JPH0225748A - 培養細胞数の計測方法及びそれに用いる超音波発振器 - Google Patents
培養細胞数の計測方法及びそれに用いる超音波発振器Info
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- JPH0225748A JPH0225748A JP63175345A JP17534588A JPH0225748A JP H0225748 A JPH0225748 A JP H0225748A JP 63175345 A JP63175345 A JP 63175345A JP 17534588 A JP17534588 A JP 17534588A JP H0225748 A JPH0225748 A JP H0225748A
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- cells
- dye
- ultrasonic oscillator
- cell
- chips
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- Apparatuses For Generation Of Mechanical Vibrations (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産１上亘剋王立互
本発明は、培養により増殖した細胞数を簡便かつ迅速に
計測するための方法及びそれに用いる超音波発振器に関
する。
計測するための方法及びそれに用いる超音波発振器に関
する。
皿米茨徽
従来、培養により得られた増殖細胞数を計測する方法と
して、■細胞数を直接血球計算盤やコルターカウンター
で計測する方法及び■増殖による細胞のＤＮＡ合成の変
化を（’Ｈ）−チミジンの取り込みで測定する方法が知
られている。
して、■細胞数を直接血球計算盤やコルターカウンター
で計測する方法及び■増殖による細胞のＤＮＡ合成の変
化を（’Ｈ）−チミジンの取り込みで測定する方法が知
られている。
そして、上記■の方法としては、１）細胞数を直接数え
る方法、２）細胞分裂に際し、コルヒチンにより紡錘糸
の形成が阻害されて染色体像を出現した細胞数を数える
方法及び３）（３Ｈ）−チミジンなどを用いてＤＮＡ合
成の充進している細胞をオートラジオグラフィーによっ
て同定して数える方法等がある。
る方法、２）細胞分裂に際し、コルヒチンにより紡錘糸
の形成が阻害されて染色体像を出現した細胞数を数える
方法及び３）（３Ｈ）−チミジンなどを用いてＤＮＡ合
成の充進している細胞をオートラジオグラフィーによっ
て同定して数える方法等がある。
一方、上記■の方法としては、４）試験管で培養して〔
３Ｈ〕−チミジンを取り込ませ、トリクロロ酢酸不溶物
をガラスフィルターに集める方法、５）マイクロタイタ
ープレートで培養して〔３Ｈ〕−チミジンを取り込む細
胞を細胞ハーベスタ−を用いてガラスフィルターに集め
る方法などがある。
３Ｈ〕−チミジンを取り込ませ、トリクロロ酢酸不溶物
をガラスフィルターに集める方法、５）マイクロタイタ
ープレートで培養して〔３Ｈ〕−チミジンを取り込む細
胞を細胞ハーベスタ−を用いてガラスフィルターに集め
る方法などがある。
これらのうち、上記１）あるいは５）の方法が、現在の
ところ最も普及した方法として実施されているが、ｌ）
の方法は、細胞を比較的大きな規模（２〜１ｏ１１！！
）で培養しなければならない欠点があり、また、５）
の方法は管理されたラジオアイソトープ実験施設内で行
わなければならず、したがって、放射線生物学に関する
知識と技術の習熟が必要であるという問題がある。
ところ最も普及した方法として実施されているが、ｌ）
の方法は、細胞を比較的大きな規模（２〜１ｏ１１！！
）で培養しなければならない欠点があり、また、５）
の方法は管理されたラジオアイソトープ実験施設内で行
わなければならず、したがって、放射線生物学に関する
知識と技術の習熟が必要であるという問題がある。
また、１９８３年にＭｏｓｓｍａｎｎは、細胞増殖測定
法として、動物細胞による色素分解生成物を指標とした
ＭＴＴアッセイを開発した（ジャーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソッド、６５．５５〜６３．１９８３）。
