JPH02265488A - α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖、このＤＮＡ鎖により形質転換された酵母、およびこの酵母を用いる酒類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、アセトバクター・アセチφサブスピーシーズ
・キシリナムＩＦＯ３２８８が産生するようなα−アセ
ト乳酸脱炭酸酵素 （以下α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅという）の生物工学的産
生能を存するＤＮＡ鎖、およびこのＤＮＡ鎖により形質
転換されてａ−ＡＬＤＣａｓｅ産生能を有しているサッ
カロマイセス・セレビシエに属する酵母、ならびにこの
酵母を用いる酒類の製造法、に関するものである。

先行技術 ビール、清酒、ワイン等の酒類は、一般に、麦汁、果汁
等の醸造原料液にサッカロマイセス・セレビシエに属す
る酵母を加え、これをアルコール発酵させることにより
製造される。この発酵過程において、酵母は自己の増殖
に必要なある柾のアミノ酸（バリン、ロイシン等）の生
合成の中間物質としてα−ア七ト乳酸（以下α−ＡＬと
いう）を産生じ、これを不可避的に細胞外、すなわち発
酵液中、に漏出する。このようにして発酵液中に存在す
るに到ったα−ＡＬは、発酵液中において非生物学的な
反応により、自動的にダイアセチル（以下ＤＡという）
へと変化する。

ＤＡは一般に「スエ臭」またはｒＤＡ臭」または「つわ
り香」と呼ばれる強烈な不快臭を有する物質であり、香
味的にすぐれた（すなわちＤＡ臭のない）酒類を製造す
るためには、発酵液中のα−ＡＬおよびＤＡ含量を、′
最終的には、仮にそのα−ＡＬが全てＤＡに変化したと
してもその全ＤＡ含量が酒類中のＤＡ臭の弁別閾（例え
ば、ビールでは０．０５〜０．１ｍｇ／リットル）を超
えることがないように、低下させることが必要である。

発酵液中のＤＡは酵母の共存中では比較的すみやかに無
味無臭のアセトインへと変換されるが、発酵液中のα−
ＡＬは酵母によっては変化を受けず、それが非生物学的
な化学反応によりＤＡに変化したときにはじめて酵母に
よってアセトインへと変換されるようになる。しかし、
発酵液中におけるα−ＡＬからＤＡへの変化は非常にゆ
っくりとした速度で進行するため、この反応が律速とな
ってα−ＡＬおよびＤＡ含量の低い（すなわちＤＡ臭の
ない）酒類を製造するためには、発酵液を長期間酵母の
共存下で熟成させることが一般に必要であった。

α−ＡＬＤＣａｓｅはａ−ＡＬをアセトインに変換する
性質を有する酵素であって、一般的には種々のＶｏｇｅ
ｓ　Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ反応陽性の細菌、例えばエンテ
ロバクター−アエロゲネス、バシラス・リケニフォルミ
ス、ラクトバシラスφケーセイ、バシラス・プレビス、
エンテロバクタ−・クロアカニ、アセトバクター属細菌
（アセトバクター・ランセンス、アセトバクター・アセ
チ等）等により産生されることが知られている。

〔発明の概要〕

要旨 本発明は、ＤＡ臭のない香味的にすぐれた酒類を従来法
に比べてはるかに短期間のうちに製造するのに有用と考
えられる、α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの生物工学的産生能
を有するＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換さ
れて α−ＡＬＤＣａｓｅ産生能を有する酵母を提供するもの
である。また、本発明は、この酵母を用いる酒類の製造
法を提供するものである。

すなわち、本発明による、α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの生
物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖は、α−アセト乳酸脱
炭酸酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的に第１
図に示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでのも
のであるポリペプチドをコードする塩基配列を有するこ
と、を特徴とするものである。

また、本発明によるサツカロマイセス会セレビシェに属
する酵母は、α−アセト乳酸脱炭酸酵素活性を有してい
てアミノ酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ
酸配列のうちＡからＢまでのものであるポリペプチドを
コードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖によって形質転換
されて、α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ産生能を有すること、
を特徴とするものである。

さらにまた、本発明による酒類の製造法は、α−アセト
乳酸脱炭酸酵素活性を有していてアミノ酸配列が実質的
に第１図に示されているアミノ酸配列のうちＡからＢま
でのものであるポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡ鎖によって形質転換されてα−ＡＬＤＣａ　
ｓ　ｅ産生能を有する酵母によって醸造原料を発酵させ
ること、を特徴とするものである。

効果 本発明によるＤＮＡ鎖は、種々の微生物、例えばサッカ
ロマイセス・セレビシエにα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの産
生能を付与してそのα−ＡＬの産生能を抑制したり、あ
るいは α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの生物工学的産生において有効
に利用することができる。

また、本発明による酵母は、 α−ＡＬＤＣａｓｅ産生能を有するものであるところ、
α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅは酵母細胞内に産生ずれば一般
に酵母のα−ＡＬの産生能（正確にはα−ＡＬの細胞外
への漏出）を抑制するので、本発明による酵母により醸
造原料液を発酵させれば、発酵液中のα−ＡＬの濃度は
きわめて低くなり、その結果として発酵液中のα−ＡＬ
の処理に要する熟成期間、ひいては酒類の醸造期間、を
著しく短縮することが可能である。

なお、本発明の酵母においてそのα−ＡＬの産生能が抑
制されるのは、発酵過程において細胞内にα−ＡＬが産
生されても、同じく細胞内に産生されたα−ＡＬＤＣａ
　ｓ　ｅによりα−ＡＬがアセトインに変換されるため
であると考えられる。

発酵製品の不快臭の問題は酒類の製造の場合の外にたと
えば食酢の製造の場合にも認められていて、食酢の所謂
「つわり香」または「むれ香」という不快臭の本体もた
とえばＤＡであるといわれている。従って、本発明によ
る α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅの生物学的産生能を有するＤＮ
Ａ鎖は、それによって酢酸菌を形質転換させて該形質転
換体で食酢を製造すれば不快臭の軽減した食酢を得るこ
とが可能であるという効果をも有する。

〔発明の詳細な説明〕

α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子 定義 本発明によるα−ＡＬＤＣａｓｅの生物工学的産生能を
有するＤＮＡ鎖すなわち ａ−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子は、 α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ酸配列が実
質的に第１図に示されているアミノ酸配列のうちＡから
Ｂまでのものであるポリペプチド、をコードする塩基配
列を有するもの、である。

ここでｒＤＮＡ鎖」とはある長さを有するポリデオキシ
リボ核酸の相補的２本鎖を意味するものである。そして
、本発明ではこの「ＤＮＡ鎖」はそれがコードするポリ
ペプチドのアミノ酸配列によって特定されているところ
、このポリペプチドは上記のように有限の長さのもので
あるから、このＤＮＡ鎖も有限の長さのものである。し
かし、このＤＮＡ鎖は、ａ−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅをコー
ドする遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工学
的産生を行わせるのに有用なものであるところ、この有
限の長さのＤＮＡ鎖のみによってこのような生物工学的
産生が行なえるのでなく、その５′−側上流および（ま
たは）３′　−側下流に適当な長さのＤＮＡ鎖が結合し
た状態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能とな
る訳である。

従って、本発明でｒＤＮＡ鎖」というときは、この特定
の長さのもの（第１図の対応アミノ酸配列でいえばＡ−
Ｂの長さ）の外に、この特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員
とする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態にあるものを包含
するものとする。

本発明によるＤＮＡ鎖を「ポリペプチドをコードする塩
基配列を有する」と規定した所以である。

本発明によるＤＮＡ鎖の存在形態のうち代表的なものは
、このＤＮＡ鎖を構成ハの一部とするプラスミドの形態
ならびにプラスミドとしであるいはゲノムに挿入された
形で微生物、特に大腸菌、酵母菌および酢酸菌、中に存
在する形態である。

本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい存在形態は、α−ＡＬ
ＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子が微生物中で安定に発現しつるよ
うに外来遺伝子としての本発明のＤＮＡ鎖とプロモータ
ーおよびターミネータ−とが一体に結合して、これがプ
ラスミドとしであるいはゲノムに挿入された形態で微生
物中に存在するものである。プロモーターおよびターミ
ネータ−としては、公知のものを適宜組合わせて用いる
ことができる。

この遺伝子がコードするポリペプチド 上記のように、本発明によるＤＮＡ鎖は、これがコード
するポリペプチドのアミノ酸配列によって特定されてい
る。このポリペプチドは、α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性
を有していてアミノ酸配列が実質的に第１図に示されて
いるアミノ酸配列のうちＡからＢまでのものである。こ
こで、「アミノ酸配列が実質的に第１図に示されている
アミノ酸配列のうちＡからＢまでのもの」ということは
、このペプチドがα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を有する
限りアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加等が
あってもよいことを示すものである。

本発明でのα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を有する典型的
なポリペプチドは第１図のアミノ酸配列のうちＡ−Ｂの
ものであって、２３５個のアミノ酸からなるものであり
、従来そのアミノ酸配列は知られていなかったものであ
る。

