
構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは
複数の制限酵素部位を有する前記ポリリンカー部分と、 プラスミドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β
−ガラクトシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とを
複製方向に沿って順に配置したものである。
本発明の第２発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクター
ｐＴＫ２では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片発
現用ベクターにおいて、サイズが１０．６Ｋｂで、プラ
スミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐
性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリ
ンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ （Ｎａｒｒ ）
、Ｂｇｌｌｌ ％ＰｓｔＩ ％５ｔｒｒａＩ、 Ｂａｍ
ＨＩであり、第１図の制限酵素切断地図で表わされるも
のである。
ｐＴＫ２では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片発
現用ベクターにおいて、サイズが１０．６Ｋｂで、プラ
スミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐
性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリ
ンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ （Ｎａｒｒ ）
、Ｂｇｌｌｌ ％ＰｓｔＩ ％５ｔｒｒａＩ、 Ｂａｍ
ＨＩであり、第１図の制限酵素切断地図で表わされるも
のである。
本発明の第３発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクター
ｐＴＫ３では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片発
現用ベクターにおいて、サイズが６、ＩＫｂで、プラス
ミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐性
遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリン
カー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ （Ｎａｒｒ ）、
Ｂｇｌｌｌ 、Ｐｓｔｌ 、５ｔｓａｌ 、 ＢａｍＨ
Ｉであり、第２図の制限酵素切断地図で表わされるもの
である。
ｐＴＫ３では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片発
現用ベクターにおいて、サイズが６、ＩＫｂで、プラス
ミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐性
遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリン
カー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ （Ｎａｒｒ ）、
Ｂｇｌｌｌ 、Ｐｓｔｌ 、５ｔｓａｌ 、 ＢａｍＨ
Ｉであり、第２図の制限酵素切断地図で表わされるもの
である。
本発明の′ｓ４発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクタ
ーｐＴＫ４では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片
発現用ベクターにおいて、サイズが６、ＩＫｂで、プラ
スミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐
性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリ
ンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ（Ｎａｒｌ ）、
Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｐｓｔ Ｉ ％５ｔｓａ Ｉ、８ａ
ａ＋ｆＨであり、第３図の制限酵素切断地図で表わされ
るものである。
ーｐＴＫ４では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片
発現用ベクターにおいて、サイズが６、ＩＫｂで、プラ
スミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質耐
性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリリ
ンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅＩ（Ｎａｒｌ ）、
Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｐｓｔ Ｉ ％５ｔｓａ Ｉ、８ａ
ａ＋ｆＨであり、第３図の制限酵素切断地図で表わされ
るものである。
・本発明の第５発明に係る外来遺伝子断片発現用ベクタ
ーｐＴＫ５では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片
発現用ベクターにおいて、−サイズが６．１にｂで、プ
ラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質
耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリ
リンカー部分の制限酵素部位がａｂｅ Ｉ （Ｎａｒ
Ｉ ）、Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｓａｌ Ｉ 、旧ｎｄ Ｉ
ＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｓｅａ ＩおよびＢａｍ［であり、第
４図の制限酵素切断地図で表わされるものである。
ーｐＴＫ５では、前記第１発明に記載の外来遺伝子断片
発現用ベクターにおいて、−サイズが６．１にｂで、プ
ラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物質
耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、前記ポリ
リンカー部分の制限酵素部位がａｂｅ Ｉ （Ｎａｒ
Ｉ ）、Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ｓａｌ Ｉ 、旧ｎｄ Ｉ
ＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｓｅａ ＩおよびＢａｍ［であり、第
４図の制限酵素切断地図で表わされるものである。
［作用］
大腸菌における蛋白質生産の効率の差は、遺伝子産物の
生産に影響している。このような遺伝子産物の生産に影
響する諸刃子は、 （１）転写の制御領域（オペレーター）とプロモー夕領
域及び転写終結配列の構造 （２）シャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列）を含むリ
ポソーム認識の構造 （３）アミノ酸を規定するコドンの使用頻度（４）蛋白
質の分泌などの局在化（分解からの保護）の問題 （５）遺伝子の量（コピー数）の問題 であり、特にプロモーターの強さを決めているのは、次
の因子がある。
生産に影響している。このような遺伝子産物の生産に影
響する諸刃子は、 （１）転写の制御領域（オペレーター）とプロモー夕領
域及び転写終結配列の構造 （２）シャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列）を含むリ
ポソーム認識の構造 （３）アミノ酸を規定するコドンの使用頻度（４）蛋白
質の分泌などの局在化（分解からの保護）の問題 （５）遺伝子の量（コピー数）の問題 であり、特にプロモーターの強さを決めているのは、次
の因子がある。
■ コンセンサス配列との相同性
■ ブリブナウ配列（−１０領域）と −３５領域との
距１１ｉ （１７ｂｐが最もよいとされている。）■
プロモーター近辺の配列のＡＴ含量また、リポソーム認
識の構造を詳しく付言するならば、ｍＲＮＡをテンプレ
ートとして翻訳が行われるにはｍＲＮＡと ３０ｓリボ
ゾームの１６ｓ ｒＲＮ＾の３°末端の適切な結合が必
要とされる。これを規定するのがシャイン・ダルガルノ
配列（ＳＤ配列）であり、１６ｓ ｒＲＮへの３゛末端
付近と相補性を持つ配列で、大腸菌の場合そのコンセン
サス配列は、５゛・・・＾ＧＧＡＧＧ・・・３゜ がこれに相当し、翻訳開始コドンＡｔ１Ｇの５〜１０塩
基上流に見出され、通常３〜５塩基の相同性を示す。
距１１ｉ （１７ｂｐが最もよいとされている。）■
プロモーター近辺の配列のＡＴ含量また、リポソーム認
識の構造を詳しく付言するならば、ｍＲＮＡをテンプレ
ートとして翻訳が行われるにはｍＲＮＡと ３０ｓリボ
ゾームの１６ｓ ｒＲＮ＾の３°末端の適切な結合が必
要とされる。これを規定するのがシャイン・ダルガルノ
配列（ＳＤ配列）であり、１６ｓ ｒＲＮへの３゛末端
付近と相補性を持つ配列で、大腸菌の場合そのコンセン
サス配列は、５゛・・・＾ＧＧＡＧＧ・・・３゜ がこれに相当し、翻訳開始コドンＡｔ１Ｇの５〜１０塩
基上流に見出され、通常３〜５塩基の相同性を示す。
本発明による外来遺伝子断片発現用ベクターでは、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモータ
ーとｔａｃｕｖｓプロモーターからなる合成プロモータ
である ｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ構造
遺伝子５゛末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは複数
の制限酵素部位を有するポリリンカー部分と、プラスミ
ドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β−ガラク
トシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とを複製方向
に沿って順に配置したものであるため、外来遺伝子断片
を挿入しＩ ＰＴＧで抑制解除した場合、高い発現率で
融合蛋白の産生が期待できる。
スミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモータ
ーとｔａｃｕｖｓプロモーターからなる合成プロモータ
である ｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ構造
遺伝子５゛末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは複数
の制限酵素部位を有するポリリンカー部分と、プラスミ
ドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β−ガラク
トシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とを複製方向
に沿って順に配置したものであるため、外来遺伝子断片
を挿入しＩ ＰＴＧで抑制解除した場合、高い発現率で
融合蛋白の産生が期待できる。
更に付言するならば、本発明に使用された ｔａｃプロ
モーター（Ｐｔａｃ）は、 ｔｒｐプロモーターの一３
５領域とｌａｃＵＶ５プロモーターの −１０領域（Ｐ
ｒｉｂｎｏｗｂｏｘ）からなる雑種プロモータで、１ａ
ｃＰ（野生型ラクトース・プロモーター）に比べてｌａ
ｃＵＶ５ （ｌａｃＰの変異したもの）は約１０倍、
ｔａｃプロモーターは、約５０倍活性が強い。
モーター（Ｐｔａｃ）は、 ｔｒｐプロモーターの一３
５領域とｌａｃＵＶ５プロモーターの −１０領域（Ｐ
ｒｉｂｎｏｗｂｏｘ）からなる雑種プロモータで、１ａ
ｃＰ（野生型ラクトース・プロモーター）に比べてｌａ
ｃＵＶ５ （ｌａｃＰの変異したもの）は約１０倍、
ｔａｃプロモーターは、約５０倍活性が強い。
また、本発明に使用された蛋白の翻訳開始シグナルとし
て、ｇａｌに翻訳開始シグナルを含む大腸菌ガラクトキ
ナーゼ構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌＫ’）は、 ＣＧＧＡＧ・・・９塩基・・・＾ＴＧ であり、大腸菌のＳＤ配列のコンセンサス配列に相同性
を有する。
て、ｇａｌに翻訳開始シグナルを含む大腸菌ガラクトキ
ナーゼ構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌＫ’）は、 ＣＧＧＡＧ・・・９塩基・・・＾ＴＧ であり、大腸菌のＳＤ配列のコンセンサス配列に相同性