法として、動物細胞による色素分解生成物を指標とした
ＭＴＴアッセイを開発した（ジャーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソッド、６５．５５〜６３．１９８３）。
ＭＴＴ （３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イ
ル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕
は、生細胞のミトコンドリア中の酵素により開裂され、
青紫色のＭＴＴホルマザンを生成する。
ル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕
は、生細胞のミトコンドリア中の酵素により開裂され、
青紫色のＭＴＴホルマザンを生成する。
ＭＴＴホルマザンの生成量は、生細胞数と相関関係にあ
り、イソプロパツールで溶解して吸光度を測定すること
により、ＭＴＴを加えた時点での細胞の増殖を測定する
ことができる。したがって、この方法によると放射性物
質を用いることなく、微量（５０〜２００μｌ）の培養
系で簡便で再現性の良い細胞増殖の測定が可能である。
り、イソプロパツールで溶解して吸光度を測定すること
により、ＭＴＴを加えた時点での細胞の増殖を測定する
ことができる。したがって、この方法によると放射性物
質を用いることなく、微量（５０〜２００μｌ）の培養
系で簡便で再現性の良い細胞増殖の測定が可能である。
しかし、ＭＴＴアフセイでＭＴＴホルマザンを溶解後、
長時間放置しておくと血清タンパク質の沈澱を生じてし
まうために１時間以内に比色定量を行わなければならな
いという問題がある。
長時間放置しておくと血清タンパク質の沈澱を生じてし
まうために１時間以内に比色定量を行わなければならな
いという問題がある。
さらに、Ｄｅｎｉｚｏｔらは無血清培地を用いたＭＴＴ
アフセイの改良法（ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メソッド、聾、２７１〜２７７、１９８６）を報告し
ているが、この改良法では、いったん血清含有培地で培
養後、ＭＴＴ添加時に培地を無血清培地に置換するため
に操作上煩雑であるという問題がある。
アフセイの改良法（ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メソッド、聾、２７１〜２７７、１９８６）を報告し
ているが、この改良法では、いったん血清含有培地で培
養後、ＭＴＴ添加時に培地を無血清培地に置換するため
に操作上煩雑であるという問題がある。
また、イソプロパツール添加後ＭＴＴホルマザンを溶解
するために、数回のビペ、ティングをくり返すことが必
要である。しかし、ピベ、ティング操作は、長時間を要
するために多数の検体を処理する場合には血清タンパク
質の沈澱を生じてしまうという問題がある。
するために、数回のビペ、ティングをくり返すことが必
要である。しかし、ピベ、ティング操作は、長時間を要
するために多数の検体を処理する場合には血清タンパク
質の沈澱を生じてしまうという問題がある。
また、ＭＴＴアッセイ以外に、培養細胞に付着する色素
として、クーマシーブリリアントブルー（アナリティカ
ル・バイオケミストリー、１４０，４１７〜４２３．１
９８４）あるいは、クリスタルバイオレット（ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー、月３７． （６） 。
として、クーマシーブリリアントブルー（アナリティカ
ル・バイオケミストリー、１４０，４１７〜４２３．１
９８４）あるいは、クリスタルバイオレット（ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー、月３７． （６） 。
１８７８〜１８８４．１９８６）を用いた細胞増殖測定
法も報告されている。しかし、これらの色素を用いた細
胞増殖測定法でも、限られた時間内に色素を溶媒に可溶
化させなければならず、さらにその可溶化が不十分であ
ると測定値に誤差を生じてしまう欠点がある。
法も報告されている。しかし、これらの色素を用いた細
胞増殖測定法でも、限られた時間内に色素を溶媒に可溶
