JPH02255699A - 新規血液抗凝固物質及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はトロンビンと結合してトロンビンの持つ血液凝
固の作用を血液抗凝固作用へと変換させる作用を有する
ペプチドに関する。更に詳しくは、血栓溶解作用、抗血
液凝固作用及び血小板凝集抑制作用を有し、循環器系の
疾患の治療に有用なペプチドに関する０本発明は、また
、その新規なペプチドをコードするデオキシリボ核酸（
以下”ＤＮＡ”と称する）、該ＤＮＡを含有する複製可
能な組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換され
た微生物または細胞及び組換えＤＮＡ技術による該ペプ
チドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸及びペプチドは下記に示す
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ｃＢＮ）で採用
された略号を用いて表される。なお、アミノ酸などに関
し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ
体を示すものとする。更に、特に明示しない限りペプチ
ドのアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれＮ末端及び
Ｃ末端である。

Ｇｉｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ　ニブロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 Ｐｈａ　：フェニルアラニン残基 ｃｔｙニゲリシン残基 Ｈｉｓ　：ヒスチジン残基 Ｓｅｔ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 ｌｉｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐニトリブトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ＝メチオニン残基 Ｃｙｓニジスティン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌク
レオチドの配列により表記する。

Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配列
の左端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である
。

（従来の技術） 現在、血栓溶解剤として用いられるものには、ストレプ
トキナーゼやウロキナーゼがある。また、抗血液凝固剤
としてはヘパリンやワーファリンが用いられている。さ
らに、血小板凝集抑制剤としてはアスピリン、スルフィ
ンピラゾン、ジビリダモール等が使われている。

現在これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝
集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併用して、例え
ば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、閉塞
性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、狭心
症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患の治療及び
予防に用いられている。しかしながら、これらの血栓溶
解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤は非常に複
雑な機構から成り立つ血液の凝固線溶系の極く一部に作
用するにすぎない、そこで、血液の凝固線溶系に広く作
用し、優れた血液凝固制御作用を示す薬剤が求められて
いた。

ところで、血液凝固機構において重要な役割を演じてい
るビタミンに依存性の蛋白質としてプロティンＣが知ら
れている。近年、そのプロティンＣの活性化を促進し、
トロンビンの作用による血小板の活性化とフィブリン形
成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの肺、ヒトの肺
やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬剤に比べて優
れた血液凝固制御作用を有することが報告されている。

ウサギ肺に存在する物質については、例えば、シー・テ
ィー・エスモン（ｃ，７，Ｅｓｗｏｎ）ら、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、７８巻、２２４９頁（１９８１年）；エヌ・
エル・エスモン（Ｎ、Ｌ、Ｅｓｗｏｎ　）ら、ザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）、２５７巻、８５９頁（１９８２年）；シ
ー・ティー・エスモン（ｃ，？、！！８１１１０１１）
ら、ザ・ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミスト
リ〒（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、）、２５７巻、
７９４４頁（１９８２年）；エヌ・エル・エスモン（Ｎ
、ＬＪｓｍｏｎ　）ら、ザ・ジャーナル・オプ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、
）、２５８巻、１２２３８頁（１９８２年）を参照する
ことができる。ウシの肺に存在する物質については、例
えば種本ら、生化学、５６巻、８９０頁（１９８４年）
を参照することができる。

また、ヒト胎盤に存在する物質については、例えば特開
昭６０−１９９８１９　；黒沢ら、日本血液学会誌、４
７巻、６３２頁（１９８４年）　；エッチ・エッチ・サ
ーレム、　　（Ｈ，Ｈ，５ａｌｅｓ）ら、ジャーナル・
ォブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
。

Ｃｈｅ＋ｗ、）　２５９巻、１２２４６頁（１９８４年
）；ニス。

クロサワ（Ｓ、　Ｋｕｒｏｓａｗａ）ら、トロンボシス
・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）　、、　３７＠、３５３頁（１９８５年）を参照する
ことができる。また、ヒト肺に存在する物質については
、例えば橋本ら、生化学、５７巻、１１０２頁（１９８
５年）を参照することができる。

上記の先行技術文献には上記物質の一般的性質が記載さ
れている。しかしながら、その物質の構造、例えばアミ
ノ酸配列などは解明されておらず、未だにその物質は同
定されていない、従って、上記の先行技術文献に報告さ
れている物質が単一物質であるか否か、また、これらの
先行技術文献の記載にしたがって同一の物質が繰返し得
られるか否かについては全く不明である。

最近、本発明者らによって、上記物質の遺伝子が単離さ
れ〔鈴木ら、ザ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈ・１！ＭＢ
ＯＪｏｕｒｎａｌ）、６巻、１８９１真（１９８７年）
、自弁ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｗ、）　、１０３巻、２８１頁（１９
８８年）等〕、さらに遺伝子を遺伝子工学的手法を用い
て上記物質の構造と４１！能に解析が加えられ、１１８
アミノ酸残基からなるペプチドにトロンビンによるプロ
ティンＣの活性化能を促進する作用があることが示され
ている。〔国際公開番号Ｗ　０８８１０５０５３　（国
際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ８８１０００１１）　）（発明
が解決しようとする問題点） 本発明者等は、上述の技術的前景にあって、血液の凝固
線溶系の一囚子であるプロティンＣを活性化して血液凝
固を抑制するだけでなく、線溶作用を増進する新たな物
質を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、後述するように
特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、トロンビンに
よるプロティンＣ活性化を促進して血液凝固を制御する
ことができるだけでなく、ｍｌを促進することができ、
血液凝固を＠御する薬剤として有用であることを見出し
た。更にまた、そのペプチドが、組換えＤＮＡ技術によ
って大量にかつ容易に製造できることを見出した０本発
明は、これら知見に基づいて完成した。即ち、本発明の
目的はトロンビンと結合してトロンビンの持つ血液凝固
の作用を血液抗凝固作用へと変換させる作用を有するペ
プチドを提供することにある。

また、本発明の別の目的は、上記ペプチドをコードする
ＤＮＡを提供することにある。

更にまた、本発明の他の目的は、該ペプチドをコードす
るＤＮＡを含有する複製可能な組換え体ＤＮＡを提供す
ることにある。

更にまた、本発明の他の目的は、上述のような組換え体
ＤＮＡを形質転換された微生物または細胞を提供するこ
とにある。

更にまた、本発明の他の目的は、上述のようなペプチド
の製造方法を提供することにある。

（問題を解決するための手段） 即ち、本質的には、本発明によれば、次式（Ｉ）＝Ｖａ
ｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ
　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　ＧｌｕＴｙｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　に
Ｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　５ｅ
ｒＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　
Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　ＡｌａＰｒｏ　ｌｉｅ　Ｐｒ
ｏ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ
　ＧｌｎＭｅｔ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔ
ｈｒ　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　ＡｌａＡｓｐ　Ｃｙ
ｓ　　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　　Ａ
ｌａ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＧｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＩＩｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＡｓｐＧ
ｌｙ　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｉ
ｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＧｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　
　ＣｙｓＨｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　　ｌ１ｅＣｙｓ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　ｔｌｉｓｌｉｅ　Ｇｌｙ
　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　　−（＋　）で表されるア
ミノ酸配列を含有することを特徴とする、トロンビンと
結合してトロンビンの持つ血液凝固の作用を血液抗凝固
作用へと変換させる作用を有するペプチドが提供される
。

本発明のペプチドは実質的に前記式（１）で表されるア
ミノ酸配列から成っていてもよいし、また、式（１）で
表されるアミノ酸配列と、そのＮ末端及び／またはＣ末
端に結合した少なくとも１種の他のペプチドのアミノ酸
配列を更に含有してもよい。

さらに、自然の変異によりまたは人工の変異により、ペ
プチドの活性に重大な変化を与えることなく、ペプチド
の構造の一部を変化させることが可能であるから本発明
のペプチドは、前記アミノ酸配列を有するペプチドの相
同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓνａｒｔａｎｔ）に相
当する構造を有するペプチドも包含する。

