JPH02268696A - 抗ＨＩＶ―２モノクローナル抗体およびそれを用いた抗ＨＩＶ―２ｇｐ４１抗体の検出方法 - Google Patents
抗ＨＩＶ―２モノクローナル抗体およびそれを用いた抗ＨＩＶ―２ｇｐ４１抗体の検出方法Info
- Publication number
- JPH02268696A JPH02268696A JP2025000A JP2500090A JPH02268696A JP H02268696 A JPH02268696 A JP H02268696A JP 2025000 A JP2025000 A JP 2025000A JP 2500090 A JP2500090 A JP 2500090A JP H02268696 A JPH02268696 A JP H02268696A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hiv
- antibody
- amino acid
- monoclonal antibody
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—RNA viruses
- C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
- C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
- C07K16/1145—Env proteins, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, principal neutralising domain [PND] or CD4-binding site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/974—Aids related test
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
- Y10S930/221—Retrovirus related, or human immunodeficiency virus related, or simian immunodeficiency virus related
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因で
あるＩ−１１Ｖ （ヒト免疫不全ウィルス）に対する暴
露の検出に関する。さらに詳しくは、本発明は、マウス
モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９７、トＩＩｆ−２ｇｐ４
１内のそのエピトープに関し、これらは、ｌ目Ｖ−１ウ
イルスに暴露した患者から１−１１ Ｖ −２ウイルス
に暴露した患者を識別するのに用いるためのイムノアッ
セイの基礎を提供する。
あるＩ−１１Ｖ （ヒト免疫不全ウィルス）に対する暴
露の検出に関する。さらに詳しくは、本発明は、マウス
モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９７、トＩＩｆ−２ｇｐ４
１内のそのエピトープに関し、これらは、ｌ目Ｖ−１ウ
イルスに暴露した患者から１−１１ Ｖ −２ウイルス
に暴露した患者を識別するのに用いるためのイムノアッ
セイの基礎を提供する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）幾つ
かの）Ｉ Ｉ Ｖ単離物についでプロウィルスゲノムの
ヌクレオヂド配列が決定されている。それらＨＩ Ｖ
１１ｉｌ物としテハ、ＨＩ Ｖ −１株であルＩ−１’
１’ Ｌ Ｖ −Ｊ１７ ［ラットナ−（ＲａＬｎｅｒ
）ら、Ｎ ａｔｕｒｃ（１９８５）３１３：２７７］：
ΔＩ″ＬＶ −２［ザンヂエスベスカドール（Ｓ ａｎ
ｃｈｅｚ −Ｐ ｅｓｃａｄｏｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ
（１９８５）２２７ ：４８４ ］；ＬＡＶ［ウェイン
ーホブソン（Ｗ ａ ｉ ｎ−１−１ｏｂｓｏｎ）ら、
Ｃｃｌ［ＩＱ ８５）４０：９１およびＣＤＣ−／１５
１［デザイ（Ｄｅｓａｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、［ＪＳ Ａ（１９８６）８３ ：８３
８０］が挙げられる。）ｉｒＶ−２ＲＯＤ単離物のヌク
レオヂド配列は、ガイアダー（Ｇｕｙａｄｅｒ）らによ
って報告されている［Ｎ ａｔｕｒｅ（１９８７）３
２６ 二６６２］。 ＨＩＶ−２１１Ｈｚ 単ｍ物は、
ツァガリ−（Ｚ ａｇｕｒｙ）らによって報告されてい
る［ＰＮＡＳ（１９８８）８５：５９４１〜５９４５］
。さらに別のＩ−１Ｔ Ｖ配列がマイヤーズ（Ｍｅｙｅ
ｒｓ）らにより見出されている［ヒニーマン・レトロバ
イラスイズ・アンド・Ａ Ｉ Ｄ Ｓ （１−１ｕａ＋
ａｎ ＲｅＬｒｏｖｉｒｕｓｃｓ ａｎｄ Ａ Ｉ Ｄ
Ｓ ） ｌ ９８８、ア・コンビレーンヨン・アンド
・アナリシス・才ブ・ニュークレイツク・アシッド・ア
ンド・アミノ・アシブド−ンークエンシイズ（Ａ Ｃ
ｏｌｌ１ｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ａｎｄ Ａｍ１ｎ
ｏ Ａｃ１ｄ ５ｃｑｕｅｎｃｅｓ）（ロスアラモス・
ナショナル・ラボラトリ−（Ｌｏｓ ΔＩａＩ１１ｏｓ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ロス
アラモス、ＮＭ）］。
かの）Ｉ Ｉ Ｖ単離物についでプロウィルスゲノムの
ヌクレオヂド配列が決定されている。それらＨＩ Ｖ
１１ｉｌ物としテハ、ＨＩ Ｖ −１株であルＩ−１’
１’ Ｌ Ｖ −Ｊ１７ ［ラットナ−（ＲａＬｎｅｒ
）ら、Ｎ ａｔｕｒｃ（１９８５）３１３：２７７］：
ΔＩ″ＬＶ −２［ザンヂエスベスカドール（Ｓ ａｎ
ｃｈｅｚ −Ｐ ｅｓｃａｄｏｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ
（１９８５）２２７ ：４８４ ］；ＬＡＶ［ウェイン
ーホブソン（Ｗ ａ ｉ ｎ−１−１ｏｂｓｏｎ）ら、
Ｃｃｌ［ＩＱ ８５）４０：９１およびＣＤＣ−／１５
１［デザイ（Ｄｅｓａｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、［ＪＳ Ａ（１９８６）８３ ：８３
８０］が挙げられる。）ｉｒＶ−２ＲＯＤ単離物のヌク
レオヂド配列は、ガイアダー（Ｇｕｙａｄｅｒ）らによ
って報告されている［Ｎ ａｔｕｒｅ（１９８７）３
２６ 二６６２］。 ＨＩＶ−２１１Ｈｚ 単ｍ物は、
ツァガリ−（Ｚ ａｇｕｒｙ）らによって報告されてい
る［ＰＮＡＳ（１９８８）８５：５９４１〜５９４５］
。さらに別のＩ−１Ｔ Ｖ配列がマイヤーズ（Ｍｅｙｅ
ｒｓ）らにより見出されている［ヒニーマン・レトロバ
イラスイズ・アンド・Ａ Ｉ Ｄ Ｓ （１−１ｕａ＋
ａｎ ＲｅＬｒｏｖｉｒｕｓｃｓ ａｎｄ Ａ Ｉ Ｄ
Ｓ ） ｌ ９８８、ア・コンビレーンヨン・アンド
・アナリシス・才ブ・ニュークレイツク・アシッド・ア
ンド・アミノ・アシブド−ンークエンシイズ（Ａ Ｃ
ｏｌｌ１ｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ａｎｄ Ａｍ１ｎ
ｏ Ａｃ１ｄ ５ｃｑｕｅｎｃｅｓ）（ロスアラモス・
ナショナル・ラボラトリ−（Ｌｏｓ ΔＩａＩ１１ｏｓ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ロス
アラモス、ＮＭ）］。
１−１１ Ｖ−１感染の検出のために重要な血清学的標
的の一つに、膜透過性タンパク質（ＴＭＰ）であるｇｐ
４１がある。このタンパク質に対する抗体は血清変換に
際して最初に出現するものの一つであり、抗ｇｐ’ｌ
＋抗体がＡＩＤＳの無症候および他の臨床段階において
ほぼ全般的に存在することがら明示されるように、ｇｐ
４１に対する免疫応答は該疾但の進行を通じて比較的強
く保持されているものと思われる。該タンパク質に対す
る抗体応答の大部分は、よく特徴付けられた免疫優性（
ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）領域に向けられており