本発明で「アミノ酸配列が実質的に第１図に示されてい
るアミノ酸配列のうちＡからＢまでのもの」ということ
がアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加等があ
ってもよいことを示すものであることは前記したところ
であるが、そのようなアミノ酸に関して変化の生じてい
るペプチドの一例は、第１図に示されているアミノ酸配
列のＡ点の上流に６９個のアミノ酸残基（第１図の２１
２番目から４１８番目までの塩基に対応するアミノ酸）
が結合したアミノ酸配列のもの（アミノ酸敗３０４個）
、すなわち第１図のＡ１からＢまでのもの、である。こ
のペプチドは、アミノ酸配列がＡ−Ｈのもののα−ＡＬ
ＤＣａｓ　ｅ活性の１／１０程度ではあるけれども α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を持つものだからである。

同様に、第１図のアミノ酸配列のＡ２〜Ｂ　−Ａ　３〜
Ｂ、Ａ　　−ＢＳＡ５〜ＢおよびＡ６〜Ｂに対応するペ
プチド（たりし、Ａ　　−Ｂ、Ａ５〜ＢおよびＡ６〜Ｂ
に対応するペプチドは、Ｎ末端がＶａｌからＭｅｔに変
ったものである）も、後記実施例に示すようにα−ＡＬ
ＤＣａｓ　ｅ活性を持つものであるので、本発明でいう
ペプチドの範鴫に入るものである。

本発明は基本的にはＤＮＡ鎖に関するものであるところ
、上記のようにアミノ酸の付加がＡ−Ｂのアミノ酸配列
の外側に生じているペプチドが本発明でいうペプチドで
あるということは、そのようなペプチドをコードする塩
基配列のＤＮＡ鎖も本発明のＤＮＡ鎖の箱鳴に入るとい
うことを示すものである。そのようなＡ−Ｂより長いペ
プチドをコードする塩基配列は、Ａ−Ｈのペプチドをコ
ードする塩基配列を「有する」ものだからである。

ＤＮＡ鎖の塩基配列 ａ−ＡＬＤＣａｓｅをコードするＤＮＡ鎖は、第１図の
Ａ〜Ｂの塩基配列を持つものまたはその縮重異性体なら
びに上記のようなα− ＡＬＤＣａｓｅのアミノ酸配列の変化に対応する塩基配
列を持つものまたはその縮重異性体、である。ここで「
縮重異性体」とは、縮重コードンにおいてのみ異なって
いて同一のポリペプチドをコードすることのできるＤ　
Ｎ　Ａ　ｊ、ｎを意味する。たとえば第１図のＡ−Ｂの
塩基配列をもつＤＮＡ鎖に対して、そのアミノ酸のどれ
かに対応するコードンたとえばＣ−末端のＧｌｙに対応
するコードン（ＧＧＣ）が、これと縮重関係にあるたと
えばＧＧＴに変ったものを本発明では縮重異性体と呼ぶ
ものとする。

本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具体例は、３′　−側
末端に接して停止コードンを少なくとも１個（例えばＴ
ＧＡ）をもつものである。

さらに本発明のＤＮＡ鎖の５′　−側上流および（また
は）３′　−側下流には、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖
（３′　−側下流の最初の部分は、ＴＧＡのような停止
コードンであることがふつうである）がある長さで続い
ていてもよい。

なお、第１図に示したＤＮＡ鎖の塩基配列は、アセトバ
クター・アセチ・サブスピーシーズ・キシリナムＩＦ０
　３２８８より取得したα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅをコー
ドする遺伝子について、ダイデオキシ法によって決定し
たものである。

ＤＮＡ鎖の取得 上記のα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅのアミノ酸配列をコード
する塩基配列を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの手段は
、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも一部を
化学合成することである。

しかし、実験操作上は、この化学合成法よりも、アセト
バクター・アセチ・サブスピーシーズ・キシリナムＩＦ
０　３２８８の染色体遺伝子ライブラリーから遺伝子工
学の分野で慣用されている方法例えば適当なプローブに
よるハイブリダイゼーション法により取得する方が好ま
しいといえる。

なお、本発明者らはアセトバクター・アセチ・サブスピ
ーシーズ・キシリナムＩＦＯ３２８８のα−ＡＬＤＣａ
　ｓ　ｅをコードする塩基配列およびアミノ酸配列が未
知であったため、ショットガン法を用いて前記の遺伝子
ライブラリーより本発明のＤＮＡ鎖を取得した（詳細後
記実施例参照）。

α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ産生能を有する酵母上記のよう
にして取得される本発明ＤＮＡ鎖はα−ＡＬＤＣａ　ｓ
　ｅをつくるための遺伝情報を含んでいるので、これを
生物工学的手法により、般に酒類の醸造用酵母として使
用されている酵母（サツカロマイセス番セレビシェ）に
導入してこれを形質転換させれば、α−ＡＬＤＣａｓｅ
産生能を有する従ってα−ＡＬ産生能の抑制された醸造
用酵母を得ることができる。

酵母 本発明における形質転換の対象となる酵母は、「ザ・イ
ースツ・ア・タフソノ−ミック・スタデイＪ　　（Ｔｈ
ｅ　ｙｅａｓｔｓ、　ａ　ｔａｘｏｎｏｍｉｅ　５ｔｕ
ｄｙ、）　３ｒｄ　Ｅｄ。

（Ｙａｒｒｏｗ、　Ｄ、、　ｅｄ、　ｂｙ　Ｎ、Ｊ、讐
、　Ｋｒｅｇｅｒ−Ｖａｎ　Ｒｌｊ。

Ｅｌｓｅｖｌｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅ
ｒｓ　Ｂ、Ｖ、、　ＡＩＩｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）
　、ｐ３７９）記載のサッカロマイセス・セレビシエに
属する酵母およびそのシノニムないし変異株であるが、
本発明の目的からすれば、サツカロマイセス拳セレビシ
ェに属する酒類の醸造用酵母、具体的にはビール酵母、
ワイン酵母、清酒酵母等が好ましい。具体的には、たと
えば、ワイン酵母：ＡＴＣＣ３８６３７、ＡＴＣＣ ３８６３８、ＩＦＯ２２６０（ワイン酵母０Ｃ２）、ビ
ール酵母：ＡＴＣＣ２６２９２、ＡＴＣＣ２７０４、Ａ
ＴＣＣ３２６３４、清酒酵母：ＡＴＣＣ４１３４、ＡＴ
ＣＣ ２６４２１、ＩＦＯ２３４７（清酒酵母協会７号）があ
る。

なお、これらの醸造用酵母の性質についてさらに付言す
るならば、これらは長年にわたって醸造に適する形質、
すなわち醸造原料液を効率よく発酵すること、香味の良
い酒類をつ（ること、遺伝学的形質が安定していること
等を指標として選抜、純粋培養が重ねられてきた結果、
たとえばビール酵母では遺伝学的には交雑・分離が極め
て起こり難い高次倍数体となっており、生胞子形成能は
殆んど完全に失われている。因みに、実用ビール酵母に
ついてみるならば、麦汁中の糖成分であるマルトース、
マルトトリオースの資化能が高まっている一方、クリス
タルバイオレット感受性である等、！ｖＦ生味を失って
いる。

形質転換 形質転換体の作成のための手順ないし方法そのものは、
分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において
慣用されているものでありうるので、本発明においても
下記したところ以外のものについてはこれら慣用技術に
準じて実施すればよい。

酵母中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現させるためには
、まず酵母中で安定に存在するプラスミドベクター中に
この遺伝子をつなぎかえる必要がある。この際に用いら
れるプラスミドベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系
、ＹＣｐ系、Ｙｌｐ系等種々知られているものすべてを
用いることができる。これらのプラスミドベクターは、
文献上公知であるばかりでなく、容易に作成することが
できるものである。

一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を酵母中で発現させるた
めには、それが有する遺伝情報を転写・翻訳させる必要
がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニット
にあたる、プロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′　−側
上流に、ターミネータ−を３′　−側下流に、それぞれ
組み込めばよい。

このプロモーターおよびターミネータ−としては、すで
にＡＤＨ，ＧＡＰＤＨ（別名、ＧＰＤ）、ＰＨＯ，ＧＡ
Ｌ、ＰＧＫ、ＥＮＯＳＴＲＰ。

ＨＩＰ等のものが知られており、本発明でもこれらのい
ずれをも利用することができる。これらは文献上公知で
あるばかりでなく、容易に作成することができるもので
ある。

本発明によって得られるべき形質転換体を選択するため
のマーカーとしては、０４１８、ハイグロマイシンＢ１
メソトレキセートとスルファニルアミドとの組合せ、ツ
ニカマイシン、エチオニン、コンパクチン、銅イオンな
どに対する耐性遺伝子を用いることができる。

本発明のＤＮＡ鎖をより安定的に酵母に保持させるため
に、これを酵母のゲノムに挿入することもできる。この
場合には、プラスミドベクターに組み込まれた本発明Ｄ
ＮＡ鎖のゲノムＤＮＡへの挿入を容品にするために別途
このプラスミドベクターにゲノムＤＮＡと高い相同性を
有するＤＮＡを導入しておくことが望ましいところ、こ
のためのＤＮＡとしてはｒＲＮＡ遺伝子、ＨＯ遺伝子等
を用いることができる。