化させなければならず、さらにその可溶化が不十分であ
ると測定値に誤差を生じてしまう欠点がある。
さらに、近年、マイクロウェルプレートを直接使用する
各種測定方法や装置が開発、市販されており、これらの
装置に簡便に組み込むことのできる細胞数計測方法の開
発が望まれていた。
各種測定方法や装置が開発、市販されており、これらの
装置に簡便に組み込むことのできる細胞数計測方法の開
発が望まれていた。
、８が”しようとする課
本発明は、畝上の従来技術にみられる問題点を解消する
目的でなされたものであって、培養による増殖細胞の数
、すなわち、細胞増殖活性を簡便かつ迅速に測定するた
めの方法及びそれに使用する超音波発振器を提供するこ
とを課題とする。
目的でなされたものであって、培養による増殖細胞の数
、すなわち、細胞増殖活性を簡便かつ迅速に測定するた
めの方法及びそれに使用する超音波発振器を提供するこ
とを課題とする。
以下本発明の詳細な説明する。
課 を ゛するための手
本発明に係る方法は、細胞に付着させた色素もしくは細
胞に色素を反応させて得られる色素分解生成物を超音波
発振器で分散、溶解させてその吸光度を測定することを
特徴とする。
胞に色素を反応させて得られる色素分解生成物を超音波
発振器で分散、溶解させてその吸光度を測定することを
特徴とする。
すなわち、本発明による培養細胞数の計測方法は、色素
を用いた細胞増殖活性測定法において、超音波発振器を
用いることにより、増殖細胞を破砕して色素の可溶化を
瞬時に行って色素を完全にン容解さゼ・ること力（可能
となる。
を用いた細胞増殖活性測定法において、超音波発振器を
用いることにより、増殖細胞を破砕して色素の可溶化を
瞬時に行って色素を完全にン容解さゼ・ること力（可能
となる。
本発明において用いる色素は、細胞に付着可能なもの、
もしくは細胞によって色素分解物を生じ得るものを包含
し、このような色素として３−（４５−ジメチルチアゾ
ール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム
ブロマイド＜ＭＴＴと称せられる）、クリスタルバイオ
レフト、クマシーブリリアントブルーなどを例示し得る
。
もしくは細胞によって色素分解物を生じ得るものを包含
し、このような色素として３−（４５−ジメチルチアゾ
ール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム
ブロマイド＜ＭＴＴと称せられる）、クリスタルバイオ
レフト、クマシーブリリアントブルーなどを例示し得る
。
本発明では、増殖可能なあらゆる動物、植物の細胞を培
養した増殖細胞に、上記色素を付着させるか、もしくは
色素を反応させて色素分解生成物を生成させる。この場
合、色素はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して
用いる。
養した増殖細胞に、上記色素を付着させるか、もしくは
色素を反応させて色素分解生成物を生成させる。この場
合、色素はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して
用いる。
なお、上記細胞の培養は、動物細胞ではＲＰＭＩ １６
４０培地、ダルベツコ変法イーグル培地、最小必須培地
（ＭＥＭ）などのような通常的培地を用い、これらの培
地に牛胎児血清もしくはヒトＡＢ型血清のような動物血
清を１〜２０％（ｗｔ）、好ましくは５〜１０％（ｗｔ
）添加した培地、或は増殖因子を添加した無血清培地で
行うとよい。一方、植物細胞の培養は、無機要素のほか
、ビタミン類などの有機物質を、炭素源及びエネルギー
源としての糖類に添加し、さらに植物成長調節物質を加
えた培地を用いて行う。
４０培地、ダルベツコ変法イーグル培地、最小必須培地
（ＭＥＭ）などのような通常的培地を用い、これらの培
地に牛胎児血清もしくはヒトＡＢ型血清のような動物血
清を１〜２０％（ｗｔ）、好ましくは５〜１０％（ｗｔ
）添加した培地、或は増殖因子を添加した無血清培地で
行うとよい。一方、植物細胞の培養は、無機要素のほか
、ビタミン類などの有機物質を、炭素源及びエネルギー
源としての糖類に添加し、さらに植物成長調節物質を加
えた培地を用いて行う。
因に、微生物の増殖活性を測定する場合には、肉汁、麦
