JPH0225133B2

JPH0225133B2 -

Info

Publication number: JPH0225133B2
Application number: JP55162722A
Authority: JP
Inventors: Aaru Guroobusu Maikuru; Eichi Kuurutaa Uooresu
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1979-11-23
Filing date: 1980-11-20
Publication date: 1990-05-31
Also published as: FR2470377A1; FR2470377B1; US4298836A; IT1148275B; AU6457280A; GB2064133B; DE3043814A1; CH639767A5; SE8008148L; GB2064133A; AU540023B2; JPS5686336A; ES8201313A1; ES497018A0; BR8007591A; NL8006326A; CA1151730A; IT8050207A0

Description

【発明の詳細な説明】本発明は粒子分析装置、特にインピーダンス感
知原理を用いて粒子系を研究する装置に関するも
のである。

粒子を計数し且つ大きさを測定する原理は25年
前にウオーレスヘンリークールターによつて
発明された。クールターは、基本特許第2656508
号に示されているように懸濁流体中で微粒子を走
査して微粒子の計数、大きさ測定及び分析を電子
的に行なう種々の方法及び装置を開発した。この
従来の装置では、２個の容器内の懸濁流体内にそ
れぞれ電極を懸垂して両容器間に直流電流路を設
定している。両流体間は微小孔隙でのみ連通し、
従つて電流路及び電界がこの孔隙内に設定され
る。この孔隙と、この孔隙内及びその周囲に得ら
れる電界域は感知域を構成する。客粒子はこの感
知域を通過するので、その通過時間中感知域のイ
ンピーダンスが変化し、これにより感知域を流れ
る電流及び電界が変化し、従つて斯る変化に応答
するよう構成された検出器に供給すべき信号が発
生せしめられる。（「Coulter」なる商標はアメリ
カ合衆国フロリダ州ハイアリース所在のクールタ
ーエレクトロニクス社の登録商標である。）粒子通過による感知域のインピーダンスの変化
は、粒子の断面積が孔隙の断面積より十分に小さ
く且つ粒子の直径が孔隙の軸線方向の長さより小
さい場合には粒子の体積に略々比例することが証
明されている。従つて、粒子の体積又は大きさを
測定するためにインピーダンス感知装置の出力信
号の振幅を測定するようにした種々の粒子分析装
置が開発され、市販されている。斯る装置は粒子
の電気的大きさを測定するものであり、以後この
粒子の大きさを「粒度」と称し、測定されたこの
粒子の大きさを「測定粒度」と称す。

更に、粒子の形状が測定される粒度に影響を与
えて粒子の実際の体積、即ち真の体積と正確に比
例しなくなることも証明されている。一般に、殆
んどの装置においては流体力学的集束のために細
長い粒子はその長軸が孔隙の中心軸線と略々平行
になる。これがため、等しい体積であるが一方は
球形、他方は細長い楕円形の２つの粒子の場合、
球形粒子は、細長いだ円形粒子よりも、孔隙を通
過する間電流路に垂直方向に大きな断面積を有す
る。従つて、球形粒子は、細長い粒子と同一の体
積であるにもかゝわらず、感知域の電界を細長い
粒子より大きく歪ませ、細長い粒子より大きな測
定粒度信号を発生する。これを補償するために、
“形状係数”と称される概念を用いて粒子をそれ
らの形状について分類している。例えば、極めて
細長い粒子に1.0の形状係数を割当てる場合、同
一の体積の球形粒子は1.5の形状係数を有するも
のとする。２個の感知域を用い形状係数を決定し
得るようにした装置は米国特許第3793587号に示
されている。この装置では、一方の孔隙の長さを
粒子の長さと同程度又はそれより短かくする。従
つて、この孔隙では細長い粒子は最大値に上昇後
ある時間その最大値にとどまり次いで低下するパ
ルスを発生する。これに対し、球形粒子は最大値
に上昇後直ちに低下するパルスを発生する。この
特許には粒子によるインピーダンス変化をその形
状指数で割算して測定粒度を補正し得ることが示
唆されている。電界の複雑化のために、これらの
補正は更に改善の余地がある。

粒子が感知孔隙内を通過する際の流体圧力によ
る粒子の変形性又は粒子の形状は、測定粒度に影
響を与える係数として及び粒子を検査するパラメ
ータとして極めて重要である。第１に、粒子の変
形又は形状はそれらの形状係数に影響を与え、こ
れが更に測定粒度に影響を与える。第２に、生物
細胞粒子の変形状態は細胞の種類のみならず、細
胞の年齢にも依存する。例えば、哺乳類の赤血球
には核がない。そして低い内部粘性のために、白
血球に比べ変形し易い。また、ある種の細胞にお
いては細胞膜が齢ととも硬化して変形しにくくな
る。細胞の病理学的状態はその変形性又は本来の
形状に影響を与える。