［ヂャング（Ｃｈａｎｇ）ら、ｒ３ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（１９８５）３ ：９０５〜９０９］、アミノ
酸５７８〜６１３として大まかに定められている（番号
付けはｌ−（Ｘ Ｆ３２単離物についでマイヤーズらに
よる）。重要な免疫原配列を形成するものとして免疫優
性領域内の特定の小さな配列が同定されてきている。そ
のような配列の例としては、ＲＩ ＬＡＶＥＩＩＹＬＫ
ＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ８（ベブヂドの免疫原性を保持す
るのＪＣａｒｇ −１、ｉｌｅ −２およびＩｙｓ−Ｉ
Ｑがそれぞれ重要な役割を担っている）［ワンプ（Ｗ
ａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ。
的の一つに、膜透過性タンパク質（ＴＭＰ）であるｇｐ
４１がある。このタンパク質に対する抗体は血清変換に
際して最初に出現するものの一つであり、抗ｇｐ’ｌ
＋抗体がＡＩＤＳの無症候および他の臨床段階において
ほぼ全般的に存在することがら明示されるように、ｇｐ
４１に対する免疫応答は該疾但の進行を通じて比較的強
く保持されているものと思われる。該タンパク質に対す
る抗体応答の大部分は、よく特徴付けられた免疫優性（
ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）領域に向けられており
［ヂャング（Ｃｈａｎｇ）ら、ｒ３ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（１９８５）３ ：９０５〜９０９］、アミノ
酸５７８〜６１３として大まかに定められている（番号
付けはｌ−（Ｘ Ｆ３２単離物についでマイヤーズらに
よる）。重要な免疫原配列を形成するものとして免疫優
性領域内の特定の小さな配列が同定されてきている。そ
のような配列の例としては、ＲＩ ＬＡＶＥＩＩＹＬＫ
ＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ８（ベブヂドの免疫原性を保持す
るのＪＣａｒｇ −１、ｉｌｅ −２およびＩｙｓ−Ｉ
Ｑがそれぞれ重要な役割を担っている）［ワンプ（Ｗ
ａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８６）８３
：６１５９〜６１６３］、Ｉ、ＧＬＷＧＣＳＧＫＬ
Ｉ ｃＣべ’ｊヂドの免疫原性を保持するのに両ｃｙｓ
残基が重要な役割を担っていると思われる）［ダナン（
Ｇ ｎａｎｎ）ら、Ｊ 、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７
）６１ ：２６３９〜２６４１］および５ＧＫＬ Ｉ
ＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ（天然ウィルスでは隠されている
か疾但の進行の間はｉ１Ｎされ免疫原性となるエピトー
プからなる）［ナーバネン（Ｎ ａｒｖａｎｅｎ）ら、
Ａ ＩＤ５（＋ ９８８）２：１１９〜１２３］が挙げ
られる。配列ＧＩＷＧＣＳＧＫＬ Ｔ Ｃをマツピング
するヒトモノクローナル抗体が産生されており、この配
列が免疫原としての中心的な役割を担っていることがさ
らに支持された［バナボー（ｇ ａｎａｐｏｕｒ）ら、
Ｊ 、 Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、（１９８７）１３９：４０
２７〜４０３３コ。
：６１５９〜６１６３］、Ｉ、ＧＬＷＧＣＳＧＫＬ
Ｉ ｃＣべ’ｊヂドの免疫原性を保持するのに両ｃｙｓ
残基が重要な役割を担っていると思われる）［ダナン（
Ｇ ｎａｎｎ）ら、Ｊ 、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７
）６１ ：２６３９〜２６４１］および５ＧＫＬ Ｉ
ＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ（天然ウィルスでは隠されている
か疾但の進行の間はｉ１Ｎされ免疫原性となるエピトー
プからなる）［ナーバネン（Ｎ ａｒｖａｎｅｎ）ら、
Ａ ＩＤ５（＋ ９８８）２：１１９〜１２３］が挙げ
られる。配列ＧＩＷＧＣＳＧＫＬ Ｔ Ｃをマツピング
するヒトモノクローナル抗体が産生されており、この配
列が免疫原としての中心的な役割を担っていることがさ
らに支持された［バナボー（ｇ ａｎａｐｏｕｒ）ら、
Ｊ 、 Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、（１９８７）１３９：４０
２７〜４０３３コ。
ｇｐ４１の他の領域は、免疫応答を引き起こす上で役割
を担っているとしても二次的な役割しか担っていないと
思われ［グナンら、Ｊ 、 Ｉ ｎｒｅｃｔ、Ｄ １ｓ
ｃａｓａｓ（１９８７）Ｉ ５６：２６１〜２６７：お
よびウインドホイザー（Ｗ ｉｎｄｈｅｕｇｅｒ）およ
びウッド（Ｗｏ。
を担っているとしても二次的な役割しか担っていないと
思われ［グナンら、Ｊ 、 Ｉ ｎｒｅｃｔ、Ｄ １ｓ
ｃａｓａｓ（１９８７）Ｉ ５６：２６１〜２６７：お
よびウインドホイザー（Ｗ ｉｎｄｈｅｕｇｅｒ）およ
びウッド（Ｗｏ。
ｄ）、Ｇｅｎｅ（１９８８）６４：１０７〜！ １９］
、診断上有用なものとしては同定されていない。
、診断上有用なものとしては同定されていない。
ＬＩ Ｉ Ｖ −２の免疫優性エピトープ（本明細書で
は、以下、ｒＨＩ Ｖ −２ｇｐ４ Ｎという）に関シ
テははるかに知られておらず、この分野の研究は、１−
１１ Ｖ−１に対する暴露から１−１ ［Ｖ −２に対
する暴露を識別するための血清学的標的として該タンパ
ク質の免疫優性領域を使用することに主として向けられ
ている。ダナンら［５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３７
：１３４６〜１３４９コは、ＨＩ Ｖ −２に対する抗
体を検出しこれをＩ−（ＩＶ−１に対する抗体から識別
するために、合成ペプチドＮ５ＷＧＣＡＦＲＱＶＣ中＋
ＣＨ［Ｖ−２ｒｔＯＤ免疫侵免疫酸性領域を用いた。加
えて、コツト（Ｃｏｔ）ら［ＡＩＤＳ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ＦＺｅｔｒｏｖｉｒｕＳｅ
ｓ（１９８８）４ ：２３９〜２４１］もまた、ＨｒＶ
−１ｇｐ４１に対するヒト抗体からＨＩＶ−２ｇｐ４１
に対するヒト抗体を識別するために免疫優性領域ペプチ
ドを用いた。用いたｌ−１１Ｖ −２ベブヂドは、配列
Ｉ？ＶＴＡ ＩＥＫＹＴ、ＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦ
ＲＱＶＣであった。両研究において、利用した領域は第
二のシスティン残基で終わっていた。
は、以下、ｒＨＩ Ｖ −２ｇｐ４ Ｎという）に関シ
テははるかに知られておらず、この分野の研究は、１−
１１ Ｖ−１に対する暴露から１−１ ［Ｖ −２に対
する暴露を識別するための血清学的標的として該タンパ
ク質の免疫優性領域を使用することに主として向けられ
ている。ダナンら［５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３７
：１３４６〜１３４９コは、ＨＩ Ｖ −２に対する抗
体を検出しこれをＩ−（ＩＶ−１に対する抗体から識別
するために、合成ペプチドＮ５ＷＧＣＡＦＲＱＶＣ中＋
ＣＨ［Ｖ−２ｒｔＯＤ免疫侵免疫酸性領域を用いた。加
えて、コツト（Ｃｏｔ）ら［ＡＩＤＳ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ＦＺｅｔｒｏｖｉｒｕＳｅ
ｓ（１９８８）４ ：２３９〜２４１］もまた、ＨｒＶ
−１ｇｐ４１に対するヒト抗体からＨＩＶ−２ｇｐ４１
に対するヒト抗体を識別するために免疫優性領域ペプチ
ドを用いた。用いたｌ−１１Ｖ −２ベブヂドは、配列
Ｉ？ＶＴＡ ＩＥＫＹＴ、ＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦ
ＲＱＶＣであった。両研究において、利用した領域は第
二のシスティン残基で終わっていた。
両研究においても、また他のいかなる報告にも、ｔ−ｉ
ｉ ｖ −２配列ＨＴ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗが血清学的標
的として、またはモノクローナル抗体の抗原として診断
