JPH0225499A - 鳥類由来生理活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、鳥類由来の利尿作用、ナトリウム利尿作用及
び降圧作用を有する新規な生理活性ペプチドに関する。

〔従来の技術〕

哺乳類の心房組織において合成・貯蔵・分泌されるホル
モンである心房性ナトリウム利尿活性ペプチド（ＡＮＰ
）は、体液及び血圧の恒常性を調節している物質である
。近年、哺乳類（ヒト、ラット等）ＡＮＰの研究により
、ＡＮＰはまず心房で１２６残基からなるγ−ＡＮＰと
して生合成され、次にプロセッシング酵素によりＴ−八
ＮＰのＣ末端の２８残基からなるα−ＡＮＰが生じ、こ
れが血液を循環していることが明かになった（ｄｅ　Ｂ
ｏｌ’ｄ、Ａ、Ｊ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、２３０，７６７−７７０，１９８５；
　Ｃａｎｔｉｎ、　Ｍ、及びＧｅｒｒｅｓ　ｔ、　Ｊ　
、　、　［１ｎｄｏｃｒｉｎｅ”　Ｒｅｖｉｅｗｓ　＋
　６　＋　１０７−１２Ｌ　１９８５　；Ｍａｔｓｕｏ
、Ｍ、及びＮａｋａｚａｔｏ、ｆｔ、、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ　　Ｃ１１
ｎｉｃｓ　　ｏｆ　　Ｎｏｒｔｈ　　Ａｍｅｒｉｃａ、
１６＋八ｔｒｉａｌＮａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　Ｆａｃｔ
ｅｒ（ｅｄｓ　Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ、Ｍ、　ａｎｄＪ
ａｃｏｂｓ、Ｊ、Ｗ、）＋ｐ、４３−６１）　、　Ａ　
Ｎ　Ｐのアミノ酸配列はげっ歯頚からヒトまで哺乳類動
物において広い範囲で類似している。特に、α−ＡＮＰ
はヒト、イヌ、及びブタを含む高等動物においては同一
の配列（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｆｏｒｍ）を持つ物質と
して見いだされた。また、げっ歯頚においても、１個の
アミノ酸が異なるのみである（Ｋａｎｇａｗａ、　Ｋ、
及びＭａｔｕｏ、Ｉｔ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ　、　、　１１８．１３１−１３９．１９８４
　；Ｆｌｙｎｎ、Ｔ、Ｇ、、ｄｅ　Ｂｏｌｄ、Ｍ几、及
びｄｅ　Ｂｏｌｄ　Ａ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ、　、　１４７．８５９−８６５．１９８３　
；Ｏｉｋａｗａ、Ｓ、等＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　＋　１３２＋８６２
−８９８，１９８５；　Ｎｅｍｅｒ、Ｍ等Ｎａｔｕｒｅ
、　３１２，６５４−６５６゜１９８４；　Ｏｎｇ、Ｈ
，、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、、　３Ｂ、１３０９４３１５．
１９８６；Ｓｅｉｄｍａｎ、、Ｃ，Ｅ、、等、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ、　２２６．１２０６−１２０９．１９８４）
。

一方、組織学的または薬理学的研究により、哺乳類でな
い動物の心房又は心室においてもＡＮＰ様物質が存在す
ることが示唆されている（ｄｅ　Ｂｏｌｄ八、Ｊ、、　
等、Ｃａｎ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
、、６１＋１２７−１３０＋１９８３：Ｂｅｎｓｃｏｍ
ｅ、Ｓ、Ａ、及びＢｅｒｇｅｒ、Ｊ、Ｍ、、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓａｎｄ　Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ。

ｖｏｌ、５．１７３−２１３．１９７１）。特に、鳥類
のうちニワトリに関しては、免疫組織化学的または生物
活性的にいくつかのデータが示されて、おり、ニワトリ
由来のＡ　Ｎ　Ｐ　（ｃｈＡＮＰ）は哺乳類のものとは
異なることが示唆されていた（Ｂｅｎｓｃｏｍｅ、　Ｓ
、八、及びＢｅｒｇｅｒ、Ｊ。

Ｍ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎ
ｔｓ　ｉｎ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰａｔｈｏｌｏ
ｇｙ、　ｖｏｌ、５．１７３−２１３，１９７１；ｄｅ
　Ｂｏｌｄ、Ａ、Ｊ。

及び５ａｌｅｒｎｏ、Ｔ、Ａ、　、Ｃａｎ、Ｊ、Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

６１．１２７−１３０，１９８３；　Ｇｒｅｇｇ、Ｃ，
Ｍ、及び−ｔｄｅｍａｎ、　Ｊｒ　−＋１１、Ｆ、、八
ｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏ１．，２５１，５４３−５５１．
１９８５；Ｃｈａｐｅａｕ。

Ｃ，、Ｇｕｔｋｒｖｓｋａ、　Ｊ、及びＣａｎｔｉｎ、
Ｍ、、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、　３３．５４１−５５０．１９
８６＞。これらのことから、鳥類にニワトリ）にもＡＮ
Ｐ様物質が存在すると考えられるが、その構造について
はヒトＡ、ＮＰと異なる可能性が指摘されているだけで
未だ明らかではなかった。