芽汁、血清などの天然物を主成分として含む天然液体培
地あるいは合成液体培地を用いて培養するとよい。
芽汁、血清などの天然物を主成分として含む天然液体培
地あるいは合成液体培地を用いて培養するとよい。
本発明では、上述のようにして培養細胞に色素を付着さ
せたもの、もしくは色素を反応させて分解したものに、
超音波を作用させて細胞を破砕するとともに色素を溶解
させる。
せたもの、もしくは色素を反応させて分解したものに、
超音波を作用させて細胞を破砕するとともに色素を溶解
させる。
ここで超音波を作用させるために用いる超音波発振器は
、市販のハンディタイプの超音波ホモジナイザーでよく
、細胞破砕用チップとして、先端の形状が円錐形または
円柱形をなしたちの１本又は９ｍｍ間隔で８本ないし１
２本、もしくは、９ｍ＋ｗ間隔で縦に８本と横に６本計
４８本又は９ｍｍ間隔で縦に８本と横に１２本計９６本
連結して備えていることを特徴とする。
、市販のハンディタイプの超音波ホモジナイザーでよく
、細胞破砕用チップとして、先端の形状が円錐形または
円柱形をなしたちの１本又は９ｍｍ間隔で８本ないし１
２本、もしくは、９ｍ＋ｗ間隔で縦に８本と横に６本計
４８本又は９ｍｍ間隔で縦に８本と横に１２本計９６本
連結して備えていることを特徴とする。
上記細胞破砕用チップは、直径４１以下、好ましくは１
ｍｍ〜３１で長さが７ｍ１ＩＩ以上、好ましくは３０１
１１１〜５０ｍｍを有するチタニウム製又はステンレス
製で構成されたものが望ましい。また、チップの並びに
沿って片側もしくは両側に、高さ３０ＩＩｌｌ１１〜１
００ｍｍ、厚さ１１〜５ｎｖの硬質ゴム製、ゴム製もし
くはシリコンコーティング（又はカバー）されたプラス
チック製、ステンレス製、アクリル樹脂製又は塩化ビニ
ル樹脂製のガイドを装着させたものが好ましい。
ｍｍ〜３１で長さが７ｍ１ＩＩ以上、好ましくは３０１
１１１〜５０ｍｍを有するチタニウム製又はステンレス
製で構成されたものが望ましい。また、チップの並びに
沿って片側もしくは両側に、高さ３０ＩＩｌｌ１１〜１
００ｍｍ、厚さ１１〜５ｎｖの硬質ゴム製、ゴム製もし
くはシリコンコーティング（又はカバー）されたプラス
チック製、ステンレス製、アクリル樹脂製又は塩化ビニ
ル樹脂製のガイドを装着させたものが好ましい。
添付の第１図は、チップの形状を例示したものであって
、図のｆａｔは１本のチップを、（ｂｌは８本のチップ
を、（Ｃ１は１２本のチップをそれぞれ示し、（ｄｌは
９６穴プレートに適合するように９６本（８Ｘ １２）
連結状にしたチップを示す。
、図のｆａｔは１本のチップを、（ｂｌは８本のチップ
を、（Ｃ１は１２本のチップをそれぞれ示し、（ｄｌは
９６穴プレートに適合するように９６本（８Ｘ １２）
連結状にしたチップを示す。
上述のように構成された超音波発振器を用いて、培養細
胞に色素を付着させたもの、もしくは培養細胞に色素を
反応させたものに超音波を作用させると、極めて短時間
に細胞を破砕し得るとともに、色素を完全に溶解するこ
とができるので、従来法にみられる血清タンパク質の沈
澱を抑制することが可能となる。
胞に色素を付着させたもの、もしくは培養細胞に色素を
反応させたものに超音波を作用させると、極めて短時間
に細胞を破砕し得るとともに、色素を完全に溶解するこ
とができるので、従来法にみられる血清タンパク質の沈
澱を抑制することが可能となる。
次に、上記超音波発振器を用いて超音波を作用させる手
法を説明する。
法を説明する。
マイクロタイタープレート中で細胞を培養した後、この
培養液に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に色素を溶
解した溶液を添加して所定時間放置した後、超音波発振
器の先端をマイクロタイタ−プレートの底に傷をつけな
いように、ウェル底部と少くとも２１１１１１％好まし
くは３ｍｎ＋以上離して、かつ培養液がウェルから飛び
散らないように培養液面より少くとも３１以上、好まし
くは４ｆｆ１ｍ以上深く挿入することが望ましい。
培養液に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に色素を溶
解した溶液を添加して所定時間放置した後、超音波発振
器の先端をマイクロタイタ−プレートの底に傷をつけな
いように、ウェル底部と少くとも２１１１１１％好まし