的価値を存することは示されていない。
ｉ ｖ −２配列ＨＴ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗが血清学的標
的として、またはモノクローナル抗体の抗原として診断
的価値を存することは示されていない。
（課題を解決するための手段）
本発明の目的は、アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを実質的に
有するＨＩＶ−２ｇｐ４１上のエピトープに対する特異
性を特徴とするモノクローナル抗体： 上記モノクローナル抗体を産生ずる咄乳動物抗体産生細
胞抹； マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＩ（Ｂ１００
１２゜ ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＪ、ＩＢ Ｉ ００１２
により産生されたモノクローナル抗体：但者のＨ［Ｖ
−１に対する暴露からＩ−Ｉ Ｉ Ｖ −２に対する暴
露を識別する方法であって、 （ｉ）該患者からの生物学的試料を、実質的にＨｒＶ−
２のアミノ酸５７８からアミノ＃６０３の領域からなる
アミノ酸配列に結合した、アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを
実質的に有するエピトープを含む抗原、および該エピト
ープに特異的な抗体と接触させて抗原抗体複合体を生成
させ、ついで（ｉ ｉ）生成した該複合体のｍを測定し
てｌ−目Ｖ−２に対するｎ露を決定する ことを特徴とする方法；および 生物学的試料中のｉ−１１Ｖ−２ｇｐ’ｌ Ｉに対する
抗体の存在または爪を検出する方法であって、（ｉ）該
試料を、実質的に１−１１ Ｖ −２のアミノ酸５７８
からアミノ酸６０３の領域からなるアミノ酸配列に結合
した、アミノ酸配列ＨＴ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗを実質的に有
するエピトープを含む抗原、および該エピトープに特異
的な流体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、つい
で （ｉ ｉ）生成した該複合体のｍを測定して試料中のＨ
ＩＶ−２ｇｐ４１に対する抗体の存在または爪を決定す
る ことを特徴とする方法を提供することにある。
有するＨＩＶ−２ｇｐ４１上のエピトープに対する特異
性を特徴とするモノクローナル抗体： 上記モノクローナル抗体を産生ずる咄乳動物抗体産生細
胞抹； マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＩ（Ｂ１００
１２゜ ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＪ、ＩＢ Ｉ ００１２
により産生されたモノクローナル抗体：但者のＨ［Ｖ
−１に対する暴露からＩ−Ｉ Ｉ Ｖ −２に対する暴
露を識別する方法であって、 （ｉ）該患者からの生物学的試料を、実質的にＨｒＶ−
２のアミノ酸５７８からアミノ＃６０３の領域からなる
アミノ酸配列に結合した、アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを
実質的に有するエピトープを含む抗原、および該エピト
ープに特異的な抗体と接触させて抗原抗体複合体を生成
させ、ついで（ｉ ｉ）生成した該複合体のｍを測定し
てｌ−目Ｖ−２に対するｎ露を決定する ことを特徴とする方法；および 生物学的試料中のｉ−１１Ｖ−２ｇｐ’ｌ Ｉに対する
抗体の存在または爪を検出する方法であって、（ｉ）該
試料を、実質的に１−１１ Ｖ −２のアミノ酸５７８
からアミノ酸６０３の領域からなるアミノ酸配列に結合
した、アミノ酸配列ＨＴ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗを実質的に有
するエピトープを含む抗原、および該エピトープに特異
的な流体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、つい
で （ｉ ｉ）生成した該複合体のｍを測定して試料中のＨ
ＩＶ−２ｇｐ４１に対する抗体の存在または爪を決定す
る ことを特徴とする方法を提供することにある。
本発明は、まず、アミノ酸配列）ＩＴＴＶＰＷを実質的
に存するＨ Ｉ Ｖ−２ｇｐ４１上のエピトープに対す
る特異性を特徴とするモノクローナル抗体を提供する。
に存するＨ Ｉ Ｖ−２ｇｐ４１上のエピトープに対す
る特異性を特徴とするモノクローナル抗体を提供する。
本発明はまた、該モノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマ細胞株を６提供する。好ましいｊ３様において
、マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＩ（Ｉ３１
００１２はモノクローナル抗体１−［３７ｃ９４を産生
ずる。
リドーマ細胞株を６提供する。好ましいｊ３様において
、マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＩ（Ｉ３１
００１２はモノクローナル抗体１−［３７ｃ９４を産生
ずる。
本発明はまた、患者のＩ−ｆ Ｉ Ｖ −１に対する暴
ハから■１１ Ｖ−２に対する暴露を識別する方法をも
提供する。該方法は、該患者からの生物学的試料を、実
質的にＨＩ Ｖ−２のアミノ酸５７８からアミノ酸６０
３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミノ酸配
列）Ｉ Ｔ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗを実質的に１４するエピト
−プを含む抗原、および該エピトープに特異的な抗体と
接触さＵて抗原抗体複合体を生成さＵ、ついで、生成し
た該複合体の舟を測定してＩ−１ｒ Ｖ −２に対する
暴露を決定する、ことを特徴とする。
ハから■１１ Ｖ−２に対する暴露を識別する方法をも
提供する。該方法は、該患者からの生物学的試料を、実
質的にＨＩ Ｖ−２のアミノ酸５７８からアミノ酸６０
３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミノ酸配
列）Ｉ Ｔ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗを実質的に１４するエピト
−プを含む抗原、および該エピトープに特異的な抗体と
接触さＵて抗原抗体複合体を生成さＵ、ついで、生成し
た該複合体の舟を測定してＩ−１ｒ Ｖ −２に対する
暴露を決定する、ことを特徴とする。
他の態様において、本発明のモノクローナル抗体は、生
物学的試料中の抗ト冊Ｖ−２抗体を検出するためのプロ
ーブとして用いることができる。
物学的試料中の抗ト冊Ｖ−２抗体を検出するためのプロ
ーブとして用いることができる。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、アミノ酸配列［Ｉ Ｔ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗを実
質的に有するｌ−１１Ｖ−２ｇｐ４１上のエピト−プに
対する特異性を特徴とするモノクローナル抗体を１是供
する。ここで、「実質的」なる語は、保存されたまたは
保存されないアミノ酸変化を含みながら、なお該モノク
ローナル抗体により認識されるあらゆる関連配列を包含
することを意味する。
質的に有するｌ−１１Ｖ−２ｇｐ４１上のエピト−プに
対する特異性を特徴とするモノクローナル抗体を１是供
する。ここで、「実質的」なる語は、保存されたまたは
保存されないアミノ酸変化を含みながら、なお該モノク
ローナル抗体により認識されるあらゆる関連配列を包含
することを意味する。
他の態様において、本発明は、本発明のモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞株を提供する。好ま
しい態様において、マウス由来ハイブリドーマ細胞株Δ
ＴＣＣｔｌＢＩ００１２はモノクローナル抗体Ｈ３７ｃ
９４を産生ずる。
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞株を提供する。好ま
しい態様において、マウス由来ハイブリドーマ細胞株Δ
