JPH02265490A - 組み換え遺伝子の発現法、発現ベクター及び発現補助ベクター - Google Patents
組み換え遺伝子の発現法、発現ベクター及び発現補助ベクターInfo
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- JPH02265490A JPH02265490A JP1292539A JP29253989A JPH02265490A JP H02265490 A JPH02265490 A JP H02265490A JP 1292539 A JP1292539 A JP 1292539A JP 29253989 A JP29253989 A JP 29253989A JP H02265490 A JPH02265490 A JP H02265490A
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
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- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明ハ、アルギニンのＡＧＡコドン及び／又はＡＧＧ
コドンを含む組み換え遺伝子を含有する発現ベクターで
形質転換することにより、Ｅ。
コドンを含む組み換え遺伝子を含有する発現ベクターで
形質転換することにより、Ｅ。
コリ中で該組み換え遺伝子を発現させる方法に関する。
従来の技術
蛋白質又は蛋白質含有遺伝子産物の遺伝子工学的製造は
現代のバイオテクノロジーの主要目的の１つである。と
シわけ原核生物は発酵性が蛋 簡単であるため多量の一白質の製造に好適であるので、
真核生物の遺伝子な原核生物中で発現することもたびた
び試みられた。しかしその際に、しばしは真核生物の蛋
白質は原核生物の細胞中では僅少量でしか製造されずか
つ細胞は蛋白質の生産量を高める際に発酵／成長の困難
を示すという点で困難さが生じる。
現代のバイオテクノロジーの主要目的の１つである。と
シわけ原核生物は発酵性が蛋 簡単であるため多量の一白質の製造に好適であるので、
真核生物の遺伝子な原核生物中で発現することもたびた
び試みられた。しかしその際に、しばしは真核生物の蛋
白質は原核生物の細胞中では僅少量でしか製造されずか
つ細胞は蛋白質の生産量を高める際に発酵／成長の困難
を示すという点で困難さが生じる。
とシわけ、発現させる際のこのような問題は組織型プラ
スミノーデン活性因子（ｚ−ＦＡ）で認められる。この
蛋白質の製造については、この蛋白質が臨床実験で梗塞
疾患の治療に好適であるので努力する価値がある。Ｅ、
コリ細胞はプラスミド又はベクターに導入された１−Ｐ
Ａ −ｃＤＮＡを十分な量で発現しかつｔ−ＰＡを産
生することができるが、この細胞はバイオマスを形成す
る際に発酵中に著しく衰退し、それ故全体的Ｋｔ−ＦＡ
の製造は、各細胞の製造から出発する場合に予測できる
水準には達しない。
スミノーデン活性因子（ｚ−ＦＡ）で認められる。この
蛋白質の製造については、この蛋白質が臨床実験で梗塞
疾患の治療に好適であるので努力する価値がある。Ｅ、
コリ細胞はプラスミド又はベクターに導入された１−Ｐ
Ａ −ｃＤＮＡを十分な量で発現しかつｔ−ＰＡを産
生することができるが、この細胞はバイオマスを形成す
る際に発酵中に著しく衰退し、それ故全体的Ｋｔ−ＦＡ
の製造は、各細胞の製造から出発する場合に予測できる
水準には達しない。
また、Ｅ６コリ細胞中でプラスミド安定性が低く、かつ
コード付はプラスミドの損失によシ生産率は更に低下す
る。それ故、従来は全細胞蛋白質の約５優のｔ−ＰＡの
発現を達成し得た（ Ｒｏｔｈａｔｅｉｎ及びＢｅｘｔ
ｏｎｉａ共著、” Ｇｏｎｅ６１巻、４１〜５０頁（１
９８７年）〕。
コード付はプラスミドの損失によシ生産率は更に低下す
る。それ故、従来は全細胞蛋白質の約５優のｔ−ＰＡの
発現を達成し得た（ Ｒｏｔｈａｔｅｉｎ及びＢｅｘｔ
ｏｎｉａ共著、” Ｇｏｎｅ６１巻、４１〜５０頁（１
９８７年）〕。
発明が解決しようとする課題
本発明は、発現の際に従来公知の方法では宿主細胞の成
長が明らかに悪化しかつプラスミドが不安定になる組み
換え遺伝子を１高収率で発現させることのできる方法を
開示するという課題をペースとする。
長が明らかに悪化しかつプラスミドが不安定になる組み
換え遺伝子を１高収率で発現させることのできる方法を
開示するという課題をペースとする。
課題を解決するための手段
本発明によシこの課題は、アルギニンのＡＧＡ−及び／
又はＡＧＧコドンを含有する組み換え遺伝子を含む発現
ベクターで形質転換することにより、Ｅ−コリ中で前記
組み換え遺伝子を発現させるに当ル、Ｅ、コリ細胞中に
存在する、アルイニ／を組み込みかつコドンＡＧＧ及び
ＡＧＡをｇ職するを −ＲＮＡ量を、通常この細胞中で
産生ずる量の少なくとも５倍に高めることを特徴とする
方法によシ解決される。
又はＡＧＧコドンを含有する組み換え遺伝子を含む発現
ベクターで形質転換することにより、Ｅ−コリ中で前記
組み換え遺伝子を発現させるに当ル、Ｅ、コリ細胞中に
存在する、アルイニ／を組み込みかつコドンＡＧＧ及び
ＡＧＡをｇ職するを −ＲＮＡ量を、通常この細胞中で
産生ずる量の少なくとも５倍に高めることを特徴とする
方法によシ解決される。
この際に１本発明の範囲では、ＡＧＡ ／ ＡＧＧ −
コドンを認識しかつアルギニンを組み込むｔ−ＲＮＡと
は、Ｅ、コリ中で産成する相応する天然ｔ −ＲＮＡば
かシでなく、前記のｑ＃性を有する合成物、変異したも
の又はサプレッサーｔ −ＲＮＡも含む。
コドンを認識しかつアルギニンを組み込むｔ−ＲＮＡと
は、Ｅ、コリ中で産成する相応する天然ｔ −ＲＮＡば
かシでなく、前記のｑ＃性を有する合成物、変異したも
の又はサプレッサーｔ −ＲＮＡも含む。
本発明方法により、従来は発現の際ＫＥ、コリ宿主細胞
の成長が悪いために所望の蛋白質が僅少収率でしか生成
されなかった組み換え遺伝子を明らかに高められた量で
製造することができる。達成されたこの技術的効果は、
細胞中で蛋白質合成する際に本発明によシ使用するを−
ＲＮＡが不足している場合は、外来遺伝子の発現が不良
なはずであるということを前提とすべきであったし、か
つそうではなくて実際にそうであるように外来遺伝子は
良好に発現するが細胞の発育が悪いので予想外である。
の成長が悪いために所望の蛋白質が僅少収率でしか生成
されなかった組み換え遺伝子を明らかに高められた量で
製造することができる。達成されたこの技術的効果は、
細胞中で蛋白質合成する際に本発明によシ使用するを−
ＲＮＡが不足している場合は、外来遺伝子の発現が不良
なはずであるということを前提とすべきであったし、か
つそうではなくて実際にそうであるように外来遺伝子は
良好に発現するが細胞の発育が悪いので予想外である。
本発明の優れた実施形では、Ｅ、コリ細胞中のＡＧＡ
／ ＡＧＧ−コドンをｇ識しかつアルギニンを組み込む
ｔ、 −ＲＮＡ （以下率Ｋ ｔ−ＭＡとも記載する）
の量を、このようなｔ −ＲＮＡをコード付けする遺伝
子少なくとも１個を細胞中に導入するととＫより高める
。殊に１仁れは染色体外発現ベクター上のｔ −ＲＮＡ
遺伝子１個又は数個を細胞中に導入するととＫよシ行な
うことができる。
／ ＡＧＧ−コドンをｇ識しかつアルギニンを組み込む
ｔ、 −ＲＮＡ （以下率Ｋ ｔ−ＭＡとも記載する）
の量を、このようなｔ −ＲＮＡをコード付けする遺伝
子少なくとも１個を細胞中に導入するととＫより高める
。殊に１仁れは染色体外発現ベクター上のｔ −ＲＮＡ
遺伝子１個又は数個を細胞中に導入するととＫよシ行な
うことができる。
Ｅ、コリ中でアルギニンを組み込みかっコドンＡＧＡ及
びＡＧＧを認識する天然ｔ −ＲＮＡは、１ｎａＹ遺伝
子の産物であ）、これはガルシア及びその他共著（Ｇａ
ｒｃｉａ ｅｔ ａｌ ） 、 ＠セル（Ｃｅ１ｌ ）
″４５巻、４５３〜４５９頁（１９８６年）Ｋ記載され
た。この遺伝子の全配列は知られてお夛、それは必須塩
基対１１８個を含有しが句〜伝子を導入することによシ
Ｅ、コリ中のｔ −ＲＮＡ。
びＡＧＧを認識する天然ｔ −ＲＮＡは、１ｎａＹ遺伝
子の産物であ）、これはガルシア及びその他共著（Ｇａ
ｒｃｉａ ｅｔ ａｌ ） 、 ＠セル（Ｃｅ１ｌ ）
″４５巻、４５３〜４５９頁（１９８６年）Ｋ記載され
た。この遺伝子の全配列は知られてお夛、それは必須塩
基対１１８個を含有しが句〜伝子を導入することによシ
Ｅ、コリ中のｔ −ＲＮＡ。
量を高めるのに使用すると優れている。しかしながら、
アルギニンを組み込みかっＡＧＡ ／ Ａ（）Ｇ−コピ