〔発明が解決すべき課題〕

そこで本発明者らは、哺乳類（ヒ））ＡＮＰと同様な単
離方法を用いて、ヒヨコ直腸弛緩活性を指標として、ニ
ワトリ心臓由来のＡＮＰについて鋭意探求した結果、利
尿作用、ナトリウム利尿作用、更に血圧降下作用を有す
る新規な生理活性ペプチド、すなわち２９アミノ酸残基
からなるペプチド（α−ｃｈＡＮＰ）及びそれをＣ末端
に有し１１６アミノ酸残基からなるペプチドであるニワ
トリＡＮＰ　’　（ｒ−ｃｈＡＮＰ）を見いだし、単離
・精製し、その構造を決定することに成功した。更に、
これらのペプチドに対応するｃＤＮＡのクローニングに
も成功し、このｃＤＮＡを解析することによりｃｈＡＮ
Ｐ前駆体の構造を決定し本発明を完成した。従って、本
発明は哺乳類動物のＡＮＰとその構造が似ているが、し
かし、それらとは明確に区別される新規生理活性ペプチ
ドを提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕 １、　　ｃｈＡＮＰの製造 本発明における生理活性物質はニワトリの心臓組織を適
当な酸性溶媒、例えば、酢酸或は塩酸含有酢酸などの中
でホモジネートし、Ｃｕｒｒｉｅ等の方法（Ｃｕｒｒｉ
ｅ等、Ｎａｔｕｒｅ、２’２１．１−１３．１９８３）
に従いヒヨコ直腸標本弛緩活性を指標として、遠心分離
、アセ１〜ン沈澱、溶媒抽出、限外濾過、ゲル濾過、吸
着クロマトグラフィーなど、ペプチドの精製に常用され
る各種処理及びα−ｃｈＡＮＰ抗体を用いたラジオイム
ノアッセイ　（ＲＩＡ）等を適宜組み合わせてペプチド
を分離することにより得られる。本発明では、第２図に
示すように、分子量３Ｋ及び１２にダル］・ンに相当す
る部分にヒヨコ直腸標本弛緩活性が認められた。

Ａ、α−ｃｈＡＮＰ 分子量３にの両分についてイオン交換及び逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＩＩＰＩ、Ｃ）を用いて精製する
。この両分における生理活性物質はアミノ酸分析の結果
、アミノ酸数が２９であり、α−ｃｈＡＮＰと命名され
た。さらに、該生理活性ペプチドの構造（アミノ酸配列
）が明かであれば、さらに工業的に得るには化学合成法
を用いるのがより有利であることは言うまでもない。本
発明のα−ｃｈＡＮＰは、ペプチドの合成に常用される
同相法または液相法により製造することができる。例え
ば、メリフィールド等の固相合成法によりｃＪ＋ＡＮＰ
を合成することができる。この方法を本発明に適用する
場合、α−アミノ基はいずれのアミノ酸残基についても
ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保
護し、アルギニンのグアニジノ基はトシル基（Ｔｏｓ基
）で、セリンの水酸基はベンジル基（Ｂｚｌ基）で、ア
スパラギン酸のβ−カルボン酸基はＯ−ベンジル基（０
−Ｂｚｌ基）で各々保護することが好適である。

まず、Ｃ末端アミノ酸であるアスパラギンの保護誘導体
；　Ｂｏｃ−Ａｓｎをクロロメチルポリスチレン樹脂に
導入し、以後、順次アミノ酸を延長して保護ｃｈＡＮＰ
−樹脂を合成し、これをフン化水素で処理することによ
り保護ｃｈＡＮＰを樹脂から切断し、同時に脱保護し、
これを還元することにより、Ｃｙｓ７２３−（Ｓ−Ａｃ
ｍ）−ｃｈＡＮＰ（八ｃｍはシスティンのチオール基を
保護するアセトアミドメチル基である）を得ることがで
きる。次に、これをヨウ素で酸化することによりチオー
ル保護基Ｓ−Ａｃｍ−Ｂｏｃを脱離せしめると同時に７
位及び２３位のシスティンのチオール基による分子内ジ
スルフィド結合を形成させることにより、粗合成ｃｈＡ
ＮＰが得られ、逆相及びイオン交換ＨＰＬＣ等を用いて
精製することにより、目的とするα−ｃｈＡＮＰを得る
ことができる。

Ｂ、　　　ｒ−ｃｈＡＮＰ 前記１２にの両分について、イオン交換及び逆相高速液
体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）による精製後、更
にα−ｃｈＡＮＰ抗体を用いた免疫親和性クロマ１−グ
ラフィを用いて精製する。精製に際して、生理活性分画
の検出はα−ｃｈＡＮＰ抗体を用いたＲＩＡによって行
う。この両分における生理活性物質はアミノ酸分析の結
果、アミノ酸数が１１６であり、γ−ｃｈＡＮＰと命名
された。