前記特許第2656508号に従つて構成された市販
の装置においては、感知域の電界は直流又は低周
波電流により設定している。上述したように、直
流又は低周波電流により設定された小区域の電界
中を粒子が通過することにより生ずる電気的変化
は粒度に略々比例する。直流は本願では零周波数
であるものとする。しかし、斯るインピーダンス
感知理は、粒子の粒度に限らず米国特許第
3502974号及び同第3502973号に記載されているよ
うに粒子の組成及び粒子を構成する材料の性質等
を含む粒子に関する種々の情報を得るよう広く利
用されている。これら従来の装置は一般に少くと
も２個の電流源を具え、一方を無線周波数電流源
とし、他方を“零周波数（直流）”電流源もしく
は粒子インピーダンスのリアクタンス分が装置の
応答に与える影響が無視し得るような充分低い周
波数の電流源として両電流を同一の感知域に同時
に供給するようにしている。この２重電流源構成
により得ることができる有用な粒子識別情報は当
該分野において粒子の“不透明度”として既知で
ある。一般に、不透明度は無線周波数で測定した
粒度と低周波数又は零周波数で測定した粒度の差
の尺度となる。

細胞学の分野においては、粒子の識別、分析及
び分類に有効な新たな粒子識別情報を測定し得る
ことが知られている。例えば、細胞は極めて高い
固有抵抗（絶縁の範囲）の膜を有する。しかし、
細胞の内部は相当電性で、異なる種類の粒子は異
なる内部固有抵抗を有する。また、細胞の病理学
的状態がその内部固有抵抗に影響を与える。従つ
て、この細胞の内部固有抵抗を測定することが望
まれている。

米国特許第3890568号には、興味ある感知孔隙
の電界の形状が図解されている。更に、この特許
には感知域の長さを越える細長い粒子の不正確な
粒度測定値を補正するために粒子の長さを測定す
る方法が示されている。しかし、この方法は粒子
の長さが実効走査域又は粒子を有効に感知し得る
区域より長いときにしか粒子の長さを正確に決定
し得ず、この状態が生ずるのは一般に繊維のよう
な粒子を分類する場合のみで、生物細胞のような
殆んどの粒子に対しては、孔隙の長さは、、これ
ら粒子が孔隙における流体の力により伸ばされた
としてもこれら粒子の長さの数倍を有する。

米国雑誌「THE JOURNAL OF
HISTOCHEMISTRY AND
CYTOCHEMISTRY」Vol.277，No.１（1979）．
pp335―341弐論文「Fast Imaging in Flow：Ａ
Means of Combining Flow―Cytometry and
Image Analysis」に、粒子を感知孔隙に通した
後に粒子の形状を検査し得るようにした装置が開
示されている。この装置では、限定された予定の
粒子集団用の感知孔隙と関連する電子装置により
フラツシユランプをトリガしてフイルム上に感知
粒子の像を投映して粒子の形状を記録し検査す
る。しかし、この装置では粒子の形状を測定粒度
と粒子毎に相関させることができない。また、粒
子の最終的な形状情報はフイルム上の像にほかな
らないため、斯る情報をコンピユータ処理のため
に高速に量子化するとが容易でない。更に、１秒
当りの撮像枚数は150枚が限度であるため、粒子
懸濁流体の流速を５メートル／秒に制限し、予め
選択した粒子しか撮像できない。代表的な流速は
５〜10メートル／秒で、この場合の粒子計数は
1000〜5000粒子／秒であるのが代表的である。

米国特許第3710933号に記載されているように、
インピーダンス感知孔隙を光吸収検出、散乱光検
出及びけい光検出と組み合わせることも行なわれ
ている。しかし、孔隙の下流で行なわれるこの種
の光学測定は後述する本発明に必要とされる情報
を提供しない。他の従来装置は光学的に透明なフ
ローセルにてインピーダンスと上述の光学的信号
を同時に測定している。散乱光のパターンは粒子
の形状により影響されるけれども、この影響は極
めて複雑な装置によつて、しかも限度ぎりぎりの
精度でしか検出し識別することができない。その
理由は、散乱光を粒度に主として依存する反射光
と、粒子の光透過特性、即ち吸収及び屈折率と粒
度に主として依存する屈折光とから遮蔽しなけれ
ばならないためである。

細い光ビームで粒子を分折する種々のスリツト
走査技術も、「THE JOURNAL OF
HISTOCHEMISTRY AND
CYTOCHEMISTRY」Vol.27，No.１（1979），
pp329―334に発表されている論文「Imging in
Flow”に示されているように既知である。