くは３ｍｎ＋以上離して、かつ培養液がウェルから飛び
散らないように培養液面より少くとも３１以上、好まし
くは４ｆｆ１ｍ以上深く挿入することが望ましい。
そのためには、第２図に示すように、例えば硬質ゴム製
の板状ガイドを発振器先端（チップ）に取り付けたもの
を用いることにより、上記先端をマイクロタイタープレ
ートの底に接することなく、該プレート中に均一に挿入
し得る。
の板状ガイドを発振器先端（チップ）に取り付けたもの
を用いることにより、上記先端をマイクロタイタープレ
ートの底に接することなく、該プレート中に均一に挿入
し得る。
ここで用いる板状の安全ガイドは、厚さ０．５＋ｍｓ以
上、好ましくは１１１ｍ〜５Ｉｌｌｌｌ、幅１１０５ｕ
以上、好ましくは１５ＩＩＩｌ〜１３０ＩＩＩ１１、及
び高さ３０ｍｍ以上のものが望ましい。また、ガイドの
材質はマイクロタイタープレートとの接着部に傷がつか
ないように、硬質ゴム製、もしくは厚さが０．１ｏｎ＋
以上、好ましくはｌｌ１１ｍ〜２０ａｕ＋＋の硬質ゴム
あるいはシリコンを接着面にコーティングしたプラスチ
ック、ステンレス、アクリル樹脂、塩化ビニル樹脂など
で構成されたものである。
上、好ましくは１１１ｍ〜５Ｉｌｌｌｌ、幅１１０５ｕ
以上、好ましくは１５ＩＩＩｌ〜１３０ＩＩＩ１１、及
び高さ３０ｍｍ以上のものが望ましい。また、ガイドの
材質はマイクロタイタープレートとの接着部に傷がつか
ないように、硬質ゴム製、もしくは厚さが０．１ｏｎ＋
以上、好ましくはｌｌ１１ｍ〜２０ａｕ＋＋の硬質ゴム
あるいはシリコンを接着面にコーティングしたプラスチ
ック、ステンレス、アクリル樹脂、塩化ビニル樹脂など
で構成されたものである。
なお、第２図において、ｆａｔは板状ガイドの正面と側
面（横）を示し、（ｂ）はチップ８本のものに板状ガイ
ドを装着した状態を、（Ｃ）はチップ９６本のものに装
着した状態をそれぞれ示す。また、（ｄｌは板状ガイド
を装着したチップをマイクロタイタープレートに挿入し
た状態を示す。
面（横）を示し、（ｂ）はチップ８本のものに板状ガイ
ドを装着した状態を、（Ｃ）はチップ９６本のものに装
着した状態をそれぞれ示す。また、（ｄｌは板状ガイド
を装着したチップをマイクロタイタープレートに挿入し
た状態を示す。
上述のようにして、超音波発振器をマイクロタイタープ
レート中の培養液に挿入した後、超音波を発振させるが
、発振時間は２秒〜１０秒、好ましくは５秒程度で十分
である。
レート中の培養液に挿入した後、超音波を発振させるが
、発振時間は２秒〜１０秒、好ましくは５秒程度で十分
である。
なお、２秒以上発振して培養液に超音波を作用させるこ
とにより、不溶物は全く認められなくなる。
とにより、不溶物は全く認められなくなる。
すなわち、本発明に従って、超音波発振器を用いて、培
養細胞に色素を付着もしくは反応させたものを超音波を
作用させることにより、細胞が破砕されるとともに色素
が完全に溶解し、実質上不溶物のない培養液が得られる
ので、その吸光度を測定して簡便に細胞数を計測できる
。したがって、本発明によると多数の検体の細胞増殖活
性を測定できる。
養細胞に色素を付着もしくは反応させたものを超音波を
作用させることにより、細胞が破砕されるとともに色素
が完全に溶解し、実質上不溶物のない培養液が得られる
ので、その吸光度を測定して簡便に細胞数を計測できる
。したがって、本発明によると多数の検体の細胞増殖活
性を測定できる。
また、本発明で用いる超音波発振器は、その先端に細胞
破砕のためのチップを備えており、かつチップには安全
ガイドを取付けているので、培養細胞を収容したマイク
ロタイタープレートの底部に傷をつける心配がない。
破砕のためのチップを備えており、かつチップには安全
ガイドを取付けているので、培養細胞を収容したマイク
ロタイタープレートの底部に傷をつける心配がない。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。
実施例１
本実施例は、ヒト培養細胞株を用いて、培地中の細胞数
と三波長測定によるＭＴＴアッセイで得られた吸光度と
の関係及び測定の所要時間を示したものである。
と三波長測定によるＭＴＴアッセイで得られた吸光度と
の関係及び測定の所要時間を示したものである。
ヒト培養細胞株は、第日本製薬より入手したＢリンパ芽