１　）　ｃｈＡＮＰ抗血清の調製 α−ｃｈＡＮＰ’　（５−２９）　（４■）をグルタル
アルデヒドによりウシ・サイログロブリン（ｔｈｙｒｏ
ｇ　Ｉｏｂｕ　Ｉ　１ｎ）（８■）と結合させ、抗原と
して用いた。本抗原溶液を等量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ａ
ｄｊｕｂａｎｔと混合し、これをニューシーラント白ウ
サギに皮肉注射して免疫し、抗血清を得る。

２）イムノアフィニティ・クロマトグラフィー（免疫親
和性クロマトグラフィー） 上記方法で得られた２ｍｌの抗血清より、プロティンＡ
−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）カラム
を用いてイムノグロブリンＧＯｇＧ）分画を調製する。

これを更に０．１Ｍリン酸ナトリウムバッフｙ−（ｐ）
１７．４）中でＡＦＦＩ−ＧＲＬＩＯ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）（２，５ｍ１）に結合させ、ｃｈＡＮＰ抗体結合樹脂
としてクロマトグラフィーに用いる。次に、サンプルを
０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，４＞に
溶かし、該カラムにかけ（総量２．２ｍ１）、同緩衝液
で洗浄する。吸着物は１０％ＣＩ１．ＣＮを含有する１
Ｍ酢酸で溶出させる。

３）ラジオイムノアッセイ　（ＲＩ　Ａ）α−ｃｈＡＮ
Ｐ　（１０，１７ｇ）を０．４Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
に熔解し、Ｎａ　Ｉ′２５存在下ラクトパーオキシダー
ゼ法（Ｙ、Ｍ、Ｙａｃｈｉ、Ｊ、ｌｌ、Ｖａｉｔｕｋａ
ｉｔｉｓ、Ｅ。

Ｎ１ｅｓｃｈｌａ、　Ｍ、Ｂ、Ｉ、１ｐｓｅｔｔ、　Ｊ
、ＣＩ　ｉｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ、　＋　３４２３
−２８．１９７２）により、１１２５−標識α−ｃｈＡ
ｔ什を合成し、ＨＰＬＣで精製後、トレーサーとして用
いる。

上記抗血清及びトレーサーを用いて、常法に従いＲＩＡ
系を確立した。本性により０．５　ｆｍｏｌ　／　ｔｕ
ｂｅのｃｈＡＮＰを測定可能である。

後記実施例で述べるように、酸性溶媒抽出における総ｃ
ｈＡＮＰ免疫活性を有する部分の殆どがγ−ｃｈＡＮＰ
であることから、哺乳類ＡＮＰと同様にＴ型で貯蔵され
ており、α−ｃｈＡＮＰがホルモンとして必要な時にま
ず前駆体からＴ型がプロセ・ノシングされ、次にα型に
変換されて分泌されると考えられる（第１４図参照）。

２、ｃｈＡＮＰの構造 Ａ１本発明における新規生理活性物質ｃｈＡＮＰは第１
図に示すアミノ酸配列を有する；γ−ｃｈＡＮＰ（１−
１１６位）、α−ｃｈＡＮＰ　（８８−１１６位）。

Ｂ０分子量：　　３０００ダルトン（α−ｃｈＡＮＰ）
１２０００ダルトン（ｒ　−ｃｈＡＮＰ）Ｃ９酸性・中
性・塩基性の区別：塩基性り、アミノ酸の組成（アミノ
酸分析による；γ＾ＮＰ、第１表参照） Ｅ、アミノ酸の比較 １　　）　　α−ｃｈＡＮＰ 特にＡＮＰ活性に必要と考えられるシスティン残基間の
１７アミノ酸残基においては僅かに４カ所、すなわちラ
ットＡＮＰの１０位のグリシンがアルギニンに、１７位
のアラニンがセリンに、１８位のグルタミン酸がロイシ
ンに、２１位のロイシンがメチオニンに変わっているの
みである。

また、ヒトＡＮＰとは５カ所、すなわち前記のほかにｈ
ＡＮＰの１２位のメチオニンがイソロイシンに変わって
いる。これは、活性発現に必須なシスティン残基間の配
列が鳥類及び哺乳類においても保持されていて、この部
分が利尿作用を有するために重要であることを強く示す
るものである。

一方、ｃｈＡＮＰのＮ末端及びＣ末端部分においては哺
乳類の配列と異なる特徴がみられる。すなわち、３位の
アスパラギンは哺乳類においては見られず、また、哺乳
類ＡＮＰにおいてはその活性を示すのに必要不可欠であ
ると考えられるＣ末端部分の配列；　Ａｓｎ−３Ａｓｎ
−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒ　Ａ＜Ａｓｎ−Ｇｌｙ−３ｅｒ
Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎに変わっている（第１図参照）
。

