JPH02257063A - 免疫測定試薬および免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、不溶性担体を使用し免疫凝集反応に基づいて
被測定物質を測定するために用いられ、高い検出感度で
非特異反応が少ない免疫測定試薬および免疫測定法に関
する。特に抗原および抗体の測定に適した免疫測定試薬
に関する。

また、特に梅毒トレポネーマ抗体およびＨＢＳ抗体の測
定に適した免疫測定試薬に関する。

（従来の技術） 体液中の微量成分などの測定方法のひとつとして、目的
とする被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体
または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物質との抗
原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合を検出
することにより、被測定物質を測定する免疫測定法があ
る。このような測定法としては、ラテックス凝集反応法
、赤血球凝集反応法などが知られている。

この凝集の程度を検出する方法としては、凝集の有無を
肉眼で判定する方法と、反応液に光を照射して散乱光あ
るいは透過光を測定する方法がある。

肉眼で判定する方法は試料中の抗原あるいは抗体の有無
の判定法、あるいは半定量法として用いられている。光
学的な測定方法は試料中の抗原あるいは抗体の定量に用
いられている。

これらの凝集反応の測定法において、測定感度の向上あ
るいは抗原抗体反応の促進を目的として、ポリエチレン
グリコール（以下、ＰＥＧと略すときがある）を反応系
に添加することが提案されている。例えば、特開昭５８
−４７２５６号公報では、抗原または抗体を担持した不
溶性微粒子と抗体及び／または抗原とを溶液中で反応さ
せ、反応混合物に光を照射して反応の進行度を光学的に
測定する抗原抗体反応の測定法において、溶液中にポリ
エチレングリコールを共存させでいる。これは測定感度
の向上を目的とするものであり、ポリエチレングリコー
ルとしては、平均分子量が１　、０００以上のものが効
果ありとされ、実施例では１　、５４０〜８．０００の
ものが使用されている。

また、特開昭５９−５４９６８号公報では、赤血球凝集
反応の促進用試薬として、リン酸緩衝液に溶解させたポ
リエチレングリコールが使用されている。この実施例に
おいては、平均分子量４，０００〜２０，０００のポリ
エチレングリコールが使用されている。

また、不溶性担体を使用した凝集反応を測定原理とする
ものではないが、特公昭６３−４５０６６号公報では、
変性ヒト免疫グロブリンを含有する溶液とリウマチ因子
との反応において、凝集促進剤としてポリエチレングリ
コールを使用しており、平均分子量としてり、ＯＯＯ〜
２０，０００のものが有効に使えるとの記載がある。

このように、抗原抗体反応の反応系にポリエチレングリ
コールを使用することが提案されているが、その分子量
は、平均分子量２０，０００以下のものである。

（発明が解決しようとする課題） 従来、使用されてきたＰＥＧは、平均分子量２万以下の
ものであるが、感度向上または反応促進の効果はまだ不
十分であり、更に効果の高いものが求められていた。

本発明は、上記の問題点を解決するものであり、その目
的とするところは、高い検出感度で非特異反応が少ない
免疫測定試薬および測定方法を提供することにある。

更に、梅毒トレポネーマ抗体またはＨＢＳ抗体の測定に
適した免疫測定試薬を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 上記の問題点を解決するために、ポリエチレングリコー
ルについて鋭意研究した。ポリエチレングリコールの感
度向上または反応促進の効果は、反応系中での濃度が高
いほど大きくなる。

しかし、ポリエチレングリコールの濃度を上げて行くと
試料そのものが混濁を生じたり、抗原あるいは抗体を感
作した不溶性担体そのものが凝集を生しる。本発明者は
、従来検討されたことのない平均分子量３万以上のポリ
エチレングリコールについて、反応系中での濃度とその
効果について検討し、平均分子量を大きくすると、平均
分子量２万以下のものを使用したときと比較して極めて
少量で、同等以上の感度向上効果があり、かつ、試料を
混濁させず、非特異的な凝集反応もひき起こさないこと
を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の免疫測定試薬は、被測定物質である
抗原または抗体に対応する抗体または抗原を担持した不
溶性担体および平均分子量３０、０００以上のポリエチ
レングリコールから構成され、そのことにより前記目的
が達成される。

本発明の免疫測定試薬は、被測定物質である抗体に対応
する抗原を担持した不溶性担体および平均分子量３０．
０００以上のポリエチレングリコールから構成され、そ
のことにより前記目的が＝６ 達成される。

本発明の免疫測定試薬は、梅毒トレポネーマ抗原または
ＨＢＳ抗原を担持した不溶性担体および平均分子量３０
，０００以上のポリエチレングリコールから構成され、
そのことにより前記目的が達成される。