を有する。
さらに、外来性の遺伝子断片を大腸菌中で融合蛋白の一
部として発現させる有用なベクターの特質には、 ■ 外来性遺伝子断片をクローニングする外来遺伝子発
現用ベクターに多様なりローニング部位（制限酵素切断
部位）があること ■ 宿主細菌に導入した際に、形質転換を行う選択マー
カとしての薬剤耐性遺伝子があること■ 分子サイズが
小さくコピー数が多いこと■ プロモータ活性の制御が
厳密に行われること等があり、具体的には本発明の別な
発明の外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２．ｐＴＫ
３．ｐＴＫ４．ｐＴＫ５が前記の特質を有する有用な外
来遺伝子断片発現用ベクターとなっている。
部として発現させる有用なベクターの特質には、 ■ 外来性遺伝子断片をクローニングする外来遺伝子発
現用ベクターに多様なりローニング部位（制限酵素切断
部位）があること ■ 宿主細菌に導入した際に、形質転換を行う選択マー
カとしての薬剤耐性遺伝子があること■ 分子サイズが
小さくコピー数が多いこと■ プロモータ活性の制御が
厳密に行われること等があり、具体的には本発明の別な
発明の外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２．ｐＴＫ
３．ｐＴＫ４．ｐＴＫ５が前記の特質を有する有用な外
来遺伝子断片発現用ベクターとなっている。
外来遺伝子断片を融合蛋白として大腸菌で発現させるた
めには、該遺伝子断片を、転写および翻訳開始４８号の
下流部分に正確に挿入しなければならない。
めには、該遺伝子断片を、転写および翻訳開始４８号の
下流部分に正確に挿入しなければならない。
また、これらの外来遺伝子断片発現用ベクターは、 １
ａｃＺ遺伝子の読み枠は、アミノ末端部分をコードする
遺伝子の読み枠とずれており、そのままでは大腸菌内で
活性なβ−ガラクトシダーゼを産生できなくなっており
、このような外来遺伝子断片発現用ベクターのクローニ
ング部位に適当な長さの外来遺伝子断片を挿入し、 １
ａｃＺの読み枠を５゛末端遺伝子の読み枠と正確に合致
させてやると、β−ガラクトシダーゼ活性を持つ融合蛋
白が産生されるようになる。
ａｃＺ遺伝子の読み枠は、アミノ末端部分をコードする
遺伝子の読み枠とずれており、そのままでは大腸菌内で
活性なβ−ガラクトシダーゼを産生できなくなっており
、このような外来遺伝子断片発現用ベクターのクローニ
ング部位に適当な長さの外来遺伝子断片を挿入し、 １
ａｃＺの読み枠を５゛末端遺伝子の読み枠と正確に合致
させてやると、β−ガラクトシダーゼ活性を持つ融合蛋
白が産生されるようになる。
活性なβ−ガラクトシダーゼを産生ずるコロニ−は、５
−ブロモー４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＭＢ２−グルコース培地
（Ｉ ＰＴＧの存在下）上で濃青色のコロニーとして容
易に検出される。
−ブロモー４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＭＢ２−グルコース培地
（Ｉ ＰＴＧの存在下）上で濃青色のコロニーとして容
易に検出される。
また、本発明の外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２
．ｐＴＫ５については、徴工研菌寄第１０６２２号、徴
工研菌寄第１０６２３号として既に寄託されており、本
発明の他の外来遺伝子断片発現用ベクターであるｐＴＫ
３．ｐＴＫ４については、ｐＴＫ２を使って本実施例に
開示されている操作により、またｐＴｋ５を使って本実
施例に開示されている逆の操作により得られるため、菌
の寄託の必要性は認められなかった。
．ｐＴＫ５については、徴工研菌寄第１０６２２号、徴
工研菌寄第１０６２３号として既に寄託されており、本
発明の他の外来遺伝子断片発現用ベクターであるｐＴＫ
３．ｐＴＫ４については、ｐＴＫ２を使って本実施例に
開示されている操作により、またｐＴｋ５を使って本実
施例に開示されている逆の操作により得られるため、菌
の寄託の必要性は認められなかった。
［実施例］
本発明による一連の外来遺伝子断片発現用ベクターの作
成方法を以下に述べる。
成方法を以下に述べる。
宿主菌としては、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉに−１２ＪＭ１０
３株（△１ａｃ−ｐｒｏ、ｔｈｉ、５ｔｒＡ、５ｕｐＥ
、ｅｎｄ＾、５ｂｃＢ、ｈｓｄＲ−、Ｆ。
３株（△１ａｃ−ｐｒｏ、ｔｈｉ、５ｔｒＡ、５ｕｐＥ
、ｅｎｄ＾、５ｂｃＢ、ｈｓｄＲ−、Ｆ。
ｔｒａＤ３６．ｐｒｏＡＢ、１ａｃｌｑ、Ｚ△Ｍ１５）
を用いた。
を用いた。
ＪＭＩ ０３株および外来遺伝子断片を挿入したプラス
ミドベクターを持つＪＭ１０３株はＬＢ培地（バクト・
トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製） １０ｇ 、酵母エキス
（Ｄｉｆｃｏ社製） ５ｇ、塩化ナトリウム １０ｇ、
水ｌＩ１．、ｐｉ（７，５）またはＬＢ寒天平板上で必
要に応じアンピシリン（以下、Ａｐと記す）（明治製菓
社製）５０ｇｇ／ｍｌを加え、培養した。
ミドベクターを持つＪＭ１０３株はＬＢ培地（バクト・
トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製） １０ｇ 、酵母エキス
（Ｄｉｆｃｏ社製） ５ｇ、塩化ナトリウム １０ｇ、
水ｌＩ１．、ｐｉ（７，５）またはＬＢ寒天平板上で必
要に応じアンピシリン（以下、Ａｐと記す）（明治製菓
社製）５０ｇｇ／ｍｌを加え、培養した。
β−ガラクトシダーゼ活性を有するクローンは、平板ま
たはＡｐおよび５−ブロモ−４−クロル−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（４０ｇｇ／＋１．以下、Ｘ
−ｇａｌと略す）（シグマ社製）及び１ｍＭＩＰＴＧを
含むＭＢ２−グルコース寒天平板培地上（にＨ２ＰＯ４
１３，６ｇ、 （ＮＨ４）２ｓｏ４２．Ｏｇ、 ０．５
ｋＦａＳＯ４”７８２００．１ｍｌ、 １ＭＭｇ５Ｏ４
４Ｈ２０１，０＋１１１．２０Ｘｇｌｕｃｏｓｅ １０
ａｌ、 ０．１９ｇｔｈｉａｍｉｎａ １．Ｏｍｌ、
Ｈ２Ｏにて１ｕ 、８Ｎ ＭｏｌにてｐＨ７，０，Ｂａ
ｔｏａｇａｒ１５ｇ）で培養し、濃青色を呈するコロニ
ーとして選択した。
たはＡｐおよび５−ブロモ−４−クロル−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（４０ｇｇ／＋１．以下、Ｘ