このうち、ｒＲＮＡ遺伝子は、１倍体酵母ゲノム中に約
１４０囲繞列に反復していることが明らかにされている
（ジャーナル・オブφモレキュラーーバイオロジー、４
０．２６１−２７７（１９６９））。この特徴により、
この配列を組み換えのターゲット配列として利用した場
合は、他の遺伝子配列を利用した場合と比較して以下の
様な利点がある。

（１）形質転換頻度が上昇することが期待される。

（２）組み込みによるターゲット配列の対応形質の変化
は無視できると考えられる。（３）プラスミドの組み込
み、ベクター配列の削除という一連の操作のくり返しで
、外来遺伝子を複数個ゲノム中へ組み込むことが可能と
なる。

また、本発明において酵母の形質転換に使用し得るＤＮ
Ａ鎖は、それがコードするポリペプチドが、α−ＡＬＤ
Ｃａｓｅ活性を有する限りにおいては、第１図に示され
ているＡ−Ｈのポリペプチドと異なるポリペプチドをコ
ードするものであってもよいことは前記したところであ
る。

このようにしてつくったプラスミドによる酵母の形質転
換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されてい
る合目的的な任意の方法、例えばスフェロプラスト法〔
プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−會
オブ争すイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｌ
、ＵＳＡ）、７５．１９２９（１９７８）　）　、リチ
ウムアセテート法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
−（Ｊ、Ｂａｃｉｃｒｌｏｌ、）、１５３．１６３　　
（１９Ｈ）　）等によって行うことができる。

このようにして得られる本発明の酵母は、本発明ＤＮＡ
鎖によって導入された遺伝情報による新しい形質（すな
わち、α−ＡＬＤＣａｓｅの産生能。その結果、細胞内
のα−ＡＬが分解されて、α−ＡＬの細胞外への漏出量
が低下することになる）および使用ベクター由来の形質
ならびに場合によって生じているかも知れない遺伝子組
換時の一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を除
けば、そのゼノタイブないしフェノタイプにおいて形質
転換前の酵母と同じである。さらに、ＹＩｐ型プラプラ
スミドいて本発明ＤＮＡ鎖を酵母染色体へと導入した後
、不要ベクター配列を削除すれば、得られるビール酵母
は、使用ベクター由来の形質を持たない。

従って、本発明による酵母は、従来の醸造用酵母と本質
的には全く同一の発酵条件で使用することが可能であり
、一方で発酵液中でのα−ＡＬの産生能の抑制が可能で
あるので、結果として発酵液のα−ＡＬ含量が低く、従
ってその処理に要する発酵液の熟成期間を著しく短縮す
ることができることになる。

酒類の製造 上記のような本発明による酵母によって醸造原料を発酵
させれば、上記のような効果を伴なって酒類が製造され
る。

醸造用原料は製造しようとする酒類によって決まること
はいうまでもなく、たとえば、ビールの製造には麦芽汁
が、ワインの製造には果汁、特にブドウ果汁が、使用さ
れる。

酵母の使用態様も、スラリー状の外に、固定化した形態
、その他、合目的的な任意のものでありうる。醸造条件
も、通常の酵母使用の場合と異ならない。

製造される酒類は、使用した酵母が α−ＡＬＤＣａｓ　ｅ産生能を有するものであるのでα
−ＡＬ含量が低く、従ってＤＡ臭の低減された酒類の製
造のためのその処理に要する発酵液の熟成期間を短かく
することができることは前記したところである。

実施例 （１）　ａ　−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子の調製（１）
　α−ＡＬＤＣａｓｅ生産株染色体ＤＮＡの精製 アセトバクターナアセチ中サブスピーシーズ・キシリナ
ム　ＩＦｏ　　３２８８　（財団法人　発酵研究所より
入手〕を１００ｍ１のＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２
％ペプトン、２％グルコース）で−晩通気培養すること
により、０，７ｇの湿菌体を得た。これを３０ｍ１の緩
衝液（５０ｍＭ）リス−ＭＣＩ　　（ｐＨ８，０）　、
５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に懸濁させた。次いで、４００
μｇ　／　ｍｌのリゾチーム（生化学工業製）、１０μ
ｇ　／　ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）で３
７℃で１５分間処理した。これに、７０ｍ１のバッファ
ー（５０ｍＭトリス−ＭＣＩ　　（ｐＨ８，０）　、５
０ｍＭＥＤＴＡ）を加えた。次に、０．５％のドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および５０μｇ　／　ｍｌの
ブロテイナーゼＫ（シグマ社製）で６５℃で３０分間処
理した。次に、フェノール抽出を２回、フェノール：ク
ロロホルム（１；　１）抽出を１回行なった。これをエ
タノール沈殿後、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　）
リス−ＨＣ１（ｐＨ８，０＞、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に
溶かした。次にｉｏｏμｇ／ｍｌのりボヌクレアーゼＡ
で３７℃で１時間処理した後、フェノール抽出とフェノ
ール：クロロホルム（１：　１）抽出を１回ずつ行なっ
た。これをエタノール沈殿した後、２ｍ！のＴＥバッフ
ァーに溶し、１リツトルのＴＥバッファーに対して透析
して、３６０μｇの染色体ＤＮＡを得た。

（１１）　　コスミド・ライブラリーの作製（１）で得
た染色体ＤＮＡ　　１１μｇを制限酵素５ａｕ３ＡＩで
約４０ｋｂになるように部分分解した。これをコスミド
ｐＪＢ８アーム（アマ−ジャム社製）４．２μｇとＴ４
リガーゼにより連結した。このＤＮＡをλＤＮＡ・イン
ビトロ・パッケージング・キット（アマ−ジャム社製）
を用いてインビトロ・パッケージングして大腸菌（Ｒ。

ｃｏｉｌ）ＤＨＩ　（Ｆ　　、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ
ｌ。

ｒｅＬＡ１？、ｅｎｄＡＩ、ｔｈｉ　−１，１１ｓｄＲ
１７，５ｕｐＥ４４、λ　）〔ジャーナル・オブ・モレ
キュラー中バイオロジー（Ｊ、　Ｈｏｔ。

Ｂｉｏｌ、）、１６６．５５７−５８０　（１９８３）
：ＡＴＣＣ３３８４９）に形質導入して、コスミド・ラ
イブラリーを得た。

（１１１）　α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子保持株のスクリ
ニング （１１）で得たコスミド・ライブラリーより、α−ＡＬ
ＤＣａ　ｓ　ｅ活性を示す株を選び出すことによって、
α−ＡＬＤＣａｓ　ｅ遺伝子保持株を得た。

具体的には、コスミド・ライブラリーより６００株を１
株ずつ５０μｇ　／　ｍｌアンピシリンおよび０．　５
％ブドウ糖を含むし一培地に植菌し、３７℃で一夜通気
培養して、それぞれについてα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活
性を測定した。すなわち、集めた菌体を各々３０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，２）に懸濁させ、１０μ
ｌのトルエンを加えて３０秒間激しく撹拌した。この細
胞懸濁液についてα−ＡＬＤＣａｓ　ｅ活性をゴットフ
レドセン（Ｇｏｄｒｒｅｄｓｅｎ）らの方法〔カールス
バーグ・リサーチ・コミュニケーション（Ｃａｒｌｓｂ
ｅｒｇ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏ５５ｕｎ、）　、　４７．９３（１９８
２））に従って、測定した。この結果、２株のα−ＡＬ
ＤＣａ　ｓ　ｅ活性保持法を得た。得られたクローンの
プラスミドをそれぞれｐＡＸｌおよびｐＡＸ２と命名し
た。

（Ｉｖ）　　ａ−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子ＤＮＡ塩基配列
決定 第３図に概略を示す方法でα−ＡＬＤＣａｓ　ｅ遺伝子
のサブクローニングを行なった。まず、ｐＡＸｌを５ａ
ｕ３ＡＩで部分分解して得られる５ａｕ３ＡＩ断片を、
ｐＵｃ１２　（ファルマシア社製）のＢａｍＨＩ切断点
に挿入した。このようにして得られたプラスミドの中に
、大腸菌中でα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を示すものが
見出され、これには３．６ｋｂの染色体ＤＮＡ断片が含
まれていた（このプラスミドをｐＡＸＳｌ　１と命名し
た。）、ｐＡＸｓｌｌからＫ　ｐ　ｎ　Ｉと５ａｃｌに
よる切断によって切り出される約１２６０ｂｐの断片を
プラスミドｐＵｃ１９　Ｃ宝酒造社製）のＫｐｎｌ切断
点とＳａｃ　Ｉ切断点の間に挿入して、プラスミド（ｐ
ＡＸ６と命名した）を作製した。

ｐＡＸ６をもつ大腸菌はａ−ＡＬＡＤＣａｓｅ活性を示
した。

ｐＡＸ６に含まれるＫｐｎＩ−３ａｕ３Ａ！断片につい
て、ダイデオキシ法〔プロシーディングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステー′ソ・オブ・アメリカＰｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ。