球様細胞株Ｗｌ−Ｌ２を用い、１〜１６ Ｘ １０’／
個／ウェルの細胞数となるように、９６穴マイクロタイ
タープレート （ファルコン３０７２）中で３７℃の温
度下で５％炭酸ガス含有空気及び湿度１００％の雰囲気
中で培養した。ＭＴＴアッセイは、細胞培養液を１００
μｌずつ９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン
３０７２）に加え、所定時間培養した後、予めリン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５ ｔａｇ／−βとなるよう
にＭＴＴを溶解したＭＴＴ溶液を１０μ！添加し、３７
℃の温度下で５％炭酸ガス含有空気及び湿度１００％の
雰囲気中で４〜６時間静置した。ＭＴＴの開裂によって
生じたＭＴＴフォルマザンを溶解するために１５０μｌ
の塩酸−イツブロバノールを加えて直ちにピペットマン
（ギルマン）を用いてピペッティングを行った場合と、
−本のチップを有する超音波発振器を用いた場合で行っ
た。尚、超音波発振器には硬質ゴムをコーティングした
アクリル樹脂製安全ガイドを取りつけた。
球様細胞株Ｗｌ−Ｌ２を用い、１〜１６ Ｘ １０’／
個／ウェルの細胞数となるように、９６穴マイクロタイ
タープレート （ファルコン３０７２）中で３７℃の温
度下で５％炭酸ガス含有空気及び湿度１００％の雰囲気
中で培養した。ＭＴＴアッセイは、細胞培養液を１００
μｌずつ９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン
３０７２）に加え、所定時間培養した後、予めリン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５ ｔａｇ／−βとなるよう
にＭＴＴを溶解したＭＴＴ溶液を１０μ！添加し、３７
℃の温度下で５％炭酸ガス含有空気及び湿度１００％の
雰囲気中で４〜６時間静置した。ＭＴＴの開裂によって
生じたＭＴＴフォルマザンを溶解するために１５０μｌ
の塩酸−イツブロバノールを加えて直ちにピペットマン
（ギルマン）を用いてピペッティングを行った場合と、
−本のチップを有する超音波発振器を用いた場合で行っ
た。尚、超音波発振器には硬質ゴムをコーティングした
アクリル樹脂製安全ガイドを取りつけた。
連室波長は、主波長５７７ｎｍ、副波長６２０ｎｍで行
い、コントロールとして細胞を含まない培地でＭＴＴア
ッセイ測定を行った。
い、コントロールとして細胞を含まない培地でＭＴＴア
ッセイ測定を行った。
第３図に細胞数と三波長測定によるＭＴＴアッセイの吸
光度の関係を示す。図にみられるとおり、三波長測定の
結果、細胞数と吸光度の差（ＡＳ７７Ａｂｚｏ）は良い
直線性を示し、相関係数は０．９９２であった。ピペッ
ティングによる溶解と超音波発振器による溶解で両者の
差が認められなかったが、ＭＴＴフォルマザン溶解に要
した時間はピペッティング操作が、２０ウエルの溶解に
約１６分も要したのに対して超音波発振器で行うと約２
分に短縮された。
光度の関係を示す。図にみられるとおり、三波長測定の
結果、細胞数と吸光度の差（ＡＳ７７Ａｂｚｏ）は良い
直線性を示し、相関係数は０．９９２であった。ピペッ
ティングによる溶解と超音波発振器による溶解で両者の
差が認められなかったが、ＭＴＴフォルマザン溶解に要
した時間はピペッティング操作が、２０ウエルの溶解に
約１６分も要したのに対して超音波発振器で行うと約２
分に短縮された。
実施例２
本実施例は、１枚の９６穴マイクロタイタープレートに
ヒト培養細胞株Ｈ０３２３（Ｏｈａｓｈｉ ＩＩ、ら、
セル・バイオロジカル・インターン・レポート、■。
ヒト培養細胞株Ｈ０３２３（Ｏｈａｓｈｉ ＩＩ、ら、
セル・バイオロジカル・インターン・レポート、■。
７７．１９８６．）を培養し、ＭＴＴアッセイを行った
。ＭＴＴフォルマザン溶解にはピペットマン（ギルソン
）を用いたピペッティングと、第２図ｆｂ）に示した８
連のチップを有する超音波発振器を用いた場合とで行っ
た。
。ＭＴＴフォルマザン溶解にはピペットマン（ギルソン
）を用いたピペッティングと、第２図ｆｂ）に示した８
連のチップを有する超音波発振器を用いた場合とで行っ
た。
尚、超音波発振器には硬質ゴムをコーティングしたステ
ンレス製安全カバーを取りつけた。