／を認識する合成の、変異した又はサプレッサーのｔ
−ＲＮＡの遺伝子を細胞中に導入することもできる。フ
ァージＴ４からのｔ −ＲＮＡ遺伝子を使用することも
できる。
アルギニンを組み込みかっＡＧＡ ／ Ａ（）Ｇ−コピ
／を認識する合成の、変異した又はサプレッサーのｔ
−ＲＮＡの遺伝子を細胞中に導入することもできる。フ
ァージＴ４からのｔ −ＲＮＡ遺伝子を使用することも
できる。
本発明の優れた実施形では同一の発現ベクター上の１８
１又は数種のｔ −ＲＮＡ遺伝子な真核生物の遺伝子と
一緒に細胞中に導入する。この際に１発現ベクターがハ
イコピープラスミドである場合には、細胞内ｔ −ＲＮ
Ａ濃度の十分な上昇が達成され、それ故真核遺伝子の発
現の際に宿主細胞に対するマイナスの作用は認められな
かった。
１又は数種のｔ −ＲＮＡ遺伝子な真核生物の遺伝子と
一緒に細胞中に導入する。この際に１発現ベクターがハ
イコピープラスミドである場合には、細胞内ｔ −ＲＮ
Ａ濃度の十分な上昇が達成され、それ故真核遺伝子の発
現の際に宿主細胞に対するマイナスの作用は認められな
かった。
他の優れた実施形では、ｔ −ＲＮＡ遺伝子及び真核生
物遺伝子を異なる発現ベクターに乗せてＥ、コリ細胞中
に導入する。Ｅ、コリ中で組み換え蛋白質を発現させる
関Ｋ ｔ −ＲＮＡ Ａｒｇ（ＡＧＧ ／ＡＧＡ ）を
供給することのプラスの作用は、このｔ −ＭＡの遺伝
子がその都度の発現ベクターのシス位に存在しているこ
とＫは左右されないことである。このｔ −ＲＮＡは第
２のベクター上でコード付けされていてもよい（トラン
ス活性）。
物遺伝子を異なる発現ベクターに乗せてＥ、コリ細胞中
に導入する。Ｅ、コリ中で組み換え蛋白質を発現させる
関Ｋ ｔ −ＲＮＡ Ａｒｇ（ＡＧＧ ／ＡＧＡ ）を
供給することのプラスの作用は、このｔ −ＭＡの遺伝
子がその都度の発現ベクターのシス位に存在しているこ
とＫは左右されないことである。このｔ −ＲＮＡは第
２のベクター上でコード付けされていてもよい（トラン
ス活性）。
この付加ベクターはＥ、コリ細胞中の発現ベクターと適
合性でなければならず、つまシ発現シラスミドとは異な
る複製開始点を有すべきである。
合性でなければならず、つまシ発現シラスミドとは異な
る複製開始点を有すべきである。
この際に１発現プラスミドよシも少ないプラスミドコピ
ー数のベクターを使用することもできるが、真核生物遺
伝子が乗っている発現ベクターよルも高いコピー数で存
在するベクターの使用によシ真核生物遺伝子よシも高い
ｔ −ＲＮＡ濃度を達成することもできる。ｔ −ＲＮ
Ａ遺伝子及び真核生物遺伝子を同一の発現ベクター上に
乗せる場合、両方の遺伝子を異なるプロモータの制御下
に使用することも、また両方の遺伝子をオペロンの形で
同じプロモータの制御下に使用することもできる。この
場合に、真核生物遺伝子とｔ −ＭＡ遺伝子との間に終
止コドンが存在することだけは重要であシ、それＫよシ
転写の際に融合蛋白質は生成しまい。
ー数のベクターを使用することもできるが、真核生物遺
伝子が乗っている発現ベクターよルも高いコピー数で存
在するベクターの使用によシ真核生物遺伝子よシも高い
ｔ −ＲＮＡ濃度を達成することもできる。ｔ −ＲＮ
Ａ遺伝子及び真核生物遺伝子を同一の発現ベクター上に
乗せる場合、両方の遺伝子を異なるプロモータの制御下
に使用することも、また両方の遺伝子をオペロンの形で
同じプロモータの制御下に使用することもできる。この
場合に、真核生物遺伝子とｔ −ＭＡ遺伝子との間に終
止コドンが存在することだけは重要であシ、それＫよシ
転写の際に融合蛋白質は生成しまい。
本発明の他の優れた実施形では、１種又は数種のｔ −
ＲＮＡ遺伝子を宿主細胞の染色体中に組み込む。この場
合、遺伝子が強力なゾロモータの下で発現されるように
組込むことは特に優れている。このために、ｔ−ＲＮＡ
遺伝子１種又は数種を強力なプロモータ（この制御下に
ｔ−ＲＮＡは発現される）と同時に導入すると有利であ
る。
ＲＮＡ遺伝子を宿主細胞の染色体中に組み込む。この場
合、遺伝子が強力なゾロモータの下で発現されるように
組込むことは特に優れている。このために、ｔ−ＲＮＡ
遺伝子１種又は数種を強力なプロモータ（この制御下に
ｔ−ＲＮＡは発現される）と同時に導入すると有利であ
る。
ｔ −ＲＮＡ遺伝子を染色体中に導入するに当シ、この
遺伝子を発現ベクター中に導入するに当シかつ宿主細胞
の形質転換のために公知方法を適用する。染色体中に導
入するためには、トランス活性ン又は７アージの適用下
にかつ組み換え現象の利用下に適用すると有利である。
遺伝子を発現ベクター中に導入するに当シかつ宿主細胞
の形質転換のために公知方法を適用する。染色体中に導
入するためには、トランス活性ン又は７アージの適用下
にかつ組み換え現象の利用下に適用すると有利である。
細胞中のｔ −ＲＮＡ量を高めるための他の優れた可能
性は、とのｔ −ＲＮＡをコード付けする染色体遺伝子
の天然プロモータを、ｔ −ＲＮＡが多量に形成さえる
ように変化させることである。
性は、とのｔ −ＲＮＡをコード付けする染色体遺伝子
の天然プロモータを、ｔ −ＲＮＡが多量に形成さえる
ように変化させることである。
このためには、全天然プロモータをよシ強力な殊に誘導
性及び／又は抑制性プロ七−夕に代えると特に優れてい
る。この種のプロモータは当業者に公知であシ、この場
合も殊にトランス活性ン又は７アージの使用下に実施す
るプロモータ交換法も知られている。
性及び／又は抑制性プロ七−夕に代えると特に優れてい
る。この種のプロモータは当業者に公知であシ、この場
合も殊にトランス活性ン又は７アージの使用下に実施す
るプロモータ交換法も知られている。
本発明の他の目的は、アルギニノのＡＧ、Ａ−及び／又
はＡＧＧ−コドンを有する組み換え遺伝子を含有する発
現ベクターを用いて形質転換することによ’ｐ、Ｅ−コ
リ中で前記組み換え遺伝子を発現させるだめの方法であ
シ、これは通常Ｅ。
はＡＧＧ−コドンを有する組み換え遺伝子を含有する発
現ベクターを用いて形質転換することによ’ｐ、Ｅ−コ
リ中で前記組み換え遺伝子を発現させるだめの方法であ
シ、これは通常Ｅ。
コリ中で産生ずる、コドンＡＧＧ及びＡＧＡを認識しか
つアルギニノを形成するを −ＲＮＡの量の少なくとも
５倍量を含有するＢ、）す菌株を選択しかつむの菌株を
宿主細胞として使用することを特徴とする。
つアルギニノを形成するを −ＲＮＡの量の少なくとも
５倍量を含有するＢ、）す菌株を選択しかつむの菌株を
宿主細胞として使用することを特徴とする。
たいていの場合従来公知の菌株は、アルキ二ンを組み込
みかつコドンＡＧＡ ／ ＡＧＧをＷ、にするを −Ｒ
ＮＡを僅少量で含有するだけであシ、かつ外来遺伝子の
発現の際に冒頭に記載した結果がもたらされる。本発明
で使用する通すｆ゛の僅少量のｔ −ＲＮＡを有するＥ
、コＩＪ １１株の標準としては、例、１ば菌株ＤｓＭ
５６８９．Ｄ８Ｍ２１０２゜ＨｐＲ３０００及びｃ６０
０（Ｄｓｍ２０９３）〔あとの２種はＢａｃｈｃａｎｎ
著、 ” Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
みかつコドンＡＧＡ ／ ＡＧＧをＷ、にするを −Ｒ
ＮＡを僅少量で含有するだけであシ、かつ外来遺伝子の
発現の際に冒頭に記載した結果がもたらされる。本発明
で使用する通すｆ゛の僅少量のｔ −ＲＮＡを有するＥ
、コＩＪ １１株の標準としては、例、１ば菌株ＤｓＭ
５６８９．Ｄ８Ｍ２１０２゜ＨｐＲ３０００及びｃ６０
０（Ｄｓｍ２０９３）〔あとの２種はＢａｃｈｃａｎｎ
著、 ” Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
Ｒｅｖ、” ６６巻、１８０〜２３０頁に記載されてい
る〕が挙げられる。場合によ）、本発明方法により、も
ともと多量の即ち少なくとも２倍量のとのｔ、 −ＲＮ
Ａを含有するＥ、コリ菌株を見つけ出すことができる。
る〕が挙げられる。場合によ）、本発明方法により、も
ともと多量の即ち少なくとも２倍量のとのｔ、 −ＲＮ
Ａを含有するＥ、コリ菌株を見つけ出すことができる。
このために、Ｅ、コリ細胞の全ＭＡを製造しかつこれを
ｔ −ＲＮＡのＤＮＡ配列の特異的部分に相当する、標
識したオリゴヌクレオチドに対してノ・イブリッド形成
して選択すると優れている。それ故、ノーサンプロット
法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ −ｂｌｏｔ −Ｔｅｃｈｎｉｋ
）を適用すると優れている。ノーずンプロット法は当
チ 業者に公知であシ、例えばマニアＩス及びその他共著（
Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｑｔ ａｌ ） ＊ ”モレキュラ
ール働クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ）ゼ “ア・うＩラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ） ” Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在に記載されている。ハイブリッド形
成には放射性標識したオリゴヌクレオチドを使用すると
有利であるが、ＤＮＡ７ラグメントの他のすべての標識
も有利に使用することができる。コドンＡＧＧ及び／又
はＡＧＡを認識するを −ＲＮＡのＤＮＡ配列の特異的
部分とは、ｔ −ＲＮＡ中のアンチコドンに直接隣接す
る及び直接隣接中のＤＮＡ配列、所謂アンチコドンルー
プである。シソイドウリジン−又はジヒドロウリジンル
ープとは逆ＫｔＲＮＡのこの領域は他のｔＲＮＡに対し
てあまシ相同性ではなく、それ故配列５’ −ＣＡＣＧ
ＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧ −３’又は例えば
短い配列５’ −ＧＡＣＴ’Ｉ’ＡＧＡＡＧＣ）ＴＣ（
）ＴＴ −３’のオリがヌクレオチド並びにそれぞれの
相補性オリゴヌクレオチド（５′−ｃＡＡｃｏＡｃＣＴ
ｒｃｒＡＡｏＴｃｏＴＧ−３’ ） ＊ （５’ −
ＡＡＣ（）ＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ−３’ ）をこの
ｔＲＮＡの検出及び特徴付けの特異的プローブとして使
用することができる。本発明によシ、塩基対長さ１４〜
３０であるオリがヌクレオチドを使用すると有利である
。
ｔ −ＲＮＡのＤＮＡ配列の特異的部分に相当する、標
識したオリゴヌクレオチドに対してノ・イブリッド形成
して選択すると優れている。それ故、ノーサンプロット
法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ −ｂｌｏｔ −Ｔｅｃｈｎｉｋ
）を適用すると優れている。ノーずンプロット法は当
チ 業者に公知であシ、例えばマニアＩス及びその他共著（
Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｑｔ ａｌ ） ＊ ”モレキュラ
ール働クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ）ゼ “ア・うＩラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ） ” Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在に記載されている。ハイブリッド形
成には放射性標識したオリゴヌクレオチドを使用すると
有利であるが、ＤＮＡ７ラグメントの他のすべての標識
も有利に使用することができる。コドンＡＧＧ及び／又
はＡＧＡを認識するを −ＲＮＡのＤＮＡ配列の特異的
部分とは、ｔ −ＲＮＡ中のアンチコドンに直接隣接す
る及び直接隣接中のＤＮＡ配列、所謂アンチコドンルー
プである。シソイドウリジン−又はジヒドロウリジンル
ープとは逆ＫｔＲＮＡのこの領域は他のｔＲＮＡに対し
てあまシ相同性ではなく、それ故配列５’ −ＣＡＣＧ
ＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧ −３’又は例えば
短い配列５’ −ＧＡＣＴ’Ｉ’ＡＧＡＡＧＣ）ＴＣ（
）ＴＴ −３’のオリがヌクレオチド並びにそれぞれの
相補性オリゴヌクレオチド（５′−ｃＡＡｃｏＡｃＣＴ
ｒｃｒＡＡｏＴｃｏＴＧ−３’ ） ＊ （５’ −
ＡＡＣ（）ＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ−３’ ）をこの
ｔＲＮＡの検出及び特徴付けの特異的プローブとして使
用することができる。本発明によシ、塩基対長さ１４〜
３０であるオリがヌクレオチドを使用すると有利である
。
本発明方法はすべての組み換え遺伝子に好適であ夛、真
核生物遺伝子もしくはそのｃＤＮＡを発現させるのに有
利であシ、特に多数のＡＧＧ及び／又はＡＧＡ−コドン
を含有するものに好適である。これは、例えばヒトウロ
キナーゼ、％−ＰＡ又はその訪導体、）！ＩＶ３Ｍ白Ｘ
（例えばｇｐ４１ ｖ ｐ ２４ ）、酵母からのα
−グルコシダーゼである。本発明方法の大きな利点は、
組み換え遺伝子を構成的に発現させることもできること
である。
核生物遺伝子もしくはそのｃＤＮＡを発現させるのに有
利であシ、特に多数のＡＧＧ及び／又はＡＧＡ−コドン
を含有するものに好適である。これは、例えばヒトウロ
キナーゼ、％−ＰＡ又はその訪導体、）！ＩＶ３Ｍ白Ｘ
（例えばｇｐ４１ ｖ ｐ ２４ ）、酵母からのα
−グルコシダーゼである。本発明方法の大きな利点は、
組み換え遺伝子を構成的に発現させることもできること
である。
本発明方法は、組み換え遺伝子としてｔ−ＰＡ遺伝子（
Ｐａｎｎｉｃａ及びその他共著、” Ｎａｔｕｒｅ６０
１巻、２１４〜２２１］ｒｌ（１９８３年）〕又はその
変異体を発現させてｔ−ＦＡを製造するには特に優れて
いる。従来技術水準で公知になった、Ｅ、コリ全細胞蛋
白質歯＃）ｔ−ＦＡ約５％という発現率を本発明によ、
９３０％よシ高い収率を達成することができる。これは
本発明方法を用いると収率が６００％上昇することを表
わす。
Ｐａｎｎｉｃａ及びその他共著、” Ｎａｔｕｒｅ６０
１巻、２１４〜２２１］ｒｌ（１９８３年）〕又はその
変異体を発現させてｔ−ＦＡを製造するには特に優れて
いる。従来技術水準で公知になった、Ｅ、コリ全細胞蛋
白質歯＃）ｔ−ＦＡ約５％という発現率を本発明によ、
９３０％よシ高い収率を達成することができる。これは
本発明方法を用いると収率が６００％上昇することを表
わす。
本発明の他の優れた実施形ではＥ、コリ中で、ｔ−ＰＡ
の遺伝子及びｄｎａ Ｙ遺伝子を含有するデラスミ）”
ｐＵＢ８９８． ａｋｙｌ、 ＤＳＭ ４８９８を発
現させる。
の遺伝子及びｄｎａ Ｙ遺伝子を含有するデラスミ）”
ｐＵＢ８９８． ａｋｙｌ、 ＤＳＭ ４８９８を発
現させる。
本発明の他の目的は、組み換え遺伝子及びアルイニンを
構成しかつコドンＡＧＧ及び／又はＡＧＡをｇｍするを
、 −ＲＮＡ遺伝子を含有する発現ベクターである。両
方の遺伝子はそれぞれ異なるプロモータの制御のもとに
あってもよく、その際それぞれの遺伝子に対して均一な
あるいはまた不均一なゾロモータが使用可能であり、ま
たは本発明の優れた実施形によシ共通のプロモータの制
御下にオペロンの形で存在してもよい。
構成しかつコドンＡＧＧ及び／又はＡＧＡをｇｍするを
、 −ＲＮＡ遺伝子を含有する発現ベクターである。両
方の遺伝子はそれぞれ異なるプロモータの制御のもとに
あってもよく、その際それぞれの遺伝子に対して均一な
あるいはまた不均一なゾロモータが使用可能であり、ま
たは本発明の優れた実施形によシ共通のプロモータの制
御下にオペロンの形で存在してもよい。
一般ＫＥ、コリ中で組み換え遺伝子をクローン化しかつ
発現させるＯＫ使用可能な優れた発現ベクターは ｔｒｐ−１ｉ！、コリ・リポソームプロモータ、バチル
ス・ステアロテルモフィルス （ＢａｃｉｌｌｕａＳｔｅａｒｏｔｈｏｒｍｏｐｈｉｌ
ｕａ ）α−ガラクトシダーゼ−プロモータ）、 −統いて選択的に翻訳開始するためのリポソーム結合部
位、 一続いて選択的に翻訳開始コドン（ＡＴＧが優れている
）、 一続いて発現すべき遺伝子／ ｃＤＮＡをクローン化す
るためのポリリンカー 一続いて選択的Ｋ ＤＩＩＲＮＡ安定化配列−絖いて転
写ターミネータ（殊Ｋ ｆｃｌ−ターミネータ）、 一耐性遺伝子（殊にカナマイシン耐性遺伝子）、−Ｅ、
プリ中で安定なプラスミド堆層能を有する複製開始点、 −ｔＲＮＡ Ａｒｇ （ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ）の遺伝
子よ構成る。
発現させるＯＫ使用可能な優れた発現ベクターは ｔｒｐ−１ｉ！、コリ・リポソームプロモータ、バチル
ス・ステアロテルモフィルス （ＢａｃｉｌｌｕａＳｔｅａｒｏｔｈｏｒｍｏｐｈｉｌ
ｕａ ）α−ガラクトシダーゼ−プロモータ）、 −統いて選択的に翻訳開始するためのリポソーム結合部
位、 一続いて選択的に翻訳開始コドン（ＡＴＧが優れている
）、 一続いて発現すべき遺伝子／ ｃＤＮＡをクローン化す
るためのポリリンカー 一続いて選択的Ｋ ＤＩＩＲＮＡ安定化配列−絖いて転