ＴＣＣｔｌＢＩ００１２はモノクローナル抗体Ｈ３７ｃ
９４を産生ずる。
本発明はまた、患者のＩ−Ｉ Ｉ Ｖ −１に対する暴
露からＩ−Ｉ Ｔ Ｖ −２に対する暴露を識別する方
法をも提供する。該方法は、該４ｗ者からの生物学的試
料を、実質的にＨＩＶ−２のアミノ酸５７８からアミノ
酸６０３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミ
ノ酸配列１１ＴＴＶ））Ｗを実質的に有するエピトープ
を含む抗原、および該エピトープに特異的な抗体と接触
させて抗原抗体複合体を生成させ、ついで、生成した該
複合体の量を測定して！−Ｎ Ｉ Ｖ −２に対する暴
露を決定する、ことを特徴とする。
露からＩ−Ｉ Ｔ Ｖ −２に対する暴露を識別する方
法をも提供する。該方法は、該４ｗ者からの生物学的試
料を、実質的にＨＩＶ−２のアミノ酸５７８からアミノ
酸６０３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミ
ノ酸配列１１ＴＴＶ））Ｗを実質的に有するエピトープ
を含む抗原、および該エピトープに特異的な抗体と接触
させて抗原抗体複合体を生成させ、ついで、生成した該
複合体の量を測定して！−Ｎ Ｉ Ｖ −２に対する暴
露を決定する、ことを特徴とする。
上記方法に用いる抗原には、不活化全ウィルス、または
部分的に精製した天然の、合成の、もしくは組換えによ
り製造したＨＩＶ−２ｇｐ４１が含まれる。該エピトー
プに結合した該アミノ酸において用いた「実質的」なる
語は、保存されたまたは保γｆされないアミノ酸変化お
よびアミノ酸の付加もしくは欠失を含みながら、なお！
−１１Ｖ−２ｇｐ４１ヒト成体を認識するあらゆる配列
を包含することを意味する。
部分的に精製した天然の、合成の、もしくは組換えによ
り製造したＨＩＶ−２ｇｐ４１が含まれる。該エピトー
プに結合した該アミノ酸において用いた「実質的」なる
語は、保存されたまたは保γｆされないアミノ酸変化お
よびアミノ酸の付加もしくは欠失を含みながら、なお！
−１１Ｖ−２ｇｐ４１ヒト成体を認識するあらゆる配列
を包含することを意味する。
好ま１．い態様において、本発明の方法は、アミノ酸）
ＩＴＴＶＰＷを実質的に有するエピトープに特異的な抗
体としてｌ−１３７ｃ９４を用いる。このモノクローナ
ル抗体１−１３７ｃ９４は、該抗原に対する結合に関し
、試料中に含まれる抗１−１１ Ｖ −２ｇｐ４１抗体
と競合する。
ＩＴＴＶＰＷを実質的に有するエピトープに特異的な抗
体としてｌ−１３７ｃ９４を用いる。このモノクローナ
ル抗体１−１３７ｃ９４は、該抗原に対する結合に関し
、試料中に含まれる抗１−１１ Ｖ −２ｇｐ４１抗体
と競合する。
本発明の他の態様において、モノクローナル抗体Ｈ３７
ｃ９４は、生物学的試料中の抗ＨＩ Ｖ２ ｇｐ４１抗
体を検出するためのプローブとして用いることができる
。好ましいｊ７３槌では、試験試料を標識Ｈ３７ｅ９４
と混合１−１ついで固体支持体に固定した組換えＩ−ｒ
Ｉ Ｖ−２ｇｐ４１を加える。
ｃ９４は、生物学的試料中の抗ＨＩ Ｖ２ ｇｐ４１抗
体を検出するためのプローブとして用いることができる
。好ましいｊ７３槌では、試験試料を標識Ｈ３７ｅ９４
と混合１−１ついで固体支持体に固定した組換えＩ−ｒ
Ｉ Ｖ−２ｇｐ４１を加える。
結合した標識［−１３７ｃ９４が存在しないと吸光度は
減少し、試験試料中に抗ＨＩＶ−２ｇｐ４１坑体が存在
したことを示ず。ｔｌ、３７ｃ９４をヒト抗ＩＩ Ｉ
Ｖ −２抗体と競合さＵ゛る他のアッセイのり様は、当
業者には知られている。
減少し、試験試料中に抗ＨＩＶ−２ｇｐ４１坑体が存在
したことを示ず。ｔｌ、３７ｃ９４をヒト抗ＩＩ Ｉ
Ｖ −２抗体と競合さＵ゛る他のアッセイのり様は、当
業者には知られている。
本発明の方法により容易に試験できる生物学的試料とし
ては、全面、面清、商事、脳を髄液およびリンパ球など
のヒトおよび動物体液または細胞培養上清などが挙げら
れる。
ては、全面、面清、商事、脳を髄液およびリンパ球など
のヒトおよび動物体液または細胞培養上清などが挙げら
れる。
本発明のイムノアッセイに用いる固体支持体としては、
反応トレイのウェル、試験管、ポリスチレンビーズ、ス
トリップ、膜、微細粒子、および当業者に知られた他の
固体マトリックスなどが挙げられる。
反応トレイのウェル、試験管、ポリスチレンビーズ、ス
トリップ、膜、微細粒子、および当業者に知られた他の
固体マトリックスなどが挙げられる。
検出可能なシグナルを生成することのできるあらゆる標
識または酵素増幅ンステムを本発明のイムノアッセイに
用いることができる。代表的な標識としては、酵素標識
、放射性同位体標識、蛍光標識および化学発光標識が挙
げられる。または特異的結合成分のペアを用いることも
でき、その際、一方の成分を本発明アッセイの抗体に結
合させ、もう一方の成分を検出可能な標識に結合させる
。
識または酵素増幅ンステムを本発明のイムノアッセイに
用いることができる。代表的な標識としては、酵素標識
、放射性同位体標識、蛍光標識および化学発光標識が挙
げられる。または特異的結合成分のペアを用いることも
でき、その際、一方の成分を本発明アッセイの抗体に結
合させ、もう一方の成分を検出可能な標識に結合させる
。
たとえば、ビオヂン／標識抗ビオチン系のようなハブテ
ン／標識抗ハブテン系を用いることができる。加えて、
該抗体に対する標識特異的結合タンパク質を用いること
もでき、該タンパク質は、標識した第二の抗体または標
識したプロティンＡであってよい。」二記モノク【１−
ナル抗体がマウス（１＝山来するときは、該モノクロー
ナル抗体に特異的な標識ｂ″Ｃマウス免疫免疫グツ−１
プリンいることができる。本明細書に記載のモノクロー
ナル抗体を検１１するために、標識した抗イデイオタイ
プ抗体を用いることらできる。
ン／標識抗ハブテン系を用いることができる。加えて、
該抗体に対する標識特異的結合タンパク質を用いること
もでき、該タンパク質は、標識した第二の抗体または標
識したプロティンＡであってよい。」二記モノク【１−
ナル抗体がマウス（１＝山来するときは、該モノクロー
ナル抗体に特異的な標識ｂ″Ｃマウス免疫免疫グツ−１
プリンいることができる。本明細書に記載のモノクロー
ナル抗体を検１１するために、標識した抗イデイオタイ
プ抗体を用いることらできる。
加えて、本発明のアッセイ試薬は、キットを調製するの
に理想的に適している。その、Ｌうなキットは、密な区
域内に収容するために区画化されたギヤリヤ手段、およ
びバイアル、びん、試験管などの１または２以上のコン
テナー手段からなる。
に理想的に適している。その、Ｌうなキットは、密な区
域内に収容するために区画化されたギヤリヤ手段、およ
びバイアル、びん、試験管などの１または２以上のコン
テナー手段からなる。
各コンテナー手段は、本発明のイムノアッセイに用いる
別々の要素の一つを含んでいる。
別々の要素の一つを含んでいる。
細胞株Ｈ３７ｃ９４を、１９８９年１月３１［］に受託
番号１−１１１１００１２にてアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ’ｒｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｃｃｔｉｏｎＸ［７Ｚｌク
ビル、メリーランド）に寄託した。
番号１−１１１１００１２にてアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ’ｒｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｃｃｔｉｏｎＸ［７Ｚｌク
ビル、メリーランド）に寄託した。
以下に述べる方法および実施例は、本発明のモノクロー
ナル抗体Ｈ３７ｃ９４の調製および特徴付１ｙ、並びに
小者のＩＩＪＶ−１への暴露から１４ ＴＶ−２への暴
〃を識別するノコめのその臨床学的ａ用性を、詳述する
ものである。
ナル抗体Ｈ３７ｃ９４の調製および特徴付１ｙ、並びに
小者のＩＩＪＶ−１への暴露から１４ ＴＶ−２への暴
〃を識別するノコめのその臨床学的ａ用性を、詳述する
ものである。
ｎえ
Ａ、合成ペプチドの合成
バラリー（Ｂ ａｒａｒｙ）およびメリフィールド（Ｍ
ａｒｒｉｆｉｅｌｄ）により記載された一般的な方法Ｅ
グロス＆マイネホーフｙ （Ｇ ｒｏｓｓ＆ Ｍｅｉ