ンレス製安全カバーを取りつけた。
測定波長は実施例１と同様に行った。
その結果、実施例１と同様細胞数と吸光度の差（Ａ 、
ｔｑ Ａ ｈｚｏ＞には良い直線関係が認められたが
、ＭＴＴフォルマザン溶解に要した時間は、ピペッティ
ング操作が９６穴ウエルの溶解に約７０分も要したのに
対し、８連チツプの超音波発振器では１分３０秒で完了
した。
ｔｑ Ａ ｈｚｏ＞には良い直線関係が認められたが
、ＭＴＴフォルマザン溶解に要した時間は、ピペッティ
ング操作が９６穴ウエルの溶解に約７０分も要したのに
対し、８連チツプの超音波発振器では１分３０秒で完了
した。
実施例３
本実施例は、ヒト−ヒトハイブリドーマ９ Ｐ−１３−
２（新本ら、アグリカルテャル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、剋、 ２２１７．１９８６）を用いて２０枚
の９６穴マイクロタイタープレートに培養し、ＭＴＴア
ッセイを行った。ＭＴＴフォルマザン溶解にはピペット
マン（ギルソン）を用いたピペッティングと第２図の（
Ｃ１に示した９６連のチップを有する超音波発振器を用
いた場合とで行った。
２（新本ら、アグリカルテャル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、剋、 ２２１７．１９８６）を用いて２０枚
の９６穴マイクロタイタープレートに培養し、ＭＴＴア
ッセイを行った。ＭＴＴフォルマザン溶解にはピペット
マン（ギルソン）を用いたピペッティングと第２図の（
Ｃ１に示した９６連のチップを有する超音波発振器を用
いた場合とで行った。
尚、超音波発振器には硬質ゴム製安全ガイドを取りつけ
た。測定波長は実施例１と同様に行った。
た。測定波長は実施例１と同様に行った。
その結果、ピペッティング操作では２枚目のプレートよ
りタンパク質の沈澱を生じ測定不可能となった。これに
対し、超音波発振器を用いると２０枚のプレートを約４
分で処理が完了し、タンパク質の沈澱は全く認められな
かった。さらに超音波発振器を用いると、どのプレート
も細胞数と吸光値には良い直線関係が認められた。
りタンパク質の沈澱を生じ測定不可能となった。これに
対し、超音波発振器を用いると２０枚のプレートを約４
分で処理が完了し、タンパク質の沈澱は全く認められな
かった。さらに超音波発振器を用いると、どのプレート
も細胞数と吸光値には良い直線関係が認められた。
第１図は、本発明に係る超音波発振器に取り付けるチッ
プを示し、ｆａｔは１本のチップを、由）は８連のチッ
プを、（ｅ）は１２連のチップを、ｆｄｌは４８連並び
に９６連のチップの形成状態をそれぞれ示す。 第２図はチップに取り付けた板状ガイドを例示したもの
であって、（ａ）はガイドの正面と側面を示し、（ｂｌ
は８連のチップにガイドを取り付けた状態を、ｆｃｌは
９６連のチップにガイドを取り付けた状態をそれぞれ示
し、（ｄ＋はガイドを取り付けたチップ（１本）をマイ
クロタイタープレートに挿入した状態を示す。 また、第３図は、三波長測定によるＭＴＴアフセイの吸
光度と細胞数の関係を示す。
プを示し、ｆａｔは１本のチップを、由）は８連のチッ
プを、（ｅ）は１２連のチップを、ｆｄｌは４８連並び
に９６連のチップの形成状態をそれぞれ示す。 第２図はチップに取り付けた板状ガイドを例示したもの
であって、（ａ）はガイドの正面と側面を示し、（ｂｌ
は８連のチップにガイドを取り付けた状態を、ｆｃｌは
９６連のチップにガイドを取り付けた状態をそれぞれ示
し、（ｄ＋はガイドを取り付けたチップ（１本）をマイ
クロタイタープレートに挿入した状態を示す。 また、第３図は、三波長測定によるＭＴＴアフセイの吸
光度と細胞数の関係を示す。
Claims (5)
- （１）培養により増殖した細胞に、細胞付着性色素を付
着もしくは反応させ、次いで超音波を作用させることに
より上記色素を溶解させるとともに細胞破砕を行つた後
、その吸光度を測定することを特徴とする培養細胞数の
計測方法。 - （２）細胞付着性色素が３−（４，５−ジメチルチアゾ
ール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム
ブロマイドである請求項（１）に記載の培養細胞数の計
測方法。 - （３）細胞破砕用チップを、１本又は９ｍｍ間隔で８本