α−ｃｈＡＮＰは哺乳類ＡＮＰとの相同性は認められる
が、分子全体の構造としてはかなりの相違がみられる。

２　）　　ｒ　−ｃｈＡＮＰ γ−ｃｈＡＮＰのＣ末端部（８８−１１６）がα−ｃｈ
ＡＮＰ構造に対応し、心臓貯蔵型γ−ｃｈＡＮＰから血
液循環型α−ｃｈＡＮＰが生合成される可能性を示す点
で、哺乳類のγ−ＡＮＰ／α−ＡＮＰ相対関係と類似し
た分子構造を示す。しかし、第１５図に示すように、ｒ
　−ＡＮＰとγ−ｃｈＡＮＰの構造類似性はＣ末端部（
α−ｃｈＡＮＰ部位）に顕著にみられること、及びＮ末
端Ａｓｎ−Ｐｒｏ　、。

Ｐｒｏ（８６）−Ａｒｇ（８７）が共通であること以外
には両者の全体的な相同性はあまり高くない。Ａｓｎ−
ＬｅｕＳｅｒ（５−７）、八５ｎ−Ｇｌｙ−５ｅｒ（１
１１−１１３）に糖付加可能なアミノ酸配列がみられる
が、ｒ　−ｃｈＡＮＰにおいて糖鎖の存在は認められな
い。

以上まとめると、α−ｃｈＡＮＰ及びγ−ｃｈＡＮＰの
アミノ酸配列は次の様に表わされる。

Ｘ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−八ｒｇ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌｙ
＾ｒｇ−Ｌｙｓ−八ｓｎ 上記アミへ酸配列において、α−ｃｈＡＮＰではＸは存
在せず、そしてγ−ｃｈＡＮＰではＸは次のアミノ酸配
列： Ａｓｎ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−へ５ｎ−Ｌｅｕ−Ｓ
ｅｒ−Ｐｒｏ−八ｌａ−ＬｙｓＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｇ］、ｕへｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ八Ｉへ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ｇｉｎ−ＧｌｕＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　Ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＧｌｕＬｅｕ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕＳｅｒ−Ｔｙｒ−八ｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−八ｒｇ−ＬｅａＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを表わす。

３、ｃｈＡＮＰｃＤＮＡの単離 ニワトリの心臓より、常法に従い、全ＲＮＡを調製、続
いてｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロースカラムを用い、ｐｏ
ｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを調製する。次に、ここで得ら
れたｐｏｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを用い、Ｇｕｂｌｅｒ
らの方法（Ｇｕｂｌｅｒ、Ｕ、＆　Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｂ
、Ｊ、、Ｇｅｎｅ＋２５．２６３０９８３）に従い、ｃ
ＤＮＡを作製する。次に、ＥｃｏＲＴアダプターを結合
させた後、その一部分（７０ｎｇのポリ　（Ａ）＋ＲＮ
Ａに相当）を予めＥｃｏＲＩ処理し、脱リン酸化したλ
ｇｔ　１０　ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）
　とライゲーションを行う。ライゲーション後、その半
分をＧｉｇａｐａｃｅ　Ｐｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を用いた１ｎｖｉｔｒｏパツケージングによりライ
ブラリーを作製する。次に、ここで得られたｃＤＮＡラ
イブラリーより目的とするｃｈＡＮＰｃＤＮＡを単離す
るためにｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ法（Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｍ、Ｈ，、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ’ｅｔｔ、、　
２２．１８５９−１８６２．１９８１）を用いて、３つ
のオリゴデオキシヌクレオチドプローブ（プローブＩａ
、プローブＩｂ、プローブ■）を作製する（第１１図参
照）。次に、各プローブの３゛末端を（α−３２Ｐ）　
ｄＣＴＰ　（２−５ＸＸ１０７ｃｐ／ｐｍｏｌ）を用い
て放射標識を行い、ブラークハイフ゛リダイセーション
によりｃＤＮへのスクリーニングすることにより、ニワ
トリ心臓から精製したｃｈＡＮＰに対応する単一なｃＤ
ＮＡクローンを得ることができる。

４、　ｃｈＡＮＰのｃＤＮＡ解析 得られた単一なりローンより常法に従いプラスミドを単
離し、種種の制限酵素で切断して、ｃＤＮＡの制限酵素
地図を作成する。次に、このｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列
を決定するために、まず種種の制限酵素で切断したｃＤ
ＮＡ断片をＭ１３ファージにサブクローニングし、各ク
ローンのｃＤＮＡ部分のＤＮＡ塩基配列を２゛　−デオ
キシ−７−ジアザ−ＧＴＰを用いた７−ゾアザシークエ
ンスキソト（宝酒造）により決定する。また、５゛末端
部位における転写開始点はブライマー伸張法（ｐｒｉｍ
ｅｒ　ｅｘｔｎｓｉｏｎ　；Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、等
、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ＋ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８７、Ｎａｋａｙａｍａ、に、等、Ｎａｔｕｒｅ、
３１０．６９９−７０１．１９８４）により決定するこ
とができる。