７４．５４８３　（１９７７）　）によりＤＮＡ塩基配
列を決定した（第１図の１番目の塩基から１２５２番目
の塩基まで）。これを解析した結果、アミノ酸３０４個
、分子ｍ３３７４７の蛋白質をコードすることが可能な
９１２ｂｐのオーブンリーディングフレームが存在した
。

（２）α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子の酵母への尋人（
その１） （１）ＧＰＤプロモーターの取得 サツカロマイセス瞭セレビシェ　５２８８Ｃ〔（α、５
ＬＩＯ２、ｍ　ａ　１　ｓ　ｇ　ａ　ｌ　２、ＣＵＰＩ
）：バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ（Ｂ　Ｉｏｃｌ＋ｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　ＣｏｍＩＩｕｎ、　）　
ｓ　５０．１１１１Ｂ（１９７３）　　：ＡＴＣＣ２６
１０８］より、常法に従って染色体ＤＮＡを調製した。

このＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩを用いて約１０ｋｂ
の大きさの断片を多く生じるような条件のもとに部分分
解した後、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）の制
限酵素ＢａｍＨＩ切断点に挿入してライブラリーを作成
した。

ＧＰＤ遺伝子〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｎ＋、）　、２
５４．９８３９（１９７９））のコーディング領域の７
番目から３６番目の塩基に対応する合成オリゴマーを３
２Ｐで末端標識し、これをプローブとしてライブラリー
よりＧＰＤ遺伝子を含むクローンを得た。このクローン
から得られるプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、約２．１ｋｂのＢｉｎｄ■断片をとり、プ
ラスミドｐＵｃ１８　（ファルマシア社製）のＨｉｎｄ
ＩＩＩ切断点に挿入してプラスミドｐＧＰＤ１８１を作
製した。その後、第４図に概略を示す方法に従って、Ｇ
ＰＤプロモータ（Ｓａ　ｌ　Ｉ−ＢｇｌＩＩ）を取得し
た。まず、ｐＧＰＤ１８１を制限酵素Ｈｉｎｄｍ及びＸ
ｂａＩで切断して、ＧＰＤ遺伝子のプロモータ一部分（
第４図中で斜線で示される）とコーディング領域の一部
を含む）ｉｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌ断片を得た。

この断片のＨｉｎｄｍ末端に下記の塩基配列をもつ合成
二重鎖ＤＮＡを付加した。この合成二重鎖ＤＮＡにはＰ
ｓｔｌと５ｐｈｌの切断点及び５ａｌＩとＨｉｎｄＩＩ
［の接着末端が含まれている。

ＧＧＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＴＴＣＧＡこの合成二重鎖
ＤＮＡの付加によってＨｉｎｄ■末端を５ａｌｌ末端に
変換することができた。

次に、この断片をｐＵｃ１９の５ａｉｌ切断点とＸｂａ
ｌ切断点の間に挿入した。このようにして得たプラスミ
ドｐａｐ１をＸｂａｌで切断した後、Ｂａ１３１ヌクレ
アーゼ処理を行なうことにより完全にコーティング領域
を欠失させた後、フレノウフラグメント（宝酒造社製）
を用いて平滑末端とした。この平滑末端に下記の塩基配
列をもつ合成二重鎖ＤＮＡを付加した（この合成二重鎖
ＤＮＡは一方の末端にＢｇｌＩＩの接着末端をもつ。）
。

ＧＴＴＣＧＡＣＣＣＧＴＣＴＡＧ この合成二重鎖ＤＮＡの付加により、平滑末端を８ｇｌ
ｎ末端に変換することができた。この後、５ａｌｌで切
断することにより得られるＧＰＤプロモーターを含むＳ
ａｌＩ−Ｂｇｌｎ断片を、ＧＰＤプロモーター（Ｓａｉ
ｌ−ＢｇｌＩＩ）と呼ぶことにした。

（ｉｆ）　　ＰＧＫターミネータ−の取得ＰＧＫ遺伝子
〔ヌクレイツク・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、　）、ｌ０５７７９１（１９８２）
）を、実施例（２）　−（１）で作製したライブラリー
より、実施例（２）−（１）と同様の手法を用いてクロ
ーニングした。プローブとしては、ＰＧＫＪ伝子のコー
ディング領域の１番目から２８番目の塩基に対応する合
成オリゴヌクレオチドを３２Ｐで末端標識したものを用
いた。このクローンから得られたプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＰＧＫ遺伝子を含む
２．９ｋｂの断片を得た。この断片を更に制限酵素Ｂｇ
ｌｎで切断して、ＰＧＫ遺伝子のターミネータ一部分と
コーディング領域の一部を含む３７５ｂｐのＢｇｌＩＩ
Ｈｉｎｄｍ断片を得た。この断片から第５図に概略を示
した方法に従ってＰＧＫターミネータ−を作成した。ま
ずこの断片のＢｇｌ■末端に下記の塩基配列をもつ合成
二重鎖ＤＮＡを付加した。この合成二重鎖ＤＮＡはＳｍ
ａ　Ｉ切断部位及び５ａｃＩとＢｇｌＩＩの接着末端を
含んでいる。

ＴＣＧＡＧＣＧＧＧＣＣＣＣＴＡＧ その後、このＳａｃ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩｒ断片をｐＵｃ
１２のＨｉｎｄＩ［Ｉ切断点とＳａｃ　Ｉ切断点の間に
挿入して、プラスミドｐＰＧ１を作成した。

次に、ｐＰＧｌをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、クレノウ′
フラグメントで処理して平滑末端とした。この平滑末端
に下記の塩基配列をもつ合成二重鎖ＤＮＡを付加した。

この合成二重鎖ＤＮＡは５ａｉｌの接着末端を含んでい
る。

ＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴ 付加後に再結合することにより、プラスミドｐＰＧ２を
作製した。５ａｃｌと Ｓ、ａｌｌ切断により、ｐＰＧ２からターミネータ一部
分を含む５ａｃｌ−ＳａｌＩ断片を得ることができる。

この断片を、ＰＧＫターミネータ−（Ｓａｃｌ−Ｓａｌ
ｌ）と呼ぶことにした。

（１１１）発現プラスミドの作成及び酵母への導入第６
図に概略を示す方法に従って、 α−ＡＬＤＣａｓ　ｅ遺伝子を酵母中で発現させるプラ
スミドｐＡＸ４３を作成した。まず実施例（１）　−（
ＩＶ）で作製したプラスミドｐＡＸ６をＫｐｎＩとＳａ
ｃ　Ｉで切断し、 ａ−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を含む約１２６０ｂｐのＫｐ
ｎＩ−ＳａｃＩ断片を得た。この断片を制限酵素Ｒｓ　
ａ　Ｉで部分分解することにより、第１図に示したα−
ＡＬＤＣａｓ　ｅ遺伝子を含む１．０２ｋｂのＲｓａｌ
−８ａｃＩ断片を得た。

これをプラスミドｐＵｃ１２　（ファルマシア社製）の
制限酵素Ｓｍａ　Ｉ切断点と制限酵素Ｓａｃ　Ｉ切断点
との間に挿入して、プラスミドｐＡＸ３１を作製した。

このプラスミドを制限酵素５ａｃｌ及びＢａｍＨＩで切
断することにより、前述したａ−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子
を含むＢａｍＨｌ−Ｓａｃｌ断片（第１図に示されてい
る塩基配列のうち２４３番目から１２５２２５２番目び
ベクターの一部の配列を持つ）を得た。この断片及び＜
２）　−（１）で得たＧＰＤプロモーター（ＳａｌＩ−
ＢｇｌＩＩ）及び（２）　−（１１）で得たＰＧＫター
ミネータ−（Ｓａｃｌ−８ａｌＩ）の三つの断片を、プ
ラスミドＹＥｐｌＢＫ　（詳細後記〕の制限酵素Ｘｈｏ
ｌ切断点と制限酵素５ａｉｌ切断点の間に挿入して、発
現プラスミドｐＡＸ４Ｂを作製した（第２図）。このプ
ラスミドｐＡＸ４３をリチウムアセテート法〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｌｏ
ｌ、）、１５３．１６３（１９８３）　〕によって酵母
〔サツカロミセス・セレビシェ３２８８Ｃの変異株であ
るＴ　Ｄ　４　（ａ　ｓ　　ｈｉｓｓｕｒａ　％　ｔｃ
ｕ　５ｔｒｐ　）株〕に導入した。このようにして得た
ｐＡＸ４３を含むＴＤ４株をＹＡＬ２と呼ぶこととする
。

前記のプラスミドＹＥ　Ｅ）　１３には、酵母内で復製
可能なプラスミドＹＥｐ１３（ジーン（Ｇｅｎｅ）、８
．１２１　（１９７９）　：　ＡＴ　ＣＣ３７１１５）
を基本的に用いて、以下の手順で作成したものである。