或いは１２本もしくは、９ｍｍ間隔で縦に８本と横に６
本計４８本又は９ｍｍ間隔で縦に８本と横に１２本計９
６本連結して成る超音波発振器。 - （４）超音波発振器のチップが直径４ｍｍ以下で長さ７
ｍｍ以上である請求項（３）に記載の超音波発振器。 - （５）チップの並びに沿つて片側もしくは両側に、高さ
３０ｍｍ〜１００ｍｍ、厚さ１ｍｍ〜５ｍｍの硬質ゴム
製、又はゴム製のガイド、もしくはシリコンをコーティ
ングしたプラスチック製、ステンレス製、アクリル樹脂
製又はポリ塩化ビニル製ガイドを装着して成る請求項（
３）もしくは（４）に記載の超音波発振器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63175345A JPH0630629B2 (ja) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | 培養細胞数の計測方法及びそれに用いる超音波発振器 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63175345A JPH0630629B2 (ja) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | 培養細胞数の計測方法及びそれに用いる超音波発振器 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0225748A true JPH0225748A (ja) | 1990-01-29 |
| JPH0630629B2 JPH0630629B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=15994443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63175345A Expired - Lifetime JPH0630629B2 (ja) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | 培養細胞数の計測方法及びそれに用いる超音波発振器 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630629B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003031084A3 (de) * | 2001-10-04 | 2003-08-28 | Beatrix Christa Meier | Ultraschallvorrichtung zur übertragung von ultraschall in ein probenvolumen |
| EP1514601A3 (en) * | 2002-01-08 | 2005-09-21 | Kevin R. Oldenburg | Rapid thermal cycling device with lid having pins for transfer of energy |
-
1988
- 1988-07-14 JP JP63175345A patent/JPH0630629B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003031084A3 (de) * | 2001-10-04 | 2003-08-28 | Beatrix Christa Meier | Ultraschallvorrichtung zur übertragung von ultraschall in ein probenvolumen |
| EP1514601A3 (en) * | 2002-01-08 | 2005-09-21 | Kevin R. Oldenburg | Rapid thermal cycling device with lid having pins for transfer of energy |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0630629B2 (ja) | 1994-04-27 |
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