本発明は、以上の点に鑑み、液体流中に懸濁さ
れた個々の粒子の電気インピーダンス測定用孔隙
と、粒子の流れを流体力学的に集束して粒子を予
定の軌道に沿つて前記孔隙に通す装置と、前記孔
隙に低周波電流を流して第１電気インピーダンス
信号を発生せしめる第１電気装置とを具える粒子
走査装置において、各粒子の長さを表わす長さ信
号を発生する信号発生装置、好適には光学的な信
号発生装置と、各粒子毎に前記長さ信号を対応す
る前記第１インピーダンス信号に相関させる装置
とを設けて、各粒子毎に前記信号を発生させ相関
させて粒子の形状情報を得る計算に必要とされる
全てのパラメータを提供するように構成したこと
を特徴とする粒子走査装置を提供しようとするも
のである。

本発明は、更に、液体流中に懸濁した個々の粒
子を流体力学的に集束して電気インピーダンス測
定用孔隙に通すと共に、低周波電流を前記孔隙に
流して第１電気インピーダンス測定値を発生する
ようにした粒子走査方法において、流体力学的に
集束された各粒子の長さを好適には光学的に測定
し、且つ前記第１インピーダンス測定値と長さ測
定値を各粒子毎に相関させて各粒子の形状情報を
得ることを特徴とする粒子走査方法を提供しよう
とするものである。

即ち、本発明は液体の流れ中に懸濁した粒子を
流体力学的に集束してインピーダンス感知孔隙に
通すようにした粒子感知装置及び方法に関するも
のである。本発明では低周波電流を孔隙に流して
略々粒子の大きさを表わす第１インピーダンス信
号を発生させる。高周波電流を孔隙に流して粒子
の大きさ、形状、向き及び内部抵抗率に依存する
粒子の内部抵抗値を略々表わす第２インピーダン
ス信号を発生させる。各粒子の長さを表わす粒子
通過時間信号を発生する検出装置を具え、この信
号を用いて第１インピーダンス信号に基づく粒子
の大きさ測定値を補正して粒子の形状と関係なく
正確な形状と体積の測定値を得るようにする。正
確な粒子の形状と体積の測定値を用いて、第２イ
ンピーダンス信号に基づく内部抵抗値から粒子の
抵抗率を精密に決定することができる。各粒子毎
に決定し得る粒子の抵抗率は生物細胞を分析し識
別するための新しい識別情報として極めて価値が
ある。

従来の装置でも第２インピーダンス信号を用い
て粒子の内部抵抗値を測定することができるが、
この測定はそれだけでは何の意味もない。これ
は、内部抵抗測定値は粒子の内部抵抗率のみなら
ず、その大きさ、形状及び向きによつても変化す
るためである。同様に、従来装置でも第１及び第
２インピーダンス信号を用いて粒子の不透明度を
測定することができるが、この測定はそれだけで
は何の意味もない。これは、この不透明度の測定
値は粒子の形状、向き及び内部抵抗率によつて大
きく変化するためである。本発明装置及び方法は
信号発生中細長い粒子を同一の姿勢で予定の軌道
に沿つて流動させる。そして、従来の粒子流動装
置では得られない新規な組み合わせの３つの信号
を粒子の内部抵抗率の正確な導出のために発生し
得る。従つて、本発明の分野に価値のある新らし
い粒子識別情報を提供し得る。

本発明の装置及び方法の一例では粒子通過時
間、従つて粒子の長さを決定する光学的検出装置
を用いる。この例は第１インピーダンス信号と粒
子通過時間信号のみを用いて粒子の形状係数、真
の体積及び変形された又はもとのまゝの形状を測
定するのに有用である。

以下図面につき本発明を詳細に説明する。

第１図は試料供給管１２、管１２と同軸配置さ
れこれを囲む外管１４と、外管１４の先端に設け
られた微小孔隙１６とを有する粒子走査装置１０
を示す。図示してない圧力容器から粒子懸濁液を
管１２に供給する。更に、図示してない別の圧力
容器から層流液を管１４に供給してこの液体で粒
子懸濁液流を層状につつむようにする。粒子懸濁
液流が管１２から出ると、これをつゝむ層流（以
後さや流という）の流体圧力により粒子懸濁液流
の直径が減少し、その流速はさや流の速度に等し
くなる。さや流は粒子の流れを中心に維持して粒
子が中心軸線１８に沿つて孔隙１６を通過し、細
長い粒子でもその長軸が中心軸線１８と整列して
孔隙１６を通過するように作用する。粒子は、孔
隙１６を出た後、１部が光学的に透明なキユベツ
ト２２で構成された液体充満流室２０に入る。光
学的に透明なキユベツト２２は金属外箱２４で囲
まれる。流室２０には金属注入管２６により第２
のさや流を形成するのが好適である。孔隙１６と
関連する圧力低下のために、第２さや流により充
分な流体圧力を与えて粒子をその長軸が中心軸線
１８と整列した状態に維持して流室２０及び出口
ノズル２７を通過するようにするのが好適であ
る。粒子が孔隙１６を通過する間変形する場合、
第２さや流の補助により後述する次の光学測定中
その変形を維持するのに必要な流体圧力を与え
る。この粒子走査装置は慣例の設計のもので、米
国特許第3710933号に詳細に示されている。この
走査装置を僅かに変形し、流体仕切壁２８を挿入
して液体充満室２０を空気充満室２９から分離す
る。粒子は中心軸線１８に沿つて流動するように
示してあるが、他の軌道を流動するようにするこ
ともできる。例えば、粒子の流れは中心軸線１８
とある角度を成して孔隙１６を通る予定の軌道に
沿つて進ませることもできる。可能な軌道の全て
に共通する重要な特徴は流体圧力が粒子の長軸を
予定の軌道と整列した状態に維持するようにする
ことである。