ｎｅｈｏｆｅｒ）編、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、 Ｖ
ｏｌ、２（アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８
０）］に従い、■目Ｖ−２エンベロープタンパク質の配
列６０４〜６３６に対応するペプチドを樹脂支持体上で
段階固相合成法（カルボキシ末々１′μ残ＪＩ（から合
成１１１１姶）により組み立てた。ＢＯＣ−Ｌ−Δ５ｎ
−ＯＣＨ，−Ｐａｍ樹脂をアプライド・バイオシステム
ズ・シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｃｍｓ ５ｙｎｔｈｃｓｉｚｃｒ）、モデル４３０Δの
反応容器に移した。アルギニン、アスパラギンおよびグ
ルタミン付加の場合にニーニッヒ（Ｋｏｎｉｇ）および
ガイガー（Ｇ ｅｉｇｅｒ）により記載されたＤＣＣ／
ｌ−１０＋３Ｔプロトコール［Ｃｈｅｍ、 ＋３ ｅｒ
。
ａｒｒｉｆｉｅｌｄ）により記載された一般的な方法Ｅ
グロス＆マイネホーフｙ （Ｇ ｒｏｓｓ＆ Ｍｅｉ
ｎｅｈｏｆｅｒ）編、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、 Ｖ
ｏｌ、２（アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８
０）］に従い、■目Ｖ−２エンベロープタンパク質の配
列６０４〜６３６に対応するペプチドを樹脂支持体上で
段階固相合成法（カルボキシ末々１′μ残ＪＩ（から合
成１１１１姶）により組み立てた。ＢＯＣ−Ｌ−Δ５ｎ
−ＯＣＨ，−Ｐａｍ樹脂をアプライド・バイオシステム
ズ・シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｃｍｓ ５ｙｎｔｈｃｓｉｚｃｒ）、モデル４３０Δの
反応容器に移した。アルギニン、アスパラギンおよびグ
ルタミン付加の場合にニーニッヒ（Ｋｏｎｉｇ）および
ガイガー（Ｇ ｅｉｇｅｒ）により記載されたＤＣＣ／
ｌ−１０＋３Ｔプロトコール［Ｃｈｅｍ、 ＋３ ｅｒ
。
（１９７０）ｌ ０３ニア８８〜７９８］を用いた他は
、既存の対称無水物法（ｐｒｅｒｏｒｍｃｄ ｓｙｍｍ
ｅｔｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）により保護アミノ酸を樹脂支持体に段階的に二重結合
さＵ゛た。ずべてのα−アミノ末端残基はｔ−ブヂルオ
ギンカルポニル（１−ＢＯＣ）結合により保護し、種々
のアミノ酸残基の側鎖は下記基により保護した：Ｔｈｒ
（Ｂｚｌ）、Ｔｌ１ｓ（Ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（４ＭｅＩ３
ｚｌ）、Ａ ｒｇ（Ｔ ｏｓ）、５ｅｒ（ｎｚｌ）、Ａ
ｓｐ（Ｏｌｌｚｌ）、Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）、Ｌｙｓ
（２−Ｃ１−Ｚ）、Ｇ Ｉｕ（ＯＢ ｚｌ）、アミノ酸
のトリプト７７ンおよびメヂオニンは、側鎖保護基を用
いることなく使用した。トリプトファン導入後、その後
のすべてのＮα−保護（Ｂ ＯＣ）基を除去するため、
インドールを１％（Ｗ／Ｖ）の濃度にてトリフルオロ酢
酸に加えた。メヂオニン導入後、エタンジオールもまた
０、２５％（ｖ／Ｖ）の濃度にてトリフルオロ酢酸に加
えた。
、既存の対称無水物法（ｐｒｅｒｏｒｍｃｄ ｓｙｍｍ
ｅｔｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）により保護アミノ酸を樹脂支持体に段階的に二重結合
さＵ゛た。ずべてのα−アミノ末端残基はｔ−ブヂルオ
ギンカルポニル（１−ＢＯＣ）結合により保護し、種々
のアミノ酸残基の側鎖は下記基により保護した：Ｔｈｒ
（Ｂｚｌ）、Ｔｌ１ｓ（Ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（４ＭｅＩ３
ｚｌ）、Ａ ｒｇ（Ｔ ｏｓ）、５ｅｒ（ｎｚｌ）、Ａ
ｓｐ（Ｏｌｌｚｌ）、Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）、Ｌｙｓ
（２−Ｃ１−Ｚ）、Ｇ Ｉｕ（ＯＢ ｚｌ）、アミノ酸
のトリプト７７ンおよびメヂオニンは、側鎖保護基を用
いることなく使用した。トリプトファン導入後、その後
のすべてのＮα−保護（Ｂ ＯＣ）基を除去するため、
インドールを１％（Ｗ／Ｖ）の濃度にてトリフルオロ酢
酸に加えた。メヂオニン導入後、エタンジオールもまた
０、２５％（ｖ／Ｖ）の濃度にてトリフルオロ酢酸に加
えた。
保護ペプチド−樹脂（３０Ｑｚｇ）を塩化メチレン（Ｃ
ｔｌｙＣＬ）中で５分間膨潤させた。、Ｎα−ＢＯＣ保
護基の除去は、インドールおよびエタンジオールを含有
する６０％トリフル才［１酢酸（ＴＥＡ／Ｃ１，ＣＩ、
）を用い、ＣＩＩｔＣｌ、で洗浄！７．１０％Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥΔ／ ＣＨｔ Ｃ
Ｉ ｚ）で中和し、最後にＣＩ−１１ＣＩ 、で洗浄す
ることにより行った。この樹脂を真空乾燥させた。こう
して得られたペプチド−樹脂を無水フッ化水素酸（＋−
ｒＦ、 Ｉ ０１１２）で処理し、これに０℃にてｐ
−クレゾール（１ｘＱ）およびジメヂルスルフィド（ｌ
ｘＱ）を６０分間かけて加えた。Ｉ−Ｉ Ｆを０℃に
て真空留去した。開裂した遊離のペプチドおよび樹脂を
ジエヂルエーテルのアリコート（１５ｇ０で３回洗浄し
た。ついで、このペプチドを４０％酢酸水溶液のアリコ
ート（１０１ので６回抽出した。
ｔｌｙＣＬ）中で５分間膨潤させた。、Ｎα−ＢＯＣ保
護基の除去は、インドールおよびエタンジオールを含有
する６０％トリフル才［１酢酸（ＴＥＡ／Ｃ１，ＣＩ、
）を用い、ＣＩＩｔＣｌ、で洗浄！７．１０％Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥΔ／ ＣＨｔ Ｃ
Ｉ ｚ）で中和し、最後にＣＩ−１１ＣＩ 、で洗浄す
ることにより行った。この樹脂を真空乾燥させた。こう
して得られたペプチド−樹脂を無水フッ化水素酸（＋−
ｒＦ、 Ｉ ０１１２）で処理し、これに０℃にてｐ
−クレゾール（１ｘＱ）およびジメヂルスルフィド（ｌ
ｘＱ）を６０分間かけて加えた。Ｉ−Ｉ Ｆを０℃に
て真空留去した。開裂した遊離のペプチドおよび樹脂を
ジエヂルエーテルのアリコート（１５ｇ０で３回洗浄し
た。ついで、このペプチドを４０％酢酸水溶液のアリコ
ート（１０１ので６回抽出した。
水性抽出物を集めて凍結乾燥して苓口製のペプチドを得
、情製に付した。
、情製に付した。
この粗製のペプチドを、分析カラム［Ｖｙｄａｃ−２１
４−ＴＰ５４、ビダック・セパレーション・グループ（
Ｖｙｄａｃ ５ｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ）、ヘ
スペリア、カリフォルニア］においてはｌ ｚ（１／分
の流速、セミプレバラティブカラｊｂ（Ｖｙｄａｃ−２
１４−ＴＰ ｌ ０２２］、：おいてはｌ２Ｉａ／分の
流速にて、溶媒系として０．１％ＴＦΔ／水（Ａ）およ
び１００％アセトニトリル（Ｂ）の勾配を用いたＣ。
４−ＴＰ５４、ビダック・セパレーション・グループ（
Ｖｙｄａｃ ５ｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ）、ヘ
スペリア、カリフォルニア］においてはｌ ｚ（１／分
の流速、セミプレバラティブカラｊｂ（Ｖｙｄａｃ−２
１４−ＴＰ ｌ ０２２］、：おいてはｌ２Ｉａ／分の
流速にて、溶媒系として０．１％ＴＦΔ／水（Ａ）およ
び１００％アセトニトリル（Ｂ）の勾配を用いたＣ。
カラム上の逆相ＨＩ） Ｌ Ｃにより精製した。上記勾
配は、３０％Ｂで開始した。３分後、２０分の間にこの
勾配を４０％Ｂまで一次的に増加させ、ついで１分で３
０％Ｂに戻した。
配は、３０％Ｂで開始した。３分後、２０分の間にこの
勾配を４０％Ｂまで一次的に増加させ、ついで１分で３
０％Ｂに戻した。
ペプチドの存在は、２２５ｎａ＋および２８０止にてモ
ニターした。ペプチドの組成は、６Ｎ塩酸１０．３％フ
ェノール中、１５０℃にて２時間真空下に加水分解し、
引き続きベックマン６３００アミノ酸分析機で分析する
ことにより確認した。
ニターした。ペプチドの組成は、６Ｎ塩酸１０．３％フ
ェノール中、１５０℃にて２時間真空下に加水分解し、
引き続きベックマン６３００アミノ酸分析機で分析する