本発明の免疫測定法は、被測定物質である抗原または抗
体に対応する抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、
被測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の
凝集の度合を検出することにより、被測定物質を測定す
る方法であって、該抗原抗体反応の反応系に平均分子量
３０．０００以上のポリエチレングリコールを存在させ
、そのことにより前記目的が達成される。

本発明に用いられるＰＥＧとしては、平均分子量３万〜
５００万、好ましくは５万〜２００万のものが好適であ
る。平均分子量の測定方法は、ゲルクロマトグラフ（Ｇ
ＰＣ）法、末端基定量法、粘度法などより適宜選ばれる
。例えば、ＧＰＣ法による分子量の測定の１例を次に示
す。

サンプルをＴＨＦに溶かし、メンブランフィルタ−でろ
過し、得られたろ液をカラムに注入する。カラムはＨ３
（、−３０（積木ファインケミカル■製）　７．９　ｔ
ｎＩｌｌφＸ　５００ｍｍφを３本面列につなぐ。キャ
リアはＴＨＦを用い、流量１　、　ＯｒｎＲ／ｍｉｎの
条件で検出器は示差屈折計を用いる。

分子量は、市販のＰＥＧ分子量標準物を用い、サンプル
の保持時間を標準物の保持時間と比較することによって
サンプル中のＰＥＧの分子量を決定する。

本発明で用いられる不溶性担体としては、有機高分子粉
末、無機物質粉末、微生物、血球および細胞膜片などが
挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶性アガロー
ス、セルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、
好ましくはラテックス懸濁液がよい。ラテックスとして
は、例えばポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン
酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体
、アクリロニトリルブタジェンスチレン共重合体、塩化
ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニル
アクリレート等がある。用いるラテックスの平均粒径は
、測定対象物質の検出濃度或は測定機器によって、０．
０５〜１．０μｍのものが適宜選択される。無機物質粉
末としてはシリカ、アルミナ、或は金、チタン、鉄、ニ
ッケル等の金属片などが例示される。

本発明により測定されるべき物質は特に限定されず、一
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。

被測定物質としては、タンパク、脂質などがあり、それ
には例えば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素などが
挙げられる。具体的には、ＣＲＰ、ヒトフィブリノーゲ
ン、リウマチ因子、アルファーフェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）、抗ストレプトリジン０抗体、梅毒トレポネーマ抗
体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢＳ抗体、ＨＢＣ抗
体、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶＩ、ｎ、■に対する抗体など
が例示される。

本発明により被測定物質を測定する場合の測定系は、例
えばラテックス凝集反応や血球凝集法などの凝集法が利
用される。試薬の調製は、まず公知の方法により、不溶
性担体に抗原または抗体を物理的に吸着あるいは化学的
に結合により担持（感作）させる。用いる抗体は免疫グ
ロブリンあるいはその断片、例えばＦ（ａｂ’）ｚでも
良い。

次に、測定系について述べる。例えば、ラテックス試薬
を用いた抗原抗体反応により被測定物質を測定する場合
には、被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体
または抗原を担持したラテックス試薬にあらかじめＰＥ
Ｇを添加しておく。あるいは、ＰＥＧを含まないラテッ
クス試薬を使用することも可能で、この場合には抗原抗
体反応時にＰＥＧが該反応系に存在するようにすればよ
い。例えば、検体にあらかじめＰＥＧを添加しておく方
法；使用する緩衝液にＰＥＧを加えておく方法などがあ
り、特に限定されない。言いかえれば、本発明の測定試
薬は、例えば、抗体または抗原を担持した不溶性担体、
およびＰＥＧを含む、１液系の試薬；抗体または抗原を
担持した不溶性担体を含む第１試薬と、ＰＥＧを含む緩
衝液でなる、第２試薬とで構成される２液系の試薬；な
ど種々の形態であり得る。

このような試薬を用いて凝集反応を行ない、生じた凝集
の程度を光学的に観察もしくは目視観察することにより
被測定物質が測定され得る。

具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出す
る方法においては、測定は散乱光強度、吸光度または透
過光強度を測定する光学機器で行う。測定の波長は３０
０〜２４００ｎｍが使用できる。

測定方法については公知の方法に従い、用いる不溶性担
体の粒子の大きさあるいは濃度の選択、反応時間の設定
により、散乱光強度、吸光度または透過光強度の増加も
しくは減少を測定することにより行われる。また、これ
らの方法を併用することも可能である 不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する試薬において
は、通常、試料と感作不溶性担体を含む溶液を判定板上
で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝集の有無を判
定する。凝集判定には、単に肉眼判定以外に、ビデオカ
メラで撮影し、画像処理を施すことによって判定するこ
とも可能である。