−ｇａｌと略す）（シグマ社製）及び１ｍＭＩＰＴＧを
含むＭＢ２−グルコース寒天平板培地上（にＨ２ＰＯ４
１３，６ｇ、 （ＮＨ４）２ｓｏ４２．Ｏｇ、 ０．５
ｋＦａＳＯ４”７８２００．１ｍｌ、 １ＭＭｇ５Ｏ４
４Ｈ２０１，０＋１１１．２０Ｘｇｌｕｃｏｓｅ １０
ａｌ、 ０．１９ｇｔｈｉａｍｉｎａ １．Ｏｍｌ、
Ｈ２Ｏにて１ｕ 、８Ｎ ＭｏｌにてｐＨ７，０，Ｂａ
ｔｏａｇａｒ１５ｇ）で培養し、濃青色を呈するコロニ
ーとして選択した。
β−ガラクトシダーゼの誘導は培地に１ｍＭＩＰＴＧ（
イソプロとルチオーβ−Ｄ−ガラクトシド）（シグマ社
）を添加して行った。
イソプロとルチオーβ−Ｄ−ガラクトシド）（シグマ社
）を添加して行った。
制限酵素は宝酒造株式会社および東洋紡株式会社より入
手した。
手した。
Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメント（以下、 Ｐｏ１ＩＫと記す）Ｔ４ＤＮ
＾リガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリ
ヌクレオチド・キナーゼは東洋紡株式会社から入手した
。
ｗフラグメント（以下、 Ｐｏ１ＩＫと記す）Ｔ４ＤＮ
＾リガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリ
ヌクレオチド・キナーゼは東洋紡株式会社から入手した
。
ＯＮへの切断、修飾、分離、回収などは、ア・ラボラト
リ−・マニュアルの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅ
ｔａｌ、、 （１９８２） 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａ
ｒｇｅλ、 ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） に準じて行った。
リ−・マニュアルの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅ
ｔａｌ、、 （１９８２） 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａ
ｒｇｅλ、 ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） に準じて行った。
プラスミド［）ＮＡはアルカリ溶菌法で調製し、臭化エ
チジウムを含む塩化セシウム密度勾配遠心によって精製
した。
チジウムを含む塩化セシウム密度勾配遠心によって精製
した。
クローニング部位を含む合成オリゴヌクレオチドリンカ
ーはＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステム（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔａｍｓ）社）を用い、フ
ォスフオールアミダイト法（Ｈｅｒｏｎ、Ｅ、Ｊ、、
（１９８４）Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅ
ｄ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＡＩ。
ーはＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステム（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔａｍｓ）社）を用い、フ
ォスフオールアミダイト法（Ｈｅｒｏｎ、Ｅ、Ｊ、、
（１９８４）Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅ
ｄ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＡＩ。
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌａｂ、５ｅｐｔｅａ＋ｂｅｒ）で合
成した。
成した。
実施例１
本発明に係る一連の外来遺伝子断片発現ベクターは第５
図に示す方法に従って作成した。
図に示す方法に従って作成した。
まず、ｔａｃプロモーター １ａｃオペレーターおよび
シャインーダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列と記す）を
含むガラクトキナーゼ遺伝子（以下、ｇａｌＫと記す）
の５°末末端上流列、を有するプラスミドＰＤＲ５４０
（東洋紡■製）（１ｕｇ）を用い、そのｇａｌＫ遺伝子
のヌクレオチド番号７２〜７７にある唯一のＢｂｅＩ
（Ｎａｒｌ ）切断部位で切断した。生じた３°突出末
端をｔ４ ＩＩＮＡポリメラーゼで消化し、更に５°末
端を子牛小腸アルカリフォスファターゼで脱リン酸化し
た。
シャインーダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列と記す）を
含むガラクトキナーゼ遺伝子（以下、ｇａｌＫと記す）
の５°末末端上流列、を有するプラスミドＰＤＲ５４０
（東洋紡■製）（１ｕｇ）を用い、そのｇａｌＫ遺伝子
のヌクレオチド番号７２〜７７にある唯一のＢｂｅＩ
（Ｎａｒｌ ）切断部位で切断した。生じた３°突出末
端をｔ４ ＩＩＮＡポリメラーゼで消化し、更に５°末
端を子牛小腸アルカリフォスファターゼで脱リン酸化し
た。
この直鎖状のｐＤＲ５４０に挿入されたときにＢｂｅＩ
（Ｍａｒｌ ）部位が再生され、かつそれに隣接して
Ｂａ１ｌ、ＰｓｔｌおよびＳｍａＩ部位を有するように
設計された塩基配列を持っ２３−ｍａｒ合成ポリリンカ
ー（５−ＧＣＧＣ（：ＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣ
ＧＧＧ ）を合成し、これをＴ４ポリヌクレオチド・キ
ナーゼで５゛末端をリン酸化したもの（２５０ｎｇ）を
、Ｔ４リガーゼを用いて先の直鎮状のｐ Ｄ Ｒ５４０
（２５０Ｂ）に挿入した。
（Ｍａｒｌ ）部位が再生され、かつそれに隣接して
Ｂａ１ｌ、ＰｓｔｌおよびＳｍａＩ部位を有するように
設計された塩基配列を持っ２３−ｍａｒ合成ポリリンカ
ー（５−ＧＣＧＣ（：ＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣ
ＧＧＧ ）を合成し、これをＴ４ポリヌクレオチド・キ
ナーゼで５゛末端をリン酸化したもの（２５０ｎｇ）を
、Ｔ４リガーゼを用いて先の直鎮状のｐ Ｄ Ｒ５４０
（２５０Ｂ）に挿入した。
これをＪＭ１０３株に形質転換し、Ａｐを含むＬＢ寒天