５、ｃｈＡＮＰの薬理学的性質 本発明のペプチドｃｈＡＮＰは利尿作用、ナトリウム利
尿作用及び降圧作用を有する。なお、本発明においてナ
トリウム利尿とは、カリウムイオンに対してナトリウム
イオンを選択的に排出する利尿をいう。

〔試験方法〕

雄性ＳＤ系ラット（体重３００〜４００　ｇ　）にベン
トハルビタール６０．７ｋｇを腹腔的投与により麻酔す
る。気道確保のため、気管カニユーレ（ＰＨ−２４０Ｃ
１ａｙ−Ａｄａｍｓ）を施し、股動脈に血圧測定用の動
脈カニユーレ（ＰＨ−５０）を挿入し、股静脈にリンゲ
ル液投与用の静脈カニユーレ（ＰＨ−５０）を挿入する
。

この静脈カニユーレを通して１．２ｍｌ／ｈｒの速度で
定常注入（ｃｏｎｓｔａｎｔ　１ｎｆｕｓｉｏｎ）を行
う。シラステインク・チューブ（内径０６０２インチ、
外径０．０３フインチ、ダウコーニング社製）の膀胱カ
ニユーレより試験管内に採尿し、この採尿は被験物質を
投与する前１５分間と投与後５分間又はその後経時的に
行い、この尿試料の分析値を比較することにより被験物
質の作用を測定する。

被験物質ｆＡＮＰは、その所定量を０．　Ｉ　Ｎ酢酸に
溶解した後、１／１０容量の１．３　Ｍ　）リス酢酸溶
液で中和する。これを５０μＩの滅菌生理食塩水で希釈
し、頚静脈から投与する。対照としては公知のナトリウ
ム利尿剤であるヒＩ−ＡＮＰ（α−ｈＡＮＰ）を用いて
いる。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実ｌ側０エ　ニ　ｌ−１ゝ　か゛のＡＮＰの製 ９０羽のニワトリの心臓（７２０ｇ）を摘出し、細断し
た後、プロテアーゼを不活化させるために７容量の沸騰
水で５分間処理した。冷却後、酢酸及び塩酸を加え、酢
酸の最終濃度をＩＭ、塩酸のそれを２０ｍＭとした。処
理した組織をポリトロンミキサーを用いて４℃にてホモ
ジナイズし、２４００　Ｘｇで３０分間遠心分離後、６
６％アセトンにより沈澱させた。沈澱物除去後、上滑を
濃縮し＝愈世た。得られた濃縮物を０．５Ｍ酢酸に溶か
し、Ｃ１８シリカゲルカラム（３２ｘ　５００ｍ、Ｃ−
５ＯＲＢ　ＳＰＷ−Ｃ−ＯＤＳＣｈｅｍｃｏ）にかけた
。３倍量の０．５８Ｍ酢酸で洗浄後、濃縮物を０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する６０％アセトニ
トリル（Ｃ）Ｉ　、Ｃｔ＋）で溶出させた。溶出液を濃
縮後、再び１Ｍ酢酸に溶かし、１Ｍ酢酸で平衡化したＳ
Ｐ−セファデックスＣ−２５カラム（Ｈ＋−ｆｏｒｍ、
１．　６　ｘ６０ａｎ、１０ｍ１）を用いたイオン交換
クロマトグラフィーにかけた。１Ｍ酢酸、２ｍピリジン
、及び２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５，０）により連続的
に溶出させ、各溶液における溶出液ｓｐ−ｒ　、ｓｐ−
ｎ、及びｓｐ−ｍを得た。凍結乾燥後、ヒヨコ直腸標本
弛緩作用を有し塩基性ペプチドを含むＳＰ−■両分（乾
燥重量２６９．９■）をセファデックスＧ−５０カラム
（ｆｉｎｅ、　１．８　×１３５ｃｍ、ファルマシア）
を用いたゲル濾過（溶媒；１Ｍ酢酸、流速；　７．５　
ｍｌ　／　ｈｒ、画分サイズ；　５　ｍｌ　／　ｔｕｂ
ｅ）にかけた。次に、各分画をヒヨコ直腸標本弛緩作用
を活性指標としてアッセイしたところ、分子量３Ｋ及び
１２にダルトンに相当する部分に該作用が認められた（
第２図Ａ、Ｂ参照）。