この免疫測定法において、抗原抗体反応の反応系に存在
させるＰＥＧの濃度は、ＰＥＧの分子量、共存する塩、
タンパク、糖類などの添加物の濃度によって適宜選ばれ
る。一般には、該反応系に０．０１〜３％（Ｗ／誓）、
好ましくは、０．０５〜１．５％（Ｗ／Ｗ）の割合で含
有されるように調製される。ＰＥＧ濃度が０．０１％（
Ｗ／Ｗ）を下まわると、ＰＥＣ，と抗原および抗体との
相互作用が小さくなる結果、増感効果が得られない。逆
に３％（Ｗ／Ｗ）を上まわると不溶性担体が非特異的に
凝集し易くなる。

上記抗原抗体反応の条件は通常の場合と同様であり、反
応媒体としては、被測定物質の種類に応じた各種緩衝液
が用いられる。この緩衝液は、被測定物質を失活させる
ことがなく、かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオ
ン強度やｐＨを有するものであればよい。例えば、リン
酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液が使用される
。反応のｐＨは、５〜１０特に６〜８が好ましい。反応
温度は０〜５０°Ｃ特に２０〜４０°Ｃが好ましい。反
応時間は適宜法められる。反応時には、さらに測定系の
特異性を高めるために、塩化コリンなどの第４級アンモ
ニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイ
オン（ＣＩ！、−，１、５ＣＮ−など）、ゼラチンなど
を添加することも可能である。

本発明によれば、平均分子量３万以上のＰＥＧの働きに
より、高感度かつ非特異反応が少ない測定ができる。

なお、本発明の原理は、分子量の大きなＰＥＧの抗原抗
体反応の促進効果によっており、抗原または抗体を不溶
性担体に担持しない免疫比濁法の試薬、測定方法におい
ても、その測定感度の向上、抗原抗体反応の促進効果が
ある。

以下に、本発明の実施例を述べ、その効果を具体的に説
明する。

（実施例） 本発明を以下の実施例にて説明する。

本実施例および比較例においてＰＥＧは、すべて和光純
薬工業■のものが使用された。

実施例１ ヒ１−ＣＲＰの測定試薬及び測定法−凝集像の肉眼観察
による検出方法 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製抗ヒトＣＲ
Ｐ抗体を１■／　ｍｌのＩｇＧ濃度でＯ，１Ｍグリシン
緩衝液（ｐＨ８，８）に溶解した液１０　ｒｄに、平均
粒径が０．２６μｍのポリスチレンラテックス（固形分
１０％、積木化学社製）１　ｍｌを添加し、３７°Ｃに
て６０分間撹拌した。次いで、この液を４°Ｃにて６０
分間、１８．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離した。得られた
沈澱物にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略）を０
．５重量％含有する０、１Ｍグリシン緩衝液（ｐｌ＋　
８．８）１０戚を添加し、ラテックスを懸濁させ、抗Ｃ
ＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。

（２）　Ｐ　Ｅ　Ｇ溶液の調製 平均分子量５００，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを１重量
％含有するリン酸−食塩緩衝液（０，０５門リン酸緩衝
液（ｐｔ＋　７．０）　、０．１０Ｍ　ＮａＣＩ）に、
０．０゜１０．０．２５．０．５０．１．００重量％の
濃度になるように溶解した。

（３）ヒＩ−ＣＲＰ測定試薬 本実施例のし）ＣＲＰ測定試薬は、上記（１）項の抗Ｃ
ＲＰ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記（２
）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬とから構成
される２液系の試薬である。

（４）標準ＣＲＰ液の調製 ＣＲＰを０．０．０．１０．０．５０．１．００．２゜
０μｇ／ｄ濃度で含むヒト血清を上記（２）項のＰＥＧ
溶液で１＝１に希釈して、ＣＲＰ濃度０．０〜１．０μ
ｇ／ｍｆｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。

（５）抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液５０μｌを判定板上に採り、これに上記（
１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液５０μ！を滴下
し混和する。判定板を手に持ち、ゆるやかに揺動し２分
後に凝集の度合を肉眼で観察した。結果を第１表に示し
た。

第１表 ＋１凝集を示したもの ：凝集を示さなかったもの 比較例１ 実施例１における１）ＥＧ温溶液調製の項を、次のよう
に行ったことを除いては、実施例１と同様にして、ヒト
ＣＲＰ測定試薬を作成した。