本発明のペプチドは少なくとも１個の糖残基を含有して
いてもよいし、含有していなくてもよい。

また、本発明によれば遺伝暗号の縮重に基づき少なくと
も１個の塩基が置換されている又は置換されていない前
記式（１）で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド
をコードするデオキシリボ核酸が提供される。

上記デオキシリボ核酸の１つの態様として、遺伝暗号の
縮重に基づき少なくとも１個の塩基が置換されているま
たは置換されていない次式（■）：ＧＴＧＧＡＣＣＣＧ
Ｔ　ＧＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＴＧＣＧＡＧ　ＴＡ
ＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡ　　ＣＣＡＡＡ
ＣＴＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＧ　　ＴＣＴＧＣＧＣＣ
ＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＣＧ　ＣＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＣ
ＧＡＧＣＣＧＣＡ　ＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴ
ＴＧＣＡ　ＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣ
ＧＡＣＴＧＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡ　ＧＧＣＴ
ＡＧＣＴＧＴ　ＧＡＧＴＧＣＣＣＴＧ＾＾ＧＧＣＴＡＣ
ＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴ　　Ｇ
ＣＡＣＧＧＡＣＡＴ　　ＣＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＡＡＡ
ＡＣＧＧＣＧ　ＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＧＴ
ＧＣＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＴ　　Ｃ
ＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧ　　ＡＣＴＣ
ＧＧＣＣＣＴＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＣＣ
Ｇ　ＡＣＴＧ？　　・・・　（ＩＩ）で表される塩基配
列を含有するデオキシリボ核酸が提供される。

本発明のＤＮＡは前記式（ＩＩ）で表される塩基配列と
、その５′末端および／または３′末端に結合した少な
くとも１種の他の塩基配列とを含有していてもよい。

本発明によれば、上記ＤＮＡと相補的なりＮＡもまた提
供される０本発明によれば、上記ＤＮＡとそれに相補的
なりＮＡが互いに相補的に結合して２重ｌＤＮＡを形成
していてもよい。

自然の変異によりまたは人工的異変により、主たる活性
に変化を与えることな（、ＤＮＡの構造及びそれから演
鐸されるペプチドの構造の一部を変異せしめることが可
能であるから、本発明のＤＮＡは前述のすべてのペプチ
ドの相同変異体に相当する構造を有するペプチドをコー
ドする塩基配列を含有することも可能である。

遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子の塩基
配列の少なくとも１つの塩基を他のａｌ類の塩基に置換
することができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺
伝暗号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列
を含有することも可能である。この場合、上記置換によ
り得られた塩基配列から演鐸されるアミノ酸配列は前に
定義したアミノ酸配列と一致する。

更にまた、本発明によれば、前記の本発明のデオキシリ
ボ核酸と複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な
組換え体ＤＮＡが提供される。該ｍｔａえ体ＤＮＡは、
それによって形質転換された微生物または細胞中で、本
発明のペプチドを発現することができる。適したベクタ
ーの例としてはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２？
、ＹＲｐ？、ＹＥＧ１２４　（ＡＴＣＣ３７０５１）　
　、　ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）　　
、　ｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）な
どが挙げられる。尚、発現ベクターは宿主として使用す
る微生物または細胞に適したものを選択する必要がある
。

更に本発明はまた、上述の複製可能な組換え体ＤＮＡで
形質転換された微生物または細胞に関する。微生物の例
としては、エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー・コリ豆１匹旦り
に１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）、イー・コリ
（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　　Ｂ　　、　イー・コ’Ｊ（Ｅ、
　ｃｏｌｉ）　　Ｘ１７７６（ＩＴｃｃ　３１５３７）
、イー・コリ旦、飴旦）Ｃ６００およびイー・コリ（Ｅ
、　ｃｏｌｉ）　　Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー・コリ（
Ｅ、　ｃｏｌｉ）　　＠　３１１０　（Ｆ−１λ−、プ
ロトトロフィック、ＡＴＣ（：　２７３７５）；バチラ
ス　サブチリスＢａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）の如きバチラス（９ａｃｉｌｌｕｓ）の属の菌株；サ
ルモネラ　チフイムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ
　　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　　またはセラチアマーセサンス
（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌
以外の腸内菌；シュードモーナス（Ｐｓｓｕｄｏ細ｏｎ
ａｓ）属の種々の菌株；およびサツカロミセス　セレビ
シェＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）などが挙げられる。

細胞の例としては、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ−８１）
　　細胞、ＲｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣
（ｃ）１０）細胞株、引３８、ＢＩＩＫ　、　ＣＯ５−
７およびＭＤＣＫ細胞株等の動物細胞が挙げられる。

更に本発明の他の態様によれば、 （ｅ）　　前述のペプチドをコードするデオキシリボ核
酸と複製可能な発現ベクターに連結じて該デオキシリボ
核酸と該複製可能な発現ベクターとからなる複製可能な
組換え体ＤＮＡを得、山）　該複製可能な組換え体ＤＮ
Ａで微生物または細胞を形質転換させて形質転換体を形
成せしめ、（ｃ１該形質転換体を該微生物または細胞の
親細胞から選別し、 （ｄｌ　　該形質転換体を培養して、該形質転換体に該
デオキシリボ核酸を発現させて該ペプチドを産生せしめ
、そして ｔｅｌ　　該ペプチドを培養した形質転換体から単離す
ることを含む本発明のペプチドの製造方法が提供される
。

本発明の方法によれば、前述の本発明のＤＮＡが正しく
転写し、それによって得られるｄＮＡからの翻訳が正し
く行われるように本発明のＤＮＡを複製可能な発現ベク
ターのプロモーターなどのＤＮＡ領域の下流に組入れて
該ＤＮＡを有する複製可能な組換え体ＤＮＡを得、得ら
れた該組換え体ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換さ
せて該組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体を得る。得
られた形質転換体は、該組換え体ＤＮＡに与えられた表
現型によって微生物または培養細胞の親細胞から単離さ
れる。得られた形質転換体を培養して前記デオキシリボ
核酸の有する遺伝情報を発現させて本発明のペプチドを
製造する。

尚、本発明のＤＮＡ及び組換え体ＤＮＡを構築するため
に必要なりＮＡ配列、例えばプロモーターや複製起源等
をクローニングするためには原核細胞を宿主として用い
る宿主−ベクター系を使用するのが好ましい、原核細胞
の例としてはエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｔａ　ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー・コリ（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ）　　に１２株２９４（ＡＴＣＣａ１４４６）、
イー・コリ旦、　ｃｏｌｉ）　　Ｂ　　％イー・コリｑ
、　ｃｏｌｔ）　　Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）
、イー・コリ」。

ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー・コリー組、二壮Ω−Ｗ　
３１１０　（Ｆ−１λ−、プロトトロフィック、＾ＴＣ
Ｃ２７３７５）；バチラス　サブチリス　（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　の如きバチラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）の属の菌株；サルモネラ　チフイムリウム
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕｓ＋）
　　またはセラチアマーセサンス（Ｓａｒｒａｔ＋ａ　
ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内細菌；シュ
ードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｗｏｎａｓ）属の種々の菌
株；およびサツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げら
れる。これらの細胞のうちエシェリヒア　コリ旦。

ｃｏｌｔ）Ｋ１２株２９４が最も好ましい、上記微生物
を宿主として使用する場合、これら微生物に適したプラ
スミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発現ベク
ターとして一般に用いられる０例えば大腸菌を形質転換
するためのプラスミドベクターとしてはプラスミドｐＢ
Ｒ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができる。プ
ラスミドベクターは通常複製起源、プロモーター、およ
び＆Ｕ換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別するのに
有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー遺伝子
等を含んでいる。

プロモーターの例としては、β−ラクタマーゼ及びラク
トースプロモーター、トリプトファンプロモーター等が
挙げられる。マーカー遺伝子の例としては、アンピシリ
ン耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられ
る。一方、本発明のＤＮＡを発現して本発明のペプチド
を製造するためには上記の原核細胞を宿主として用いる
宿主−ベクター系およびを推動物の細胞などの真核生物
の細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベクター系を使用
することができる。真核細胞の例としては前述の動物の
細胞株などの細胞が挙げられる０本発明のＤＮＡを前述
の真核細胞で発現させるために、本発明の組換え体ＤＮ
Ａは一般に遺伝子発現を制御するための機能配列、例え
ば、複製起源、本発明のＤＮＡの上流に位置すべきプロ
モーターリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位や転
写終止配列を含有している０本発明のＤＮＡを真核細胞
内で発現させるのに用いることができるそのような機能
配列はウィルスやウィルス性物質から得ることができる
。