平板上に生じるコロニーについて、そのプラスミドを適
当な制限酵素を用いて分析し、 ｇａｌＫ遺伝子の５°
末端に近接してＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ ）部位を再生し
ているプラスミドを得てｐＴＫ １とした。
平板上に生じるコロニーについて、そのプラスミドを適
当な制限酵素を用いて分析し、 ｇａｌＫ遺伝子の５°
末端に近接してＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ ）部位を再生し
ているプラスミドを得てｐＴＫ １とした。
このｐＴＫｌ （５μｇ）をＥｃｏＲＩと Ｓｍａ Ｉ
で切断し、大きさ０．７にｂの、ｔａｃプロモーター
１ａｃオペレーター ｇａｌＫ遺伝子のＳＤ配列とアミ
ノ末端の２４個のアミノ酸をコードする配列（ｇａｌＫ
’遺伝子）および制限酵素部位（ＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ
）。
で切断し、大きさ０．７にｂの、ｔａｃプロモーター
１ａｃオペレーター ｇａｌＫ遺伝子のＳＤ配列とアミ
ノ末端の２４個のアミノ酸をコードする配列（ｇａｌＫ
’遺伝子）および制限酵素部位（ＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ
）。
８ｇ目＋ 、Ｐｓｔｌ 、ＳｍａＩ ）を含むポリリン
カーを有するＤＮＡ断片を、１％低融点アガロースゲル
電気泳動によって分ｍ精製した。
カーを有するＤＮＡ断片を、１％低融点アガロースゲル
電気泳動によって分ｍ精製した。
一方、アミノ末端８個のアミノ酸を欠失した’ ｌａｃ
Ｚ遺伝子とそのすぐ５′末端上流にＥｃｏＲＩ、Ｓｍ
ａ ＩおよびＢａｍ）ＩＩ部位を持つＰＭＣ１４０３（
Ｃａｓａｄａｂａｎｍ、Ｍ、Ｊ、 ら、Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、１４３．９７１−９８０、１９８０
東大応微研所有）（ｔμｇ）をＥｃｏＲＩＳｍａ Ｉ
で切断し、子牛小腸フォスファターゼで脱リン酸化した
。これにｐＴＫｌの０．７にｂ ＥｃｏＲＩ−Ｓｍａ
Ｉ断片（２５０ｎｇ）をＴ４リガーゼを用いて挿入し、
これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＭＢ２−グルコース寒天平板上に生じるコロニ
ーを得た。これらのクローンからプラスミドを調製し、
ポリリンカーの有する制限酵素部位をすべて持つプラス
ミドをｐＴに２とした。第１図は得られたプラスミドｐ
ＴＫ２の制限酵素切断地図である。
Ｚ遺伝子とそのすぐ５′末端上流にＥｃｏＲＩ、Ｓｍ
ａ ＩおよびＢａｍ）ＩＩ部位を持つＰＭＣ１４０３（
Ｃａｓａｄａｂａｎｍ、Ｍ、Ｊ、 ら、Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、１４３．９７１−９８０、１９８０
東大応微研所有）（ｔμｇ）をＥｃｏＲＩＳｍａ Ｉ
で切断し、子牛小腸フォスファターゼで脱リン酸化した
。これにｐＴＫｌの０．７にｂ ＥｃｏＲＩ−Ｓｍａ
Ｉ断片（２５０ｎｇ）をＴ４リガーゼを用いて挿入し、
これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＭＢ２−グルコース寒天平板上に生じるコロニ
ーを得た。これらのクローンからプラスミドを調製し、
ポリリンカーの有する制限酵素部位をすべて持つプラス
ミドをｐＴに２とした。第１図は得られたプラスミドｐ
ＴＫ２の制限酵素切断地図である。
この外来遺伝子断片発現用ベクターでは°ｌａｃ Ｚ遺
伝子はアミノ末端をコードするｇａｌＫ’遺伝子の読み
枠とは、ポリリンカーの介在によフてずれており、この
雑種遺伝子は表現形としては １ａｃＺ−である。
伝子はアミノ末端をコードするｇａｌＫ’遺伝子の読み
枠とは、ポリリンカーの介在によフてずれており、この
雑種遺伝子は表現形としては １ａｃＺ−である。
この外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２は大きさが
１０．８Ｋｂであり、 ｇａｌＫ’遺伝子と°ｌａｃ
Ｚ遺伝子との間に、５゛側から ＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ
）、 ＢｇｌＩＩ、Ｐｓｔｒ 、ＳｍａｌおよびＢａ
ｍＨ１部位があり、このうちＢｇｌＩＩおよびＳｍａ１
部位は唯一の制限酵素のサイトであるので、外来遺伝子
断片発現用ベクターのクローニングに用いることができ
る。
１０．８Ｋｂであり、 ｇａｌＫ’遺伝子と°ｌａｃ
Ｚ遺伝子との間に、５゛側から ＢｂｅＩ （Ｎａｒｌ
）、 ＢｇｌＩＩ、Ｐｓｔｒ 、ＳｍａｌおよびＢａ
ｍＨ１部位があり、このうちＢｇｌＩＩおよびＳｍａ１
部位は唯一の制限酵素のサイトであるので、外来遺伝子
断片発現用ベクターのクローニングに用いることができ
る。
実施例２
つぎに、更により有用な外来遺伝子断片発現用ベクター
を作成するために、ｐＴＫ２の改良を第６図に示す方法
に従って以下のように行った。
を作成するために、ｐＴＫ２の改良を第６図に示す方法
に従って以下のように行った。
ＰＴＫ２ （５μｇ）をＥｃｏＲｒ、口ｒａＩおよび５
ａｌｌによフて切断し、０．８％低融点アガロースゲル
電気泳動によって、最大のＥｃｏＲＩ −Ｄｒａ Ｉ断
片を分離精製した。
ａｌｌによフて切断し、０．８％低融点アガロースゲル
電気泳動によって、最大のＥｃｏＲＩ −Ｄｒａ Ｉ断
片を分離精製した。
この断片は大きさが３．８Ｋｂであり、ｔａｃプロモー
ター、Ｉａｃオペレーター ｇａｌＫ遺伝子のＳＤ配列
およびアミノ末端（ｇａｌＫ’遺伝子）、クローニング
部位を含むポリリンカー部分、′ｌａｃＺ遺伝子および
１ａｃＹ遺伝子のアミノ末端部分（１ａｃＹ’遺伝子）
を含んでいる。
ター、Ｉａｃオペレーター ｇａｌＫ遺伝子のＳＤ配列
およびアミノ末端（ｇａｌＫ’遺伝子）、クローニング
部位を含むポリリンカー部分、′ｌａｃＺ遺伝子および
１ａｃＹ遺伝子のアミノ末端部分（１ａｃＹ’遺伝子）
を含んでいる。
一方、ｐＢＲ３２２のＡＰ遺伝子上のＰｓｔｆ部位を除
くために、以下の操作を行った。すなわち、ｐＢＲ３２
２を ＢｇｌｌおよびＰｖｕｌｌで処理して得た断片と
、ＰｓｔＩ部位を欠いたＡｐ遺伝子を有するプラスミド
ＰＫＫＩ ７７−３ （西ドイツＦｒｅｉｂｕｒｇ大学
Ｂ、Ｒａｋ氏より入手）をＢｇｌ Ｉおよびｐｖｕｌｌ
で処理して得た断片（２５３ｂｐ） とからＰｓｔ１
部位を欠いたｐＢＲ３２２△Ｐｓｔｌを得た。