ことにより確認した。
Ｈ［Ｖ−２エンベロープの配列５７７〜６０７に対応す
るペプチドを上記のようにして組み立てた。トリプトフ
ァン導入後、その後のすべてのＮα−保護基（Ｌ−ＢＯ
Ｃ）を除去するため、インドールを１１／村の濃度にて
トリフルオロ酢酸に加えた。３２０ｉ９の保護ペプチド
−樹脂を８ 、５３１１２の無水フッ化水素酸（ＩＩＦ
）で処理し、これにｐ−クレゾール（０，５Ｎ１２）、
ｐ−ヂオクレゾール（０，５ｇ）およびジメヂルスルフ
ィド（０，５ｆｆ□を加えた。
るペプチドを上記のようにして組み立てた。トリプトフ
ァン導入後、その後のすべてのＮα−保護基（Ｌ−ＢＯ
Ｃ）を除去するため、インドールを１１／村の濃度にて
トリフルオロ酢酸に加えた。３２０ｉ９の保護ペプチド
−樹脂を８ 、５３１１２の無水フッ化水素酸（ＩＩＦ
）で処理し、これにｐ−クレゾール（０，５Ｎ１２）、
ｐ−ヂオクレゾール（０，５ｇ）およびジメヂルスルフ
ィド（０，５ｆｆ□を加えた。
この粗製のペプチドを、２８％■３の勾配から始め、３
分後に２３分間かけて４５％Ｂまで一次的に増加させて
精製した。ついで、１分間かけて２８％Ｂまで戻した。
分後に２３分間かけて４５％Ｂまで一次的に増加させて
精製した。ついで、１分間かけて２８％Ｂまで戻した。
Ｂ、免疫
５匹のＢａ１ｂ？ウスをｔｌ Ｉ Ｖ−２ｇｐ４１ペプ
チド６０４〜６３６で免疫した。５００朽のｐ６０４〜
６３６を、解毒した内毒素（５００μ？）およびトレハ
ロースダイマイコレート（５００１ｔ９）全含有するＲ
ＩＢＩアジュバント［ＲＩ ｒ３ ［イムノケム・リザ
ーヂ（ＲＩＢＩ Ｉ＋ｍｕｎｏｃｈｅｉ、Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ｉｎｃ、）］（製造業者により記載されたよ
うにしてクロロホルム／メタノール中で再溶解させたし
の）と混合した。スクアレン（２０μｍ２）を加え、こ
の混合物をホモジナイズし、ついで０．２％ツイーン２
０を含有する水を最終容量１．２ｚＱまで加えノこ。
チド６０４〜６３６で免疫した。５００朽のｐ６０４〜
６３６を、解毒した内毒素（５００μ？）およびトレハ
ロースダイマイコレート（５００１ｔ９）全含有するＲ
ＩＢＩアジュバント［ＲＩ ｒ３ ［イムノケム・リザ
ーヂ（ＲＩＢＩ Ｉ＋ｍｕｎｏｃｈｅｉ、Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ｉｎｃ、）］（製造業者により記載されたよ
うにしてクロロホルム／メタノール中で再溶解させたし
の）と混合した。スクアレン（２０μｍ２）を加え、こ
の混合物をホモジナイズし、ついで０．２％ツイーン２
０を含有する水を最終容量１．２ｚＱまで加えノこ。
１回目に各マウスに０ 、 Ｉ ｘＱを皮下で、Ｏ、Ｉ
ｘＱ。
ｘＱ。
を腹腔内で投与し、ｐ６０４〜６３６を合計で約１００
μ？投与するようにした。８週間後、上記のようにして
２５（Ｊ１１９のｐ６０４〜６３６を２５０μ９のＲ１
８１アノユバントと混合することにより調製したｐ６０
４〜６３６（５０ｇｇ）を各マウスに投与して２回目の
免疫を行った。３回目、４回目および５回目の免疫に関
しては、それぞれ最初の免疫から２０週、２３逓および
２９週後に、Ｒ［ＢＩアジュバント中の約３４μ？、２
５μ２および２５μ９のｐ６０４〜６３６で腹腔内およ
び皮下投与によりマウスを免疫した。４回目の免疫の５
日後にマウスを出血させた。免疫マウスの免疫応答は、
下記で述べる酵素結合イムノアッセイにより、坑ＨＩ
Ｖ −２抗体についで血ｔ１１７をアッセイすることに
より評価した。４遇間後、１匹の特定（７）マウスを滅
菌水（１５０ｆｉ）中（７）ｐ６０４〜６３６ （Ｉ
ｘｇ／ｘＱ、 ｌ ＯＯμＱ）を尾静脈に注射して免
疫した。３日後、このマウスを融合のため屠殺した。
μ？投与するようにした。８週間後、上記のようにして
２５（Ｊ１１９のｐ６０４〜６３６を２５０μ９のＲ１
８１アノユバントと混合することにより調製したｐ６０
４〜６３６（５０ｇｇ）を各マウスに投与して２回目の
免疫を行った。３回目、４回目および５回目の免疫に関
しては、それぞれ最初の免疫から２０週、２３逓および
２９週後に、Ｒ［ＢＩアジュバント中の約３４μ？、２
５μ２および２５μ９のｐ６０４〜６３６で腹腔内およ
び皮下投与によりマウスを免疫した。４回目の免疫の５
日後にマウスを出血させた。免疫マウスの免疫応答は、
下記で述べる酵素結合イムノアッセイにより、坑ＨＩ
Ｖ −２抗体についで血ｔ１１７をアッセイすることに
より評価した。４遇間後、１匹の特定（７）マウスを滅
菌水（１５０ｆｉ）中（７）ｐ６０４〜６３６ （Ｉ
ｘｇ／ｘＱ、 ｌ ＯＯμＱ）を尾静脈に注射して免
疫した。３日後、このマウスを融合のため屠殺した。
Ｃ，マイクロタイタープレートの調製
１．０μ９／１１（ｌのｐ５７７〜６０７の溶液および
１．０ｇｇ／肩Ｑのｐ６０４〜６３Ｇの溶液を、炭酸水
素塩バッファー（ｐｉ−１９、６）を用いて１ｌｉ１０
した。
１．０ｇｇ／肩Ｑのｐ６０４〜６３Ｇの溶液を、炭酸水
素塩バッファー（ｐｉ−１９、６）を用いて１ｌｉ１０
した。
ウェル当たり１００μＱのｐ５７７〜６０７溶液かまた
はｐ６０４〜６３６溶液を用い、マイクロタイタープレ
ートを室温にて一部コーティングした。
はｐ６０４〜６３６溶液を用い、マイクロタイタープレ
ートを室温にて一部コーティングした。
このプレートを炭酸水素塩バッファーで洗浄し、ついで
室温にてウェル当たり２００μＱの炭酸水素塩バッファ
ー中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３時間かけ
てコーティングした。このプレートを、０．０５％ツイ
ーン２０および０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）を含有するりン酸緩衝食塩水（Ｐ［３Ｓ）で３回
洗浄した。
室温にてウェル当たり２００μＱの炭酸水素塩バッファ
ー中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３時間かけ
てコーティングした。このプレートを、０．０５％ツイ
ーン２０および０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）を含有するりン酸緩衝食塩水（Ｐ［３Ｓ）で３回
洗浄した。
Ｄ 酵素結合イムノアッセイ（Ｅ ＩΔ）未免疫マウス
および免疫マウスからの血清を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ
、１０％ウノ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％正常ヤギ血清（
ＮＧＳ）および０．５％トリトンＸ−１００を含有する
２０ｍＭリン酸カリウノ、・バッファー（＋１１１−（
７、４）で系列希釈した。この希釈血清を、」二足でジ
１η製しｐ５７７〜６０７かまた１；１ｐ６０４〜６３
６をコーティングしたマイクロタイタープレートのウェ
ルに加えた。この血清を含むプレートを４０℃にて３０
分間、ついで４℃にて一夜インキユベートした。このプ
レートを００５％０５％ライ２０を含ａず７．、＞ Ｐ
Ｂ Ｓ テＩ Ｏ回洗浄し、ついでＮＧＳ巾でＩ：ｌ
０００に希釈したヤギ抗マウス夏ｇＧ （１ ＋１．）西洋ワザビベルオギ ノダーゼ（ｔｒＲＰＯ）結合抗体［ジャクノン・ラボラ
トリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）］を加えた。
および免疫マウスからの血清を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ
、１０％ウノ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％正常ヤギ血清（
ＮＧＳ）および０．５％トリトンＸ−１００を含有する
２０ｍＭリン酸カリウノ、・バッファー（＋１１１−（
７、４）で系列希釈した。この希釈血清を、」二足でジ
１η製しｐ５７７〜６０７かまた１；１ｐ６０４〜６３
６をコーティングしたマイクロタイタープレートのウェ
ルに加えた。この血清を含むプレートを４０℃にて３０
分間、ついで４℃にて一夜インキユベートした。このプ
レートを００５％０５％ライ２０を含ａず７．、＞ Ｐ
Ｂ Ｓ テＩ Ｏ回洗浄し、ついでＮＧＳ巾でＩ：ｌ