例えば、本発明で用いることのできるプロモーターはア
デノウィルス２、ポリオーマウィルス、シミアンウィル
ス４０　　（ＳＶ４０）などから得ることができる。特
に、アデノウィルス２の主後期プロモーターやＳＶ４０
の初期および後期プロモーターが好ましい、また、トロ
ンビンのプロティンＣ活性化を促進する作用を有するヒ
ト肺由来のペプチドをコードする遺伝子の上流の位置に
本来存在するプロモーターも、上述の宿主−ベクター系
で使用するのに適しているならば使用することができる
。

複製起源については、外来性の起源、例えば、アデノウ
ィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水泡性口内炎ウィルス
（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）等のウィル
ス由来の複製起源を用いることができる。また、発現ベ
クターとして宿主染色体に組み込れるような性質を有す
るベクターを用いる場合、宿主染色体の複製起源を利用
することができる。

本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換された微
生物または細胞は、前述のとおり、組換え体ＤＮＡに与
えられた少なくとも１種の表現型によって形質転換され
ずに残った親細胞から選別される０表現型は少なくとも
１種のマーカー遺伝子を組換え体ＤＮＡに挿入すること
によって与えることができる。また、複製可能な発現ベ
クターが本来有しているマーカー遺伝子を利用すること
もできる。マーカー遺伝子の例としては、例えば、ネオ
マイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダ
クターゼ（以下＠ＤＨＦＲ″と称する）をコードする遺
伝子などが挙げられる。これに関し、ＤＨＦＲ遺伝子を
マーカー遺伝子として用いる場合、ＤＨＦＲには様々の
タイプがあるため、その使用するマーカー遺伝子のコー
ドしているＤＨＰＲのタイプによって用いるべき宿主を
選択しなければならない０例えば、マーカー遺伝子とし
て野性型ＤＨＦＲをコードする遺伝子を用いる場合、宿
主としてはＤ）ＩＦＲ欠損株を用いるのが好ましい。

ＤＨＦＲ欠損株はヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求するので、ヒボキサンチン、グリシンおよびチ
ミジンを含まない培地中では成育できない、しかしなが
ら、ＤＨＦＲ欠損株をＤＨＰＲ遺伝子を含有する組換え
体ＤＮＡで形質転換すると、その株はもはやヒポキサン
チン、グリシン及びチミジンを要求しなくなり、ヒポキ
サンチン、グリシン及びチミジンを含まない培地中でも
成育することができる。従って、形質転換細胞は、ヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンについての栄養要求
性を判断基準にして形質転換されないで残った細胞から
容易に選択することができる。

一方、メトトレギセー）　（ＭＴＸ）に対する親和性の
低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以下“ＭＴＸ
耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー遺伝子とし
て用いる場合には、宿主細胞は正常なりＩ（ＰＲをコー
ドする遺伝子を有していてもよ＜ＤＨＰＲを欠損してい
る必要はない。

その理由は以下のとおりである。正常ＤＨＦＲはＭＴＸ
によって阻害されるため、正常ＤＩ（ＰＲをコードする
遺伝子を含有する宿主細胞はＭＴＸの存在化ではヒポキ
サンチン、グリシン及びチミジンを要求する。しかしな
がら、その宿主細胞がＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含有
する＆［ｌ換え体［ＩＮＡで形質転換すると形質転換細
胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒポキサンチン、グ
リシＸおよびチミジンを要求しない、従って、形質転換
細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンについての栄養要求性を判断基準として
用いて形質転換されていない細胞から選択することがで
きる。これに関し、真核細胞の大多数がＭＴＸ感受性で
あるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマーカー遺伝子と
して用いるのに好都合である。

サツカロミセス　セレビシェ旦ａｃｃｈａｒ姐２ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｓ）などの酵母も本発明のＤＮＡを発現す
るための宿主として用いることができる。酵母で本発明
のＤＮＡを発現するためには複製可能な発現ベクターと
して例えばプラスミドＹＥｐ２４を用いることができる
。プラスミドＹＥｐ　２４はｔＪｒａ３遺伝子を含有し
ており、このＵｒａ３遺伝子をマーカー遺伝子として利
用することができる。

酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては
、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、
ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェー
トイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの解糖系に関与
する酵素類の遺伝子のプロモーターやアルコールデヒド
ロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフアター
ゼ、窒素代謝に関与する酵素、ガラクトース、マルトー
ス及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプ
ロモーターが挙げられる。これらのうち、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフア
ターゼ、窒素代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及びガラクト
ース、マルトース及びラクトースの利用に関与する酵素
類の遺伝子のプロモーターは、これらのプロモーターに
よる転写を宿主の培養条件を変えることによって制御す
ることができるので有利である。

酵母細胞中における転写や翻訳を制御するための複製起
源や終止コドンおよびその他のＤＮＡ配列としては、酵
母細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配列を用いるこ
とができる。

形質転換した微生物または細胞は通常の栄養培地を用い
て通常の公知の方法で培養することにより本発明のペプ
チドをコードするＤＮＡを発現して本発明のペプチドを
製造することができる。培養後、本発明のペプチドは形
質転換体の培養物から通常の公知の方法、例えばカラム
クロマトグラフィーなど用いて単離することができる。

このようにして得られたペプチドは様々な種類と長さの
Ｉ！Ｉを少なくとも１種含有していてもよい、得られた
ペプチドが１１！鎖を含有しているか否かは用いる宿主
細胞の種類によって異なる。また、ペプチドがＩｌ！鎖
を含有している場合の糖鎖の種類や長さも用いる宿主細
胞の種類によって異なる。

一般に翻訳開始シグナルのＡＴＩＣから翻訳されたペプ
チドは宿主細胞から分泌されるときにブロセツシングを
受けて成熟蛋白になることが知られている０本発明のペ
プチドの場合もそのようなプロセッシングを受けること
がある。ペプチドがプロセッシングを受ける部位は、宿
主により、または培養条件により変化する場合がある０
例えば、本発明のペプチドが、穴口→で表されるペプチ
ドとリーダー配列とを含むプロセッシングを受けていな
い未成熟形で形質転換細胞中で産生される場合、その未
成熟形ペプチドはプロセッシングを受けてリーダー配列
が削除されて成熟形となることがある。しかしながら、
前述のように未成熟形ペプチドのプロセッシングを受け
る位置は使用する宿主の種類や宿主の培養条件により変
化するので必ずしも上記のようなプロセッシングが起き
るとは限らない。

前述のとおり、本発明のペプチドは組喚えＤＮＡ技術を
用いる方法により製造することができる。

また、本発明のペプチドは通常の公知の方法により、例
えば市販の自動ペプチド合成装置などを用いて有機合成
により製造することもできる。

本発明のペプチドはトロンビンによるプロティンＣ活性
化を促進する作用を有する。プロティンＣは血液凝固＆
ｌ溶機構において重要な役割を演じているビタミンに依
存性の蛋白質であり、トロンビンの作用により活性化さ
れる。活性型プロティンＣは、生体内で血液凝固系補酵
素の活性型第Ｖ因子、および活性型第Ｖ因子を失活させ
、また血栓溶解作用を有するプラスミノーゲンアクチベ
ーダーの産生に関与していることが知られている。

〔鈴木宏治、医学の歩み、第１２５＠、９０１頁、（１
９８３年）〕０本発明のペプチドは、このトロンビンに
よるプロティンＣの活性化を促進して抗血液凝固作用と
血栓溶解作用を示す活性型プロティンＣを大量に産生せ
しめるものである。従って、本発明のペプチドは生体に
おける抗血液凝固及び血栓溶解に大きく寄与するもので
ある。