光源３０（好適には赤色レーザ）により平行光
ビーム３２を第１円柱レンズ３４に供給する。円
柱レンズ３４はその光を“スリツト状”ビーム３
６とし、中心軸３７上に水平方向の線焦点３８を
結ぶ。線焦点３８を通過した光はビームダンパ３
９で遮断される。光線４１で示す散乱光は検出器
４２（好適には光電装置）で受光される。この構
成によれば、各粒子の通過時間を決定することが
できる。特に、各粒子の前縁部が最初に光を散乱
し、その粒子はその後縁が光ビームを通過し終る
まで光を散乱し続ける。線焦点３８は孔隙１６の
真下に位置させて、粒子が変形さた場合、又は本
来細長い形状の場合に、充分な流体圧力によつて
粒子が線焦点３８を通過するときその変形及び軸
線方向整列が維持されるようにする。孔隙１６と
出口ノズル２７との間隔は第１図においてこの光
学測定部を一層良好に図解するために誇張して示
してある。インピーダンス感知と光学検出は中心
軸１８上の異なる位置で行なわれるが、これらは
既知の光学的に透明なフローセルを使用すること
により同時に測定することもできる。検出器４２
からの電気信号は慣例の構成のパルス持続時間
（パルス幅）回路４３により処理し、これにより
粒子の所定部分がビーム３６内に存在した時間又
はビーム３６の通過に要した時間を表わす所望の
信号が得られる。斯る回路は米国特許第3890568
号に示されている。粒子が線焦点３８を通過する
際の粒子の速度は予め決めることができるため、
デジタルコンピユータ４４を用いて各粒子の通過
時間をその長軸の長さと関係づけることができ
る。

試料供給管１２は適当な導電材料から成り、本
好適例ではインピーダンス感知孔隙１６の上流電
極として機能する。注入管２６も適当な導電材料
から成り、孔隙１６の下流電極として機能する。
孔隙１６は外管１４の先端に位置するサフアイヤ
ウエフア４５に形成する。孔隙１６は管１２と管
２６との間の唯一の流体連絡路を形成し、電界が
孔隙１６内に設定される。既知の構成では、低周
波数電流源４６と高周波電流源４８を導線５０に
より試料注入管１２に、導線５２により接地注入
管２６に結合する。低周波数電流源４６は“零周
波数”の電流（直流）又は粒子インピーダンスの
リアクタンス分が装置１０の応答に与える影響が
無視し得るような充分に低周波数の電流を供給す
る。このため本願では低周波電流源は直流電流源
もその意味に含むものとする。唯一の条件は、粒
子が孔隙１６を通過した時に低周波電流源から得
られる信号が主として粒子の大きさ（粒度）に比
例することである。高周波電流源４８は低周波電
流源４６からの電流と同時に孔隙１６を流れる電
流を供給し、この電流は無線周波数もしくはそれ
以上の高周波数を有する。両電流源４６及び４８
は粒子が孔隙１６を通過する際にそれぞれ識別し
得る信号を発生し、一方の信号は略々粒度のみに
依存する低周波（L.F.）信号であり、他方の信号
は粒度のみならず粒度、形状、抵抗率及びリアク
タンスの複合特性に依存する無線周波（R.F.）信
号（1MHz以上）である。これら出力信号は導線
５０及び５２により慣例の検出装置５４に供給さ
れる。検出装置５４はRF信号用検出器５６とLF
信号用検出器５８を含み、各検出器５６及び５８
は導線５０及び５２から信号を受信する。検出器
５８により発生された第１インピーダンス信号
S_LFは粒子の粒度に主として比例する。検出器５
８は増幅器、フイルタ及び市販のクールターカウ
ンタに見られるような他の公知の回路を含み、更
に低域フイルタのような装置を付加してRF信号
を阻止してこれにより回路が飽和されないように
する。検出器５６はRF信号を復調してパルス状
の第２インピーダンス信号S_RFを発生する振幅復
調装置を具える。検出器５６にはフイルタ、増幅
器、復調器及び他の既知の回路を設けることがで
きる。電流源４６及び４８及び検出装置５４の構
成は公知であり、これら装置の詳細な構成は米国
特許第3502974号に記載されている。空気充満室
２９は孔隙１６の電解液の上流と下流との間に空
隙を形成して高周波電流損を低減する。