くために、以下の操作を行った。すなわち、ｐＢＲ３２
２を ＢｇｌｌおよびＰｖｕｌｌで処理して得た断片と
、ＰｓｔＩ部位を欠いたＡｐ遺伝子を有するプラスミド
ＰＫＫＩ ７７−３ （西ドイツＦｒｅｉｂｕｒｇ大学
Ｂ、Ｒａｋ氏より入手）をＢｇｌ Ｉおよびｐｖｕｌｌ
で処理して得た断片（２５３ｂｐ） とからＰｓｔ１
部位を欠いたｐＢＲ３２２△Ｐｓｔｌを得た。
このｐＢＲ３２２ΔＰｓｔｌ （５μｇ）をＥｃｏＲＩ
と ｐｖｕｌｌで切断し、０．８％低融点アガロースゲ
ル電気泳動によって分離精製し、Ａｐ遺伝子と複製開始
点を含む大きさ２．３にｂのＤＮＡ断片を得た。
と ｐｖｕｌｌで切断し、０．８％低融点アガロースゲ
ル電気泳動によって分離精製し、Ａｐ遺伝子と複製開始
点を含む大きさ２．３にｂのＤＮＡ断片を得た。
ｐＴＫ２由来の３．８にｂ Ｅｃｏ−ＲＩ 、−Ｄｒａ
Ｉ ＤＮＡ断片（２５０ｎｇ）とｐＢＲ３２２誘導
体（ｐＢＲ３２２△ＰｓｔＢ由来の２．３にｂ ＤＮＡ
断片（２５Ｑｎｇ）をＴ４リガーゼを用いて環状化し、
これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＭＢ２−グルコース寒天平板上に生じる白色コ
ロニーを得た。これらのクローンからプラスミドを調製
し、制限酵素を用いて分析し、求めるクローンを得、こ
れをｐＴＫ３とした。第２図は得られたプラスミドｐＴ
Ｋ３の制限酵素切断地図である。
Ｉ ＤＮＡ断片（２５０ｎｇ）とｐＢＲ３２２誘導
体（ｐＢＲ３２２△ＰｓｔＢ由来の２．３にｂ ＤＮＡ
断片（２５Ｑｎｇ）をＴ４リガーゼを用いて環状化し、
これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＭＢ２−グルコース寒天平板上に生じる白色コ
ロニーを得た。これらのクローンからプラスミドを調製
し、制限酵素を用いて分析し、求めるクローンを得、こ
れをｐＴＫ３とした。第２図は得られたプラスミドｐＴ
Ｋ３の制限酵素切断地図である。
このｐＴＫ３上のＥｃｏＲ１部位とｔａｃプｏモーター
の間にある単一のＨｉｎｄｍ部位を除去するために、ｐ
ＴＫ３（ｌμｇ）を）Ｉ ｌ ｎ ｄ ＩＩＩで切断し
、 Ｐｏ１ＩＫを用いて５“突出末端を２重鎮とし、平
滑末端としたのち、再びＴ４ＤＮ＾リガーゼで環状化し
た。これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−
ｇａｌを含むＭ２Ｓ−グルコース寒天平板上に生じる。
の間にある単一のＨｉｎｄｍ部位を除去するために、ｐ
ＴＫ３（ｌμｇ）を）Ｉ ｌ ｎ ｄ ＩＩＩで切断し
、 Ｐｏ１ＩＫを用いて５“突出末端を２重鎮とし、平
滑末端としたのち、再びＴ４ＤＮ＾リガーゼで環状化し
た。これをＪＭ１０３株に形質転換し、ＡｐおよびＸ−
ｇａｌを含むＭ２Ｓ−グルコース寒天平板上に生じる。
コロニーを得た。求める旧ｎ ｄ １１１部位を欠いた
ものをｐＴＫ４とした。第３図は得られたプラスミドｐ
ＴＫ４の制限酵素切断地図である。
ものをｐＴＫ４とした。第３図は得られたプラスミドｐ
ＴＫ４の制限酵素切断地図である。
このｐＴＫ４ （１μｇ ）をＢｇｌｌｌとＳｍａ Ｉ
で切断、直線化したのち、子牛小腸アルカリフォスター
ゼで脱リン酸化した。一方、十鎖２Ｂ−ｍａｒ、−鎖２
２−＋＋ｅｒからなる一本鎖部分を含む相補的な合成２
重鎖ポリリンカーを調製し、これをＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼで５°末端をリン酸化した。この合成ポリリ
ンカーは前述の直線化されたｐＴＫ４に挿入されると、
隣接して Ｂｇｌｌｌ 、 Ｓａｌ Ｉ ％Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ％ Ｐｓｔｆ、および５ｔｒａｒ部位を与えるよ
うに設計されている。このポリリンカー（２５０ｎｇ）
を直線状ｐ Ｔ Ｋ ４ （２５０ｎｇ）にＴ４［ＩＮ
Ａリガーゼを用いて挿入し、前述の方法に従って求める
プラスミドｐＴＫ５を得た。第４図は得られたプラスミ
ドｐＴＫ５の制限酵素切断地図である。
で切断、直線化したのち、子牛小腸アルカリフォスター
ゼで脱リン酸化した。一方、十鎖２Ｂ−ｍａｒ、−鎖２
２−＋＋ｅｒからなる一本鎖部分を含む相補的な合成２
重鎖ポリリンカーを調製し、これをＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼで５°末端をリン酸化した。この合成ポリリ
ンカーは前述の直線化されたｐＴＫ４に挿入されると、
隣接して Ｂｇｌｌｌ 、 Ｓａｌ Ｉ ％Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ％ Ｐｓｔｆ、および５ｔｒａｒ部位を与えるよ
うに設計されている。このポリリンカー（２５０ｎｇ）
を直線状ｐ Ｔ Ｋ ４ （２５０ｎｇ）にＴ４［ＩＮ
Ａリガーゼを用いて挿入し、前述の方法に従って求める
プラスミドｐＴＫ５を得た。第４図は得られたプラスミ
ドｐＴＫ５の制限酵素切断地図である。
このようにして得られた外来遺伝子断片発現用ベクター
ｐＴＫ５は大きさ６．１ｋｂで、 ｇａｌＫ’遺伝子と
°１ａｃＺ遺伝子の間に唯一のＢｂｅＩ （ＭａｒＩ
）、Ｂｇｌ ｆｌ 、 Ｓａｌ Ｅ 、旧ｎ、ｄ ＩＩ
Ｉ 、 Ｐｓ ｔ、ＩおよびＳｉａ １部位を持ち、こ
れらの部位に外来遺伝子断片をクローニングすることが
で幹る。
ｐＴＫ５は大きさ６．１ｋｂで、 ｇａｌＫ’遺伝子と
°１ａｃＺ遺伝子の間に唯一のＢｂｅＩ （ＭａｒＩ
）、Ｂｇｌ ｆｌ 、 Ｓａｌ Ｅ 、旧ｎ、ｄ ＩＩ
Ｉ 、 Ｐｓ ｔ、ＩおよびＳｉａ １部位を持ち、こ
れらの部位に外来遺伝子断片をクローニングすることが
で幹る。
このようにして作成した一連の外来遺伝子断片発現用ベ
クターはｇａｌに′遺伝子と゛１ａｃＺ遺伝子との間に
３ｎ＋２個のヌクレオチドからなるポリリカーを有する
ので、これらのクローニング部位に３ｎ＋１個のヌクレ
オチドからなる外来遺伝子断片を挿入すれば、ｇａｌＫ
’遺伝子と゛１ａｃＺ遺伝子の読み枠が一致し、活性の
あるβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白が産生される。
クターはｇａｌに′遺伝子と゛１ａｃＺ遺伝子との間に
３ｎ＋２個のヌクレオチドからなるポリリカーを有する
ので、これらのクローニング部位に３ｎ＋１個のヌクレ
オチドからなる外来遺伝子断片を挿入すれば、ｇａｌＫ
’遺伝子と゛１ａｃＺ遺伝子の読み枠が一致し、活性の
あるβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白が産生される。