１）前記作用を有する両分のうち分子量の小さい領域に
あたるフラクションｆｆ１５５−６２　（総量２１．５
ｍｇ）について精製を行うために、該フラクションを凍
結乾燥後、ＴＳＫＣＭ−２５Ｗカラム（７，６Ｘ　３０
（ｉｎ、東ソー）を用いたイオン交換逆相高速液体クロ
マトグラフ　イー　（ＨＰＩ、Ｃ）　Ｃ溶媒；Ａ　；　
１０ｍＭ　ＨＣＯＯＮＩＩ４（ｐＨ６，６）　　：　Ｃ
Ｈ３ＣＮ　＝９０　：　１０（ｖ／ｖ）、ＢＲＩＭＨＣ
ＯＯＮ）ｌ、（ｐＨ６，６）　　：　ＣＨ３ＣＮ　＝９
０　：　１０（ｖ／ｖ）、直線濃度勾配（時間）Ａ−Ｂ
；１４０分、流速；２．Ｏｍｌ／ｈｒ、画分サイズ；　
５ｍｌ／１ｕｂｅ）　）にかけた。溶出時間が７０〜７
６分である活性画分（第３図矢印部分）を集め、更にＣ
ｈｍｃｏｓｏｒｂ　３０ＤＳ−Ｈカラム（８，０×７５
鰭、ｃｈｅｍｃｏ）を用いた逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにかけ精
製した（溶媒：　１ｌｚＯ：　ＣＨ３ＣＮ　　：　１０
％ＴＦＡ＝　（Ａ）　９０：１０：１、（Ｂ　）　４０
　：　６０　：　１　（ｖ／ｖ）、流速ｉ２．ｏｍｌ／
ｈｒ、直線濃度配（時間）Ａ−Ｂ；１２０分）。最後に
、最終精製として溶出時間が３４分である活性画分（第
４図Ａ星印部分）を２１９Ｔｐ５４フエニルカラム（４
，６Ｘ　２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ社製）を用いた逆相Ｈ
ＰＬＣを用イテ精製した（溶媒；Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ　
　：ｔ。

％ＴＦＡ−（Ａ）　９０　：　１０　：　１、（Ｂ）　
４０：６０：　１（ｖ／ｖ）、流速；　１．　Ｏｍｌ　
／ｈｒ、直線濃度勾配（時間）Ａ→Ｂ；　　１２０分）
（第４図Ｂ参照）。

後記実施例において示すように、精製された両分におけ
るペプチドは、アミノ酸分析及びアミノ酸配列決定によ
りそのアミノ酸数が２９のペプチドであることがわかり
、これをα−ｃｈＡＮＰと命名した（第５図参照）。

２）次に、前記活性画分のうち１２にダルトンに相当す
る領域（画分番号３４−３７）をＰＴＡにかけ免疫活性
を有するペプチド（ｒ−ｃｈＡＮＰ）を溶出させた。こ
の両分を集め凍結乾燥後（乾燥重量５０■）、更に前記
抗α−ｃｈＡＮＰ　ＩｇＧ−ＡＦＦＩ−ＧＥＩ、カラム
（２，２ｍｌ＞を用いた免疫親和性クロマトグラフィー
にかけた。吸着物を１０％Ｃ）１３ＣＮを含有する１Ｍ
酢酸で溶出させた後、旧−Ｐｏｒｅ　ＲＰ−３１８カラ
ム（４，６Ｘ　２５Ｏｎ＋、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた
逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにがけた〔溶媒；　ＨｚＯ：　Ｃｌｌ
３ＣＮ　　：　１０％　ＴＦＡ−（Ａ＞　９０：１０：
１、（Ｂ）　４０　：　６０　：　１　（ｖ／ｖ）、流
速；１．５ｍｌ／ｈｒ、直線濃度勾配（時間）　Ａ　：
　Ｂ＝　１００：　Ｏ−８０：２０（５分）　、Ａ　：
　Ｂ＝８０：２０→Ｏ：１００（８０分）］。保持時間
が約５２分のところに表れるピークの両分は免疫活性を
有していた（第６図参照）。最終精製として、μｍＢｏ
ｎｄａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ−１８カラム（３，８Ｘ　１５
０ｍｍ、３００Ａ　、Ｗａｔｅｒ）を用いた逆相肝ＬＣ
ニかけて精製した〔溶媒；　１１２０　’：　ＣＨ３Ｃ
Ｎ　：１０％　ＴＦＡ−（Ａ）１００　　：　　Ｏ：　
　１　　、　　（Ｂ）　　４０：６０：　　１（ｖ／ｖ
）、流速；　１．　Ｏｍｌ／ｈｒ、直線濃度勾配（時間
）Ａ−Ｂ（６０分）、第７図参照〕。総酸率は２４ｎｍ
ｏｌであった。

後記実施例において示すように、精製された両分におけ
るペプチドは、アミノ酸分析によりそのアミノ酸数が１
１６のペプチドであることがわかり、これをγ−ｃｈＡ
ＮＰと命名した。アミノ酸組成の結果を第１表に示した
。

実遺り江入　ヱはノＪ［お引列脈捉 １　）（Ｘ−ｃｈＡＮＰ アミノ酸組成の分析は、まずペプチドを０．１％フェノ
ールを含有する６Ｎ塩酸中で、１１０’Ｃ２０時間の加
水分解を行った後、日立８３５アミノ酸配列分析機を用
いて行った。この結果、アミノ酸組成は八ｓｐ；４．０
５（４）、Ｓｅｒ：３．６９（４）、Ｇｌｙ；６．０１
（６）、Ｃｙｓ；＋　（２）、Ｍｅｔ；２．８２（３）
、Ｉｌｅ；２．１２（２）、Ｌｅｕ；１．０７（１）。