写ターミネータ（殊Ｋ ｆｃｌ−ターミネータ）、 一耐性遺伝子（殊にカナマイシン耐性遺伝子）、−Ｅ、
プリ中で安定なプラスミド堆層能を有する複製開始点、 −ｔＲＮＡ Ａｒｇ （ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ）の遺伝
子よ構成る。
本発明によシ特に優れたプラスミドはｐｅＰａ９５、５
ｋｙｌ 、 ＤＳＭ ４８９８である。このプラスミド
はｄｎａ Ｙ遺伝子もｔ−ＰＡ遺伝子も含有する。
ｋｙｌ 、 ＤＳＭ ４８９８である。このプラスミド
はｄｎａ Ｙ遺伝子もｔ−ＰＡ遺伝子も含有する。
本発明の他の目的は発現補助ベクター
（ＥｘｐｒｅｓｓｆＯｎｓｈｉｌｆｓｖｅｋｔｏｒｅｎ
）であシ、これはアルギニンを組み込みかつコｙ ７
ＡＧ（）及び／又はＡＧＡを認識するを −ＲＮＡの遺
伝子を含有し、かつＣｏｌ Ｅ １−プラスミド及びそ
の誘導体とは異なる複製開始点を有する。
）であシ、これはアルギニンを組み込みかつコｙ ７
ＡＧ（）及び／又はＡＧＡを認識するを −ＲＮＡの遺
伝子を含有し、かつＣｏｌ Ｅ １−プラスミド及びそ
の誘導体とは異なる複製開始点を有する。
これによシＥ、コリ細胞中でＣｏ１Ｅ１−発現ベクター
と一緒に補助培養（Ｃｏｋｕｌｚｉｖｉｅｒｕｎｇ ）
が可能である。
と一緒に補助培養（Ｃｏｋｕｌｚｉｖｉｅｒｕｎｇ ）
が可能である。
本発明の優れた実施形では、ｔ −ＲＮＡの遺伝子はＥ
、コリ中のその天然の、従って均一なバチルス・ステア
ロテルモフィルスからのα−ガラクトシダーゼプロモー
タの制御を受ける。
、コリ中のその天然の、従って均一なバチルス・ステア
ロテルモフィルスからのα−ガラクトシダーゼプロモー
タの制御を受ける。
本発明の他の目的は、前記の発現ベクターをその中に存
在する組み換え遺伝子を発現させるＯＫ使用することで
あ）、その際に著しく高い収率が達成され、かつ他の目
的は、遺伝子の発現に好適な組み換えＤＮＡの形でＥ、
プリ細胞中に装入される遺伝子の発現で収率な高めるた
めに前記の発現補助ベクターを使用することである。こ
の際に１本発明によシ構成性プロモータの使用で組み換
え遺伝子を構成発現させることができる。
在する組み換え遺伝子を発現させるＯＫ使用することで
あ）、その際に著しく高い収率が達成され、かつ他の目
的は、遺伝子の発現に好適な組み換えＤＮＡの形でＥ、
プリ細胞中に装入される遺伝子の発現で収率な高めるた
めに前記の発現補助ベクターを使用することである。こ
の際に１本発明によシ構成性プロモータの使用で組み換
え遺伝子を構成発現させることができる。
実施例
次に本発明の実施例を添付図面につき詳説する。
第１図／表１は、発現補助プラスミドを用いて誘導しか
つコトランスフエクションする際の組み換えｔ−ＦＡの
発現効率の上昇及び１−ＰＡ発現の際に細胞の生活力に
対する発現補助プラスミドのプラスの作用を示している
。
つコトランスフエクションする際の組み換えｔ−ＦＡの
発現効率の上昇及び１−ＰＡ発現の際に細胞の生活力に
対する発現補助プラスミドのプラスの作用を示している
。
例 １
ｔ−ＰＡ−発現プラスミドの構成
ａ）プラスミドｐｅＰａ １２６．１
改良ｔ−ＰＡ−発現プラスミドの構成のための出発プラ
スミドとしてはプラスミドｐｅ Ｐａ９８．１（ヨーロ
ッパ特許公開第２４２８３６号明細書）を使用した。こ
のプラスミド中のｔ−Ｐ Ａ −ｃＤＮＡの３７−非翻
訳域、長さ約４００ ｂｐをＸｈｏ Ｉｆ −７ラグメ
ント、長さ３６１ｂｐの欠失によシ約４０ ｈｐ Ｋ短
かくした。この生じたプラスミドの名前はｐｅＰａ １
２６．１でア）、このシラスにドｐａ Ｐａ １２６−
１とｐｓＰａ ９８−１とは例えば制限エンドヌクレア
ーゼＢａｎ ＨＩ及びＨｌｎｄ Ｉでの２重消化によシ
区別され、ｐｅＰａ９８．１ においては長さ２２３４
ｂｐと４３７２ｂｐとの２つのフラグメントが、ｐｇ
Ｐａ １２６．１においてはこれに対して長さ１８７
３ ｂｐと４３７２ ｂｐの２つの７ラグメントが検出
される。
スミドとしてはプラスミドｐｅ Ｐａ９８．１（ヨーロ
ッパ特許公開第２４２８３６号明細書）を使用した。こ
のプラスミド中のｔ−Ｐ Ａ −ｃＤＮＡの３７−非翻
訳域、長さ約４００ ｂｐをＸｈｏ Ｉｆ −７ラグメ
ント、長さ３６１ｂｐの欠失によシ約４０ ｈｐ Ｋ短
かくした。この生じたプラスミドの名前はｐｅＰａ １
２６．１でア）、このシラスにドｐａ Ｐａ １２６−
１とｐｓＰａ ９８−１とは例えば制限エンドヌクレア
ーゼＢａｎ ＨＩ及びＨｌｎｄ Ｉでの２重消化によシ
区別され、ｐｅＰａ９８．１ においては長さ２２３４
ｂｐと４３７２ｂｐとの２つのフラグメントが、ｐｇ
Ｐａ １２６．１においてはこれに対して長さ１８７
３ ｂｐと４３７２ ｂｐの２つの７ラグメントが検出
される。
ｂ）プラスミドｐＵＢ８９８． ａｋｙ１発現プ２スξ
ドｐＵＢ８９８． ａｋｙｌはプラスミドｐＤＭの約３
０００ ｂｐの大きさのＤｒａ ｌ−装入されたｔ −
ＲＮＡ Ａｒｇ （ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ） ｉｃ関す
る遺伝子（ｄｎａ Ｙ ）を含有しく Ｇａｒｃｉａ等
著、Ｃｅ１ｌ、第４５巻、１９８６年、第４５３〜４５
９頁）、これは前記プラスミドｐｅＰａ１２１５．１の
カナマイシン耐性誘導体である。
ドｐＵＢ８９８． ａｋｙｌはプラスミドｐＤＭの約３
０００ ｂｐの大きさのＤｒａ ｌ−装入されたｔ −
ＲＮＡ Ａｒｇ （ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ） ｉｃ関す
る遺伝子（ｄｎａ Ｙ ）を含有しく Ｇａｒｃｉａ等
著、Ｃｅ１ｌ、第４５巻、１９８６年、第４５３〜４５
９頁）、これは前記プラスミドｐｅＰａ１２１５．１の
カナマイシン耐性誘導体である。
ｐＵＩ３８９８．５ｋｙｌはドイツ微生物保存機関（Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｎ ；ＤＳＭ ）に寄託
番号４８９８で寄託されている。
ｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｎ ；ＤＳＭ ）に寄託
番号４８９８で寄託されている。
例 ２
発現補助プラスミドの存在での大ｍ菌中でのｔ−ＰＡの
発現 ｔ −ＭＡ Ａｒｇ （ＡＣ）Ｇ ／ ＡＧＡ ）に関
する遺伝子を、Ｃｏ１ｇ１−複製開始点を有する？、−
ＰＡ−発現ベクターｐｅ Ｐａ １２６．１と適合性で
あるシラスミドでクローン化し九〇 シラスミド］）ＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ及びＣ０ｈ
ｅｎ著、Ｊ、 Ｂａｃｔ、 、第１３４巻、１９７８年
、第１１４１〜１１５６頁）、Ｄ８Ｍ１６９３Ｆをこの
ためＫＤｒａＩで切断し、３２３０ｐｂ７ラグメントを
単離した。この７ラグメントを、ｉｎａ Ｙ−遺伝子を
含有する、シラスミドｐＤＭ２０１からの長さ約３００
０ ｂｐＯＤｒａ ｌ−フラグメントと連結し、この連
結配合物を大腸菌、ＤＡＭ ２１０２中に形質転換した
〇 プ５ スミＹ ｐＵＢｓ ４００もしくはｐＵＢｓ ４
０１を含有するカナマイシン耐性クローンヲ、オリゴヌ
クレオチド［５’ −ＡＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡ
ＡＧＴＣＧＴＧＧ（） −３’ ）を用いてコロニーフ
ィルターハイブリツＰ化を行なうことによシ同定し、単
離した。
発現 ｔ −ＭＡ Ａｒｇ （ＡＣ）Ｇ ／ ＡＧＡ ）に関
する遺伝子を、Ｃｏ１ｇ１−複製開始点を有する？、−
ＰＡ−発現ベクターｐｅ Ｐａ １２６．１と適合性で
あるシラスミドでクローン化し九〇 シラスミド］）ＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ及びＣ０ｈ
ｅｎ著、Ｊ、 Ｂａｃｔ、 、第１３４巻、１９７８年
、第１１４１〜１１５６頁）、Ｄ８Ｍ１６９３Ｆをこの
ためＫＤｒａＩで切断し、３２３０ｐｂ７ラグメントを
単離した。この７ラグメントを、ｉｎａ Ｙ−遺伝子を
含有する、シラスミドｐＤＭ２０１からの長さ約３００
０ ｂｐＯＤｒａ ｌ−フラグメントと連結し、この連
結配合物を大腸菌、ＤＡＭ ２１０２中に形質転換した
〇 プ５ スミＹ ｐＵＢｓ ４００もしくはｐＵＢｓ ４
０１を含有するカナマイシン耐性クローンヲ、オリゴヌ
クレオチド［５’ −ＡＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡ
ＡＧＴＣＧＴＧＧ（） −３’ ）を用いてコロニーフ
ィルターハイブリツＰ化を行なうことによシ同定し、単
離した。
このようにして単離されたシラスミドｐＵＢｓ ４００
及びｐＵＢｓ ４０１はｔ −ＲＮＡ Ａｒｇ（ＡＧＧ
／ ＡＧＡ ）Ｋ関する遺伝子がそこに存在するＤｒ
ａ Ｉ−切断忙中への３０００ ｂｐ挿入物によシｐＡ
ＣＹＣとは区別され、かつｐＵＢｓ ４００とｐＵＢｓ
４０１とはベクター中の３０００ ｂｐ −Ｄｒａ
Ｉ−挿入物（例１）の方向性におりて区別される。
及びｐＵＢｓ ４０１はｔ −ＲＮＡ Ａｒｇ（ＡＧＧ
／ ＡＧＡ ）Ｋ関する遺伝子がそこに存在するＤｒ
ａ Ｉ−切断忙中への３０００ ｂｐ挿入物によシｐＡ
ＣＹＣとは区別され、かつｐＵＢｓ ４００とｐＵＢｓ
４０１とはベクター中の３０００ ｂｐ −Ｄｒａ
Ｉ−挿入物（例１）の方向性におりて区別される。
ｐＵＢｓ ４００はＨｌｎｄ ［［−Ｈｌｎｄ Ｉ−二
重消化ゾラスミｙ −ＤＮＡのすずン分析において約３
３００ ｂｐ−フラグメントが合成オリゴヌクレオチド （５’ −ＡＧＣＡＡｃｅＡＣＣＴ’ｒＣ’ｒＡＡＧ’
ｒＣＧ’ｒＧＧＧ−３’ ”］とハイブリッド化するこ
とを特徴とする。
重消化ゾラスミｙ −ＤＮＡのすずン分析において約３
３００ ｂｐ−フラグメントが合成オリゴヌクレオチド （５’ −ＡＧＣＡＡｃｅＡＣＣＴ’ｒＣ’ｒＡＡＧ’
ｒＣＧ’ｒＧＧＧ−３’ ”］とハイブリッド化するこ
とを特徴とする。
ｐＵＢｓ ４０１は同様に寅施される分析において約１
７００ ｂｐ−フラグメントがハイブリッド化する。
７００ ｂｐ−フラグメントがハイブリッド化する。
プラスミドｐＩＱ ５００はｌａｃ ＩＩ−遺伝子を有
する１）ＡＣＹＣ１７７０８体である。プラスミドｐＩ
Ｑ ５００は１ｑ−プロモーター突然変異（Ｃａｌｏｇ
著、Ｎａｔｕｙｅ 、第２７４巻、第７６２〜７６５頁
、１９７８年）を有するｌａｃ Ｉ−遺伝子（Ｐ、Ｊ。
する１）ＡＣＹＣ１７７０８体である。プラスミドｐＩ
Ｑ ５００は１ｑ−プロモーター突然変異（Ｃａｌｏｇ
著、Ｎａｔｕｙｅ 、第２７４巻、第７６２〜７６５頁
、１９７８年）を有するｌａｃ Ｉ−遺伝子（Ｐ、Ｊ。
Ｆａｒａｂａｕｇｈ 、 ＮａＬｕｒｓ ％第２７４巻
１第７６５〜７６９頁、１９７８年）を１’！ｉｎｄ
ＩＩ −７ツグメント（部分的＆ＩｃｐＭｃｊから、Ｃ
ａｌｏｇ １９７８年前記参照）としてＨｌｎｄ Ｉ−
切断シラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ及びＣｏ
ｈｅｎ ’！、Ｊ、 Ｂａｃｔ、 、第１３４巻、１９
７８年、第１１４１〜１１５６］［）中に挿入して含有
する。
１第７６５〜７６９頁、１９７８年）を１’！ｉｎｄ
ＩＩ −７ツグメント（部分的＆ＩｃｐＭｃｊから、Ｃ
ａｌｏｇ １９７８年前記参照）としてＨｌｎｄ Ｉ−
切断シラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ及びＣｏ
ｈｅｎ ’！、Ｊ、 Ｂａｃｔ、 、第１３４巻、１９
７８年、第１１４１〜１１５６］［）中に挿入して含有
する。
ｐＩＱ ５００を含有する大腸菌細胞はカナマイシン耐
性であυ、かつ（ｐＡＣＹＣ１７７含有の大な大腸菌よ
シ著しく高濃度のＬａｃ −リプレッサー分子（ｌａｃ
Ｉ ）を含有する。ｐｌＱ５００は、相撲遺伝子を１
ａｃ−プロモーター又はその誘導体、例えばｔａｃ ；
ｔｒｃ等の制御下に転写する限ｆｉにおいては、誘発
されない状態で相撲遺伝子の抑制を補助すゐために使用
され、かつ発現シラスミドはｐＩＱ ５００と適合性で
ある（例えばｐＫＫ ２２５−３−誘導体）。
性であυ、かつ（ｐＡＣＹＣ１７７含有の大な大腸菌よ
シ著しく高濃度のＬａｃ −リプレッサー分子（ｌａｃ
Ｉ ）を含有する。ｐｌＱ５００は、相撲遺伝子を１
ａｃ−プロモーター又はその誘導体、例えばｔａｃ ；
ｔｒｃ等の制御下に転写する限ｆｉにおいては、誘発
されない状態で相撲遺伝子の抑制を補助すゐために使用
され、かつ発現シラスミドはｐＩＱ ５００と適合性で
ある（例えばｐＫＫ ２２５−３−誘導体）。
ｔ −ＲＮＡ −Ａｒｇ （ＡＧＧ／ＡＧＡ ）遺伝子
のこのプラスミドでのクローン化はｌａｃ ＩＩ−遺伝
子に付加的に、大腸菌細胞が誘発されていない状態で抑
制のために必要な量の１ａｃ−リプレッサーだけでなく
、真核蛋白質の発現の間に必要な多量のｔ −ＲＮＡ
Ａｒｇ （ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ）を供給することも可
能にする。
のこのプラスミドでのクローン化はｌａｃ ＩＩ−遺伝
子に付加的に、大腸菌細胞が誘発されていない状態で抑
制のために必要な量の１ａｃ−リプレッサーだけでなく
、真核蛋白質の発現の間に必要な多量のｔ −ＲＮＡ
Ａｒｇ （ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ）を供給することも可
能にする。
プラスミドｐｌＱ ５ Ｄ ＯをＤｒａ ｌで切断し、
かつ４８３６ ｂｐフラグメントを単離する。このフラ
グメントをｄｎａ Ｙ−遺伝子を有する、プラスミド１
）ＤＭ ２０１からの約３０００ ｂｐのＤｒａ １−
フラグメントと連結し、かっこの連結配合物を大腸菌Ｄ
ＳＭ ２１０２中に形質転換した。
かつ４８３６ ｂｐフラグメントを単離する。このフラ
グメントをｄｎａ Ｙ−遺伝子を有する、プラスミド１
）ＤＭ ２０１からの約３０００ ｂｐのＤｒａ １−
フラグメントと連結し、かっこの連結配合物を大腸菌Ｄ
ＳＭ ２１０２中に形質転換した。
プラスミドｐＵＢｓ ５００もしくはｐＵＢｓ ５０１
を含有するカナマイシン耐性クローンヲ合成、ｔリボヌ
クレオチド （５’ −ＡＣ）ＣＡＡＣ（）ＡＣＣＴＴＣＴ隈θＴＣ
’（）’Ｉ’ＧＧＧ−３’ ］とコロニーフィルターハ
イブリッド化することによシ同定し、かつ単離した。
を含有するカナマイシン耐性クローンヲ合成、ｔリボヌ
クレオチド （５’ −ＡＣ）ＣＡＡＣ（）ＡＣＣＴＴＣＴ隈θＴＣ
’（）’Ｉ’ＧＧＧ−３’ ］とコロニーフィルターハ
イブリッド化することによシ同定し、かつ単離した。
このように単離されたプラスミドｐＵＢｓ ５００及び
ｐＵＢｓ ５０１はｔ −ＲＮＡ Ａｒｇ （ＡＧＧ
／ ＡＧＡ ）に関する遺伝子が存在する、Ｄｒａ ｌ
−切断忙中の３［１００ｂｐの挿入物によ）ｐ角５００
とは異なっておシ、プラスミドｐＵＢ８５００と５０１
とはベクター中の３０００ ｂｐ−挿入物の配向におい
て異なっている。ｐＵＥｌｓ ５００は、Ｈ１ｎｄ■−
消化プラスｔ ｙ −ＤＮＡのサデン分析において約４
０００ ｂｐ−フラグメントが合成オリゴヌクレオチド Ｃ５’ −ＡＧＣＡＡＣ（）ＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ
ＧＩＴ（）（）Ｇ −３’ ）とハイブリッド化するこ
とを特徴とする。ｐＵＢｓ５０１は、同様に実施する分
析において約１７００ｂｐ−７ラグメントがハイブリッ
ド化することを特徴とする。
ｐＵＢｓ ５０１はｔ −ＲＮＡ Ａｒｇ （ＡＧＧ
／ ＡＧＡ ）に関する遺伝子が存在する、Ｄｒａ ｌ
−切断忙中の３［１００ｂｐの挿入物によ）ｐ角５００
とは異なっておシ、プラスミドｐＵＢ８５００と５０１
とはベクター中の３０００ ｂｐ−挿入物の配向におい
て異なっている。ｐＵＥｌｓ ５００は、Ｈ１ｎｄ■−
消化プラスｔ ｙ −ＤＮＡのサデン分析において約４
０００ ｂｐ−フラグメントが合成オリゴヌクレオチド Ｃ５’ −ＡＧＣＡＡＣ（）ＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ
ＧＩＴ（）（）Ｇ −３’ ）とハイブリッド化するこ
とを特徴とする。ｐＵＢｓ５０１は、同様に実施する分
析において約１７００ｂｐ−７ラグメントがハイブリッ
ド化することを特徴とする。
発現補助プラスミドｐＵＢ８４００及びｐＵＢｓ５００
は、シラスミドｐｉ Ｐａ １２６．１を有するを−ｐ
人−発現のマイナス効果を、必要な１−ＲＮＡ Ａｒｇ
（ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ）を供給することによシトラ
ンス活性補償することを可能にする。
は、シラスミドｐｉ Ｐａ １２６．１を有するを−ｐ
人−発現のマイナス効果を、必要な１−ＲＮＡ Ａｒｇ
（ＡＧＧ ／ ＡＧＡ ）を供給することによシトラ
ンス活性補償することを可能にする。
プラスミドｐＵＥ８４００又はｐＵＢｓ ５００及びｐ
ｅ Ｐａ １２６−１での通常の大腸菌−実駄室菌株（
例えばＣ−＜５ＯＤ）の同時形質転換における発現はＩ
