JPH02257877A

JPH02257877A - リンホカイン活性化キラー細胞の製造法

Info

Publication number: JPH02257877A
Application number: JP1181167A
Authority: JP
Inventors: Masaharu Kojima; 雅晴小嶋; Kenji Yasuda; 健二安田; Shiho Jinkawa; 陣川　志保; Masanori Togami; 戸上　昌紀
Original assignee: Japan Synthetic Rubber Co Ltd
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1988-11-18
Filing date: 1989-07-13
Publication date: 1990-10-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は癌の治療に有効なリンホカイン活性化キラー細
胞の製造法に関する。

〔従来の技術〕

近年、免疫中尉よび悪性腫瘍の研究の進歩に伴い、種々
の殺腫瘍細胞の存在が明らかにされてきた。これらの殺
腫瘍細胞は腫瘍細胞を破壊する活性を有することか°ら
、癌の治療に有用である。

例えば、リンパ球をインターロイキン２　（以下、ｒｌ
Ｌ−２Ｊという）の存在下に培養すると殺腫瘍細胞活性
を示す一群のキラー細胞が誘導されることが知られてい
る。そしてこのキラー細胞はＬＡＫ細胞（Ｌｙｍｐｈｏ
ｋｉｎｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｋ１１ｌｅｒｃｅｌｌ
）と命名されている（以下、ｒＬＡＫ細胞」という）。

ＬＡＫ細胞は正常細胞には働かないが、自己の癌細胞を
殺す能力を有するため、このＬＡＫ細胞を用いた癌治療
法としての養子免疫療法（＾ｄｏｐｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｈｅｒａｐｙ）が近年注目をあび、その実用化研
究が行なわれている。この養子免疫療法は癌患者から大
量のリンパ球を採取し、体外でのＩＬ−２処理によりリ
ンパ球をＬＡＫ細胞に分化させた後、再び患者にＬＡＫ
細胞を注入する癌治療法である。この際、リンパ球より
ＬＡＫ［Ｉ］胞を誘導・増殖させるための培地としては
、ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ　　１６４０培地に２〜１０
容量％のヒ）ＡＢ型血漿を含有する培地が使用されてい
た。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、ヒトＡＢ型血漿を同一人より得ることには量的
に限度があるため、複数人の血漿が混合されて培養に用
いられてきた。その結果、培地の調製毎にＬＡＫ細胞の
誘導と増殖に関してバラツキがあった。またＢ型肝炎ウ
ィルスやエイズウィルスなどの病原体がヒ）ＡＢ型血漿
に混入している可能性があり、その混入検査が煩雑であ
る、感染防止のため取り扱いには十分な注意が必要であ
るなどの問題があった。さらに日本では制度上、誰でも
自由にヒ）ＡＢ型血漿が入手できる状況にはなく、ＬＡ
Ｋ細胞の製造に大きな障害となっていた。

従って、このように問題の多いヒ）ＡＢ型血漿を含有し
ない培地を用いて、効率よ＜　ＬＡＫ細胞を製造するた
めの方法の開発が熱望されていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究した結果
、入手や調製が容易であるリポ蛋白質およびＩＬ−２を
含有する培地を用いれば、ヒトＡＢ型血漿を含有する培
地を用いた場合と同様にリンパ球よりＬＡＫ細胞の誘導
と増殖が可能となることを見出し、本発明を完成するに
至った。

すなわち本発明は、リポ蛋白質およびＩＬ−２を含有す
る培地中においてリンパ球を培養することを特徴とする
ＬＡＫ細胞の製造法を提供するものである。

本発明に用いる培地はリポ蛋白質およびＩＬ−２を基礎
培地に添加して構成される。基礎培地としてはミニマル
エッセンシャルメディウム（ＭＥＭ）　、ＲＰＭＩ　　
１６４０、ハムＦ１２、ダルベツコ改変イーグルメディ
ウム（ＤＭＥＭ）、イスコツ改変イーグルメディウム（
ＩＭＤＭ）などを単独でもしくは混合して使用すること
ができるが、就中ＲＰＭＩ　　１６４０が特に好ましい
。

本発明において、リポ蛋白質としては卵黄、ヒトやウシ
の血漿、乳由来のものが挙げられるが、リポ蛋白質のう
ちで・は３０．　ＯＯＯ〜６０．　ＯＯＯｒｐｍ程度で
約１６〜６０時間超遠心した場合に沈澱しない低比重リ
ポ蛋白質が好ましい。