ＰＥＧ溶液の調製：平均分子量７，５００のＰＥＧを、
実施例１の（２）項で使用したものと同じ緩衝液に、０
、■、２．３．４重量％の濃度になるように熔解した。

標準ＣＲＰ液は次のように調製した。

標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０．０．０．１０．０．
５０．１．００．２．Ｏｕｇ１ｍｌｅＡ度で含むヒト血
清を上記のＰＥＧ溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度
０．０〜１．Ｏｕｇ　／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製
した。

上記の標準ＣＲＰ液を使用し、実施例１と同様に抗原抗
体反応を行った。結果を第２表に示した。

第２表 ＋：凝集を示したちの ：凝集を示さなかったもの 第１表および第２表において、標準ＣＲＰ液濃度が０．
０（ゼロ）μｇ／ｍｆｌで凝集を示したものは、ＰＥＧ
によってラテックスそのものが凝集したことによる。

第１表および第２表より、平均分子量５００，０００の
ＰＥＣ，を使用した場合の検出感度はＣＲＰ液濃度０．
２５μｇ／ｌｄであるが、平均分子量７　、５００のＰ
ＥＧの場合のそれは、０．５　μｇ／ｍｌであることが
わかる。従って、ｓｏｏ、ｏｏｏのＰＥＧを使用した方
が高い検出感度である。

実施例２ ヒ）ＣＲＰの測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製実施例１の
（１）項で使用した平均粒径が０．２６μｍのポリスチ
レンラテックスの代わりに、０．１３μｍのポリスチレ
ンラテックス（固形分１０％、積木化学社製）を用いた
ことを除いては、実施例１の（１）項と同様にして、抗
ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。

（２）　Ｐ　Ｅ　Ｇ溶液の調製 平均分子量５０．０００のＰＥＧを、ＢＳＡを０゜５重
量％含有する０、１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８，８）に
、０．０．０．５．１．０．２．０．３．０重量％の濃
度になるように熔解した。

（３）ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒ）ＣＲＰ測定試薬は、上記（１）項の抗Ｃ
ＲＰ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記（２
）項のＰＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬とから構成
される２液系の試薬である。

（４）標準ＣＲＰ液 ＣＲＰを０．０．１．０．２．０．２５．０．５μｇ／
ｄ含むヒト血清を使用した。

（５）抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液３μｌを、上記（２）項のＰＥＧ溶液５０
０μ！で希釈する。これに上記（１）項の抗ＣＲＰ抗体
感作ラテックス液５０μｌを添加し、撹拌混合する。該
ラテックス液の添加から５分後に５７０ｎｍの吸光度を
分光光度計で読み取る。

なお、抗原抗体反応は３７°Ｃで行なった。

その結果をｃｅｌｌ長１　ｃｍとして換算し第３表に示
した。

第３表 比較例２ 実施例２で使用した平均分子量５０，０００のＰＥＧの
代わりに、平均分子量が２０，０００のＰＥＧを用いた
ことを除いては、実施例２と同様にして抗原抗体反応を
行った。その結果を第４表に示した。

第４表 第３表および第４表において、＊印は血清そのものが混
濁を生じたあるいはラテックスそのものがＰＥＧにより
凝集を生じたことを表わす。

従って＊印以下の濃度のＰＥＧを使用しなければならな
い。

第３表および第４表において、ＰＥＧ濃度１％で平均分
子量５０，０００のＰＥＧと２０，０００のものを比較
すると、各標準ＣＲＰ液濃度での反応性（波長５７０ｎ
ｍの吸光度）は平均分子量５０，０００のものの方が高
い。すなわち、ＰＥＧの分子量は５０．０００のものを
用いる方が高い検出感度が得られることがわかる。

実施例３ ヒトフィブリノーゲン（Ｆｇ）の測定試薬及び測定法−
光学的な検出方法 （１）抗ヒトフィブリノーゲン（抗Ｆｇ）抗体感作ラテ
ックス液の調製 抗Ｆｇ山羊産生抗体を２　ｍｇ　／　ｍｌのＩｇＧ濃度
で、０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した液
１０威に、平均粒径が０．１０μｍのポリスチレンラテ
ックス（固形分１０％、積木化学社製）１ｄを添加し、
室温にて１２０分間撹拌した。

次いで、この液を４°Ｃにて６０分間、１Ｂ、ＯＯＯｒ
ｐｍで遠心分離した。得られた沈澱物にＢＳＡを０．２
重量％含有する０、３　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
１０ｍを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗Ｆｇ抗体惑
作ラテックス液を調製した。

（２）　Ｐ　Ｅ　Ｇ溶液の調製 平均分子量５００，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを０．２
重量％で含有する０、３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に、０．０．０．１．０．２．０．３．０．４重量％の
濃度になるように溶解した。