０００に希釈したヤギ抗マウス夏ｇＧ （１ ＋１．）西洋ワザビベルオギ ノダーゼ（ｔｒＲＰＯ）結合抗体［ジャクノン・ラボラ
トリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）］を加えた。
このプレートを４０℃にて１時間インキュベート１７、
上記のようにして１０回洗浄し、０−フエニレンノアミ
ン： ２１−Ｉ ＣＩ（ＯＰ Ｄ）発色試薬を加えた。
上記のようにして１０回洗浄し、０−フエニレンノアミ
ン： ２１−Ｉ ＣＩ（ＯＰ Ｄ）発色試薬を加えた。
３０分後にＩＮ）［ｔＳ０４を加えてこの反応を停止さ
せ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度はウ
ェルに結合したマウス抗体の爪に正比例した。これらの
アッセイは、免疫マウスの血清中にＩ−［ＩＶ−２ｐ６
０４〜６３６に対する抗体が存在することを示していた
。ｐ６０４〜６３６で免疫したマウスは、ｐ６０４〜６
３６に対してＩＩＩｏ、ｏ ｏ ｏよりも大きな力価を
示した。ｐ６０４〜６３６に特異的な抗血清は、ｐ５７
７〜６０７に対して交差反応性を示さなかった。
せ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度はウ
ェルに結合したマウス抗体の爪に正比例した。これらの
アッセイは、免疫マウスの血清中にＩ−［ＩＶ−２ｐ６
０４〜６３６に対する抗体が存在することを示していた
。ｐ６０４〜６３６で免疫したマウスは、ｐ６０４〜６
３６に対してＩＩＩｏ、ｏ ｏ ｏよりも大きな力価を
示した。ｐ６０４〜６３６に特異的な抗血清は、ｐ５７
７〜６０７に対して交差反応性を示さなかった。
Ｅ、細胞融合
屠殺マウスの牌臓（抗１−ｒ Ｉ Ｖ −２抗体産生細
胞を含有）を、ワイヤースクリーンを通して２．ＯｍＭ
Ｌ〜グルタミンおよび５０μ９ＩＲＱのゲンタマイシ
ンを含有するダルベツコ変性イーグル培地（１）ｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍ
ｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）中へどろどろにつぶず（ｍａｓ
ｈｉｎｇ）ことにより単一細胞に破砕した。この単一細
胞懸詞液を０．８３％塩化アンモニウム−１０ｍＭ）リ
ス（トリス［ヒドロキシメチルコアミノメタン）で処理
して赤血球を溶解し、ついでＳ Ｐ ２１０細胞と１：
１の比で混合した。この混合細胞を遠心分離にかけ、血
清不含培地で１回洗浄し、ついで再び遠心分離にかけた
。融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用
い、免疫供与胛臓細胞とミエローマ細胞株Ｓ Ｐ ２１
０とのハイブリッドを生成させた［コーラ−（Ｇ 、Ｋ
ｏｈｌｅｒ）およびミルシコタイン（Ｃ，Ｍｉｌｓｔｃ
ｉｎ）のＮａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９４参照
、モノクローナル・ハイブリドーマ・アンチボディーズ
：テクニークス・アンド・アプリケーシコンズ（Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄＡｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ）、バレル（Ｊ、Ｇ、ｒｔ。
胞を含有）を、ワイヤースクリーンを通して２．ＯｍＭ
Ｌ〜グルタミンおよび５０μ９ＩＲＱのゲンタマイシ
ンを含有するダルベツコ変性イーグル培地（１）ｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍ
ｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）中へどろどろにつぶず（ｍａｓ
ｈｉｎｇ）ことにより単一細胞に破砕した。この単一細
胞懸詞液を０．８３％塩化アンモニウム−１０ｍＭ）リ
ス（トリス［ヒドロキシメチルコアミノメタン）で処理
して赤血球を溶解し、ついでＳ Ｐ ２１０細胞と１：
１の比で混合した。この混合細胞を遠心分離にかけ、血
清不含培地で１回洗浄し、ついで再び遠心分離にかけた
。融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用
い、免疫供与胛臓細胞とミエローマ細胞株Ｓ Ｐ ２１
０とのハイブリッドを生成させた［コーラ−（Ｇ 、Ｋ
ｏｈｌｅｒ）およびミルシコタイン（Ｃ，Ｍｉｌｓｔｃ
ｉｎ）のＮａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９４参照
、モノクローナル・ハイブリドーマ・アンチボディーズ
：テクニークス・アンド・アプリケーシコンズ（Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄＡｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ）、バレル（Ｊ、Ｇ、ｒｔ。
Ｈｕｒｒｅｌ ｌ）編、ＣＩ’ｌｔＣブレス、１９８２
中で論証されている］。簡単に説明すると、脾臓細胞と
５Ｐ２１０細胞との融合は、上記ペレットを血清不含Ｄ
ＭＥＭ中の５０％ＰＥＧ（ソグマ、ＭＷ１０ｏｏ）に２
分間さらすことにより行った。このＰＥＧに血清不含Ｄ
ＭＥＭ（１ｊＩ（りを加え、１分間待ち、ついでさらに
２０籾の血清不含ＤＭＥＭを５分間かけてゆっくり加え
ることにより希釈した。
中で論証されている］。簡単に説明すると、脾臓細胞と
５Ｐ２１０細胞との融合は、上記ペレットを血清不含Ｄ
ＭＥＭ中の５０％ＰＥＧ（ソグマ、ＭＷ１０ｏｏ）に２
分間さらすことにより行った。このＰＥＧに血清不含Ｄ
ＭＥＭ（１ｊＩ（りを加え、１分間待ち、ついでさらに
２０籾の血清不含ＤＭＥＭを５分間かけてゆっくり加え
ることにより希釈した。
この細胞を遠心分離により回収した。上清をデカントし
、ＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびデミ
ノン）添加２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（２０ｉ＋ｆ）
で置き換えてハイブリドーマを選択した。この細胞を約
ｌＸｌ０’細胞／ＩＩＱに希釈し、２４マルチウエルプ
レート中にｌ ｚＱ／ウェルで入れた。非免疫Ｂａ１ｂ
／ｃマウスからの胛臓細胞もまたフィーダー層として加
えた。隔日毎にＩｘＱの培地をＨＡ Ｔ添加２０％ＦＣ
Ｓを含む新たなりＭＥＭで置き換え、ハイブリッドをさ
らに７〜１４日増殖させた。 ハイブリブトの幾つかは
、５Ｐ２１０細胞に融合した抗ＨＴ Ｖ −２抗体産生
絆臓細胞からなっていた。簡単に説明すると、融合剤は
牌臓細胞膜と５Ｐ２１０細胞膜との間の融合を促進し、
両細胞の核を含むヘテロカリオンを生成させる。その結
果、異なる核は融合して同調有糸分裂を行うことのでき
る単一核を生成する。この融合細胞が分裂すると、ハイ
ブリッドは６核の染色体を失うことにより安定する。こ
の融合細胞をウェル当たり１０５〜１０１細胞にて複数
の２４ウエルプレート中に入れる。Ｓ Ｐ ２１０・詳
臓細胞融合により生成した融合細胞は、Ｉｆ Ａ Ｔ培
地中で培養することにより１択的に増’ｈ（１さＵ゛る
。すべての未融合Ｓ Ｐ ２１０またはＳ Ｐ ２１０
二Ｓｔ”２１０融合細胞はアミノプテリンにより増殖が
妨げられ、また未融合牌臓細胞または絆臓：牌臓融合細
胞は培養中で死滅する。Ｓ Ｐ ２１０ ：牌臓）１イ
ブリツドのみがＩＩＡＴ選択培地中で増Ｗｆｉ ！１〜
るであろう。
、ＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびデミ
ノン）添加２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（２０ｉ＋ｆ）
で置き換えてハイブリドーマを選択した。この細胞を約
ｌＸｌ０’細胞／ＩＩＱに希釈し、２４マルチウエルプ
レート中にｌ ｚＱ／ウェルで入れた。非免疫Ｂａ１ｂ
／ｃマウスからの胛臓細胞もまたフィーダー層として加
えた。隔日毎にＩｘＱの培地をＨＡ Ｔ添加２０％ＦＣ
Ｓを含む新たなりＭＥＭで置き換え、ハイブリッドをさ
らに７〜１４日増殖させた。 ハイブリブトの幾つかは
、５Ｐ２１０細胞に融合した抗ＨＴ Ｖ −２抗体産生
絆臓細胞からなっていた。簡単に説明すると、融合剤は