本発明で使用されるリポ蛋白質は、人手の容易性、経済
性の点で卵黄、特に鶏卵を原料としたものが好ましい。

鶏卵からリポ蛋白質を得るための代表的な方法は以下の
とおりである。１０個の鶏卵の卵黄に対し、０．１〜０
．２Ｍの塩化ナトリウム溶液１５０〜３００ｍｊ！を加
えて室温で１０〜６０分間程度撹拌し、これを約３．　
ＯＯＯｒｐｍで５〜１５分間程度遠心分離処理して上澄
み液を得、更に例えば１７．００Ｏｒｐｍで１０〜６０
分間程度遠心分離処理して上澄み液を得、これをマグネ
シウムイオンやカルシウムイオンを含まないリン酸緩衝
生理食塩水（以下、ｒＰＢＳ−」という）によって透析
して卵黄抽出物溶液を得る。次いで、この卵黄抽出物溶
液から、例えばエバンスらの方法（Ｒｏｂｂｅｒｔ　Ｊ
ｏｈｎ　Ｂｖａｎｓｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　１６４
巻。

６−５７４　（１９６Ｂ）　）によって、リポ蛋白質溶
液を調製する。例えば、卵黄抽出物溶液を３０．０００
〜６Ｇ、　ＯＱＯｒｐｍで１６〜６０時間、３〜８℃で
超遠心し、浮上しているリポ蛋白質層を採取する。さら
にリポ蛋白質層を１Ｍ塩化ナトリウムに懸濁し３０．０
００〜６０、００Ｏｒｐｍで１６〜６０時間、３〜８℃
で超遠心し、浮上しているリポ蛋白質層を１Ｍ塩化ナト
リウムに懸濁しＰＢＳ−によって透析する。その後、透
析内液を３．０００〜１２．００Ｏｒｐｍで２０〜４０
分遠心した後、フィルターで濾過して滅菌し、必要に応
じてリポ蛋白質、遊離脂肪酸、コレステロール、リン脂
質、トリグリセライドなどの濃度を測定した上で、例え
ば−２０℃以下で凍結保存する。このリポ蛋白質溶液の
基礎培地に対する添加量はリポ蛋白質濃度が２〜１００
μｇ／ｍ１となる割合とするのが好ましい。

本発明で使用されるＩＬ−２は末梢血から分離したもの
でも、また遺伝子組換えにより調製された組換えＩＬ−
２（以下、ｒｒＩＬ−２Ｊという）でもよい。ＩＬ−２
の基礎培地への添加量は５０〜１．５００　Ｕ／ｍ１が
好適である。添加量がこれより少ない場合はＬＡＫ細胞
への誘導が不完全であり、多い場合は経済的に好ましく
ない。

本発明においては、リポ蛋白質溶液を調製せずに、卵黄
抽出物溶液をそのまま基礎培地に添加してもよい。

本発明においては、基礎培地に対し、その細胞増殖能を
さらに発揮させるために種々の物質を添加してもよい。

その具体例としては、インシュリン、トランスフェリン
、フェツイン、カタラーゼ、０−フォスホリルエタノー
ルアミン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、
２−メルカプトエタノール、コル°チコステロンなどが
挙げられる。

インシュリンとしては、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウ
マなどの由来のもの、組換え体いずれでも使用でき、そ
の添加量は、１〜１００μｇ／ｍｌ、特に１０μｇ／ｍ
１程度が好ましい。トランスフェリンとしては、ヒト、
ウシ、ウマ、イヌ、マウス、モルモット、ウサギなど由
来のものが使用でき、その添加量は１〜１００μｇ／ｍ
ｌ、特にｌＯμｇ／ｌＴ１１程度が好ましい。フェツイ
ンとしては例えばウシ由来のものが使用でき、その添加
量は１＝１００ｐｇ／ｌｏｉ！、特に１０μｍｇ／ｍ１
程度が好ましい。カタラーゼとしてはウシ、イヌ、マウ
ス、糸状菌など由来のものが使用でき、その添加量は２
〜５０μｇ／ｍ１、特に３０μｇ／ｍ１程度が好ましい
。０−フォスホリルエタノールアミンまたはエタノール
アミンは２〜２００μｇ／ｌ１１１、特に２０μｇ７ｍ
ｌ程度の添加量が好ましい。