Ｐｈｅ；１０．７（１）、Ｌｙｓ；０．９２（１）、八
ｒｇ；５．２５（５）であった。

このことによりα−ｃｈＡＮＰはアミノ酸の数が２９個
より成るペプチドであることがわかった。次に、このペ
プチドのアミノ酸配列をエドマン分解法を用いた気相ア
ミノ酸配列自動分析機（Ａｐｐｉｅｄ　Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍ社製、モデル４７〇八／１２０Δ）により
決定した。

この結果を第８図に示した。以上のようにして明かにな
ったアミノ酸配列に基づき前記方法により化学合成した
ペプチドを逆相ＨＰＬＣにがけたところ、完全に天然の
ものと同一の位置に溶出した。また、化学合成したα−
ｃｈＡＮＰのヒヨコ直腸標本弛緩作用を測定したところ
、天然のものと同程度の活性を示した。

２　）　　ｒ　−ｃｈＡＮＰ まず、精製したγ−ｃｈＡＮＰを用いて気相自動分析機
（Δｐｐｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、モデル４７
０Ａ　）によりアミノ酸配列を測定したところ、そのＮ
末端から４１位までのアミノ酸配列を決定することがで
きた。次に、γ−ｃｈＡＮＰのアミノ酸組成の分析を、
まずペプチドを０．１％フェノール及び０．０２％メル
カプトエタノールを含有する６Ｎ塩酸中で、１１０℃２
４時間の加水分解を行った後、日立８３５アミノ酸配列
分析機を用いて行った。この結果を第１表に示す。

以下余白 更に全配列の決定を以下のようにして行った。

まず、γ−ｃｈＡＮＰのアミノ酸配列を２種の酵素、す
なわち、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬）及びス
タフィロコッカス　アウレアス（Ｓｔａｐｈｙｌ。

ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ　８プロテアーゼ（
Ｍｉｌｅｓ）により処理して得られるペプチドフラグメ
ント（Ｌｌ〜■、６．■１〜Ｖ５、Ｖ６°、Ｖ７’　）
を解析した。

すなわち、精製したｒ　−ｃｈＡＮＰ　（１，８ｎｍｏ
ｌ）を２００ｎｇのりシルエンドペプチダーゼと１００
μｌの５０ｍＭＮ−２−ヒドロエチルピペラジン−Ｎ゛
−２エタン−硫酸；　ＨＥＰＥＳ）　（ｐＨ７，５）中
で３７℃で３時間反応させた。次に、μｍＢｏｎｄａｓ
ｐｈｅｒｅ　Ｃ−１８カラム（３，８Ｘ　１５０ｉｎ、
３００Ａ、Ｗａｔｅｒ社製）を用いた逆相肝ＬＣＣ溶媒
；　Ｈ２Ｏ：　ＣＨ３ＣＮ　　：　１０％ＴＦＡ　−（
Ａ）１００：　Ｏ，：　１、（Ｂ　）　４０　：　６０
　：　１　（ｖ／ｖ）、流速；１．Ｏｍｌ／ｈｒ、直線
濃度勾配（時間）Ａ−Ｂ（６０分）〕にかけて精製する
ことにより、Ｌ１〜Ｌ６を得た（第７図参照）。一方、
精製した７　−ｃｈＡＮＰ　（１，８ｎｍ）を０．５μ
ｇの■８プロテアーゼと１００μｌの０．１　ｍＭ酢酸
アンモニウム（ｐＨ４，０）中で３７°Ｃて２時間反応
させ、更に１μｇの酵素を追加して４時間放置すること
によりＶ１〜Ｖ５を得た。また、ペプチドＶ６°及びｖ
７”は、前記の４時間放置後、更に２　ｍＭＥＤＴＡを
含有する５０μｌの０．１　Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐ
ｌ＋　７．７　）中で６時間ごとに１μｇの酵素を加え
ながら３７℃で２４時間反応させた時のペプチドフラグ
メントである。以上のようにして得た各ペプチドフラグ
メントのアミノ酸分析（第１表参照）及びこれらのアミ
ノ酸配列を決定することにより、ｒ　−ｃｈＡＮＰの全
アミノ酸配列を決定した（第９図）。

実施■主　薊ＡＮＰ■粂埋造作 前記の方法により、α−ｃｈＡＮＰの薬理活性をα−ｈ
ＡＮＰと比較した。

まず、ヒヨコ直腸弛緩活性を指標としたところ、その作
用はα−ｈＡＮＰに対してｃｈＡＮＰは約１／３０であ
った。

次に、麻酔下ラットへのｃｈＡＮＰの静注による利尿作
用及び各イオン（Ｎａ　”、Ｋ゛、Ｃβ→排出作用は、
注入後の５分間が最も強く、その後は、注入後３０分ま
でα〜ｈＡＮＰと同様な作用を示した（第２表、第１０
図参照）。