）ＵＢ８９８．５ｋｙｌ−でのｔ−ＰＡ−生産における
と同様な収量と生活力に導び〈。
ｅ Ｐａ １２６−１での通常の大腸菌−実駄室菌株（
例えばＣ−＜５ＯＤ）の同時形質転換における発現はＩ
）ＵＢ８９８．５ｋｙｌ−でのｔ−ＰＡ−生産における
と同様な収量と生活力に導び〈。
第１表及び第１図は５ ｍＭ ＩＰＴＯでの誘発におい
てｐＩＱ ５００ （試料人）もしくはｐＵＢ８５（Ｉ
Ｑ（試料Ｂ）を用いて同時形質転換する、大腸菌ＤＳＭ
２１０２中でのｐｅ Ｐａ １２６−１からの相撲ｔ
−ＰＡの発現の比較を示す・ 第 １ 表 例 ３ 大腸菌中でのｔ−ＰＡの発現の比較 プラスミドｐｅＰＡ１３３（西ドイツ国特許第３６１３
４０１号明細書）、ｐｅｐＡｌ ２６．１（例１）及び
ｐＵＢｓ ９８．５ｋｙｌ、ＤＳＭ ４８９８を工ｑ−
プラスミドを含有する大腸［、ＤＳＭ６６８９中で形質
転換した。形質転換体をカナマイシン２５μ９ ／ｙｄ
（ｐｅＰａ １３３及びｐＵＢｓ９８、 ａｋｙｌに
おいて）及びアンピシリン５０−Ｉ／Ｎｌ（ｐｇ Ｐａ
１２６−Ｉ Ｋ−おいて）を有するＬＢ−シレー）
（ＭａｎｉａＺｉｇ、１９８２年、前記）上で培養する
。
てｐＩＱ ５００ （試料人）もしくはｐＵＢ８５（Ｉ
Ｑ（試料Ｂ）を用いて同時形質転換する、大腸菌ＤＳＭ
２１０２中でのｐｅ Ｐａ １２６−１からの相撲ｔ
−ＰＡの発現の比較を示す・ 第 １ 表 例 ３ 大腸菌中でのｔ−ＰＡの発現の比較 プラスミドｐｅＰＡ１３３（西ドイツ国特許第３６１３
４０１号明細書）、ｐｅｐＡｌ ２６．１（例１）及び
ｐＵＢｓ ９８．５ｋｙｌ、ＤＳＭ ４８９８を工ｑ−
プラスミドを含有する大腸［、ＤＳＭ６６８９中で形質
転換した。形質転換体をカナマイシン２５μ９ ／ｙｄ
（ｐｅＰａ １３３及びｐＵＢｓ９８、 ａｋｙｌに
おいて）及びアンピシリン５０−Ｉ／Ｎｌ（ｐｇ Ｐａ
１２６−Ｉ Ｋ−おいて）を有するＬＢ−シレー）
（ＭａｎｉａＺｉｇ、１９８２年、前記）上で培養する
。
シラスミド含有細胞をＯＤ ５５０ ｎｍ −０，３ま
でＬＢ中で培養し、誘発しく ＩＰＴＧ Ｉ Ｄ ｍｍ
ｏｊ／ｌの添加）、かつ６７℃で発酵させる。培養物の
成長を規則的な間隔で細胞密度（ＯＤ５５０）を監視す
ることＫよシ制御する。
でＬＢ中で培養し、誘発しく ＩＰＴＧ Ｉ Ｄ ｍｍ
ｏｊ／ｌの添加）、かつ６７℃で発酵させる。培養物の
成長を規則的な間隔で細胞密度（ＯＤ５５０）を監視す
ることＫよシ制御する。
恒温保持４時間後に細胞を収穫し、超音波処理によシ破
砕する。このようにして得られた細胞−溶解物を電気泳
動分析しくコーマシーブルー着色５Ｏ８−ゲル）、ｔ−
ＰＡをウェスタンプロット法で山羊からのｔ−ＰＡＫ対
するポリクローン抗体を用いて検出し、予め行なった細
胞溶解物の蛋白質測定によルコーマシー着色８Ｄ８−デ
ルの密度法測定値を介して測量した。
砕する。このようにして得られた細胞−溶解物を電気泳
動分析しくコーマシーブルー着色５Ｏ８−ゲル）、ｔ−
ＰＡをウェスタンプロット法で山羊からのｔ−ＰＡＫ対
するポリクローン抗体を用いて検出し、予め行なった細
胞溶解物の蛋白質測定によルコーマシー着色８Ｄ８−デ
ルの密度法測定値を介して測量した。
第２表は大腸菌ＤＳＭ ３６８９中での前記プラスミド
の発現における収量及び他の９／ｖラメ−ターの比較を
示す。
の発現における収量及び他の９／ｖラメ−ターの比較を
示す。
シラスミドｐｅｔａ １３３．６でのｔ−ＰＡ−発現は
すでに西ドイツ国特許第３６１３４０１号明細書に記載
されている。
すでに西ドイツ国特許第３６１３４０１号明細書に記載
されている。
シラスミドｐｅｔａ １２６−１での発現はローラー培
地５１中の生産大腸菌の成長をほとんど損なわないが、
発酵尺度（≧１０１）においては著しく損ない、更に完
全ｔ−ＰＡは僅かな量で生産され、そのかわ、９Ｋｔ−
ＰＡ−７ラグメントが多量に生産される。
地５１中の生産大腸菌の成長をほとんど損なわないが、
発酵尺度（≧１０１）においては著しく損ない、更に完
全ｔ−ＰＡは僅かな量で生産され、そのかわ、９Ｋｔ−
ＰＡ−７ラグメントが多量に生産される。
プラスミドｐＵＢ８９８．８ｋｙｌを用いる大腸菌中で
のｔ−ＰＡの発現は、生産生物にマイナスの作用を与え
ることなく、完全ｔ−ＰＡの著しく高い発現量を可能と
する（全蛋白質の３０チ）。
のｔ−ＰＡの発現は、生産生物にマイナスの作用を与え
ることなく、完全ｔ−ＰＡの著しく高い発現量を可能と
する（全蛋白質の３０チ）。
ｔ−ＰＡ生産細胞はこのプラスミドで非常に迅速に、か
つ高い細胞密度まで成長し、ｔ−ＦＡが本質的に発現さ
れる。
つ高い細胞密度まで成長し、ｔ−ＦＡが本質的に発現さ
れる。
例 ４
発現補助シラスミドの存在又は不存在における大腸菌中
での種種の蛋白質の発現の比較シラスミドｐＵＰＡ １
１０ （シグナルペプチドを有さないへゾローウロキナ
ーゼに関する配列を含有する、Ｈｏｌｍｅｓ等著、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓ第３巻、１９８５年、第９
２３〜９２９頁）、ｐ（）ｐ ４１ （人ＨＩＶ−ヴイ
ーｂｙのｐ４１−蛋白質に関するコード付配列を有する
、Ｒａｔｎｅｒ等著、１ａｔｕｒｅ 、第６１３巻、１
９８５年、第２７７〜２８４頁）、ｐｘｘ １７７−３
／ ＧＬＵＣＰ工（酵母からのα−グルコシダーゼに
関する配列を含有、ヨーロッパ特許公開第０３００４２
５号公報）、ｐＢＴ １０２ （ＤＳＭ ２０９１ ）
（大腸菌からのα−グルコシダーゼ）及びグラスミド
ｐＵ１２８９ （大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼに
関する配列を含有、Ｒｕｔｈｅｒ及びＭｕｌｋａｒ著、
ＩＦＭＢＯＪ、 、Ｆ ２巻、１９８３年、第１７９１
〜１７９４頁）を工１−プラスミＰを含有する大腸菌Ｄ
ＡＭ ３６８９中に形質転換した。形質転換体の培養並
びに発酵は例３と同様にして実施した。
での種種の蛋白質の発現の比較シラスミドｐＵＰＡ １
１０ （シグナルペプチドを有さないへゾローウロキナ
ーゼに関する配列を含有する、Ｈｏｌｍｅｓ等著、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓ第３巻、１９８５年、第９
２３〜９２９頁）、ｐ（）ｐ ４１ （人ＨＩＶ−ヴイ
ーｂｙのｐ４１−蛋白質に関するコード付配列を有する
、Ｒａｔｎｅｒ等著、１ａｔｕｒｅ 、第６１３巻、１
９８５年、第２７７〜２８４頁）、ｐｘｘ １７７−３
／ ＧＬＵＣＰ工（酵母からのα−グルコシダーゼに
関する配列を含有、ヨーロッパ特許公開第０３００４２
５号公報）、ｐＢＴ １０２ （ＤＳＭ ２０９１ ）
（大腸菌からのα−グルコシダーゼ）及びグラスミド
ｐＵ１２８９ （大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼに
関する配列を含有、Ｒｕｔｈｅｒ及びＭｕｌｋａｒ著、
ＩＦＭＢＯＪ、 、Ｆ ２巻、１９８３年、第１７９１
〜１７９４頁）を工１−プラスミＰを含有する大腸菌Ｄ
ＡＭ ３６８９中に形質転換した。形質転換体の培養並
びに発酵は例３と同様にして実施した。
示す。
著しく高いＡＧＧ−及びＡＧＡ−含量を示すブローウロ
キナーゼ及びＨＩ’／ −ＧＰ ４１の発現において、
発現補助プラスミドの不存在の発現において発現収量及
び発現大腸菌の生活力は明らかに減少している。発現補
助シラスミドｐＵＢｓ５００の添加によシ非常に高い発
現力並びにクローンの高い生活力が達せられる。
キナーゼ及びＨＩ’／ −ＧＰ ４１の発現において、
発現補助プラスミドの不存在の発現において発現収量及
び発現大腸菌の生活力は明らかに減少している。発現補
助シラスミドｐＵＢｓ５００の添加によシ非常に高い発
現力並びにクローンの高い生活力が達せられる。
α−グルコシダーゼの発現も発現補助プラスミドによシ
上昇する。しかしながら、この遺伝子がブローウロキナ
ーゼがＨＩＶ −ａ ｐ ４１よシＡ、ＧＧ ／ ＡＧ
Ａ−コドンを僅かに含有しているので、発現補助プラス
ミドの添加における観察された発現上昇はブローウロキ
ナーゼやＨＩＶ −ＧＰＧ １程強烈ではない。
上昇する。しかしながら、この遺伝子がブローウロキナ
ーゼがＨＩＶ −ａ ｐ ４１よシＡ、ＧＧ ／ ＡＧ
Ａ−コドンを僅かに含有しているので、発現補助プラス
ミドの添加における観察された発現上昇はブローウロキ
ナーゼやＨＩＶ −ＧＰＧ １程強烈ではない。
大腸菌からのα−がラクトシダーゼに関する遺伝子は酵
母からのα−グルコシダーゼ遺伝子より更に少量のＡＧ
Ｇ ／ ＡＧＡ−コドンを含有する。