亜セレン酸ナトリウムは１０−”〜１０−’Ｍ、特に１
０−”Ｍ程度となる量の添加量が好ましい。２−メルカ
プトエタノールは１０４〜１０−７Ｍ、特に１０−”Ｍ
程度となる量の添加量が好ましい。コルチコステロンは
１０−’〜１０−’Ｍ、特にｌｏ−７Ｍ程度となる量の
添加量が好ましい。

本発明では、上記のようにして得られる培地中で、リン
パ球を培養し、リンパ球からＬＡＫ細胞を誘導・増殖さ
せる。

本発明で使用することのできるリンパ球としては、末梢
血リンパ球（ＰＢＬ）、ＩＪンパ節リンパ球（ＬＮＬ）
や腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などが挙げられる。これ
らのリンパ球は、通常、培地に通常、５ｘ１０Ｓ〜２Ｘ
１０６個／ｍ１の割合で播種する。培養は、例えば炭酸
ガスを３〜７容量％含有する空気中、３６〜３８℃で３
〜１０日間行う。

〔実施例〕次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

参考例１リポ蛋白質溶液の調製（１）新鮮な鶏卵２個から卵黄を取出し、０．１６Ｍ塩
化ナトリウム溶液４０ｍ１を加え室温で４０分間撹拌し
た。この溶液を３．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し
、沈澱物を捨て上清を得た。この上清をさらに１７．０
０Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し、６０ｍｊ！の上清を
得た後、ＰＢＳ−に対して透析し、卵黄抽出物溶液を得
た。

（２）次いで、卵黄抽出物溶液に１．５ｍｊ！０５Ｍ塩
化ナトリウムを加えて、３０．００Ｏｒｐｍで６０時間
遠心した。浮上している黄色のゼリー状物質を５０１１
１１の１Ｍ塩化ナトリウムに懸濁し、再度３０、００Ｏ
ｒｐｍで４２時間遠心した。浮上している黄色のゼリー
状物質を２０ｍｊ！の１Ｍ塩化ナトリウムに懸濁し、Ｐ
ＢＳ−に対して２日間透析した。

透析内液は３．８０Ｏｒｐｍで３０分遠心し不溶物を除
去した後、２μｍ　、　　０．８０．ｕｍ　、　　０．
２２μｍのフィルターで順に濾過した。調製したリポ蛋
白質溶液は以下の成分を含有していた。

リ　ポ蛋白質　　バイオラプドプロテインアフセイ　　
　　　　　１９．５コしステロ−ＪｌｌＯ−フタルアル
デヒド　変法　　　　　　　２６．１リン　脂質　　　
　　　コリンオキシダーｆ−ＤＡＯ３法　　　　　３１
．５トリグリセライド　　　　アセチルアセトン　法　
　　　　　　　　　　１６３．０遊離脂肪酸　Ｄｕｎｃ
ｏｍｂｅ法変法　　３．　ＩＸ　１ｏ−３１１単位：　
ｍＥｑ／ｍ１参考例２腎臓抽出物の調製腎臓のアセトン粉末（シグマ社ａｉｌ）ＬＯＯｇに、約
５００ｍ１のＲＰＭＩ　　１６４０培地を加え、３７℃
で約３０分撹拌した。ついでこの懸濁液を３００　Ｏｒ
ｐｍで約３０分間遠心分離し沈澱物を除去し上清を得た
。０．２２μｍフィルターで上清を濾過滅菌した後、５
０ｍ１のチューブに小分けし−２０℃で凍結保存した。

タンパク質濃度をバイオラブドプロティンアッセイによ
る吸光光度法で測定したところ、１２ｍｇ／ｎｕであっ
た。

実施例１末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からＬＡＫ細胞の誘導（１）１０％ＡＢ／ＲＰＭＩ　　１６４０培地の調製９
００ｍｊ！の水に下記のものを溶解させ、ｌＮ水酸化ナ
トリウムでｐＨ７，０に調整した後、０．２２μｍのフ
ィルターで濾過することにより調製した。