まず、ＹＥｐ１３のＬＥＵ２遺伝子の両端にあるＳａ　
Ｉ　ｌ−５ａｃ　！断片及びＸｈｏｌＳｍａ　Ｉ断片を
欠失させた。これにより、当プラスミドは制限酵素Ｘｈ
ｏ　Ｌ　Ｓａｃ　Ｌ　Ｓｍａ　１およびＢｇｌｎによる
切断部位をもたず、制限酵素５ａｌｌによる切断部位を
ただ１箇所もつものとなった。次に、このプラスミド中
の ｐＢＲ３２２由来の制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ切断点と、
２μｍＤＮＡ由来の制限酵素Ｈｉｎｄｍ切断点との間に
合成オリゴヌクレオチド４１ｍｅｒを挿入した。この合
成オリゴヌクレオチドは、制限酵素５ａｃＩ、Ｓｍａｌ
、Ｂｇｌ■およびＸｈｏＩ切断点をもち、また下記の塩
基配列をもつ。本発明では、このプラスミドを、ＹＥｐ
１３にと命名した。

（ｐＡＸ４３を含むＴＤ４株）をそれぞれ選択培地〔０
，７％アミノ酸酸不含イーストニトロシンベースＤＩＦ
ＣＯ社製）、２％グルコース、２０ＩＩ１ｇ／Ｄヒスチ
ジン、２０ｍｇ／ｌ）リプトファン、２０ＩＩ１ｇ／Ｒ
ウラシル〕で一夜培養した後、α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ
活性を測定した。結果は下表に示す通りであった。

酵母のα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性は、菌体をグラスビ
ーズを用いて粉砕したものを酵素液としてゴットフレド
セン（Ｇｏｄ　ｒ　ｒｅｄｓｅｎ）らの方法を用いてΔ
ＰＩ定した。活性のＩＵは、１時間当り１μｍｏｌｅの
アセトインを生成する酵素量を示す。また、酵素液のタ
ンパク量は、Ｐｒｏｔｅｌｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｂ
ｌｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。

下の表の酵母のα−ＡＬＤＣａｓ　ｅ活性の測定結果で
は、活性を酵素液中のタンパク量当りのユニット数（Ｕ
／装ｇタンパク）で表示しである。

現 ＹＥｐ１３Ｋを含むＴＤＪ株及びＹＡＬ２酵母のα−Ａ
ＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性の測定結果（その２） （１）ＡＤＨＩプロモーターの取得 実施例（２）−（１）で作製したライブラリーより、Ａ
ＤＨＩ遺伝子〔ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミ
ストリー（Ｊ、　Ｂ、　Ｃ）　２５７．３０１ｇ（１９
８２））のコーディング領域の７番目から３６岳目の塩
基に対応する合成オリゴマーを３２Ｐで末端標識したも
のをプローブとして、ＡＤＨＩ遺伝子を含むクローンを
得た。このクローンから得られたプラスミドＤＮＡを制
限酵素５ａｕ３ＡＩで部分分解して、ＡＤＨ１遺伝子の
プロモーター及びコーディング領域の一部を含む１．５
ＫｂのＤＮＡ断片を得た。

この断片をプラスミドｐＵｃ１８（ファルマシア社製）
の制限酵素ＢａｍＨＩ切断点の間に挿入し、得られたプ
ラスミドをｐＡＤＨ８１と命名した。ｐＵｃ１８のＢａ
ｍＨＩによる切断点は、制限酵素Ｘｂａｌによる切断点
と制限酵素Ｓｍａ　Ｉによる切断点との間に位置してい
るので、ＢａｍＨＩ切断点に挿入したＤＮＡ断片を、Ｘ
ｂａｌ及びＳｍａ　Ｉによる切断によって再度分離する
ことができる。

ｐＡＤＨｓｌをＸｂａｌによって切断した後、エンドヌ
クレアーゼＢａ１３１で処理し、ＡＤＨ１遺伝子のコー
ディング領域を完全に欠失させた後、ＨｉｎｄＩＩ［リ
ンカ−（宝酒造社製）を付加した。次にこれをＳｍａ　
Ｉで切断した後、ＢａｍＨＩリンカ−を付加した。この
ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍ断片をＡＤＨＩプロモーターと
して用いた。

ＡＤＨ１プロモーターをプラスミド ＹＥｐ１３にの制限酵素ＢａｍＨＩ切断点と制限酵素Ｈ
ｉｎｄ■切断点の間に挿入してプラスミドｐＹＡＤＨを
作製した。

（Ｉｆ）　　ａ−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子の発現プラ
スミドｐＡＸ６を制限酵素ＸｂａＩで切断した後、フレ
ノウフラグメントで処理して平滑末端とし、次に８ｇ１
ｍリンカ−（宝酒造社製）を付加し、再度連結してプラ
スミドｐＡＸ６８ｇを作製した。ｐＡＸ６８ｇからα−
ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を含むＨａｅｍ−ＢｇｌＩＩ断片
（第１図に示されている塩基配列のうち１８０番口から
１２５２番目まで及びベクターの一部を含む）を得た（
以降断片１と呼ぶ）。

また、実施例（２）−（ｌｉｔ）で得たＲｓａｌ−３ａ
ｃｌ断片の５ａｃｌ末端をフレノウフラグメントで処理
して平滑末端に変えた後、８ｇｌｎリンカ−を付加した
。このＲｓａＩ−ＢｇｌＩ［断片（第１図に示された塩
基配列のうち２４３番口から１２５２番目まで及びベク
ターの一部を含む）を断片２と呼ぶことにする。またｐ
ＡＸ６８ｇからα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子の一部を
含むＨｉｎｄＩ［［−Ｂｇｌｌｌ断片（第１図に示され
た塩基配列のうち３４５番目から１２５２番目まで及び
ベクターの一部を含む）を得た（以後断片３と呼ぶ）。

プラスミドｐＹＡＤＨを制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［で切断
後、フレノウフラグメントを用いて平滑末端とし、次い
で制限酵素Ｂｇ１ｍで切断した。この断片と前述した断
片１あるいは断片２を連結し、それぞれプラスミドｐＡ
Ｘ３９　（断片１の場合）、ｐＡＸ４０　（断片２の場
合）を作製した。またｐＹＡＤＩ（の制限酵素Ｈｉｎｄ
Ｉｎ切断点とＢｇ１ｍ切断点の間に断片３を挿入してプ
ラスミドｐＡＸ４１を作製した。

プラスミドｐＡＸ３９、ｐＡＸ４０、 ｐＡＸ４１は、それぞれ断片１、断片２、断片３にコー
ドされるポリペプチドをＡＤＨ１プロモーターを用いて
酵母中で産生させることができる。

プラスミドｐＡＸ３９、ｐＡＸ４０Ｓ　ｐＡＸ４１をそ
れぞれＴＤＪ株に形質転換し、得られた形質転換体のα
−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を測定した。結果を下表に示
した。

ａ−ＡＬＤＣａｓｅ活性の比較 断片２がコードするポリペプチドは第１図のＡ２からＢ
までで示されたポリペプチドである。

断片１がコードするポリペプチドは第１図のＡ１からＢ
までのポリペプチドである。

なお、断片３の発現により得られるポリペプチドには、
α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性が確認できなかった。これ
は、断片３を発現させた場合には、第１図の３５２番口
から３７２番目までの塩基配列に対応するアミノ酸から
なる短かいペプチドが産生されると推測されるところ（
３５２〜３５４番目のＡＴＧが翻訳開始コードンとなり
、３７３〜３７５番目のＴＧＡが終始コードンになると
推測される）、これはα−ＡＬＤＣａｓｅとは全く異な
るペプチドであるために、α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示
さなかったと考えられた。

（４）α−ＡＬＤＣａｓ　ｅ遺伝子の酵母への導入（そ
の３） アミノ酸配列が第１図のＡからＢまでのものであるα−
ＡＬＤＣａｓｅポリペプチドにいくつかのアミノ酸を付
加したポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖の発現 Ｏ）概要 第１図に示された塩基配列を詳細に調べると、アミノ酸
配列がＡからＢまでのものであるα−ＡＬＤＣａ　ｓ　
ｅポリペプチドをコードする塩基配列の上流には、同じ
リーディングフレームに、翻訳開始点となりうるＡＴＧ
もしくはＧＴＧがいくつか存在する。それらは第１図に
おいて、下線と番号１〜７で示されるものである。これ
らのＡＴＧあるいはＧＴＧのうちのいずれかを選び、そ
の位置からタンパク質への翻訳を開始させるような操作
を施こした後、酵母中で発現させることにより、アミノ
酸配列が第１図のＡからＢまでのものであるα−ＡＬＤ
Ｃａ　ｓ　ｅポリペプチドのＮ末端に、いくつかのアミ
ノ酸を付加した型のポリペプチドを酵母中で産生させる
ことができる。ただし、ＧＴＧを選んだ場合にはＧＴＧ
が酵母中では翻訳開始のコードンとして認識されないた
めに、これをＡＴＧに変換する必要がある。どのＡＴＧ
あるいはＧＴＧを選ぶかによって付加されるアミノ酸の
数は変化する。以下の（１１）　−（Ｖ）に示す方法に
より、これらのアミノ酸付加型の α−ＡＬＤＣａｓｅポリペプチドを産生させ、それらが
α−ＡＬＤＣａｓ　ｅ活性を有することを示した。