第−又一表 α−ｃｈＡＮＰの利尿作用及びナトリウム利尿作用（α
−ｈＡＮＰと比較）α−ｈＡＮＰ　　　３．０　（９）
　　５０１±８２　５９２±７９　２７６±２５　６５
０±１４４◎数値は、麻酔したラット被験物質を静脈内
注射し、注射前１５分間の値に対する注射後１５分間の
値を％で示したものである。

これらの結果は、利尿作用及びナトリウム利尿作用を有
することを示すものである。しかしながら、第２表に示
すように、両者ともその作用はｈＡＮＰより弱く、その
割合も約１／３０であった。

また、ｃｈＡＮＰを麻酔下ラットに注入した時は降圧作
用も示す。すなわち、ｃｈＡＮＰの１回注射（６０μｇ
　／ｋｇ）では動脈の血圧低下（１５−２０ｍｍＨｇ）
が１５−２０分間持続する。

ａ　　ｃＤＮＡクローニング α−ｃｈＡＮＰの１−５位及び２０−２５位のアミノ酸
配列に相当する部分のＤＮＡ部分プローブ（プローブＩ
ａ、Ｉｂ、及び■）を合成しく第１１図）、前記の方法
により得られたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。まず、ライブラリー（約１×１０５クローン）を
プローブ■によりスクリーニングしたところ、２９個の
ポジティブクローンが得られた。次に、そのうちの９つ
についてプローブＩａとＩｂの混合プローブ（混合比；
Ｊａ：１ｂ−１：２）でスクリーニングしたところ、ポ
ジティブな８個のクローンが得られた。このうち、約８
００ｂｐのｃＤＮＡを有するクローンをλｃｈＡＮＰ−
Ｅと命名した。このλｃｈＡＮＰ−Ｅについて、第１２
図に示すストラテジーに従ってＤＮＡ配列を決定したと
ころポリＡ及び両端にＥｃｏＲＩアダプターを含む７５
５ｂｐのＤＮＡ配列であった。ｃｈＡＮＰのＤＮＡ配列
とそれらから推定されるアミノ酸配列を第１３図に示す
。第１３図においてＤＮＡ番号３３４−４２０のＤＮＡ
は２９個のアミノ酸からなるα−ｃｈＡＮＰに相当し、
ＤＮＡ番号１−７２位は、シグナルペプチドに相当する
ところである。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明者らは、鳥類にワトリ）心臓より
ヒヨコ直腸弛緩活性を指標として新規ペプチドを単離・
精製することに成功し、このペプチドの構造を決定する
と共に、このペプチドが利尿作用、ナトリウム利尿作用
及び降圧作用を有することを見出した。すなわち、本発
明において、哺乳類のＡＮＰと構造が似ているが、しか
し、それらとは明確に区別される新規生理活性ペプチド
の存在が明かとなったことは、前記作用を有するペプチ
ドの活性に不可欠なアミノ酸配列の構造およびその活性
相関の解明に大いに寄与するものであり、該作用を示す
有用なペプチドの製造に役立つものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、α−及びγ−ｃｈＡＮＰのアミノ酸配列を■
）のゲル濾過の溶出経過及び各両分のヒヨコ直腸弛緩作
用を示す。 第３図は、イオン交換ＨＰＬＣの溶出経過を示す。 第４図Ａ、Ｂは、ｃｈＡＮＰ逆相ＨＰＬＣの溶出経過を
示す。 第５図は、エドマン分解法を用いたガス相分析器による
α−ｃｈＡＮＰの各ＰＴＨ−アミノ酸の収率を示す。各
アミノ酸は１文字表記で表されている。 アミノ酸配列を示す。 第６図は、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製さ
れたα−ｃｈＡＮＰの逆相肝ＬＣの溶出経過を示す。 第７図は、リシルエンドペプチダーゼ処理後のα−ｃｈ
ＡＮＰの逆相１（ＰＬＣの溶出経過を示す。 第８図は、ｃｈＡＮＰとｒＡＮＰ　、　ｈＡＮＰのアミ
ノ酸配列の比較を示す。 第９図は、ｒ−ｃｈＡＮＰのアミノ酸配列及び２種の酵
素処理によるペプチドフラグメントを示す。 第１０図は、ｔｙ−ｃｈＡＮＰ及びα−ｈＡＮＰの利尿
作用、Ｎａ”、Ｋ゛、Ｃρ−排出の経時経過を示す。 第１１図は、α−ｃｈＡＮＰのアミノ酸配列のうち、２
箇所に対応するＤＮＡ合成プローブを示す。 第１２図は、クローンλｃｈＡＮＰ４における配列決定
戦略を示す。 第１３図は、ｃｈＡＮＰのｃＤＮ八配列配列す。 第１４図は、ｃｈＡＮＰのプロセッシングを示す。 第１５図は、ｃｈＡＮＰの前駆体を示す（アミノ酸は１
文字表記）。 Ａ、　αべ出ＡＮＰ Ｂ、　　ＹべｔＮ伊

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｘは存在しないか、又は次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を表わす） で表わされるペプチド。