実施例３
前記実施例２で得られたｐＴＫ５ （１μｇ）をＳｍａ
ｌｌで切断し、２２−ａｅｒの合成オリゴニクレオチド
（２５０ｎｇ）をＴ４ＤＮ＾リガーゼを用いて挿入した
。得られたプラスミドをＪＭ１０３株に形質転換し、Ａ
ｐ、Ｘ−ｇａｌおよびＩ ＰＴＧを含むＭ２Ｓ−グルコ
ース寒天平板上に生じる濃青色のコロニーを選択した。
ｌｌで切断し、２２−ａｅｒの合成オリゴニクレオチド
（２５０ｎｇ）をＴ４ＤＮ＾リガーゼを用いて挿入した
。得られたプラスミドをＪＭ１０３株に形質転換し、Ａ
ｐ、Ｘ−ｇａｌおよびＩ ＰＴＧを含むＭ２Ｓ−グルコ
ース寒天平板上に生じる濃青色のコロニーを選択した。
得られたβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクーロンを、
Ａｐおよび１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、こ
れをレムリ（Ｌａｅｍａｌｉ、Ｕ。
Ａｐおよび１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養し、こ
れをレムリ（Ｌａｅｍａｌｉ、Ｕ。
に、、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ ２２７，６８０ （１９
７０））の方法に従フて１０％５ＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動により分析すると、β−ガラクトシダーゼ
融合蛋白が産生されていることが確認された。
７０））の方法に従フて１０％５ＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動により分析すると、β−ガラクトシダーゼ
融合蛋白が産生されていることが確認された。
［発明の効果］
本発明による外来遺伝子断片発現用ベクターでは、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモータ
ーとｌａｃＵＶ５プロモーターからなる合成プロそ一タ
である ｔａｃプロモーター部分（ＰｔａＣ）と、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ構造
遺伝子５′末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは複数
の制限酵素部位を有するポリリンカー部分と、プラスミ
ドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β−ガラク
トシダーゼ構造遺伝子部分（’Ｊａｃｋ）とを複製方向
に沿って順に配置したものであるため、外来遺伝子断片
を挿入した場合高い発現率で融合蛋白の産生を期待でき
る。
スミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモータ
ーとｌａｃＵＶ５プロモーターからなる合成プロそ一タ
である ｔａｃプロモーター部分（ＰｔａＣ）と、プラ
スミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ構造
遺伝子５′末端部分（ｇａｌに°）と、１もしくは複数
の制限酵素部位を有するポリリンカー部分と、プラスミ
ドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５°末端欠落β−ガラク
トシダーゼ構造遺伝子部分（’Ｊａｃｋ）とを複製方向
に沿って順に配置したものであるため、外来遺伝子断片
を挿入した場合高い発現率で融合蛋白の産生を期待でき
る。
更に付言するならば、本発明に使用された ｔａｃプロ
モーター部分（Ｐｔａｃ）は、 ｔｒｐプロモーターの
一３５領域とｌａｃＵＶ５プロモーターの ＝ｌＯ領域
（Ｐｒｉｂｎｏｗ ｂｏｘ）からなる雑種プロモーター
で、１ａｃＰ （野生型ラクトース・プロそ一ター）に
比べてＩａｃｌｌＶ５（１ａｃＰの変異したもの）は約
１０倍、 ｔａｃプロモーターは、約５０倍活性が強い
。
モーター部分（Ｐｔａｃ）は、 ｔｒｐプロモーターの
一３５領域とｌａｃＵＶ５プロモーターの ＝ｌＯ領域
（Ｐｒｉｂｎｏｗ ｂｏｘ）からなる雑種プロモーター
で、１ａｃＰ （野生型ラクトース・プロそ一ター）に
比べてＩａｃｌｌＶ５（１ａｃＰの変異したもの）は約
１０倍、 ｔａｃプロモーターは、約５０倍活性が強い
。
また、本発明において蛋白の翻訳開始シグナルとして使
用されたｇａｌに翻訳開始シグナルを含む大腸菌ガラク
トキナーゼ構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌＫ’）は、 ＣＧＧＡＧ・・・９塩基・・・ＡＴＧ の配列をもち、そのＳＤ配列は大腸菌ＳＤのコンセンサ
ス配列に近似しており、外来遺伝子を挿入した場合、効
率よく融合蛋白が発現することが期待でき、該融合蛋白
により抗原の大量生産が可能となる等の効果が期待でき
る。
用されたｇａｌに翻訳開始シグナルを含む大腸菌ガラク
トキナーゼ構造遺伝子５°末端部分（ｇａｌＫ’）は、 ＣＧＧＡＧ・・・９塩基・・・ＡＴＧ の配列をもち、そのＳＤ配列は大腸菌ＳＤのコンセンサ
ス配列に近似しており、外来遺伝子を挿入した場合、効
率よく融合蛋白が発現することが期待でき、該融合蛋白
により抗原の大量生産が可能となる等の効果が期待でき
る。
さらに、外来性の遺伝子断片を大腸菌中で融合蛋白の一
部として発現させる有用なベクターの特質として、外来
性遺伝子断片をクローニングする外来遺伝子発現用ベク
ターに多様なマルチクローニング部位があり、また宿主
細菌に導入した際に、形質転換を行う選択マーカとして
のＡｐ耐性遺伝子がある本発明の別な発明の外来遺伝子
断片発現用ベクターｐＴＫ２．ＰＴＫ３．ｐＴＫ４゜ｐ
ＴＫ５は、実用性の高い有用な外来遺伝子断片発現用ベ
クターである。
部として発現させる有用なベクターの特質として、外来
性遺伝子断片をクローニングする外来遺伝子発現用ベク
ターに多様なマルチクローニング部位があり、また宿主
細菌に導入した際に、形質転換を行う選択マーカとして
のＡｐ耐性遺伝子がある本発明の別な発明の外来遺伝子
断片発現用ベクターｐＴＫ２．ＰＴＫ３．ｐＴＫ４゜ｐ
ＴＫ５は、実用性の高い有用な外来遺伝子断片発現用ベ
クターである。
伝子断片発現ベクターｐＴＫ４の制限酵素切断地図、第
４図は本発明による外来遺伝子断片発現ベクターｐＴＫ
５の制限酵素切断地図、第５図は本発明による外来遺伝
子断片発現ベクターの作成方法を示す説明図、第６図は
本発明による他の外来遺伝子断片発現ベクターの作成方
法を示す説明図である。