（１１）部位特異的突然変異法によるｐＡＸ６への新た
な制限酵素切断部位の導入（ｐＡＬＤｃ１〜５の作製） 第１表に示すオリゴヌクレオチドＡ−Ｅを合成した。

第１表には５組の塩基配列が示されており、各組におい
て下段が合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列である
。上段はこれらのオリゴヌクレオチドを用いて変異が導
入されるｐＡＸ６の部位の配列、すなわち変異前の塩基
配列であり、第１図に示された下線部１〜５のいずれか
を含んでいる。

オリゴヌクレオチドの塩基配列（下段）は変異後に得ら
れる変化した塩基配列と同じであり、変化した塩基は上
部に黒点（・）を付して示した。変異により、第１図の
下線部１〜５の直前に、新らしくＤｒａ　Ｉ切断部位が
生じる。また、下線部がＧＴＧである場合には、ＡＴＧ
に変換される。これらのオリゴヌクレオチドを用いたｐ
ＡＸ６への変異導入は、第７図に概略を示した部位特異
的突然変異法（Ｍｏｒｌｎａｇａ、Ｙ、　ｅｔ　ａｔ、
、　Ｂｌｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

２　６３Ｂ−６３９（１９８４）　’）に従って行なっ
た。得られた変異型のプラスミドの名及びこれらの変異
型から作られる発現プラスミド（詳細は（１ｖ）で述べ
る）の名は第１表に示した。変異型プラスミドは、Ｄｒ
ａ　ＩとＳａｃ　Ｉで切断することによって、α−ＡＬ
ＤＣａｓｅ遺伝子を含むＤｒａＩ−Ｓａｃ　Ｉ断片が得
られる。

（ＩＩＩ）合成二重鎖ＤＮＡを用いたｐＡＸ６への新た
な制限酵素切断部位の導入（ｐＡＬＤＣ６，７の作成） 第２表に示す合成二重鎖ＤＮＡ　　ＦおよびＧを合成し
た。

これらの合成りＮＡは第１図に示した下線部６または下
線部７のいずれかから、その下流にあるＮｃｏｌ切断部
位までの塩基配列を有しており、なおかつ下線部６また
は下線部７の直前にＤｒａ　ＩとＨｉｎｄｍの切断部位
を有している。

ｐＡＸ６をＨｉｎｄＩ［ＩとＮｃｏｌで切断し、ｐＵｃ
１９由来のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位からａ−ＡＬＤＣａ
ｓｅ遺伝中にあるＮＣ０Ｉ切断部位までの断片を除去し
た後に、合成りＮＡ　　ＦまたはＧを挿入してそれぞれ
プラスミドｐＡＬＤＣ６、ｐＡＬＤＣ７を作製した。ｐ
ＡＬＤＣ６、ｐＡＬＤＣ・７から、Ｄｒａｌと５ａｃＩ
の切断により、それぞれα−ＡＬＤＣａｓｅｌ伝子を含
むＤｒａｌ−ＳａｃＩ断片が得られる。

（Ｉｖ）　　Ｇ　Ｐ　Ｄプロモーターの取得第８図に概
略を示した方法に従ってＧＰＤプロモーター（ＢａｍＨ
Ｉ−Ｈｉｎｄｍ）を取得した。

まず実施例（２）−（１）で作製したｐＧＰＤ１８１を
Ｘｂａｌで切断し、Ｂａ　１３１ヌクレアーゼで処理し
てコーディング領域を完全に欠失させた後フレノウフラ
グメントを用いて平滑末端とした。

この平滑末端にＨｉｎｄＩ［［リンカ−（宝酒造社製）
を付加した後、ＨｉｎｄＩ［［で切断することにより、
プロモーター領域を含むＨｉｎｄＩ［［断片を得た。

この断片をｐＵｃ１８のＨｉｎｄｌｌｌ切断点に挿入し
た。このようにして得られるプラスミドではＢｉｎｄｍ
断片の挿入方向が２通りあるが、そのうちＧＰＤプロモ
ーターの上流にｐＵｃ１８のマルチプルクローニング部
位が位置するものをｐｓＴ１８と呼ぶことにした。ｐｓ
Ｔ１８をＨｉｎｄＩＩＩで部分分解し、フレノウフラグ
メントで処理した後、再び結合させた。このようにして
得られるプラスミドのうち、ＧＰＤプロモーターの上流
にあるＨｉｎｄＩ［Ｉ切断点のみがつぶされたものを、
プラスミドｐｓ７１８Ｈと呼ぶことにした。ｐｓＴ１８
ＨをＢａｍＨＩとＨｉｎｄｍで切断して得られるＧＰＤ
プロモーターを含むＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片を
、ＧＰＤプロモーター（ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍ）と呼
ぶことにした。

（ｖ）ＰＧＫターミネータ−の取得 第９図に概略を示した方法に従ってＰＧＫターミネータ
−（Ｈｉｎｄｍ−Ｓａｉｌ）を取得した。

まず、実施例（２）−（ｌｉ）で作製したｐＰＧ２のＥ
ｃｏＲＩ切断点とＳａｃ　Ｉ切断点の間に下記の塩基配
列をもつ合成二重鎖ＤＮＡを挿入して、プラスミドｐＰ
Ｇ３を作成した。この合成二重鎖ＤＮＡはＨｉｎｄＩＩ
Ｉとｓｐｈ　１の切断点をもち、両端にはそれぞれＥｃ
ｏＲＩと５ａｃｌの接着末端をもつ。

ＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＡＣＧＣ ｐＰＧ３より、ＨｉｎｄｎＩと５ａｉｌの切断によって
切り出されるｐＧＫターミネータ一部分を含むＨｉｎｄ
ｎ［−８ａｉｌ断片をＰＧＫターミネータ−（Ｈｉｎｄ
ｍ−Ｓａｉｌ）と呼ぶことにした。

（ｖｌ）　　発現プラスミドの作製 作製法の概略を第１０図に示した。

まず、実施例（４）　−（１ｖ）で得たＧＰＤプロモー
ター（ＢａｍＨＩ−Ｈｉ　ｎｄｍ）と実施例（４）−（
Ｖ）で得たＰＧＫターミネータ−（Ｈｉｎｄｍ−３ａ　
Ｉ　Ｉ）を実施例（２）−（１１１）で作成したプラス
ミドＹＥｐ１３にのＢｇｌＩＩ切断点と５ａｌＩ切断点
の間に挿入して、プラスミドｐｓＹ１１４Ｐを作製した
。

ｐｓＹ１１４Ｐは、Ｈｉｎｄｍ切断点と５ａｃｌ切断点
の間に一定の方向で挿入された遺伝子を、ＧＰＤプロモ
ーターとＰＧＫターミネータ−を用いて、酵母中で発現
させることができる。実施例（４）−（１１）で得たｐ
ＡＬＤＣｌ、ｐＡＬＤＣ２、ｐＡＬＤＣ３、ｐＡＬＤＣ
４、ｐＡＬＤＣ５のそれぞれから、α−ＡＬＤＣａ　ｓ
　ｅ遺伝子を含む５種類のＤｒａｌ−８ａｃＩ断片を切
り出した。

ｐｓＹｌ　１４ＰをＨＬｎｄｍで切断した後にマングビ
ーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を用いて一本鎖ＤＮＡ
部分を除去した。更にフレノウフラグメントを用いて平
滑末端とした後に５ａｃＩで切断した。この断片と前述
したα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子を含む５種類のＤｒ
ａＩ−Ｓａｃｌ断片をそれぞれ結合させて、酵母中で α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子を発現させる５種類のプ
ラスミド（ｐＡＸ５０Ａ−Ｅ）を作製した。

ｐＡＸ５０Ａ、ｐＡＸ５０ＢＳｐＡＸ５０ｃ。

ｐＡＸ５０Ｄ、ｐＡＸ５０ＥはそれぞれｐＡＬＤＣｌ、
ｐＡＬＤＣ２、ｐＡＬＤＣ３、ｐＡＬＤＣ４、ｐＡＬＤ
Ｃ５に由来するα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子を含んで
いる。また、実施例（４）−（１１１）で得たｐＡＬＤ
Ｃ６及びｐＡＬＤＣ７のそれぞれから切り出したα−Ａ
ＬＤＣａｓｅ遺伝子を含むＨｉｎｄＩｆｆ−３ａｃｌ断
片を、ｐＳＹ１１４ＰのＨｉｎｄＩＩＩ切断点と５ａｃ
Ｉ切断点の間にそれぞれ挿入して発現プラスミド（ｐＡ
Ｘ５０Ｆ２及び ｐＡＸ５０Ｇ２）を作成した。ｐＡＸ５０Ｆ２、ｐＡＸ
５０Ｇ２は、それぞれ、ｐＡＬＤＣ６、ｐＡＬＤＣ７に
由来するａ−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ遺伝子を含んでいる。

上記の発現プラスミドを用いてα−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ
遺伝子を酵母中で発現させた場合、タンパク質への翻訳
開始部位及びコードするポリペプチドは次表に示した通
りと考えられる。