前述のように、本発明のペプチドは抗血液凝固作用と血
小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有するので例えば
、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性
動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩＧ）、狭心症
、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患の治療及び予
防に用いることができる０本発明のペプチドを上記の疾
患の治療に用いる際には薬剤として使用可能な担体と混
合することができる。即ち、上記の疾患を治療または予
防するのに存効な量の本発明のペプチドを適当な量の担
体と混ぜて、患者に効果的に投与するのに適した医薬組
成物を調製することができる。

本発明のペプチドは注射剤等として用いることができる
。注射剤として用いる場合は、シロ糖、グリセリン、メ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの増
粘剤、各種無機塩のｐＨ１！整剤などを添加剤として加
えることができる。

本発明の生理活性物質の成人１回当たりの投与量は年齢
、性別、体重、症状等により異なるが、一般に約０．１
〜２００■であり、−日当たり一回または必要に応じて
数回投与する。

本発明をより詳細に記述するために参考例及び実施例に
より説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例にのみ
限定されるものではない。

〔参考例〕

参考例１ （プロティンＣ活性化を促進する作用の測定）本発明の
ペプチドのプロティンＣ活性化の促進作用の測定は、合
成基質、Ｂｏａ−Ｌａｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−＾ｒｇ−Ｍ
ＣＡ　（Ｂｏｃ及びＭＣＡはそれぞれトブトキシカルボ
ニル蟇及び４−メチルクマリル−７−アミドの略称であ
る）を用いる公知のプロティンＣ測定法（ワイ・オーツ
（Ｙ、０ｈａｏ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Ｊ、Ｂ！ｏｃｈｅｍ、）、９０巻、１３８
７頁（１９８１年）〕に従って行なった。すなわち、０
．５μＨのプロティンＣおよび８０ｎＭトロンビンを含
有する水溶液５μｌに本発明のペプチドを含む水溶液５
．ｕＪ　（０〜０．０１　Ａ２８０／ｍｌ）を加え、こ
れにＮａＣｊ、　ＣａＣ１ｇ　、血清アルブミン及びト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）をそれぞれ最終濃度が０
．１５Ｍ、２．５閤Ｎ　ｓ　ｌ　ｍｌｌ／ｍｌ及び２０
ｗＭになるように、そして全量が３０μｌとなるように
加えた。得られた混合物を３７℃で１５分間反応させて
プロティンＣを活性化した後に２μけのアンチトロンと
ンｍを１０μｌ及び１０単位／ｍｌのヘパリンを含存す
る水溶液をｌＯμｌ加えて３７℃で１５分間加温して反
応を停止させた。得られた反応混合物に、前述の合成基
賀Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−＾ｒｇ−ＭＣＡ　
　（財団法人蛋白質研究奨励金ペプチド研究会（Ｐｅｐ
ｔｉｄｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）　（日本）製）２０（ｌ
ｃｒＭを含む２０℃Ｍトリス塩ＭＭ衝液（ｐＨ７，４）
　２５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、
２０％酢酸０．５＋ｗｌを加えて反応を停止させ、遊離
してきたＡＭＣ（７−アミツーツーメチル−クマリン）
の濃度を励起波長３８０ｎｓ、発光波長４４０ｎｍで蛍
光分光光度計ＲＦ−５４０型（高滓製作所製、日本）に
より測定した。得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの
蛍光強度と比較して、遊離したＡＭＣ量を求めた。値は
１分間当りに生成するＡＭＣ量で表わす。

このＡＭＣ量から本発明のペプチドを含まない水溶液を
加えたときのＡＭＣ量を引いた値がサンプルのトロンビ
ンによるプロティンＣ活性化を促進する強さを示す。

ここで、プロティンＣはヒト血しょうから鈴木らの方法
〔鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ
＋、）、２５８巻、１９１４頁、（１９８３年）〕で精
製した。

また、ヒトトロンビンはランドブラッド（Ｌｕｎｄ−ｂ
ｌａｄ）　　らの方法〔ランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌ
ａｄ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍ５ｕｎ、）、６６巻、４日２頁、　（１
９７５年）〕で精製した。

参考例２ （プラスミドＭ１３−ＴＭＤ５の構築）本発明の原料と
なるＤＮＡ断片ＴＭＤ５を組み込んだプラスミドＭ１３
−ＴＭＤ５を本発明者によって既に出願され公開されて
いる方法〔国際公開番号ＷＯ３８１０５０５３（国際出
Ｈ番号ＰＣＴ／ＪＰ８８１０００１１）に従って作成し
た。

すなわち、トロンビンによるプロティンＣ活性化を促進
するペプチドをコードするプラスミド、ｐｓＶ２ＴＭＪ
２を取得し、該ＤＮＡから部位特異的変異の手法を用い
てＤＮＡ断片、ＴＭＤ５を含む組換え体プラスミドＭ１
３−ＴＭＤ５を得た。

なお、上記のプラスミドｐｓＶ２　ＴＭＪ２は、すでに
本発明者によってブダペスト条約の規定に基き、アメリ
カ　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）に
寄託番号第６７２８３号として寄託されている。

〔実施例〕

＋１１　　プラスミドｐｓＶ２ＴＭＤ６ノ構築（ｅ）　
　ＤＮＡ断片ＴＭＤ６の構築 削除用ＤＭＡプローブ（以降「デイリーター（ｄａｌａ
ｔｅｒ）　Ｊと称す）として、下記の塩基配列を有する
ＤＮＡを有機合成した。

５　’　−ＧＣＡＣＧＧＧＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＡＣＣ
ＣＣＡＧＧ−３’　（２５ａ＋ｅｒ）　。

（この合成デイリーターをＴｉｄｓと称する。）このよ
うにして作成したデイリーターＴＭｄｓを用いて、メソ
ッド　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　
Ｉｔｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ）、第１００＠、４６８頁、（
１９８３年）、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅ＋ｗｉ
ｃＰｒｅｓｓ）に記載の方法に従って部位特異的変異の
手法で前記の如く得られた組換え体プラスミドＭ−１３
↑ＭＤ５の９塩基からなる部分の削除を行った。

すなわち、２５ｐｍｏｌのデイリークーＴＭｄｓ及びｌ
Ｏｐｍｏ　ＩｔのＭ１３ブライマーＭ３　（ユニバーサ
ルブライマー、宝酒造株式会社製、カタログ番号３８３
１）の５′末端をＴ＃キナーゼを用いてリン酸化した後
、Ｑ、５ｐｍｏｊの組換え体プラスミドＭ１３ＴＭＤ５
のジングルストランドＤＮＡを加え、９５℃で５分間加
熱後、室温にまで冷却した０次いで５単位のＥ、　　ｃ
ｏｌｉ　ＤＮ＾ポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａ
ｓａｎｔ）、及び１０単位のＴ、　ＤＮＡリガーゼを混
合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートして混合
物中に組換え体プラスミドを生成させた。得られた混合
物を大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５　（ファル
マシア社製、スウェーデン、カタログ番号２７−１５５
０）に加えた。それによってこの大腸菌を組換え体プラ
スミドでトランスフェクションした。３７℃で一夜培養
して生じた寒天培地上のプラークをニトロセルロースフ
ィルターに移しとり、８０℃で２時間加熱後、プレハイ
ブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーシ
ョンは６ＸＳＥＴ（０，９Ｍ　ＮａＣｌ、　１８０ｍＭ
　　）リス緩衝液（ｐＨ８，０）、６＋ｓＭ　ＥＤＴＡ
）　ｓ　５　ＸＤｅｎｈａｒｔｓ’　（０，１％（ｗ／
ｖ）　７４　：ｌＩ−ル（Ｆｉｃｏｌ＋）、０．１％（
ｍ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％（Ｗ／Ｖ）　
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　）　、０．１％ＳＯ
５，１００μｇ／−１変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中
で５５℃、２時間加温することにより実施した０次いで
上記の溶液中の変性サケ精子［ＩＮＡのかわりに■Ｐで
ラベルしたＴＭｄｓを加えた溶液を用いてハイブリダイ
ゼーション反応を５５℃、２時間実施した０次いで、６
　Ｘ　５ＳＣ（０，９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエン酸三ナ
トリウムの水溶液）を用いてニトロセルロースフィルタ
ーを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２回洗った後、
５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を上げていっ
て、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フィルムＸＡ
Ｒ−５（イーストマン　コダック社製、米国）をニトロ
セルロースフィルターに密着させて一８０℃、−夜露比
させたところ、Ｘ線フィルム上に強く露光した黒いスポ
ットが数１０個検出された。各スポットは組換え体プラ
スミドで感染したクローンに対応するものである。その
うち、６クローンを選択し、各クローンの組換え体プラ
スミドを単離して制限酵素解析、及び塩基配列の解析を
行ったことろ、これらのクローンの保有する組換え体プ
ラスミドは制限部位と塩基配列がそれぞれ同一であるこ
とがわかった。得られた組換え体プラスミドをＨ１３−
ＴＭＤ６と称した。更にこの組換え体プラスミドＭ１３
−ＴＭＤ６は、開始コドン（ＡＴＧ）とその下流に１１
５個のアミノ酸からなる本発明のベプチ１をコードする
塩基配列を含む塩基配列を含をするＤＮＡ断片を有する
ことがわかった。この組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭ
Ｄ６に含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ６と称した。