４図は本発明による外来遺伝子断片発現ベクターｐＴＫ
５の制限酵素切断地図、第５図は本発明による外来遺伝
子断片発現ベクターの作成方法を示す説明図、第６図は
本発明による他の外来遺伝子断片発現ベクターの作成方
法を示す説明図である。
代理人 弁理士 佐 藤 正 年
第１図は本発明による外来遺伝子断片発現ベクターｐＴ
Ｋ２の制限酵素切断地図、第２図は本発明による外来遺
伝子断片発現ベクターｐ”ｒに３の制限酵素切断地図、
第３図は本発明による外来遺第４図
Ｋ２の制限酵素切断地図、第２図は本発明による外来遺
伝子断片発現ベクターｐ”ｒに３の制限酵素切断地図、
第３図は本発明による外来遺第４図
Claims (5)
- （１）宿主細菌内で発現可能な複製開始領域と、宿主細
菌に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子領域と
、酵素蛋白合成制御を調節するオペロンと、該オペロン
内に配置された外来遺伝子を挿入するポリリンカー部分
とを有し、外来遺伝子挿入を前記酵素活性により判別す
るベクターにおいて、 プラスミドｐＤＲ５４０由来のトリプトファン・プロモ
ーターとｌａｃＵＶ５プロモーターからなる合成プロモ
ータであるｔａｃプロモーター部分（Ｐｔａｃ）と、 プラスミドｐＤＲ５４０由来の大腸菌ガラクトキナーゼ
構造遺伝子５′末端部分（ｇａｌＫ′）と、１もしくは
複数の制限酵素部位を有する前記ポリリンカー部分と、 プラスミドｐＭＣ１４０３由来の大腸菌５′末端欠落β
−ガラクトシダーゼ構造遺伝子部分（′ｌａｃＺ）とが
複製方向に沿って順に配置されたことを特徴とする外来
遺伝子断片発現用ベクター。 - （２）前記請求項１に記載の外来遺伝子断片発現用ベク
ターにおいて、 サイズが１０．６Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｎ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｐｓｔ I 、Ｓｍａ I 、Ｂａｍ
Ｈ I であり、下記の制限酵素切断地図で表わされるこ
とを特徴とする外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ２
。 ▲数式、化学式、表等があります▼ - （３）前記請求項１に記載の外来遺伝子断片発現用ベク
ターにおいて、 サイズが６．１Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｈ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｐｓｔ I 、Ｓｍａ I 、Ｂａｍ
Ｈ I であり、下記の制限酵素切断地図で表わされるこ
とを特徴とする外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ３
。 ▲数式、化学式、表等があります▼ - （４）前記請求項１に記載の外来遺伝子断片発現用ベク
ターにおいて、 サイズが６．１Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｎ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｐｓｔ I 、Ｓｍａ I 、Ｂａｍ
Ｈ I であり、下記の制限酵素切断地図で表わされるこ
とを特徴とする外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ４
。 ▲数式、化学式、表等があります▼ - （５）前記請求項１に記載の外来遺伝子断片発現用ベク
ターにおいて、 サイズが６．１Ｋｂで、 プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始領域と、前記抗生物
質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であり、 前記ポリリンカー部分の制限酵素部位がＢｂｅ I （Ｎ
ａｒ I ）、ＢｇｌII、Ｓａｌ I 、ＨｉｎｄIII、Ｐｓ
ｔ I 、Ｓｍａ I およびＢａｍＨ I であり、 下記の制限酵素切断地図で表わされることを特徴とする
外来遺伝子断片発現用ベクターｐＴＫ５。 ▲数式、化学式、表等があります▼
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7043189A JPH02249489A (ja) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | 外来遺伝子断片発現用ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7043189A JPH02249489A (ja) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | 外来遺伝子断片発現用ベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02249489A true JPH02249489A (ja) | 1990-10-05 |
Family
ID=13431288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7043189A Pending JPH02249489A (ja) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | 外来遺伝子断片発現用ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02249489A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0763598A1 (en) * | 1989-12-11 | 1997-03-19 | KAJI, Akira | Method of preparing a fusion protein |
-
1989
- 1989-03-24 JP JP7043189A patent/JPH02249489A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0763598A1 (en) * | 1989-12-11 | 1997-03-19 | KAJI, Akira | Method of preparing a fusion protein |
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