粉末ＲＰＭＩ　　１６４０　　　　　１０．４ｇ炭酸水
素ナトリウム　　　　　　　２．０ｇペニシリンＧ　　
　　　　　　　　１．２５Ｘ　１０’Ｕストレプトマイ
シン　　　　　　１２５ｍｇＨＥＰＥＳ　　　　　　　
　　　　５．０ｇＡＢ型血ｉｌｌ　　　　　　　　　　
　１００ｍｊ！ｒｌＬ−２（組換え体）　　　　　５　
Ｘ　ｌＯ’Ｕ（２）末梢血リンパ球の調製健康な末梢血（２５ｍｇ）に同量のＰＢＳ−を加えて希
釈したもの５ｍｊ！をリンパ球分離媒体［：Ｌｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ、オ
ルガノテクノ社製］　（以下、ｒＬＳＭＪという）３ｍ
ｊ！に重層し遠心しく１，３５０ｒｐｍ、　　２０　ｔ
、　　３０分）、リンパ球層を集めてラクトアルブミン
含有ハンクス緩衝液（以下、「ハンクス液」という）で
洗浄した後、これに１０ｍ１の０．７５重量％塩化アン
モニウム／トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７、６）を加えて３
７℃で５分間加温した。次に遠心分離して、溶血した赤
血球を除いた後、ハンクス液で洗浄した。得られたリン
パ球は１０％ＡＢ／ＲＰＭ１１８４０　１０ｍ１に浮遊
させ、ペトリ皿（細胞培養用、直径１００ｍｍ）に播種
し、炭酸ガス培養器（３７℃、５容量％炭酸ガス／９５
容量％空気）に１時間放置した。未接着のリンパ球を集
めて、３回ＲＰＭＩ　　１６４０培地で洗浄して、１．
８×１０１個の末梢血リンパ球を得た。

（３〕　　培地の調製培地は、１１の水に下記のものを溶解させ、ｌＮ水酸化
ナトリウムでｐＨ７，０に調整した後、０．２２μｍの
フィルターで濾過することにより調製した。

粉末ＲＰＭＩ　　１６４０　　　　１０．４ｇ炭酸水素
ナトリウム　　　　　　２．０ｇ零１）ペニシリンＧ１．２５Ｘ　１０’Ｕ零月ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５．Ｏｇインシュリシ（ブタ）　　　　　　　１０ｍｇ
トランスフェリン（ヒト＞　　　　　１０＋ｎｇフェツ
イン（ウシ）　　　　　　　　　１０ｍｇロー７オスホ
リルエタノールアミン１０ｍｇ亜セレン酸ナトリウム　
　　　　１．７３ｘ　１０−’ｍｇ２−メルカプトエタ
ノール　　　７８．　ＩＸ　１０−’ｎｇ参考例１で得
られたリポ蛋白質　７５ｍｇカタラーゼ（ウシ）　　　
　　　　　３０ｍｇ：］　ＪＬｔチ：Ｉ　スフ−Ｄ　ン
３．４６Ｘ　１０−”ｍｇｒｌＬ−２（組換え体）　　
　　　５　ｘ　１０’Ｕ本１）　　ペニシリンＧおよび
ストレプトマイシンは雑菌の混入繁殖防止のために添加
された（以下同じ）。

１２）　　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓは水素イオン濃度維持のた
めに添加された（以下同じ）。

（４）　ＬＡＫ細胞の誘導・増殖（３）で調製した培地６ｍ１をベトリ皿（細胞培養用、
直径６０闘）に入れ、（２）で得られた末梢血リンパ球
４Ｘ１０＠個を播種し、炭酸ガス培養器で３７℃で３日
間培養を行なった後、末梢血リンパ球を回収し、ハンク
ス液で洗浄したところ、ＬＡＫ細胞が２．６４　Ｘ　１
０　’個得られた。

（５）傷害性の測定（４）で得られたＬＡＫ細胞の傷害率の測定を５ＩＣｒ
遊離法〔免疫生化学研究法、続生化学実験講座５゜東京
化学同人、１９８６）により行なった。まず、標的細胞
としてＱＧ５６（ヒト肺扁平上皮癌細胞）およびに５６
２（ヒト白血病細胞）を用い、これらの標的細胞を”Ｃ
ｒでラベルした。次に、（４）で得られたＬＡＫ細胞と
、”Ｃｒでラベルした標的細胞各５Ｘ１０”個を、ＱＧ
５６は細胞数比（ＬＡＫ細胞：ＱＧ５６）５：１，１０
：１．２０：１で、Ｋ５６２は細胞数比（ＬＡＫ細胞二
に５６２）２．５：１．５：１．１０：１の割合で混合
し、９６ウエルマイクロプレートに入れ、炭酸ガス培養
器で３７℃にて培養した。４時間後、ウェル毎に放出さ
れた放射能をガンマ−カウンターで測定し、傷害率を次
式に従って求めた。