（３）Ｆｇ測定試薬 本実施例のＦｇ測定試薬は、上記（１）項の抗Ｆｇ抗体
感作ラテックスからなる第１試薬と、上記（２）項のＰ
ＥＧを含む緩衝液からなる第２試薬とから構成される２
液系の試薬である。

（４）標準Ｆｇ液 Ｆｇを０．１．０．２．０．４．０　、８．Ｏｐｇ　／
成金むヒト血清を使用した。

（５）抗原抗体反応 標準Ｆｇ液１０μ！を、上記（２）項のＰＥＧ溶液４０
０μ！で希釈する。これに上記（１）項の抗Ｆｇ抗体感
作ラテックス液６０μｌを添加し、撹拌混合する。該ラ
テックス液の添加から６０秒後と１６０秒後の波長５７
０ｎｍの吸光度の差を分光光度計で読み取る。抗原抗体
反応は３７°Ｃで行なった。その結果を第５表に示した
。

（以下余白　） 第５表 比較例３ 実施例３で使用したＰＥＧ溶液の代わりに、平均分子量
３，０００のＰＥＧを実施例５と同じ緩衝液に０．０．
０．５．１．０．２．０．３．０重量％の濃度になるよ
うに溶解したＰＥＧ溶液を用いたことを除いては、実施
例３と同様にして抗原抗体反応を行った。その結果を第
６表に示した。

（以下余白　） 第５表および第６表において、＊印は血清そのものが混
濁を生じたあるいはラテックスそのものがＰＥＧにより
凝集を生じたことを表わす。

従って＊印以下の濃度のＰＥＧを使用しなければならな
い。

第５表および第６表において、平均分子量５０ｏ、　ｏ
ｏｏのＰＥＧｉ）１度０．３％使用のものと、分子量３
，０００のＰＥＧ濃度２．０％使用のものの吸光度を比
較すると、各フィブリノーゲン濃度での反応性（波長５
７０ｎｍの吸光度）は平均分子量５０ｏ、ｏｏｏのもの
の方が高い。すなわち、ＰＥＧの分子量は５０鈷ＯＯＯ
のものを用いる方が高い検出感度を得られることがわか
る。

実施例４ 梅毒抗体の測定試薬及び測定法−凝集像の肉眼観察によ
る検出方法 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体の測定を行なった。

本実施例においては、次に挙げる試薬および測定用検体
を使用した。後述の実施例５〜７および比較例４〜７に
おいても、特に指示されない限り、同名の試薬および検
体については、同様のものを使用した。

ＰＢＳ　（リン酸緩衝液）ニリン酸−ナトリウム（２水
和物）、リン酸二ナトリウム（２水和物）および塩化ナ
トリウムを、リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそ
れぞれ０．０２Ｍおよび０．１５Ｍ、ｐＨが７．４とな
るように精製水に加えて、調製を行なった。

１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ　：　ＰＢＳにＢＳ八を１％（Ｗ
／Ｗ）　　となるように溶解させて調製した。

１％トリトンｘ−−ｉｏｏニリン酸緩衝液にトリトンＸ
−（００を１％（Ｗ／Ｗ）　　となるように溶解させた
。

梅毒抗原液：家兎翠丸中で１０〜１４日間培養したトレ
ボネーマ　パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉ
ｄｕｍ；　ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａ
ｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ　
５ｅｒｖｉｃｅ、　Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ
ｆ　ＨｅａｌｔｈＥｄｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｌ
ｆａｒｅ＋　Ａｔ１ａｎｔａ、　Ｇｅｏｒｇｉａ）より
入手したものを家兎翠丸に接種し、継代培養したものを
用いた〕を生理食塩水中に１０９個菌体／Ｉｄとなるよ
うに懸濁した菌体懸濁液１　ｍｌｌを採り、リン酸緩衝
液中で遠心分離（６，００Ｏｒｐｍ×５分、３回）する
ことにより洗浄した。次いで、得られた沈澱に１％トリ
トンＸ−１００を１　ｍｌ添加し、３７°Ｃにて３０分
間インキュベートした。

その後、これを超遠心分離機にかけて（５０，０００ｒ
ｐｍＸ１時間）上清を採取し、１％トリトンＸ１００で
１　、０００倍希釈して使用した。

梅毒陽性家兎血清：１−レポネーマ　パリダムを翠丸に
接種後４５日間飼育した家兎から血清を採取した。この
血清を１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１００倍、２００倍およ
び４００倍に希釈して使用した。

正常家兎血清：トレポネーマ　パリダムを接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。

市販のＴ　Ｐ　１１６キツト（セロディアＴＰ、冨士し
ビオ製）を用いてタイターを測定したところ、結果は陰
性を示した。この血清を１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１００
倍から４００倍に希釈して用いた。