コンピユータ４４は第１インピーダンス信号
S_LF、第２インピーダンス信号S_RF及びパルス持続
時間回路４３から通過時間信号ｔをデジタル化
し、これら信号を各粒子毎に相関させ、メモリに
記憶する。好適例では、光学信号はインピーダン
ス信号が発生する位置の下方で発生される。従つ
て、先に発生する第１及び第２インピーダンス信
号が発生する瞬時と長さ信号が発生する瞬時との
間に遅延時間が存在する。デジタルコンピユータ
４４のデータ記憶能力はこの遅延時間を考慮し、
３つの信号を各粒子毎に相関させることができ
る。或は又、米国特許第3976862号に示されてい
るように、ハードウエア回路を用いてインピーダ
ンス信号を遅延して３つの信号を相関させること
もできる。コンピユー４４により行なわれる計算
を目に見えるようにするために、コンピユータ４
４を第１のメモリ、相関及び計算装置６０と、第
２のメモリ、相関及び計算装置６２とに分けて示
す。コンピユータ４４の代りにこれらの別個のユ
ニツトを有するハードウエア回路を用いることも
できるが、記憶プログラム制御によるデジタルコ
ンピユータ４４を用いるのが好適である。計算装
置６０はインピーダンス信号S_LF及び通過時間信
号ｔを受信し、これら信号から、各粒子の形状を
考慮に入れてインピーダンス信号S_LFを変更して
真の、即ち実際の各粒子の体積測定値V_p及び各
粒子の長さ対幅の比（ａ／ｂ）を得る。計算装置
６０（インピーダンス信号S_RFを必要としない）
は、インピーダンス信号S_LFを真の体積V_pを表わ
すよう補正し得ると共に長さ対幅比ａ／ｂを粒子
の変形度と相関させるため、有用な出力を発生す
る。更に、本発明はスリツト状ビーム３６を用い
て粒子通過信号ｔを決定する新規な光検出装置を
提供する。装置６０は更に通過時間信号ｔとイン
ピーダンス信号S_LFから形状係数ｆを計算し、こ
れを計算装置６２に供給する。計算装置６２は各
粒子毎に第２インピーダンス信号S_RF、第１イン
ピーダンス信号S_LF及び形状係数ｆから成る新規
な組み合わせの信号を受信する。計算装置６２は
これら信号をデジタル化し、これら信号を粒子毎
に相関させ、メモリに記憶する。この新規な組み
合わせの３つの入力信号から、計算装置６２は各
粒子毎にその内部固有抵抗又は抵抗率、ρ_iを計算
することができる。相関装置６４は各粒子の真の
体積測定値V_p、長さ対幅比／ｂ及び内部抵抗率ρ_i
を相関させ、蓄積されたデータを読取装置６６に
よりプリント及び／又は表示する。上述の種々の
計算をする数学は次の通りである。

本発明は粒子全般に関するものであるが、ここ
では特にに膜につつまれた粒子（細胞と称す）に
関するものとする。これら細胞は例えば生物細胞
や人工的な膜でつつまれた細胞とすることができ
る。

第２図は細胞とその周囲の懸濁液の電気特性を
モデル化した既知の回路図で、この図は理解を助
けるために例示したものである。細胞は破線のア
ウトライン６８で示す。種々の抵抗値Ｒ（オーム）
は特定の材料又は溶液の抵抗率ρと既知の公式に
従つた関係がある。抵抗率ρ（導電率σの逆数）
は一般にオーム・センチメートルで測定される。
抵抗率ρ_e，ρ_n及びρ_iは細胞を囲む電解懸濁液、細
胞膜及び細胞の内容物の抵抗率をそれぞれ示す。
従つて、回路７０は懸濁液の各部を表わす抵抗値
Ｒ１（ρ_e）、抵抗値Ｒ２（ρ_e）及び抵抗値Ｒ３
（ρ_e）の直列回路から成る。細胞を表わす回路７
２は抵抗値Ｒ２（ρ_e）と並列回路と抵抗Ｒ５
（ρ_n）コンデンサＣ２の並列回路で示すように細
胞膜のインピーダンスを直列に２度含む。これら
両インピーダンスは等しいものとする。これら両
インピーダンス間には内部抵抗Ｒ６（ρ_i）が直列
に含まれる。この内部抵抗Ｒ６（ρ_i）は細胞の検
査に重要であることが確かめられている。予定の
粒子軌道７４は細胞の長軸を整列するものとして
示してある。第１図に示す実施例では、予定の粒
子軌道は中心軸１８に整列している。電流の流れ
は予定の粒子軌道７４と平行であるのもとする。
ここで、細胞が回転した状態を想像して下さい。
細胞が長軸を有し、その軸を予定の軌道７４に対
し次第に傾けていくと、内部抵抗Ｒ６（ρ_i）は次
第に減少す。従つて、種々の細胞の内部抵抗値Ｒ
６（ρ_i）を比較するためには各細胞の向きを測定
時に同一にする必要がある。上記モデルの考察か
ら、細胞抵抗率ρ_iは細胞の形状及び向きに依存す
る。これがため、測定パラメータから細胞の内部
抵抗率を計算するためには真の細胞形状を決定す
ると共に細胞の向きを一定に維持する必要があ
る。しかし、このようにしても、細胞の内部抵抗
率ρ_iは一般に懸濁液の抵抗率ρ_eより大きいが、細
胞の膜抵抗率ρ_nがその内部抵抗率ρ_iより著しく大
きいために内部抵抗率を計算することは困難であ
る。本発明では新規な組み合わせの信号から内部
抵抗率ρ_iを細胞毎に決定することができる。内部
抵抗率ρ_i又はその逆数の内部導電率σ_iを決定する
計算法について以下に説明する。