ここで最大放出量は０．ＩＮ塩酸を加えて標識細胞を溶
解した際の５ｌＣｒ放出量であり、自然放出量はＬＡＫ
細胞のかわりに培地のみを加えたときの”ｃｒ放出量で
あり、試験放出量はＬＡＫ細胞を加えたときの”Ｃｒ放
出量であ、る。

次に傷害率と、使用したＬＡＫ細胞数との関係から、細
胞傷害性をＭ、Ｈｅ１ｓｋａｌａ　ｅｔ　ａｌ。

Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌ　１０　、
　２０９　（１９８７）に記載の全傷害単位（Ｔｏｔａ
ｌＬＵ）として、次式に従い求めた。

全傷害単位＝＝ＬＵｘｎ　／　１０　”ここで、しｕは
傷害率３０％のときに使用したＬＡＫ細胞の数を１０６
個あたりに換算した細胞数であり、傷害率３０％の時に
使用したＬＡＫ細胞をａＸｌｏｂで表わした場合、１／
ａ　Ｘ　１０　’−１′で表わされる数である。

また、ｎは、上記（３）で得られたＬＡＫ細胞の数であ
る。結果を表１に示す。

比較例１（１）ＬＡＫ細胞の誘導実施例１（４）における培地の代りに１０％ＡＢ／ＲＰ
ＭＩ　　１６４０培地を用いた以外は実施例１（４）と
同様にしてＬＡＫ細胞を３．０８　Ｘ　１０　’個得た
。

（２）傷害性の測定実施例１（５）と同様にして測定した。結果を表１に示
す。

表　　１実施例２（１）培地の調製培地は、１１の水に下記のものを溶解させ、ＩＮ水酸化
す）　ＩＪウムでｐ）１７．０に調整した後、０．２２
μｍのフィルターで濾過することにより調製した。

粉末ＲＰＭＩ　　１６４０　　　　１０．４ｇ炭酸水素
ナトリウム　　　　　　２．０ｇインシュリン（ブタ）トランスフェリン（ヒト）フェツイン（ウシ）ローフォスホリルエタノールアミ亜セレン酸ナトリウム２−メルカプトエタノール０ｍｇ１０　■ ｌＯ■ ンｌｏｍｇ１、７３Ｘ　１０−’ｍｇ７８、　Ｉ　Ｘ　１０−’ｍｇとして）として）ｒＩＬ−２（組換え体）　　　　　５Ｘ１０’Ｕ（２）
ＬＡＫ細胞の誘導・増殖（１）で調製した培地６ｍｌをペトリ皿（細胞培養用、
直径６０關）に入れ、実施例１（２）で得られたＰＢＬ
　　３ｘｌＯ”個を播種し、炭酸ガス培養器で３７℃で
３日間培養を行った後、ＰＢＬを回収し、ハンクス海で
洗浄したところ、ＬＡＫ細胞が２、５５　Ｘ　１０　’
個得られた。

（３）傷害性の測定実施例１（５］と同様にして測定した。結果を表２に示
す。

実施例３リンパ節リンパ球（ＬＮＬ＞よりＬＡＫ細胞の誘導（１）ＬＮＬの調製肺腫瘍の外科手術の際に得られたリンパ節を５ｅ　Ｘ　
５　ｍｍ程度に細切し、二枚のスライドグラスで圧着し
、リンパ球をハンクス液中に押し出した。

２枚のガーゼ上で濾過し遠心分離してリンパ球を得た。

ハンクス液で洗浄後、０．７５％塩化アンモニウム／ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６＞の１０＋ｎｊ！を加えて
、３７℃７分間加温して赤血球を溶血させた。ハンクス
液で１回洗浄後、リンパ球を１０ｍ１の１０％ＡＢ／Ｒ
ＰＭＩ　　１６４０培地に浮遊させ、ペトリ皿（細胞培
養用、直径１００ｍｍ）に播種し、炭酸ガス培養器で３
７℃で２時間放置した。未接着のリンパ球を回収し、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄して、２ＸｌＯ＠個のＬ
ＮＬを得た。

（２）　ＬＡＫ細胞の誘導実施例１（４）においてＰＢＬの代りにＬＮＬ　　３×
１０６個を用いた以外は、実施例１（４）と同様にして
、９日間培養し、ＬＡＫ細胞を６．２５　ｘ　１０　’
個得た。