母からのα−グルコシダーゼ遺伝子より更に少量のＡＧ
Ｇ ／ ＡＧＡ−コドンを含有する。
従って、発現補助シラスミドの添加による発現の上昇は
比較的わずかであるが、それでもなお明らかにはつきシ
としている。
比較的わずかであるが、それでもなお明らかにはつきシ
としている。
ｆＪ１図はｒｅｃ−ｔ−ＰＡを産成するＥ、コリの生活
力が発現補助プラスミドｐＵＢ８５００ Ｋよシ高めら
れることを示す図である。 手 続 （方式） 事件の表示 平成 １、 発明の名称 特許願 ３゜ 補正をする者 事件との関係
力が発現補助プラスミドｐＵＢ８５００ Ｋよシ高めら
れることを示す図である。 手 続 （方式） 事件の表示 平成 １、 発明の名称 特許願 ３゜ 補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アルギニンのＡＧＡ−及び／又はＡＧＧ−コドンを
含む組み換え遺伝子を含む発現ベクターで形質転換する
ことにより、Ｅ．コリ中で該組み換え遺伝子を発現させ
る方法において、Ｅ．コリ細胞中に存在する、アルギニ
ンを組み込みかつコドンＡＧＧ及びＡＧＡを認識するを
−ＲＮＡの量を、通常この細胞中で産生する量の少なく
とも５倍に高めることを特徴とする組み換え遺伝子の発
現法。 ２、アルギニンのＡＧＡ−及び／又はＡＧＧ−コドンを
含む組み換え遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換
することにより、Ｅ．コリ中で該組み換え遺伝子を発現
させる方法において、通常Ｅ．コリ中で産生する量の少
なくとも５倍の、コドンＡＧＧ及びＡＧＡを認識しかつ
アルギニンを組み込むｔ−ＲＮＡの量を含有する菌株を
選択しかつこの菌株を宿主細胞として使用することを特
徴とする組み換え遺伝子の発現法。 ３、組み換え遺伝子及び、アルギニンを組み込みかつコ
ドンＡＧＧ及び／又はＡＧＡを認識するｔ−ＲＮＡの遺
伝子を含有することを特徴とする発現ベクター。 ４、アルギニンを組み込みかつコドンＡＧＧ及び／又は
ＡＧＡを認識するｔ−ＲＮＡの遺伝子を含有しかつ発現
させ、かつｃｏｌＥ１−複製開始点を有する発現ベクタ
ーに適合性であることを特徴とする発現補助ベクター。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3838378 | 1988-11-11 | ||
| DE3928899 | 1989-08-31 | ||
| DE19893931933 DE3931933A1 (de) | 1988-11-11 | 1989-09-25 | Verfahren zur expression eines eukaryontischen gens |
| DE3928899.4 | 1989-09-25 | ||
| DE3931933.4 | 1989-09-25 | ||
| DE3838378.0 | 1989-09-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02265490A true JPH02265490A (ja) | 1990-10-30 |
| JP2619077B2 JP2619077B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=27198503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1292539A Expired - Lifetime JP2619077B2 (ja) | 1988-11-11 | 1989-11-13 | 組み換え遺伝子の発現法、発現ベクター及び発現補助ベクター |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6270988B1 (ja) |
| EP (1) | EP0373365B1 (ja) |
| JP (1) | JP2619077B2 (ja) |
| AT (1) | ATE105863T1 (ja) |
| AU (1) | AU618640B2 (ja) |
| CA (1) | CA2002516C (ja) |
| DE (1) | DE58907690D1 (ja) |
| DK (1) | DK175456B1 (ja) |
| ES (1) | ES2053917T3 (ja) |
| IL (1) | IL92264A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009057622A1 (ja) * | 2007-10-29 | 2009-05-07 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | ヒト成長ホルモンの効率化された製造方法 |
| JP2009534043A (ja) * | 2006-04-22 | 2009-09-24 | スカラブ ゲノミクス， エルエルシー | ｔＲＮＡ遺伝子をしようする、組み換えタンパク質産生のための方法および組成物 |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3838377A1 (de) * | 1988-11-11 | 1990-05-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Expressions-enhancer und dessen verwendung zur erhoehung der ausbeute bei der expression von rekombinanten genen |
| CA2360352A1 (en) * | 1999-01-27 | 2000-08-03 | Stratagene | Methods and compositions for high level expression of a heterologous protein with poor codon usage |
| AU2001249170A1 (en) * | 2000-03-13 | 2001-09-24 | Aptagen | Method for modifying a nucleic acid |
| US6821755B2 (en) | 2000-07-27 | 2004-11-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Preparation of a recombinant protein in a prokaryotic host cell |
| DE10037111A1 (de) * | 2000-07-27 | 2002-02-07 | Boehringer Ingelheim Int | Herstellung eines rekombinanten Proteins in einer prokaryontischen Wirtszelle |
| US7125703B2 (en) | 2001-03-13 | 2006-10-24 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 7, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| US7172892B2 (en) | 2001-03-22 | 2007-02-06 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding serine protease CVSP14, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| JP2005506047A (ja) | 2001-03-27 | 2005-03-03 | デンドレオン・サンディエゴ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 膜貫通型セリンプロテアーゼ９をコード化する核酸分子、コード化されたポリペプチドおよびそれらに基づく方法 |