第１図に組換え体プラスミドＭ１３−Ｔ？ＩＤ５とデイ
リーターＴＭｄｓとがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片Ｔ
ＭＤ５に対応するＤＮＡ　ｍｌ域の一部が削除されると
ころを示す。

伽）　プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ６の構築実施例＋１１
−　（ｅ）で作製した組換え体プラスミドＦ１１３−Ｔ
ＭＤ６を…閃ｍおよびＢａｇ旧で完全消化してＴ月Ｄ６
の約７３０ｂｐ　ＤＮＡ断片を単離した◆一方）プラス
ミドｐｓν２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）をＨ４
ｎｄｍ及びｈＬｍで完全消化してベクターを得た。この
ベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ６とをＴ、　ＤＮＡリガー
ゼを用いて継ぎあわせ、プラスミドｐｓＶ２ＴＭ［１６
を得た。

（２）　　プラスミドＰＳＶ２ＴＭＤ６　ニよルＣＯ３
−１細胞の形質転換 ＣＯ５−１１８胞（ＡＴＣＣＣ１？Ｌ１６５０）を培養
器中に入れた１０％（ｖ／ν）のウシ胎児血清（以下“
ＦＣ３’と略する）を加えたダルベツコの最小必須培地
（以下″？ｌｌ’Ｍ’と略する）　〔米国、フローラボ
ラトリー（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、
カタログ番号１Ｏ−３３１）を用いて、３７℃で５％炭
酸ガスインキューベーター中で対数増殖期になるまで培
養し、０．１％トリプシン及び０．０２％Ｆ！ＤＴＡを
用いて培養器に付着増殖した細胞を培養器よりはがして
、ハンクス平衡塩類溶液〔米国、７ｏ−ラボラトリ−（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、カタログ
番号１７−１０１−２２　）に約ｌＸｌ０’個ノー１の
濃度になるように懸濁した。

実施例ｉｌｌ　−ｆｆ１）で得られたプラスミドｆｌｓ
Ｖ２ＴＭ［１６を約２μｇ／μｌになるように１−Ｈト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した。約１０μｇ
のプラスミドＰＳＶ２ＴＭＤ６を含む得られたプラスミ
ド懸濁液５μｌを１．５　＋＊１容量のエッペンドルフ
型試験管に入れ、次いでこの試験会に上述の如く得られ
たＣＯ３−１細胞の細胞懸濁液２００μｌを入れて０℃
で１０分間放置した。試験管内の懸濁液を米国り、Ｅ、
Ｐ、　ＳＹＳＴＥＭ社製細胞融合装置ＦＰＨ１００Ｉ型
のキュベツトに移し、１．２ｋＶで４０秒の条件で２回
電気パルスを与えた。

その後懸濁液を再び元のエッペンドルフ型試験管に移し
、０℃で５分間放置した後、１０％（Ｖ／Ｖ）　Ｆｅ２
を加えたダルベツコのＭ！！Ｍ　１０ｍ１を以下のよう
に用いて直径ＩＱｃｍの組織培養用プレートに移した。

即ち、少量の１０％（ｖ／ｖ）　Ｆｅ２を含むダルベツ
コのＭＵＭを懸濁液に加えてその混合物を組織培養用プ
レートに移した８次いで、試験管を残りのダルベツコの
Ｍ開で数回洗浄して洗浄液を同じプレートに加えた。そ
の後、プレートは５九ＣＯオ存在下３７℃で２４時間焙
培養た。

（３）トロンビンによるプロティンＣ活性化を促進する
作用の確認 培養終了後、プレートの培地をＦｅ２を含まないダルベ
ツコのＭＩＩＨに交換し、４８時間培養した。培養上澄
液を５μ！採取し、これを試料として参考例１に記載し
た方法で、プロティンＣ活性化の促進作用を測定した。

更に、直径１０ｃｍの組織培養用プレート１枚分の細胞
を米国コースタ−（ｃｏａｓｔｅｒ）社製セルスフレイ
パー（ｃｅｌｌ　５ｃｒａｐｅｒ）　（カタログ番号３
０１０）を用いて掻き取りて集め、８００μｌｍ、　１
０分間の条件で遠心分離して集める。このペレットを試
料として用いて参考例１に記載した方法でプロティンＣ
の活性化を促進する作用を測定した。またコントロール
としてはプラスミド９ＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフオ
ームしたＣＯ３−１細胞の培養上澄液及び細胞ペレット
を試料として用いた。

結果を第１表に示す０表中に示す吸光度の数値は試料の
吸光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。

以下　余白 第 表 （４）　　プラスミドｐｓＶ２ＴＭＤ６によるＣＩＯ細
胞の形質転換と形質転換細胞における発現 約４ｐｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７
１５０）、及び約２０μｇの実施例（１１−（ｂｌで作
成したプラスミドＧＩＳＶ２ＴＭＤ６を混合してエタノ
ール沈澱をした。沈澱物を風乾燥後、４５０μｌのＴＥ
（ｐＨ７，９，１１１Ｍトリス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ
　ＨＤＴＡ）に溶解し、５００μｌの２ＸＨＢＳ　（５
０ｍＭ　ＨＥＰＩ！Ｓ　、　２８０ｍＭ　ＮａＣ１，１
，５ｓ＋ＭＮａｔＨＰＯｎ、ｐＨ７，１２）を加えた０
次いで５０ｐｌの２．５Ｍ　ＣａＣ１富を滴下し室温に
１０分間放置した。一方、１０％（ｖ／＋＋）Ｆｅ２及
び、ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、
フローラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−
４９）を含有するＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２培地（米国、フ
ローラボラトリー社製、カタログ番号１Ｏ−４２１−２
０）を用いて直径６３の組織培養用プレートにプレート
１枚当たり細胞数５Ｘ１０’程度播種したＣＨＯ−Ｋｌ
株（ＡＴＣＣＣＣＬＤ　６１）を１夜培養し、培地を新
鮮な培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−
Ｋｌに前述のＣａＣ１１を滴下したプラスミドＤＮＡ溶
液を重層し、３７℃で約８時間培養した。５１のＰＢＳ
（−）　　（米国、フローラボラトリー社製、カタログ
番号２８−１０３〜０５）を用いて２回洗浄し、さらに
、５ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約
１６時間さらに培養した。

プレートに付着した細胞を０．２５％トリプシン、０．
０２％Ｉ！ＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径１０ｃＩｌ
の組織培養用プレート４枚に広げて培養した。２４時間
後、培地を選択培地に交換した０選択培地の組成は前述
の培地に４００μｇ／醜１になる様にジェネティシンＧ
、４１Ｂ（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８６０−
１８１１）を添加したものである。３〜４日おきに培地
交換を行いながら約２週間培養して、トランスフオーム
した細胞をクローニングした。この操作で得られた細胞
のクローンをそれぞれ直径１０ｃｍのｍ織培養用プレー
トでコンフルエントになるまで生育させた。途中、培地
のＦＣ５濃度を１０％から１％に凍らした培地に切り換
えて培養した。このＦＣＳ含有選択培地で培養した培養
液５０μｌをとり、これを用いて参考例１に記載した方
法でプロティンＣ活性化を促進する作用を測定したとこ
ろ、強いプロティンＣ活性化促進作用が認められた。一
方、コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏだけでトランスフオームした細胞では本活性は検出
されなかった。