ラテックス：積木化学工業■製の粒径０．２３μｍのポ
リスチレンラテックス（固形分１０％）を用いた。

０．２０．０．５．１．００および２６００％Ｐ　Ｅ　
Ｇ５００゜０００：平均分子量５００，０００のＰＥＧ
を１％ＢＳ八・ＰＢＳに、それぞれ０．２０．０．５０
．１．００および２゜００％（訂−）となるように溶解
させたもの。

（Ａ）　ラテックスへの梅毒抗原の感作ニラテックス１
００μｌと、梅毒抗原液４００μｌとを速やかに混合し
、室温で撹拌した。１時間後に１％ＢＳＡ　−ＰＢＳを
５　ｍｌｌ加え、１５０００　ｒｐｍで１時間遠心した
。これを２回繰り返してラテックスを洗浄した。洗浄後
のペレットを２　ｍｌの０．２０．０．５０、１．００
および２．００％Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００に懸濁さ
せ、よく分散して固形分０．５％のラテックス試薬を得
た。これを４°Ｃにて保存した。

（Ｂ）梅毒抗体の測定：梅毒陽性家兎血清と（八）項で
得られたラテックス試薬とを５０μｌずつ判定板上に採
り（このため反応時のＰＥＧ最終濃度は０．１〜１．０
％となる）、混合・撹拌したのち３分間反応させた。対
照として、正常家兎血清についても同様に反応を行なっ
た。ラテ・ンクス試薬の凝集を目視観察した。凝集した
検体を陽性、凝集の認められなかった検体を陰性とした
。その結果を第７表に示す。第７表において＋および＋
＋は陽性（＋＋は凝集の度合が大きい）、士は偽陽性、
そして−は陰性を示す。

比較例４ ０．２０〜２．００％Ｐ　Ｅ　０５００，０００の代わ
りに、下記の２．０．４．０．６．０．８．０％Ｐ　Ｅ
　Ｇ７，５００または１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて実施
例４と同様に反応を行なった。その結果を第７表に示す
。

２．０．４．０．６．０および８．０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　７
，５００二平均分子量７，５００のＰＥＧを１％ＢＳＡ
　−ＰＢＳに、それぞれ２．０．４．０．６．０および
８．０％（Ｗ／譬）となるように溶解させたもの。

第７表より、ＰＥＧの分子量は５００，０００を使用す
る方が７，５００よりも高い検出感度が得られることが
わかった。

（以下余白　） 第７表 実施例５ 梅毒抗体の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 実施例４と同様の検体および試薬を用い、日立７０５０
型全自動分析装置により測定を行なった。

但し、梅毒抗原感作ラテツクス試薬にはＰＥＧ５００．
０００は加えず、１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで希釈して固形
分０．２５％に調製した。

また、Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００は１％ＢＳ八・ＰＢ
Ｓに０゜１．０．２５．０．５０および１．００％（Ｗ
／Ｗ）に溶解させて使用した。すなわち、この試薬は感
作ラテツクス液からなる第１試薬とＰＥＧ溶液からなる
第２試薬とから構成されるものである。

測　　法と測　。果 検体として梅毒陽性家兎血清または正常家兎血清３μ！
を採り、これに上記のＰ　Ｅ　Ｇ　５００，０００の０
．１〜１．００％溶液３５０μ！を加えた。これに上記
の梅毒抗原感作ラテツクス液５０μ！を添加後、この溶
液を撹拌・混合した。そして、該ラテックス液の添加か
ら８０秒後と３２０秒後の波長５７０ｎｍにおける吸光
度の差（Δ０Ｄ５７０）を分光光度計で読み取った。な
お、抗原抗体反応は３７°Ｃで行なった。Δ０Ｄ５７゜
を１０，０００倍して結果を第８表に示した。

また、使用したＰＥＧの濃度とΔ０Ｄ５７０との関係を
第１図に示した。

比較例５ ０．１〜１．０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００の代わり
に、ＰＥＧ７，５００を１％ＢＳＡ　−ＰＢＳにそれぞ
れ１．０．２．０．３．０．４．０％（Ｗ／Ｗ）　とな
るように溶解させたもの、または１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ
を用いて、実施例５と同様に反応を行なった。その結果
を第８表に示した。