（３）傷害性の測定実施例１（５）と同様にして測定した。結果を表２に示
す。

比較例２（１）ＬＡＫ細胞の誘導実施例１（４）において、実施例１（３）の培地の代り
に実施例１（１）で調製した１０％ＡＢ／ＲＰＭ１１６
４０培地６ｍｌを、ＰＢＬの代りに実施例３（１）で得
たＬＮＬ３Ｘ１０’個を用いた以外は実施例１（４）と
同様にして、９日間培養し、ＬＡＫ細胞を２．３１Ｘ１
０”個得た。

Ｃ）　傷害性の測定実施例１（５）と同様にして測定した。結果を表２に示
す。

表　　２実施例４腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）よりＬＡＫ細胞の誘導（１）ＴＩＬの調製ＴＩＬは肺腫瘍の外科手術の際、切除された腫瘍より調
製した。５．０ｇの腫瘍は、５　ｍ＋ｓ　Ｘ　５　ａｍ
程度に細切し、５ｍｆの酵素液（０，０１重量％ヒアル
ロニダーゼＴｙｐｅ　Ｖ、　０．１重量％コラゲナーゼ
Ｔｙｐｅ　ＩＶ、　０．０２重量％デオキシリポヌクレ
アーゼＴｙｐ、ｅ　Ｉ　）を加えて２時間室温にて撹拌
した。

２枚のガーゼで濾過し、組織片を除いて遠心分離後、リ
ンパ球を含むペレットを得た。ハンクス液で洗浄後、１
０％ＡＢ／ＲＰＭＩ　　１６４０の６ｆｌ＋１に浮遊し
、２ｍｉずつを３ｍｊ２のＬＳＭに重層し、遠心分離し
た（１３５０ｒｐｍ、２０℃、３０分）。リンパ球層は
ハンクス液で洗浄し、ＰＢＬの時と同様に処理して、混
在する赤血球と接着性細胞を除去した。リンパ球は４ｍ
ｌの１０％ＡＢ／ＲＰＭＩ　　１６４０に浮遊させ２ｍ
ｌを、各々の２ｍｌのＬＳＭと７５％ＬＳＭ／１０％Ａ
Ｂ／ＲＰＭＩ　　１６４０に重層し、遠心分離（１３５
０ｒｐｍ、　２０℃、１０分）した。リンパ球層を分取
して、ＲＰＭＩ　　１６４０培地で３回洗浄して、２×
１０７個のＴＩＬを得た。

（２）ＬＡＫ細胞の培養実施例１（４）において、ＰＢＬの代りにＴＩＬを３Ｘ
１０’個用いた以外は実施例１（４）と同様にして７日
間培養し、ＬＡＫ細胞を２．８４　Ｘ　１０　’個得た
。

（３）傷害性の測定（２）で得られたＬＡＫ細胞の傷害性を実施例１（５〕
と同様にして甥定した。結果を表３に示す。

比較例３（１）ＬＡＫ細胞の誘導実施例１（４）において、実施例１（３）で用いた培地
の代りに実施例１（１）で得られた１０％ＡＢ／ＲＰＭ
Ｉ　　１６４０培地を用い、ＰＢＬの代りに、ＴＩＬを
３Ｘ１０’個用いた以外は実施例１（７ｇと同様にして
７日間培養し、ＬＡＫ細胞を４．７８　ｘｌｏ”個得た
。

（２）傷害性の測定（１）で得られたＬＡＫ細胞の傷害性を実施例１（５）
と同様にして測定した。結果を表３に示す。

表〔発明の効果〕本発明で使用される培地は以下の長所を有する。

（１）　　ロフト間で品質のバラツキの小さい培地が得
られ、ヒ）ＡＢ型血漿を添加した培地を用いた場合と同
様のＬＡＫ細胞の誘導や増殖が安定的に行なえる。

（２）　　ヒトに有害な病原体の検査が不必要で安全に
取り扱うことができる。

（３）材料の入手が容易で、大量に調製することができ
、且つ安定供給が可能である。

従って本発明の製造法によれば種々の癌治療に有効なＬ
ＡＫ細胞を、安全に、安定にかつ大量に製造することが
できる。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、リポ蛋白質およびインターロイキン２を含有する培
地中においてリンパ球を培養することを特徴とする、リ
ンホカイン活性化キラー細胞の製造法。２、卵黄抽出物およびインターロイキン２を含有する培
地中においてリンパ球を培養することを特徴とする、リ
ンホカイン活性化キラー細胞の製造法。