（５）　　プラスミドｐｄｌｌＰＶＴＭＤ−６−１ニよ
るＣ１２７細胞の形質転換および形質転換細胞の産生ず
るペプチドのトロンビンによるプロティンＣ活性化の促
進作用の測定 実施例（１１−（ｂ）で作成したプラスミドＰＳＶ２Ｔ
ｌ１０６をＨ３ｎｄ　ｍで完全消化した後、切断末端を
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ、ＤＮＡ
リガーゼを作用させ、プラスミドｐｓＶ２ＴＦｔＤ６の
）Ｉｉｎｄｌ１１サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２
７ＭＤ６−１を得た０次いでこのプラスミドＰＳν２Ｔ
ＭＤ６−１をムｕＩＩ及びルリーＨＩで完全消化して約
１７００ｂρのＤＮ＾ＮＡ断片た。これをプラスミドｐ
Ｕｃ１８のｆｆ１ｎｃ　　７１及びＢａ５ｅｒで完全消
化したベクターに挿入してプラスミドｐＵｃＴＭＤ６−
１を得た。一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３
７０１７）からコバスルピアスらの方法〔エル・コバス
ルピアスら（Ｌ、Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ　ｅｔ　ａｌ
）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、川。

２５、（１９８１年）に従ってプラスミドｐＢＩ？３２
７を作製した。得られたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａ
ｍＨＩ及びＨｉｎｄ　Ｉｌｒで消化して得た約２９６０
ｂ、のＤＮＡ断片に、プラスミドｐＵｃＴＭＤ６−１を
Ｂａｍ１ｌｌ及びＨｉｎｄ　ｎｒで完全消化して得た約
２６００ｂｐのＤＮＡ断片を挿入してプラスミド９ＢＲ
ＴＭＤ６−１を得た。このプラスミドｐＢＲＴＭＤ６−
１をＨｉｎｄｎｌで完全消化したものとプラスミドｐＢ
ＰＶ−１（９−１）　（ＡＴＣＣ３７１１１）を肚屁■
で完全消化して得た断片とをＴｔＤＮＡ　リガーゼを用
いて継いで、Ｃ１＊７細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰ
ＶＴＭＤ６−１を得た８以上の工程を第２図に示す。

次に実施例（４）に記載の方法に準じてｐｄＢＰＶＴＭ
Ｄ６−１でＣ１２７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）を
トランスフオームした。１０％ＦＣ８及び１ν／Ｖ％ペ
ニシリン−ストレプトマイシン（米国、フローラボラト
リー社製、カタログ番号１６−７００−４９）を含むダ
ルベツコのＭＥＮで約３週間培養したところ、フォーカ
スを形成する細胞が５個得られたのでそれぞれの細胞を
クローニングして、それぞれ直径ｌ０（２）の組織培養
用プレートでコンフルエントになるまで生育させた。そ
の後、培地をＦｅ２を含まない培地に置換して培養した
。この培地で１日培養した培養液５０μｌをとり、これ
を用いて参考例１に記載した方法でプロティンＣ活性化
の促進作用を測定したところ、強い活性が認められた。

一方、コントロールとして用いたプラスミドｐＢＰＶ−
１（９−１）だけでトランスフオームした細胞では本活
性は検出されなかった。

（６）　　プラスミドｐＹＧａ　Ｊ　Ｉ　ＴＭＤ６−Ｙ
の構築＋８）　　酵母発現用プラスミドベクターｐＹＧ
ａ　ｌ　１の構築 Ｇａ　ｌ　１プロモーターを持ったプラスミドｐＧ１（
ＡＴＣＣ３７３０５）をＢａ５ａｌで完全消化した後、
切断末端をＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、
次いで…ｎｄＩ［Ｉを用いて完全消化して、Ｇａｊ！ｔ
プロモータを含む約９００ｂ、断片を単離した。−方、
Ｍ１３ベクターのＭ１３ｔｇ１３０　（アマ−ジャム・
ジャパン製、コード番号ＲＰＮ４５３７）をＨｔｎｄ　
Ｉｌｌ及びＥｃｏ　　ＲＶで完全消化して大きな断片を
単離する。

得られた断片と前述の約９００ｂ、断片とをＴ、、ＤＮ
Ａリガーゼを用いて継ぎ、Ｍ１３ｔｇ１３０−ｐＧｌを
得た。

また、Ｔｒｐ５ターミネータ−を持ったプラスミドｐＴ
ＲＰ５６　（ＡＴＣＣ３７３０６）　を匡虹Ｒ１、及び
計１ｊで完全消化して、Ｔｒｐ５ターミネータ−を含む
約５４ｏｂｐの断片を単離した。また、プラスミドｐｌ
ＢＩ２０　（インターナシコナル・バイオチクノロシー
ズ・インク社製、カタログ番号３３８２０）をＢｃ。

Ｒ１、及びＫＰｎ　　Ｉで完全消化して約４２００ｂｐ
の大きな断片を単離した。得られた断片と前述の約５４
０ｂｐの断片とをＴ、［ｌＮＡ　リガーゼを用いて継ぎ
、ｐｌＴｒｐ５を得た。

次いで、このｐｌＴｒｐ５をＥｃｏＲＩ及びＢａ５ＨＩ
で完全消化して約５００ｂｐの断片を単離した。−方、
プラスミド）’ＩＰ２４　（ＡＴＣＣ３７０５１）をハ
ム」で完全消化後、？、［ｌＮＡ　リガーゼを用いてＢ
ａｍＨＩリンカ−（アマ−ジャム・ジャパン製コード番
号ＤＣ８００３）を継ぎ、さらにＢａｗＨＩで完全消化
し、・大きな断片を単離し、Ｔ４．ＤＮＡリガーゼを用
いて切断末端を継ぎ合わせ、プラスミドＹＥＰ２５を得
た０次いで、ＹＥＰ２５をＳａｇａ　Ｉで完全消化した
後、切断末端にＰｖｕ　ＩＩリンカ−にュー・イングラ
ンド・バイオラボ社製、カタログ番号１０４３）を丁オ
ＤＮＡ　リガーゼを用いて継ぎ、さらにＰｖｕ　ＩＩで
完全消化後、大きなりＮＡ断片を単離し、切断末端をＴ
、、ＤＮＡリガーゼで継ぎ合わせ、プラスミドＹＥＰ２
６を得た０次いで、ＹＥＰ２６を１１１１で完全消化後
、切断末端をｔｌＮ＾ポリメラーゼを用いて平滑末端に
し、さらにＢａｍＨＩで完全消化して大きなりＮＡ断片
を単離した。

得られたＤＮＡ断片と前述のｐｌＴｒｐ５をＥｃｏ　　
ＲＶ及びハｗｒ　　Ｈｌで完全消化して得た約５００ｂ
ｐの断片とをＴｔＤＮＡ　リガーゼを用いて継ぎ合わせ
、Ｙ［！Ｐ２７を得た。さらに、得られたＹＥＰ２７を
Ｐｖｕ　Ｕ及びＢａｍＨＩで完全消化して大きなりＮＡ
断片を単離した。一方、前述のＭ１３ｔｇ１３０−ＰＧ
ＩをＢａｍＨＩ及びＳ削ａ　　Ｉで消化して約９ｏｏｂ
ｐの断片を単離し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
得られた約９００ｂｐの断片を’１ＥＰ２１のＰｖｕ　
ＩＩ−ＢａＩＩＨ１断片と継ぎ合わせ、酵母発現用ベク
ターｐＹＧａ　Ｉｔ　ｌを得た。