また、使用したＰＥＧの濃度とΔＯＤ５．。との関係を
第２図に示した。

第８表、第１図および第２図よりＰ　Ｅ　Ｇ５００゜０
００の方がＰＥＧ７，５００より高感度かつ非特異反応
の少ない定量ができることがわかった。なお、第１図を
みると、ＰＥＧ濃度０．５％で正常血清でのΔ０Ｄ５７
０値が低く、梅毒陽性血清でのΔＯＤｓｗｏ値が高い値
を示しているので至適ＰＥＧ濃度は０．５％である。

第８表 実施例６ ＨＢＳ抗体の測定試薬及び測定法 凝集像の 肉眼観察による検出方法 本実施例において、実施例４と同一名の試薬は実施例４
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。

ＨＢ、抗原液：ヒト血漿よりアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製した精製ＨＢ。

抗原を使用した。抗原はリン酸緩衝液に溶解し、濃度を
ローリ−法により測定した。使用直前に、リン酸緩衝液
により希釈し、濃度を１〜ＩＯμｇ／ｄとなるように調
製し、これをＨＢ　ｓ抗原液とした。

抗ＨＢ、抗血清（陽性家兎血清）：精製ＨＢ　ｓ抗原を
、フロイントの完全アジュバントとともに家兎に免疫し
て得られた抗血清を、正常ヒト血清を結合させたカラム
で吸収操作をしてから用いた。正常ヒト血清を結合させ
たカラムはＣＮＢｒ活性化セファロース（：Ｌ４Ｂ　（
ファルマシア社）を用い、メーカー（ファルマシア）の
使用説明書に従って行った。吸収操作を行った抗ＨＢ。

抗血清は、１％ＢＳΔ・ＰＢＳにより８０から８００倍
に希釈して用いた。

正常家兎血清：ＨＢｓ抗原が接種されていない家兎から
採取した血清を用いた。市販ＰＨＡキットあるいはＥＴ
Ａキットにより抗体の有無を測定したところ、陰性であ
った。この血清を１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで８０倍から８
００倍に希釈して用いた。

０．２〜０．６％Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００　：平均
分子量５００．０００のＰＥＧを１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ
で０．２．０．３．０．３５．０．４および０．６％側
／誓）に溶解したもの。

１．０〜２．０％Ｐ　Ｅ　Ｇ５０，０００　：平均分子
量５００００のＰＥＧを１％ＢＳ八・ＰＢＳで１．０．
１．５おび２．０％（Ｗ／Ｗ）に？容解したもの。

（Ａ）　ラテックスへのＨＢ　ｓ抗原の感作ニラテック
ス１００．！／ｆｆｉと、ＨＢｓ抗原液４００１１Ａと
を速やかに混合し、室温で撹拌した。１時間後に１％Ｂ
ＳＡ　−ＰＢＳを５滅加え、１５０００ｒｐｍで１時間
遠心した。これを２回繰り返してラテックスを洗浄した
。洗浄後のペレットを２１ｎ１の０．２〜０゜６％Ｐ　
Ｅ　Ｇ　５００，０００または１．０〜２．０％ＰＥＧ
５０、０００に懸濁させ、よく分散して固形分０．５％
のラテックス試薬を得た。これを４°Ｃにて保存した。

（Ｂ）ＨＢ、抗体の測定 ＨＢ、陽性家兎血清と本実施例（Ａ）項で得られたラテ
ックス試薬とを５０μｌずつ判定板上に採り、混合・撹
拌したのち３分間反応させた。

対照として、正常家兎血清についても同様に反応を行な
った。ラテックス試薬の凝集を実施例４と同様に行なっ
た。その結果を第９表に示す。

比較例６ 実施例６で使用したＰ　Ｅ　Ｃ５００，０００またはＰ
Ｅ　Ｇ５０，０００の代わりに、下記の１．０〜４．０
％ＰＥＧ　７，５００．１０〜２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　１，
０００または１％ＢＳＡ　　−ＰＢＳを用いて、実施例
６と同様に反応を行なった。その結果を第９表に示す。

１．０〜４．０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　７，５００　：平均分子
量７，５００のＰＥＧを、１％ＢＳΔ・ＰＢＳに、１．
０．２．０．３．０および４．０％（Ｗ／Ｗ）に溶解し
たもの。

１０〜２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　１，０００　：平均分子量ｉ
　、　ｏｏｏのＰＥＧを、１％ＢＳ八・ＰＢＳに、１０
．１５および２０％（讐／Ｗ）に溶解したもの。

第９表よりＰＥＧの分子量は３０，０００以上を用いる
方が高い検出感度が得られることがわかった。また、Ｐ
ＥＧの分子量は５０，０００より５００，０００を用い
る方が、より高い感度が得られることがわかった。