本ｌ：　ただし、ＧＴＧはＡＴＧに変換しである＊２：
　ただし、Ｎ末のＶａｌはＭｅｔ（ｖｌｌ）酵母での発
現 実施例（４）　−（Ｖｉ）で作製した７種類の発現プラ
スミド（ｐＡＸ５０Ａ−Ｅ、ｐＡＸ５０Ｆ２、ｐＡＸ５
０Ｇ２）で実験酵母ＴＤ４を形質転換させた。これらの
形質転換体のα−ＡＬＤＣａｓｅ活性を実施例（２）　
−（ｌｖ）と同様の方法を用いて測定した。結果は次表
に示す通り、いずれの発現プラスミドを有する形質転換
体も、 α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を有するポリペプチドを産
生じた。

＊：ただし、Ｎ末のＶａｌはＭｅｔ （５）発酵試験によるダイアセチル生成量低減の確認 （１）ビール酵母発現用ベクターｐＡＸ４３ＫＬの作製 第１１図に作製法の概略を示した。

まず、酵母中でβ−ガラクトシダーゼを発現させること
が可能なＡＤＨＩプロモーター＋１ａｃＺ遺伝子を作製
した。まず、プラスミドｐＭｃ１８７１　（ファルマシ
ア社製）からＢａｍＨＩ断片として１ａｃＺ遺伝子（大
腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を得た。しかし、こ
の断片にはプロモーター領域及び翻訳開始点となるＡＴ
Ｇが欠けているため、この１ａｃＺ遺伝子のＢａｍＨ１
断片をＹＥｐ１３にの（実施例（２）−（１１１）で作
成）のＢｇｌ■切断点に挿入した。

ＹＥｐ１３にのＨＬｎｄｌＩＩ切断点とＢｇｌＩＩ切断
点の間にはＡＴＧを含む数十塩基の配列が存在するため
、第１１図に図示したような方向に１ａｃＺ遺伝子が挿
入された場合には、ＹＥ　ｐ　１３Ｋに存在するこのＡ
ＴＧを翻訳開始コードンとして利用することができる。

従って、そのような方向に１　ａｃＺ遺伝子が挿入され
たプラスミドｐｌａｃＺ１を選択した。次に、実施例（
３）−（Ｉ）で作成したＡＤＨ１プロモーター（Ｂａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ断片）をｐｌａｃＺｌのＨｉｎｄ
ｍとＢａｍＨ１切断点に挿入することによって、プラス
ミドｐＡＤＨ１−１ａｃＺを作成した。このプラスミド
は、ＡＤＨ１プロモーターにより酵母中でβ−ガラクト
シダーゼを発現することができる。ｐＡＤＨｌ−１ａｃ
ＺをＸｈｏｌで切断した後、フレノウフラグメント処理
により平滑末端とし、５ａｌＩリンカ−（宝酒造社製）
を付加した。その後、ＡＤＨＩプロモーター＋１ａｃＺ
遺伝子をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片として切り出した。

一方、Ｇ４１８耐性遺伝子をｐＵＣ４Ｋ　（ファルマシ
ア社製）より、ＳａｌＩ部分分解とＢａｍＨＩ切断によ
り、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片として切り出した。この
Ｇ４１８耐性遺伝子を含む断片及び上記のＡＤＨ１プロ
モーター＋１ａｃＺ遺伝子を含むＢａｍＨｌ−Ｓａ　ｌ
　Ｉ断片を、実施例（２）　−（１１１）で作製したｐ
ＡＸ４３の５ａｉｌ切断点に挿入して、プラスミドｐＡ
ｘ４３ＫＬ　（第１２図）を作製した。

（ＩＩ）　　ｐＡＸ４３ＫＬのビール酵母への導入上記
で作製したｐＡＸ４３ＫＬを用いて、リチウムアセテー
ト法によって、慣用されているビール酵母を形質転換し
た。形質転換体は、Ｇ４１８耐性を指標として一次選択
した株の中から、βガラクトシダーゼ活性を指標として
二次選択することにより、得た。得られた形質転換体の
α−ＡＬＤＣａ　ｓ　ｅ活性を測定したところ、３．２
〜７．ＯＵ／■タンパクの活性を示した。

これらの形質転換体のうち、独立したクローンを２つ選
び、それぞれＹＡＬ３−１及びＹＡＬ３２と呼ぶことに
した。

（ｌｌｉ）発酵試験 上記で得られた形質転換体を、０４１８　１０ｐｐｍを
含む麦汁５０ｍ１で２０℃　３日間静置培養し、その全
量を麦汁１リツトルＣＧ４１８１０ｐｐｍを含む）に加
えて８℃　１０日間静置培養した。生育した菌体を遠心
分離（５０００ｒｐｍＸ１０分間）により集菌した。得
られた酵母菌体を、１１°Ｐ（プラトー度）の麦汁に０
．５％（ｗｅｔ　　ｗ／ｖ）となるように添加した。こ
れを攪拌して十分に通気した後、８℃で８日間静置発酵
させた。発酵終了後、遠心分離と濾紙濾過によって菌体
を除去した発酵液について、ＴＤＡ　（全ダイアセチル
ｆｆ１）及び外観発酵度を測定した。結果は、次表に示
す通りであった。本発明の酵母を用いた発酵では、対照
株の時と比較してＴＤＡ生成量が大幅に減少したことが
明らかとなった。

なお、ＴＤＡはビシナルジケント及びアセトハイドロキ
シ酸、主としてＤＡおよびその前駆物質α−ＡＬ、より
なる。また、外観発酵度は、下記の通りに定義されるも
のである。

（６）　α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の酵母への導入（そ
の４） α−Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｃａｓｅ遺伝子の酵母染色体への組み
込み、発現及び醗酵試験 （１）　　α−Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｃａｓｅ遺伝子を酵母染色
体に組み込む方法の概略 ＧＰＤプロモーターとＰＧＫターミネータ−を付加する
ことによって酵母中で発現可能となったα−Ａ　Ｌ　Ｄ
　Ｃａｓｅ遺伝子を、クローン化した酵母のｒＲＮＡ遺
伝子の内部に挿入し、第１３図に示すような断片を作成
した。この断片を６４１８耐性遺伝子を有するＹＥｐ型
プラプラスミドＡＳ５、ｍ１４図参照）と共に用いて酵
母を形質転換し、Ｇ４１８耐性を指標として形質転換体
を得た。得られた形質転換体の中には、相同的組み換え
により、ある頻度で前述したα−Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｃａｓｃ
遺伝子が酵母染色体のｒＲＮＡ遺似子部位に組み込まれ
た形質転換体を得ることができた。

（ＩＩ）　　組み込み型プラスミド（ｐＡＸ６０Ｇ２）
の作製 酵母中での自律増殖能をもたず、染色体に組み込まれる
ことによってのみ酵母に保持されうるプラスミドｐＡＸ
６０Ｇ２を、第１５図に概略を示した方法に従って、次
の通り作製した。

まず、プラスミドｐＵｃ１２　（ファルマシア社製）の
ＥｃｏＲＩ切断部位をフレノウフラグメント処理し、Ｘ
ｈｏｌリンカ−（宝酒造社製）を付加した後に再度ライ
ゲーションした。このプラスミドには新たなＸｈｏＩ切
断部位が生まれているのと同時に、Ｘｈｏｌ切断部位の
両側にＥｃｏＲＩ切断部位が再生している。このプラス
ミドをＸｂａｌで切断し、フレノウフラグメント処理し
た後、再びライゲージランした。このようにして得られ
たプラスミドｐＵＣ１２ＥＸにはもはやＸｂａｌ切断点
は含まれていない。

また、ｒＲＮＡ遺伝子を、実施例（２）　−（１）で作
製したライブラリーより、５，８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔｐ、　２５２．８１１ｇ−８
１２５（１９７７）　）の５′末端４〜３２番目の塩基
に対応するオリゴマーを５′末端標識したものをプロー
ブとして用いて取得した。このうち、５．８３ｒＲＮＡ
遺伝子及び２５ＳｒＲＮＡ遺伝子のそれぞれ一部を含む
約３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、切り出し、フレノウフラ
グメント処理した後に、Ｘｈｏｌリンカ−を付加した。

この断片を、先に作製したｐＵＣ１２ＥＸのＸｈｏＩ切
断点に挿入してプラスミドｐｌＲｘｈｏを作製した。

さらに、（４）−（ｖｌ）で作製したプラスミドｐＡＸ
５０Ｇ２を５ａｌＩ切断し、ＧＰＤプロモーター及びα
−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子及びＰＧＫプロモーターを含む
断片（第１５図の斜線部分）を得た。この断片をフレノ
ウフラグメント処理した後にＸｂａｌリンカ−（ファル
マシア社製）を付加し、先に取得したｐ　ＩＲｘｈｏの
Ｘｂａｌ切断点に挿入してプラスミドｐＡＸ６０Ｇ２を
作製した。