後に明らかとなるように、形状係数が決定でき
れば、内部抵抗率σ_i又は内部導電率σ_iを決定する
ことができる。加えて、インピーダンス信号S_LF
を真の体積v_pを表わすよう補正することができ
る。第１インピーダンス信号S_LFは真の体積v_pに
形状係数ｆと次式の関係がある。

(1) S_LF＝ｆ・v_p・E_LF 第２インピーダンス信号S_RFは真の体積v_pに形
状係数ｆと次式の関係がある。

(2) S_RF＝ｆ・v_p（１−ρ_e／ρ_i）・E_RF／１＋（ρ_e／
ρ_i）（ｆ−１）不透明度は次のように得られる。

(3) O_p ＝S_RF／S_LF＝（１−ρ_e／ρ_i）・E_RF／〔１＋（ρ_e／ρ_i）・（ｆ−
１）〕・E_LF 以下に式(1)及び(2)を導出する方法を記す。粒子
は長球面楕円体であるものとする。次に、楕円体
粒子の長軸を座標軸Ｚ（孔隙内の電界及び電流に
平行）として、粒子の楕円面座標においてラプラ
スの方程式を解く。楕円面粒子が電荷を有しない
場合、体積積分の面積分の項で与えるグリーンの
定理は次のように書き表わせる。

(4) _S（φdz／dn−Ｚdφ／dn）ds＝０ここで、φは粒子外部の境界電位分布であり、
ｎは表面ｓに垂直の外向きベクトルである。次
に、孔隙１６の表揚を積分して次の面積分を得
る。

(5) _p＝ΔR／Ｒ・Ｅ・V_p＝Ｓ（Ｅ）・v_p ここで、ΔRは粒子が存在するときの孔隙抵抗
値Ｒの変化分、Ｅは孔隙内の任意の点の電界強
度、v_pは実行孔隙体積、Ｓ（Ｅ）は測定インピー
ダンス信号である。粒子表面の電位は、膜間の電
位及び膜を流れる電流の境界条件を用いて上記ラ
プラスの方式を解くことにより与えられ、次式で
与えられる。

(6) φ＝〔−Ｅ・Ｆ（ξ₁）＋α₁・Ｇ（ξ₁）〕・１／
A₁Ｆ（ξ₂）・Ｆ（ξ₃）ここで、ξ₁，ξ₂及びξ₃は楕円面座標である。

上式の他の項は次の通りである。

(7) Ｆ（ξ₁）＝（ξ₁＋a²）^1/2 (8) A₁＝〔（b²−a₂）・（c²−ｄ）²〕^1/2 (9) Ｇ（ξ₁）＝３／２Ｆ（ξ₁）・∫^∞〓₁du／Ｆ（ｕ
）・Ｒ（ｕ） (10) Ｒ（ｕ）＝〔（ｕ＋ａ）²・（ｕ＋b²）・（ｕ＋c
²）〕^1/
^２ここで、ａ，ｂ及びｃはそれぞれ長球面楕円体
の半長軸、半短軸である。ｕは広義の座標であ
る。α₁は粒子の面積分を4πで割つたそのに等し
く、 (11) _p＝4πα₁ である。α₁は更に粒子の内外の電位の記述に境界
条件を適用して次のように定義される。