（以下余白　） 第９表 実施例７ ＨＢ　Ｓ抗体の測定試薬及び測定法−光学的な検出方法 実施例６の検体および試薬を用い、日立７０５０型全自
動分析装置により測定を行なった。但し、ＨＢＳ抗原感
作ラテックス試薬にはＰＥＧ５０００００またばＰ　Ｅ
　Ｇ　５０，０００は力■えず、１％ＢＳ八・ＰＢＳで
希釈して固形分０．２５％に調製した。

また、Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００は１％ＢＳ八・ＰＢ
Ｓに０．２．０．３．０．３５．０．４および０．６％
（Ｗ／Ｗ）に、ＰＥＧ５０，０００は１％ＢＳＡ　−Ｐ
ＢＳに１．０．１．５および２．０％（Ｗ／Ｗ）に溶解
させて使用した。すなわち、この試薬は感作ラテツクス
液からなる第１試薬とＰＥＧ溶液からなる第２試薬とか
ら構成されるものである。

損１　　法と濱１″″ 検体としてＨＢＳ陽性家兎血清または正常家兎血清２０
μ！を採り、これに上記の各濃度のＰＥＧ　５００，０
００またはＰ　Ｅ　Ｇ５０，０００の溶液３５０μ！を
加えた。これに上記のＨＢＳ抗原感作ラテックス液５０
μ！を添加後、この溶液を撹拌・混合した。そして、該
ラテックス液の添加から８０秒後と３２０秒後の波長５
７０ｎｍにおける吸光度の差（ΔＯＤ５．。）を分光光
度計で読み取った。なお、抗原抗体反応は３７°Ｃで行
なった。八〇Ｄ５７０を１．０．０００倍して結果を第
１０表に示した。

また、使用したＰＥＧの濃度とΔ０ＤＳ７０との関係を
Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００について第３図、ＰＥＧ　
５０．０００について第４図に示した。

第１０表 比較例７ Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００またはＰ　Ｅ　０５０，０
００の代わりに、Ｐ　Ｅ　Ｇ　７，５００を１％ＢＳＡ
　−ＰＢＳにそれぞれ１．０．２．０．３．０および４
．０％（リハ）となるように溶解させたもの、ＰＥＧＩ
、０００を１％ＢＳ八・ＰＢＳにそれぞれ１０．１５お
よび２０％（誓／Ｗ）　となるように溶解させたものま
たは１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いて、実施例７と同様に反
応を行なった。

その結果を第１０表に示した。

また、使用したＰＥＧの濃度とΔ０Ｄ５７Ｇとの関係を
ＰＥＧ７，５００について第５図、ＰＥＧ１　、０００
について第６図に示した。

第１Ｏ表および第３〜６図より、ＰＥＧの分子量は３０
，０００以上を用いる方が高い検出感度が得られかつ非
特異反応の少ない定量ができることがわかった。

また、ＰＥＧの分子量は５０，０００より５００，００
０を用いる方がさらに高い検出感度が得られることがわ
かった。

Ｐ　Ｅ　Ｇ　５００，０００を用いた場合、０．３〜０
．３５％で高い検出感度が得られかつ非特異反応が少な
く、至適であることがわかった。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、不溶性担体を使用し免疫
凝集反応に基づく被測定物質の測定において、高い検出
感度で非特異反応が少ない免疫測定試薬および免疫測定
法が提供される。

従って、本発明の試薬及び測定法は、各種の生理活性物
質、特に、アルファーフェトプロティン抗原、梅毒トレ
ポネーマ抗体およびＨＢＳ抗体などの測定に適している
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により血清中の梅毒トレポネーマ抗体を
測定したときの、ＰＥＧ濃度と測定の結果得られる吸光
度との関係を示すグラフである。第２図は、この場合の
比較例を示すグラフである。第３図および第４図は、本
発明により血清中のＨＢＳ抗体を測定したときの、ＰＥ
Ｇ濃度と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラ
フである。第５図、第６図は、この場合の比較例を示す
グラフである。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体ま
   たは抗原を担持した不溶性担体および平均分子量３０，
   ０００以上のポリエチレングリコールから構成される免
   疫測定試薬。 ２）被測定物質である抗体に対応する抗原を担持した不
   溶性担体および平均分子量３０，０００以上のポリエチ
   レングリコールから構成される免疫測定試薬。 ３）被測定物質である抗体に対応する抗原が、梅毒トレ
   ポネーマ抗原またはＨＢＳ抗原である請求項２記載の免
   疫測定試薬。 ４）被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体ま
   たは抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物質との抗原
   抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合を検出す
   ることにより、被測定物質を測定する免疫測定法であっ
   て、該抗原抗体反応の反応系に平均分子量３０，０００
   以上のポリエチレングリコールを存在させる、免疫測定
   法。