以上の工程を第３図に示す。

山）　酵母発現用ＤＮＡ断片ＴＭＤ６−Ｙの構築実施例
（１１−ｆａ＋で作成したＭ１３−Ｔｌ’ｌＤ６には開
始コドン（ＡＴＧ）の直後に開始コドンを含めて５４塩
基対より成るいわゆるリーダー配列があるので、この配
列を実施例ｆ１）　−ｉ８）に記載と同様の手法で部位
特異的変異の手法で削除して酵母発現用ＤＮＡ断片丁Ｍ
Ｄ６−　’ｌを含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ
６−Ｙを作成した。なお、デイリーターとして、ＴＭｄ
、−Ｙの命名した下記の塩基配列を有するＤＮＡプロー
ブを有機合成した。

５’　　−ＧＣＡＣＧＧＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＡＣ
ＣＣＡＧＧ−３’　　（２５ｍｅｒ）第４図に組換え体
プラスミドＭ−１３７Ｍ［１６とデイリーターＴＭＤ６
−Ｙとがパイプリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＤ６に対応
するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

（ｃ１プラスミドｐＹＧａ　１１−ＴＭＤ６−’／の構
築実施例＋６）　−（ｂ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ６−Ｙを紅組■およびハｍ　　ＩＩで
完全消化してＴＭＤ６−Ｙを含むｆｌＮＡ断片を単離し
た。一方、実施例＋６１−１ａｌで作製した酵母発現用
プラスミドベクターｐＹＧａｊ！　ｌを）ｌｉｎｄ［Ｉ
Ｉ及びＲａｍ）ＩＩで完全消化してベクターを得た。得
られたベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ６−ＹとをＴオＤＮ
Ａ　リガーゼを用いて継ぎ合わせ、プラスミドｐＹＧａ
　１１−ＴＭＤ６−Ｙを得た。

（７）　　プラスミドｐＹＧａ　Ｊ　１−ＴＭＤ６−Ｙ
による酵母の形質転換と形質転換細胞における発現 サツカロマイセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓＣｓｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＨＹ３（ＡＴＣＣ４４
７７１）を３ａｌのＹＰＤ培地（１％バクト・イースト
エキストラクト、２％バクト・ペプトン、２％デキスト
ロース、２％バクト・アガー）で３０℃で一夜振盪培養
したものを１００１のＹＰＤ培地に移しかえ、３０℃で
さらに５時間振盪培養する。その培養液を１＋＋＋Ｉと
って遠心分離１０．０００ｒ、ｐ、■、、１分間）して
菌体を集め、さらにその菌体で２００μｌの０．２Ｍ　
ＬｉＣＪに懸濁し、再び遠心分Ｎ　（１０，０００ｒ、
　ｐ、ｍ、　、　１分間）して菌体を洗う、１．５ｍｌ
容量のポリエチレンチューブ内でこの洗浄菌体に２０μ
ｌのＩＭ　ＩｊＣＪ　、　３０μｌの７０％ポリエチレ
ングリコール４０００．１０μｌの０．５■／１の実施
例＋６１−　（ｃ１テ作成したプラスミドＤＮＡ　、　
ｐＹＧａｊ　１−Ｔ？ＩＤ６−Ｙをそれぞれ順次別えよ
く攪拌する。３０℃で１時間加温後、４２℃５分間の熱
処理後、イースト・ナイトロゲン・ベース（アミノ酸不
含有）（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　　Ｂａ５ｅ　
ｗｌｏ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ、　ＤＩＦＣＯ社製、
カタログ番号０９１９−１５）を６．７ｇ／　Ｉｔ　、
及びグルコース２０ｇ／　Ｉｔにさらに５ＨＹ−３の持
っている栄養要求性のうちウラシルを除（栄養源を添加
した寒天培地にブレーティングして３０℃で加温する。

３日後にこの培地に生育して来たコロニーが約３０コロ
ニー得られたのでそのうち、６コロニーを単離し、それ
ぞれ培養し、制限酵素を用いた解析をした結果、６個の
コロニーが全て、目的のプラスミドｐＹＧａ　ｌ　１−
ＴＭＤ６−Ｙを含むものであることが判明した。このう
ちの−株を５００＋ｓｌのＹＰＤ培地で３０℃で一夜振
盪培養したものを４．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、２０分間遠心
分離して菌体を集め、ガラクトースを２％含んだＳＤ培
地（０，６７％バクト・イースト・ナイトロゲン・ベー
ス、アミノ酸不含有、２％デキストロース、２％バクト
・アーガー）　１００　ｍｌに懸濁し、３０℃で４時間
振盪した。　４，０００ｒ、ｐ、ｍ、２０分間の遠心分
離で菌体を集め、湿菌体重１０ｇ当たり、５０ｇのガラ
スピーズ及び１５＋ｗｌの緩衝液（０，１Ｍ　リン酸ナ
トリウム、ｐＨ８，０）を加え、ブラウンのホモジナイ
ザー（西独、ブラウン社製、タイプ８５３０２２）を用
いて６回、各３０秒間ホモジナイズする。遠心分離して
、上澄１０μｌをとって参考例１に従ってプロティンＣ
活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が検出さ
れた。また、コントロールとして用いたτＭＤ６−Ｙの
挿入されていないプラスミドｐＹＧａ　ｊ！１で形質転
換された酵母では本活性は検出されなかった。

（８）　　本発明のペプチドの精製 実施例（４）に記載した方法で培養したプラスミドｐｓ
ν２−１１１１０及びプラスミドｐｓＶ２ＴＭ［１６で
トランスフオームしたＣＨＯ細胞を直径１０ｃ１１の組
織培養用プレート２５枚で培養した。培地は１日おきに
４回、新鮮な培地と交換した。この培養液をすべて集め
（約１００　ｍｌ）　、ｐＨ７，５に調整した後口ＩＰ
−）ロンビン−アガロースのカラムクロマトグラフィー
にかけて精製した。

すなわち、エヌ・エル・エスモン（Ｎ、Ｌ、Ｅｓ＠ｏｎ
）ら〔ザ・ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、ｌＨｏ１．Ｃｈａｍ）　、２５７巻、８５
９頁、（１９８２年）〕の方法にしたがって作製したＤ
ＩＰ　−トロンビン（ジイソプロピルホスホロトロンビ
ン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｒ
ｏｍｂｉｎ）　）を、ビーークオトレカサス（Ｐ　、　
Ｃｕａ　ｔｒｅｃａｓａｓ）の方法（ザ・ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ）　、２４５巻、３５９頁、（１９７０年））
にしたがってブロムシアン化したアガロースに結合させ
てＤＩＰ−）ロンビン−アガロースを作製した。

次にＤＩＰ　−）ロンビン−アガロースを２．５ｃｍφ
×１０１の大きさのカラムに充填して［１ＪＰ　−）ロ
ンビン−アガロースカラムを作製し室温で０．１Ｍ　Ｎ
ａＣｌ、０．５　ｍＭ　ＣａＣＩｔＳｌ　＋＊Ｍベンズ
アミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸ
　（牛丼化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍ　トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）でカラムを平衡化した０次い
で、上記の上澄液をカラムに供した。

カラムを０．３Ｍ　ＮａＣｌ　、０．５ｍＭ　ＣａＣ１
，，１１ＭＭベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）
Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸを含む０．０２Ｍ＋−リス塩ｌｆ１
１Ｍ衝Ｈｔ（ｐＨ１，５）　７Ａｔｃ浄ＬりＩｌｔ、Ｉ
ＦＩＮａＣｌ、　０．１ｇＭ　ＨＤＴＡ、　１ｍＭベン
ズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸ
を含む０．０２Ｍ　　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
で溶出して２．Ｏｍｌずつフラクションを集めた。溶出
によって得られる各フラクションについての前記の方法
でプロティンＣ活性化の促進作用を測定した。同時に島
原製作所（日本）製スペクトロフォトメーターＵシー２
４０を用いて各フラクションの波長２Ｂ０ｎｍにおける
吸光度（＾、。）を測定した。活性のある両分を回収し
、０．ＩＭ　ＮａＣ１，０，５−Ｍ　ＣａＣ１ｇ、０．
５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸ　（牛丼化学薬品製
、日本）を含む０．０２？Ｉ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で透析した。得られた透析液を２回目のＤＩＰ
−）ロンビン−アガロースカラムクロマトグラフィーに
供した。即ち１．透析液を１．５　ａｓφＸ　ＩＯＱｍ
の大きさのＤＩＰ　−トロンビン−アガロースカラムに
通し、０．４Ｍ　　ＮａＣ１、０，５ｍＭ　　ＣａＣ１
ｔ　　、　０．１　　％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを
含む０．０２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐ）１７．５）で
洗浄後、さらに０．４Ｍ　ＮａＣｌ　、０．１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、　０．１％（ｖＩｈｖ）Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸを
含む０．０２Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄
し、次いで、ＩＭ　ＮａＣｌ　、　０．５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）　Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸを含む０
．０２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で溶出した
。活性画分を回収し精製品を一８０℃で凍結保存した。