(12) α₁＝−ｆ・v_p／4π ・〔（１−ρ_e／ρ_i）・Ｅ＋（ρ_e／ρ_i）・（^o／_n／
ａ）／１＋（ρ_e／ρ_i・（ｆ−１）〕 (13) _s＝_p＋_p＝０ (14) Ｓ（Ｅ）＝ｆ・（v_p／v_p）・〔（１−ρ_e／ρ_i）Ｅ＋（ρ_e／ρ_i）・（^o／_nｖ／
ａ）／１＋（ρ_e／ρ_i）・（ｆ−１）〕ここで、ρ_i及びρ_eはそれぞれ粒子の内部及び外
部抵抗率、v^o _nは電流方向と整列した楕円面の極
（このことを“ｏ”で示す）における膜（このこ
とを“ｍ”で示す）の電位である。こゝで、式(1
４）に対する制限条件について検討する必要があ
る。第１の制限条件は低周波数電流源４６の電流
により孔隙１６内に電界E_LFを発生させることで
ある。これは次の結果を導く。

(16) v^o _n＝ｆ・ａ・Ｅ（LF）ここでＳ（Ｅ）＝Ｓ（LF）及びＥ＝Ｅ（LF）とす
ると、 (17) Ｓ（LF）＝ｆ（v_p÷v_p）・Ｅ（LF）となる。

第１及び第２図に参照すると、この第１制限条
件は、低周波電流源４６の電流供給中容量Ｃ１及
びＣ２が高いインピーダンスとなつて回路を実質
上開くように作用することを意味する。従つて、
細胞の内部抵抗は細胞膜の高い抵抗率のために検
出不能となる。次に、式(14)に対する第２の制限
条件は高周波電流源４８の電流を供給して孔隙内
に電界E_RFを発生させることである。その周波数
が充分に高い場合（例えば30MHz）、これは次の
結果を生ずる。

(18) v^o _n＝ＯここでＳ（Ｅ）＝Ｓ（RF）及びＥ＝Ｅ（RF）とす
ると、 (19) Ｓ（RF）＝ｆ（v_p／v_p）・〔（１−ρ_e／ρ_i）・Ｅ（RF）／１＋（ρ_e／ρ_i）
・（ｆ−１）〕第１及び第２図を参照すると、この第２制限条
件は、高周波電流源４８の電流供給中容量C₁及
びC₂が略々短絡回路を形成して極めて高い細胞
膜抵抗を分路するよう作用する。従つて、細胞の
内部抵抗率が容易に測定される。ここで、不透明
度は次式となる。

(20) O_p＝Ｓ（RF）／Ｓ（LF）＝〔（１−ρ_e／ρ_i）・Ｅ（RF）／（１＋（ρ_e／ρ_i）
・（ｆ−１）・Ｅ（LF）〕式(20)を考察すると、形状係数ｆと内部抵抗率
ρ_iを除く全ての変数が既知である。従つて、形状
係数ｆを決定できれば、内部抵抗率ρ_iを計算でき
る。これは次の関係式の展開により達成できる。
細胞の真の体積v_p及び長さａは、半短軸ｂ及びｃ
が等しい場合、形状係数ｆと次式の関係がある。

(21) ｂ＝（v_p・３／2π・１／ａ）^1/2 (22)ｍ＝ａ／ｂ (23) ｒ−１＝m²／m²−１−ｍ・cosh^-1m／（m₂−１）^3
/2：（ｍ＞１）従つて、式(17)及び(23)の非線形連立方程式を
形状係数ｆ及び真の体積v_pについて解くことによ
り形状係数ｆ及び真の体積v_pが得られる。これら
２項を得る計算はインピーダンス信号S_LFと粒子
の長さａを表わす粒子通過時間ｔとを用いて達成
できる。式(21)は粒子が楕円体形状であることを
仮定する。第１図に示すように、形状係数ｆ及び
真の体積v_pは計算装置６０で計算される。形状係
数ｆの計算後に、式(21)を計算装置６２で解いて
内部抵抗率ρ_iを細胞抵抗率ρ_iを細胞毎に求める。
この計算にはインピーダンス信号S_RF、インピー
ダンス信号S_LF及び形状係数ｆの受信が必要であ
る。

粒子の長軸の長さを電子的に得る他の方法が米
国特許第3793587号に開示されており、この方法
を参考のためここに記載する。本発明は粒子の長
さを得るための新規な光学検出装置を用いるが、
同じ長さ測定を精度は劣るが上記特許の２孔隙構
成いよりまたは新規な光電検出装置により粒子の
長さが得られた後に、インピーダンス信号S_LF、
インピーダンス信号S_RF及び粒子の長さから成る
新規な組み合わせの信号入力を粒子の内部抵抗率
ρ_iの決定に用いることができる。上記特許の２つ
の孔隙の内の一方の孔隙は粒子の長さと同程度も
しくはそれより短かい軸方向長さとする。粒子に
より発生されたパルスの持続時間は粒子の長さと
関連する。従つて、特許請求の範囲において粒子
の長さを決定する“検出装置”とはスリツト状ビ
ーム３６を用いるような光学的検出装置のみなら
ず上記特許の短かい軸方向長さの孔隙を用いるよ
うな電子的検出装置も意味するものとする。