| US7112430B2 (en) | 2001-05-14 | 2006-09-26 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 10, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| US20030134298A1 (en) * | 2001-07-03 | 2003-07-17 | Madison Edwin L. | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 20, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| IL159944A0 (en) * | 2001-07-19 | 2004-06-20 | Yissum Res Dev Co | Polypeptides having carotenoid isomerase catalytic activity, nucleic acids encoding same and uses thereof |
| US20030134794A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-07-17 | Madison Edwin L. | Nucleic acid molecules encoding serine protease 17, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| RU2261913C1 (ru) * | 2004-01-15 | 2005-10-10 | Институт биоорганической химии им.академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pES6-1, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ИНТЕРФЕРОН БЕТА-1b ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli BDEES6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА БЕТА-1b ЧЕЛОВЕКА |
| EP1723236A1 (en) | 2004-03-03 | 2006-11-22 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Method for the recombinant expression of an n-terminal fragment of hepatocyte growth factor |
| KR101147860B1 (ko) | 2008-09-22 | 2012-05-25 | 한국과학기술원 | 특정 아미노산의 ｔＲＮＡ와의 동시 발현을 통한 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 제조방법 |
| KR101317420B1 (ko) * | 2010-03-11 | 2013-10-10 | 한국과학기술원 | 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유 |
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|---|---|---|---|---|
| US4673641A (en) * | 1982-12-16 | 1987-06-16 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Co-aggregate purification of proteins |
| US4654307A (en) * | 1983-02-17 | 1987-03-31 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code |
| SE455704B (sv) * | 1983-10-24 | 1988-08-01 | Ac Biotechnics Ab | Bakteriecell innehallande plasmid med stabiliserad nedervning, plasmid samt forfarande for framstellning av bakteriecellen |
| US5145776A (en) * | 1987-01-14 | 1992-09-08 | President & Fellows Of Harvard College | Method of using T7 DNA polymerase to mutagenize and fill-in DNA |
| US4970147A (en) * | 1988-03-17 | 1990-11-13 | The General Hospital Corporation | Oxygen regulatable gene expression |
-
1989
- 1989-11-06 AU AU44443/89A patent/AU618640B2/en not_active Ceased
- 1989-11-08 CA CA002002516A patent/CA2002516C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-09 IL IL9226489A patent/IL92264A/en unknown
- 1989-11-10 EP EP89120895A patent/EP0373365B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-10 DE DE58907690T patent/DE58907690D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-10 AT AT89120895T patent/ATE105863T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-10 ES ES89120895T patent/ES2053917T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-10 DK DK564789A patent/DK175456B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-11-13 JP JP1292539A patent/JP2619077B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-27 US US08/009,423 patent/US6270988B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1984 * |
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| WO2009057622A1 (ja) * | 2007-10-29 | 2009-05-07 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | ヒト成長ホルモンの効率化された製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0373365B1 (de) | 1994-05-18 |
| EP0373365A1 (de) | 1990-06-20 |
| AU618640B2 (en) | 1992-01-02 |
| AU4444389A (en) | 1990-11-08 |
| CA2002516A1 (en) | 1990-05-11 |
| US6270988B1 (en) | 2001-08-07 |
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| DK564789D0 (da) | 1989-11-10 |
| ATE105863T1 (de) | 1994-06-15 |
| IL92264A (en) | 1994-08-31 |
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| ES2053917T3 (es) | 1994-08-01 |
| DK175456B1 (da) | 2004-11-01 |
| CA2002516C (en) | 1995-10-31 |
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