この精製品の分子吸光係数を一般的な蛍白質の分子吸光
係数にならい１０．０（Ｅ　’％・２８０ｎｍ−１０，
０）と規定して、それにｅｇ 基づき精製品の量を計算したところ約５μｇであった。

尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５〜１０
％のグラジェントを用いる５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察した
ところ単一のバンドのみ確認された。

（９）トロンビンによるプロティンＣ活性化を促進する
作用の確認 精製した本発明のペプチドのプロティンＣ活性化の促進
作用を以下の方法にて評価した。

即ち、０．１Ｍ　ＮａＣ１，０，５ｄ　ＣａＣＩｇ　、
１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍ　
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に５０Ｍｇ／ｍｌのプ
ロティンＣ，５ｎ−のトロンビンおよび５ｔＭの精製し
た本発明のペプチドを加えて３７℃で反応させた０反応
物に３００μｇ／ｍ＋のアンチトロンビン■（米国シグ
マ社製）および５■Ｍ　ＥＤＴＡを加えて反応を停止し
て、生成した活性型プロティンＣの量を前述の合成基質
を用いる方法で測定した。

結果を第５図に示すが、本発明のペプチドを無添加の場
合（Ｂ）では活性化プロティンＣの生成は認められなか
った（点線）が、本発明のペプチドを添加した場合（Ａ
）には、反応時間と共に生成した活性化プロティンＣの
量が増加した（実線）。

（抗血液凝固作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンによるフィブリノーゲン
のフィブリンへの変換を阻害し、血液凝固を実質的に阻
害することはハインリツヒ　アメルンク社（西独）製の
コアギュロメーターＫＣ−１０を用いて血液凝固時間を
測定することによって調べた。即ち、５麟Ｍ　ＣａＣＩ
ｇ　、　０．１Ｍ　ＮａＣ］を含む０．０５ｈ　トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に３．０Ｍｇのフィブリノー
ゲン（米国シグマ社製、フラクション■）を加え、これ
に０−５０ｎＨの精製した本発明のペプチドを加え、次
いで、全量が０．４　ｍｌになるように１０ｈＭのトロ
ンビンを加えて凝固時間を測定した。

結果を第６図に示す、トロンビンにくらべ、添加した精
製ペプチドの量が多くなるにしたがって、血液凝固時間
が延長されることが確認された。

（血小板凝集抑制作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンの血小板凝集作用を実質
的に阻害することはＳ　Ｉ　ＥＮＣＯ社（米国）製のプ
レートレットアブリボメーターを用いて評価した。即ち
、３０万ｃｅｌｌ／μｌの血小板溶液（Ｐｌａｔｅｌｅ
ｔ　Ｒｉｃｈ　ＰＩａｓ＋＊ａ　、　Ｐ、Ｒ，Ｐ、）２
５０＃　Ｉ−に１単位のトロンビン（約０．４　μｇ）
を加えると血小板が凝集するが、トロンビンを加える前
にその加えるトロンビンと等モル以上の精製した本発明
のペプチドを加えておくと血小板の凝集が起きなかった
。

〔適用例〕

以下に本発明のペプチドの適用例を応用例をもって説明
するが、本発明はそれら応用例により何ら限定されるも
のではない。

応用例！ 精製した本発明のペプチド　　　１０■精製ゼラチン　
　　　　　　　　２０■マンニトール　　　　　　　　
１００■塩化ナトリウム　　　　　　　　７．８■リン
酸ナトリウム　　　　　　１５．４■上記成分を注射用
蒸留水２１に溶解し、無菌バイアルに入れ、−３５℃で
２時間予備凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒ
ｒで３５時間−次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０
３Ｔｏｒｒで５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製
造した。得られた組成物は、投与直前に生理食塩水もし
くはブドウ糖注射液５００　ｍｌに溶解して点滴静注す
るのに用いられる。

応用例２ 精製した本発明のペプチド　　２．５■アルブミン　　
　　　　　　　　５■ マンニトール　　　　　　　　　２５１１１ｒ塩化ナト
リウム　　　　　　　１．９５℃ｗリン酸ナトリウム　
　　　　　３．８５■上記成分にて、応用例１と実質的
に同様の方法により注射用バイアルを製造した。

（効果） 本発明のペプチドは、抗血液凝固作用、血小板凝集抑制
作用、血栓溶解作用を合わせ持ち副作用の少ない循環器
系疾患や妊娠中毒症などの治療用架として極めて有用な
物質である。また、本発明のペプチドは、このような医
薬用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテー
テルなどの医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防
止する薬剤として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換え体プラスミドＭ−１３ＴＭＤ５とデイリ
ーターｒｎｄ、とが相補的にハイブリダイズした状態を
示すものであり、デイリーターがプラスミドにハイブリ
ダイズしている部分の周辺の塩基配列とそれによってコ
ードされているアミノ酸配列を示すものである。 第２図は、本発明の複製可能な組換え体１）ＮＡである
プラスミドｐｄＢＰＶ？Ｍ［＋６−１の構築を示すフロ
ーチャートである。 第３図は、本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡの酵母発
現用ベクターｐＹＧａ　１１の構築を示すフローチャー
トである。 第４図は、組換え体プラスミドト１３　ＴＭＤ６とデイ
リーターＴＭｄ、−Ｙとが相補的にハイブリダイズした
状態を示すものであり、デイリーターがプラスミドにハ
イブリダイズしている部分の周辺の塩基配列とそれによ
ってコードされているアミノ酸配列゛を示すものである
。 第５図は精製した本発明のペプチドの存在下及び非存在
下における、プロティンＣとトロンビンとの反応によっ
て生成した活性化プロティンＣの量と反応時間との関係
を示すグラフである。 第６図は、精製した本発明のペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 特許出願人　旭化成工業株式会社 メジ 図 （ａ） ＭＤ６ Ｍ１３−ＴＭ０１ Ｍ１３ＴＭＯ６ 第 図 反バ壌特間 （ｍｉｎ）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式（ I ）： 【遺伝子配列があります】・・・（ I ） で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド。
2. （２）遺伝暗号の縮重に基づき少なくとも１個の塩基が
   置換されている又は置換されていない請求項１記載のペ
   プチドをコードするデオキシリボ核酸。
3. （３）遺伝暗号の縮重に基づき少なくとも１個の塩基が
   置換されている又は置換されていない 次式（II）： 【遺伝子配列があります】・・・（II） で表わされる塩基配列を含有する請求項２記載のデオキ
   シリボ核酸。
4. （４）請求項２記載のデオキシリボ核酸と複製可能な発
   現ベクターとを含有する複製可能な組換え体ＤＮＡ。
5. （５）請求項３記載の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質
   転換された微生物または細胞。
6. （６）（ａ）請求項１記載のペプチドをコードする塩基
   配列を含有するデオキシリボ核酸を複製可能な発現ベク
   ターに結合して該デオキシリボ核酸と該複製可能な発現
   ベクターとを含有する複製可能な組換え体ＤＮＡを得、 （ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物又は細胞を
   形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
   選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該デオ
   キシリボ核酸を発現させて、該ペプチドを産生せしめ、
   そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離するこ
   とを含む請求項１記載のペプチドの製造方法
7. （７）トロンビンと結合してトロンビンの持つ血液凝固
   の作用を血液抗凝固作用へと変換させるために有効な量
   の請求項１記載のペプチド及び少なくとも１種の薬剤と
   して投与可能な担体、希釈液または賦形剤を含有する医
   薬組成物。