（Ｉｌｉ）　　０４１８耐性遺伝子を有するＹＥｐ型プ
ラスミドｐＡＳ５の作製 第１６図に概略を示した方法に従って、次の通りｐＡＳ
５を作製した。

まず、ｐＵＣ４Ｋ　（ファルマシア社製）をＢａｍＨＩ
で切断することにより、Ｇ４１８耐性遺伝子（Ｇ４１８
　ｒ）を含むＢａｍＨＩ断片を切り出し、（５）−（１
）で得たｐＡＤＨｌ−１ａｃＺのＢａｍＨＩ切断点に挿
入した。得られたプラスミドのうち、０４１８耐性遺伝
子が２ケ挿入されたものをｐＡＳ５と呼ぶことにした。

ｐＡＳ５は、Ｇ４１８耐性遺伝子が１ケしか挿入されな
かったプラスミドよりも高いＧ４１８耐性を酵母に与え
た。

（Ｉｖ）　　ａ−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の酵母染色体へ
の組み込み （１１）で得たｐＡＸ６０Ｇ２を、ＥｃｏＲＩ切断して
得られた断片（すなわち第１３図の断片）と（Ｉ　Ｉ　
りで得たｐＡＳ５（第１４図）を用いて、リチウムアセ
テート法によりビール酵母ＩＦ００７５１株を形質転換
（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆ’ｏｍａｔｌｏｎ）　した。形質
転換体はＧ４１８耐性及びβ−ガラクトシダーゼ活性を
指標として選択した。得られた形質転換体をＹＰＤ培地
で３０℃−夜振盪培養した後、α−ＡＬＤＣ活性を測定
することにより、α−Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｃａｇｏ造伝子を持
つ株を得た。これらの株をＹＰＤ培地で非選択的に１２
〜１３世代培養した後、適宜希釈してＸ−ｇａｌ（５’
　−ブロモ−４′−クロロ−３′−インドイル−β−Ｄ
−ガラクトシド）を含むＲｕｂｙらの寒天培地〔メソッ
ド書イン書エンザイモロジー、ｖｏｌ、ｌ旧、　ｐ２５
３（１９８３））に接種した。このプレートを３０℃で
３〜５日間培養し、青色を発色しない株（すな、わち、
β−ガラクトシダーゼ活性を示さない株）を得た。

これらの株はｐＡＳ５を失い、ｔｘ−ＡＬＤＣａＳＯ遺
伝子及びその発現に必要なＧＰＤプロモーターＰＧＫタ
ーミネータ−のみが染色体上に組み込まれたものと考え
られる。これらの株をＹＰＤ培地で３０℃で一夜振盪培
養した後にα− Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｃａｓｅ活性を測定した。これらの株のう
ち、１、ＯＵ／ｍｇタンパクのａ　−Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｃａ
ｓｃ活性を示した株をＹＡＬ４と呼ぶことにした。ＹＡ
Ｌ４をＹＰＤ培地で４７世代培養したところ、α−ＡＬ
ＤＣａＳｅ活性は７５％以上維持された。

（ｖ）　　醗酵試験 （ｉｖ）で得られたＹＡＬ４を麦汁５０１で２０℃３日
間静置培養し、その全量を麦汁１リツトルに加えて１０
℃で１０日間静置培養した。成育した菌体を遠心分離（
５０００ｒｐｍＸ１０分間）により集菌した。得られた
酵母菌体を、１１”Ｐ（プラトー度）の麦汁に０．６％
（ｗｅｔ　ｖ／ｖ　）となるように添加した。これを撹
拌して十分に通気した後、１０℃で１０日間静置醗酵さ
せた。醗酵終了後、遠心分離と濾紙濾過によって菌体を
除去した醗酵液について、ＴＤＡ　（全ダイアセチル量
）及び外観醗酵度を測定した。結果は、次表に示す通り
であった。本発明の酵母を用いた醗酵では、対照様の時
と比較してＴＤＡ生成量が減少したことが明らかとなっ
た。

微生物の寄託 本発明に関係する微生物ＹＡＬ２は、昭和６３年４月７
日通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れて、微工研条寄第１８４４号の受託番号を得ている。

また、本発明に関係する微生物ＹＡＬ４は、平成元年４
月７日通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されて、微工研条寄第２３７４号の受託番号を得てい
る。。

更に、本発明のＤＮＡ鎖を含むプラスミドｐＡＸ６は、
大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９（宝酒造側製）に導
入し、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９　（ｐＡＸ６を含む
）として、昭和６３年１２月１４日微工研に寄託されて
微工研条寄第２１８７号の受託番号を得ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるＤＮＡ鎖およびアミノ酸配列の
一例を示す説明図である。 第２図はいｐＡＸ４３の構造を示す説明図である。 第３図は、α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子のサブクローニン
グのフローチャートである。 第４図は、ＧＰＤプロモーター（Ｓａｌｌ−Ｂｇｌｎ）
の取得のフローチャートである。 第５図は、ＰＧＫターミネータ−（ＳａｃＩ−３ａｌｌ
）の取得のフローチャートである。 第６図は、ｐＡＸ４３の作製のフローチャートである。 第７図は、部位特異的突然変異法を示す説明図である。 第８図は、ＧＰＤプロモーター（ＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎ
ｄｍ）の取得のフローチャートである。 第９図は、ＰＧＫターミネータ−（Ｈｉｎｄｍ−３ａｌ
ｌ）の取得のフローチャートである。 第１０図は、ｐＡＸ５０Ａ−Ｈの取得のフローチャート
である。 第１１図は、ｐＡＸ４３ＫＬの作製のフローチャートで
ある。 第１２図は、ｐＡＸ４３ＫＬの構造を示す説明図である
。 第１３図は、ＧＰＤプロモーターとＰＧＫターミネータ
−を付加したα−Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｃａｓｅ遺伝子を、クロ
ーン化した酵母のｒＲＮＡ遺伝子の内部に挿入したＤＮ
Ａ断片の構造を示す説明図である。 第１４図は、ＰＡＳ５の構造を示す説明図である。 第１５図は、ＦＡＸ６０Ｇ２の作製のフローチャートで
ある。 第１６図は、ＰＡＳ５の作製のフローチャートである。 （ｊａ　（ＪＬ　１−Ｌ　ロＩＮ＋ｊコロＸヨ；１泗；
ジ占基ｓヨ ヨ５　ご左　萌Ｂ５ョ　仁自ゴ＝石 ＋　＠　（（：　　Ｃ５１０＋ａ　　（Ｊ＋ｌ　　ｃｚ
ｓｌ−４：　　＜−（ＪＬ　　＜＠　　ＬＩＬ　　ロー
ロ入口コ　（ＪＯＣ５ｘ　ＬＩＯｔ−ａロー１−ａ＋ｃ
ＪＬＬ＋−ロムイー ロロ　ロ」　ロ龜　Ｕロ　ω龜　口く 蒼　甚　民　百　ぎ１；３ｎ目回路■番２眠五＝（Ｏ＜
　　　Ｃ５１−（ＪＬ　　Ｌｌ：）　　（Ｊ−ＣＡＬ　
　口ｃ　ＱＬ　ωυ＋−Ｃ！ｌ　　　＜　　　ｅ　　　
＋−＜）、　）ｕ　　）−Ｉｌｌ　　Ｌ１４１　　＜−
〇；トＬロ　　ｐ−＜　　　＋−＋−＋ト　ト一　ロ〉
　くり　ロＬｌ　　＜１−　←侃ロ　　ロ　　ｌ−＜　
　（ＬＩＬ　　Ｃ５）％　＋５：）　　ＩＪＬ　　（Ｊ
Ｌ　　Ｃ５：）　　Ｃ３ＬＣ！ｌ　　　Ｌｌ　　　＜　
　　ロ　　ＣＪＪ：　Ｃ２−＜−ω（１＜　ｋ　＜　−
０ωｆｔ）　　　＋　　　Ｏ（ｊ　　　＜＋　　（ｊ（
ｊ　ｔ５Ｌ＋　　＋ｘ　　１−１−　　（ｊａ　く←第
９図 第１２図 ＋ ａ−ＡＬＤＣａｓｅ 十 ＰＧＫターミネータ− Ｂａｒｎｔ−１１ 第１４図 第１６図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、α−アセト乳酸脱炭酸酵素活性を有していてアミノ
   酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
   うちＡからＢまでのものであるポリペプチドをコードす
   る塩基配列を有することを特徴とする、α−アセト乳酸
   脱炭酸酵素の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖。 ２、α−アセト乳酸脱炭酸酵素活性を有していてアミノ
   酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
   うちＡからＢまでのものであるポリペプチドをコードす
   る塩基配列を有するＤＮＡ鎖によって形質転換されてα
   −アセト乳酸脱炭酸酵素産生能を有していることを特徴
   とする、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母。 ３、α−アセト乳酸脱炭酸酵素活性を有していてアミノ
   酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
   うちＡからＢまでのものであるポリペプチドをコードす
   る塩基配列を有するＤＮＡ鎖によって形質転換されてα
   −アセト乳酸脱炭酸酵素産生能を有しているサッカロマ
   イセス・セレビシエに属する酵母によって醸造原料を発
   酵させることを特徴とする、酒類の製造法。