粒子による電気的変化は感知域又は走査域と定
義される孔隙１６の実効範囲内に発生する。米国
特許第3890568号に詳細に記載されているように、
感知域は孔隙１６の軸方向長さを相当越えて延在
する。このため、本願においても、感知域は電界
強度が孔隙の中心部の電界強度の少なくとも１％
以上である孔隙周辺部も含むものとする。

更に、米国特許第3710933号に示されているよ
うな流室２０を有する粒子流動装置は本発明の実
施に使用し得る多くの粒子流動装置の一例を示し
たにすぎず、本発明はこれに限定されるものでは
なく、本発明は粒子を流体力学的に集束してイン
ピーダンス感知孔隙を通過せしめるようにした任
意の粒子流動装置を用いることができるものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置の１部の断面図と１部のブ
ロツク線図、第２図は生物細胞とその懸濁液の電
気的特性を示す等価回路図である。１０…粒子走査装置、１２…試料供給管（電
極）、１４…第１さや液供給用外管、１６…孔隙、
１８…中心軸線、２０…液体充満流室、２２…透
明キユベツト、２４…金属外箱、２６…第２さや
液供給用金属管（電極）、２７…出口ノズル、２
８…仕切壁、２９…空気充満室、３０…光源、３
２…平行光ビーム、３４，４０…円柱レンズ、３
６…スリツト状ビーム、３８…線焦点、３９…ビ
ームダンパ、４１…散乱光、４２…検出器、４３
…パルス持続時間測定回路、４４…デジタルコン
ピユータ、４６…低周波電流源、４８…高周波電
流源、５０，５２…導線、５６…無線周波信号検
出器、５８…低周波信号検出器、６０…第１計算
装置、６２…第２計算装置、６４…相関装置、６
６…読取装置、S_LF…第１（低周波）インピーダン
ス信号、S_RF…第２（無線周波）インピーダンス信
号、ｔ…粒子通過時間（粒子長さ）信号、v_p…真
の体積、ａ／ｂ…粒子の長さと幅の比、ｆ…形状
係数、ρ_i…粒子内部抵抗率、６８…粒子（細胞）
の輪郭、７０…周囲懸濁液部分の等価回路、７２
…細胞部分の等価回路、７４…粒子軌道、Ｒ１
（ρ_e），Ｒ２（ρ_e），Ｒ３（ρ_e）…懸濁液の抵抗、
Ｃ１，Ｒ４（ρ_n）；Ｃ２，Ｒ５（ρ_n）…細胞膜の
インピーダンス、Ｒ６（ρ_i）…細胞の内部抵抗。

Claims

【特許請求の範囲】１液体中に懸濁された個々の粒子の電気インピ
ーダンス測定用孔〓１６と、粒子の流れを流体力
学的に集束して粒子を予定の軌道７４に沿つて前
記孔〓に通す装置１４と、前記孔〓に低周波電流
を流して第１電気インピーダンス信号S_LFを発生
せしめる第１電流装置４６，５８とを備える粒子
分析装置において、各粒子の長さを表わす長さ信
号ｔを発生する信号発生装置３０，３４，３９，
４０，４２，４３と、各粒子毎に前記長さ信号を
対応する前記第１インピーダンス信号に相関さ
せ、各粒子の形状情報ｆを計算する装置４４，６
０と、前記孔〓１６に高周波電流を供給して第２
電気インピーダンス信号S_LFを発生せしめる第２
電流装置４８，５６と、前記第１インピーダンス
信号S_LF、前記第２インピーダンスS_LF及び前記形
状情報ｆを各粒子毎に相関させて各粒子の内部抵
抗率ρ_iを決定する装置４４，６２とを設けたこと
を特徴とする粒子分析装置。２特許請求の範囲第１項記載の装置において、
前記信号発生装置は、流体力学的に集束された粒
子の流れを横切る細い放射線ビーム３６を発生
し、各粒子が前記ビームを通過する時間長を表わ
す前記長さ信号ｔを発生する光学的信号発生装置
３０，３４，３９，４０，４２，４３をもつて構
成したことを特徴とする粒子分析装置。３特許請求の範囲１又は２記載の装置におい
て、前記第１インピーダンス信号S_LF及び前記長
さ信号ｔを用いて、前記第１インピーダンス信号
に基づく粒子の体積測定値を粒子の形状を考慮し
て補正して各粒子の真の体積v_pを与える計算装置
６０を設けたことを特徴とする粒子分析装置。４特許請求の範囲１〜３の何れかに記載の装置
において、粒子の長さと幅の比（ａ／ｂ）を計算
する計算装置６０を設けて前記比により粒子の形
状の指示を与えるようにしたことを特徴とする粒
子分析装置。５特許請求の範囲１〜４の何れかに記載の装置
において、粒子は細胞であることを特徴とする粒
子分析装置。