牌臓細胞膜と５Ｐ２１０細胞膜との間の融合を促進し、
両細胞の核を含むヘテロカリオンを生成させる。その結
果、異なる核は融合して同調有糸分裂を行うことのでき
る単一核を生成する。この融合細胞が分裂すると、ハイ
ブリッドは６核の染色体を失うことにより安定する。こ
の融合細胞をウェル当たり１０５〜１０１細胞にて複数
の２４ウエルプレート中に入れる。Ｓ Ｐ ２１０・詳
臓細胞融合により生成した融合細胞は、Ｉｆ Ａ Ｔ培
地中で培養することにより１択的に増’ｈ（１さＵ゛る
。すべての未融合Ｓ Ｐ ２１０またはＳ Ｐ ２１０
二Ｓｔ”２１０融合細胞はアミノプテリンにより増殖が
妨げられ、また未融合牌臓細胞または絆臓：牌臓融合細
胞は培養中で死滅する。Ｓ Ｐ ２１０ ：牌臓）１イ
ブリツドのみがＩＩＡＴ選択培地中で増Ｗｆｉ ！１〜
るであろう。
つぎに実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限られるものではない。
、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１
モノクローナル抗体のスクリーニング、クローニングお
よび特徴付は 上記方法を用い、Ｉ−Ｉ Ｉ Ｖ −２に対する抗体に
ついでハイブリッドをスクリーニングした。１０〜１４
日後、プロトコールにおいて下記のような変化はあった
が上記方法の説明で記載したＥｌΔ法により、ハイブリ
ドーマ細胞培養を含むウェルからの培養液をスクリーニ
ングした。このプレートを培養液とともに４０℃にて３
〜４時間時間インベコベートついで０．０５％ツイーン
２０および０．１％ＳＤＳを含むＰ １３ Ｓでプレー
トを洗浄した。選択したすべてのハイブリッドはｐ６０
４〜６３６と強く反応したがｐ５７７〜６０７に対して
は陰性であった。
よび特徴付は 上記方法を用い、Ｉ−Ｉ Ｉ Ｖ −２に対する抗体に
ついでハイブリッドをスクリーニングした。１０〜１４
日後、プロトコールにおいて下記のような変化はあった
が上記方法の説明で記載したＥｌΔ法により、ハイブリ
ドーマ細胞培養を含むウェルからの培養液をスクリーニ
ングした。このプレートを培養液とともに４０℃にて３
〜４時間時間インベコベートついで０．０５％ツイーン
２０および０．１％ＳＤＳを含むＰ １３ Ｓでプレー
トを洗浄した。選択したすべてのハイブリッドはｐ６０
４〜６３６と強く反応したがｐ５７７〜６０７に対して
は陰性であった。
さらに、標的抗原としてＨＩ Ｖ −１ｇａｇ／ ｔｌ
ｌＶ −２ｇｐ４１ （ｇａｇ−ｐ４１ ）融合タン
パク質およびＣＫＳ−ＨＩＶ−２’ｌ’ＭＩ）断片（Ｃ
ＫＳ ＴＭＰ 、ＩＩＩ Ｖ−２ＴＭＰの最初の１０
８アミノ酸を含有）融合タンパク質を用い、ハイブリッ
ドのウェスタンプロットを試験した。これらのタンパク
質は、米国特許出願第２７５３０９号および同第２７６
２６３号各明細書（１９８８年１１１１２３日出願）に
開示されているようにして調製した。
ｌＶ −２ｇｐ４１ （ｇａｇ−ｐ４１ ）融合タン
パク質およびＣＫＳ−ＨＩＶ−２’ｌ’ＭＩ）断片（Ｃ
ＫＳ ＴＭＰ 、ＩＩＩ Ｖ−２ＴＭＰの最初の１０
８アミノ酸を含有）融合タンパク質を用い、ハイブリッ
ドのウェスタンプロットを試験した。これらのタンパク
質は、米国特許出願第２７５３０９号および同第２７６
２６３号各明細書（１９８８年１１１１２３日出願）に
開示されているようにして調製した。
簡単に説明すると、５００μＣのｇａｇ−ｐ４１を５Ｉ
）Ｓおよび２−メルカプトエタノールで９５°Ｃにて処
理し、１０％ポリアクリルアミド−５ＤＳゲル中で電気
泳動にかけた［ラムリ（Ｌａｃ＋＋＋ｍ１ｉ）ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７０）２ ２ ７：６ ８ ０−６ ８
５ コ。 同様に、部分精製ＣＫＳ−ＴＭＰＯ’）２
ｚ９／ｚＱ溶液（２５０Ｉｌ１２）をＳＤＳおよび２−
メルカプトエタノールで９５℃にて処理し、１２％ポリ
アクリルアミド−５Ｉ） Ｓゲル中で電気泳動にか（Ｊ
た。クンバク質を、２５ｎ＋Ｍｌ−リス、１９２ｍＭグ
リシンおよび２．０％メタノールからなる標孕移動バッ
ファー（ｐｌ−４８、３）中、ゲルからニトロセルロー
スに＋００ｎｆｍｐの電気泳動により一夜かけて移すか
、または１ 、 Ｏａｍｐにて１〜２時間かけて移した
［タウビン（ＴＯｗｌ）ｉｎ）ら、 Ｐ ｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、（Ｉ ９ ７ ９ ）
７６・４３５０〜４３５４］。」二足組換えタンパク質
を移し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有するｌ０ｍＭトリ
フ、（ＰＩ−１８、Ｏ）中の２０％ｒｃｓで＝ト０セ／
ｌｚロースをブロッキングした後、このニトロセルロー
スをストリップにカッティングし、これを用いて抗ＨＩ
Ｖ−２抗体の存在を決定した。
）Ｓおよび２−メルカプトエタノールで９５°Ｃにて処
理し、１０％ポリアクリルアミド−５ＤＳゲル中で電気
泳動にかけた［ラムリ（Ｌａｃ＋＋＋ｍ１ｉ）ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７０）２ ２ ７：６ ８ ０−６ ８
５ コ。 同様に、部分精製ＣＫＳ−ＴＭＰＯ’）２
ｚ９／ｚＱ溶液（２５０Ｉｌ１２）をＳＤＳおよび２−
メルカプトエタノールで９５℃にて処理し、１２％ポリ
アクリルアミド−５Ｉ） Ｓゲル中で電気泳動にか（Ｊ
た。クンバク質を、２５ｎ＋Ｍｌ−リス、１９２ｍＭグ
リシンおよび２．０％メタノールからなる標孕移動バッ
ファー（ｐｌ−４８、３）中、ゲルからニトロセルロー
スに＋００ｎｆｍｐの電気泳動により一夜かけて移すか
、または１ 、 Ｏａｍｐにて１〜２時間かけて移した
［タウビン（ＴＯｗｌ）ｉｎ）ら、 Ｐ ｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、（Ｉ ９ ７ ９ ）
７６・４３５０〜４３５４］。」二足組換えタンパク質
を移し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有するｌ０ｍＭトリ
フ、（ＰＩ−１８、Ｏ）中の２０％ｒｃｓで＝ト０セ／
ｌｚロースをブロッキングした後、このニトロセルロー
スをストリップにカッティングし、これを用いて抗ＨＩ
Ｖ−２抗体の存在を決定した。
ウェスタンプロット法のため、ニトロセルしノーススト
リップ、選択ハイブリット（０，２ｘのおよびバッフｙ
−（２０ｍＭトリス、ＩｍＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａＣ
１，０，３％ｌ・リドンＸ−１００および２１２／峠Ｂ
ＳＡ、 ｐ１１７，５ＸＩ 、８峠）からなる反応混合
物を４℃にて一夜インキユベートした。
リップ、選択ハイブリット（０，２ｘのおよびバッフｙ
−（２０ｍＭトリス、ＩｍＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａＣ
１，０，３％ｌ・リドンＸ−１００および２１２／峠Ｂ
ＳＡ、 ｐ１１７，５ＸＩ 、８峠）からなる反応混合
物を４℃にて一夜インキユベートした。
このストリップを緩衝界面活性剤（０，１％ＳＤＳおよ
び０．５％トリトンＸ−１００を含むｌｏｍＭＰＢＳ、
ｐｌ−（７，５，０、５Ｍ ＮａＣＩおよび０．５％ト
リトンｘ−ｉｏｏを含むＰ［３５と交替で用いる）で洗
浄し、ついでＨＩＩ Ｉ） Ｏに結合したヤギ抗マウス
ＩｇＧ抗体を加えた。このストリップを室温にてＩ〜２
時間時間インベコベートついで緩衝界面活性剤で洗浄し
た。最後に、新たに二４製１．たＨ Ｒｒ’発色試薬（
バイオラド；１２０ｘｇを４０ｚｕ）水冷メタノール中
に溶解し、ついで１２０１１ｊの３０％過酸化水素を含
む２００ｘ（のトリス緩衝食塩水（ｐＨ７，８）中に希
釈したもの）を加えることにより組換えタンパク質に結
合した抗体を視覚化した。このアッセイにより、ｌ（ｌ
Ｖ −２タンパク質に特異的な抗体が存在することが
示された。Ｈ３７を含む２つのハイブリッドがｇａｇ−
ｐ４１およびＣＫＳ−ＴＭＰの両方に対しブ【１ツト反
応性を示した。残りのハイブリッドはｇａｇ−ｐ４１に
対してのみ反応性であった。
び０．５％トリトンＸ−１００を含むｌｏｍＭＰＢＳ、
ｐｌ−（７，５，０、５Ｍ ＮａＣＩおよび０．５％ト
リトンｘ−ｉｏｏを含むＰ［３５と交替で用いる）で洗
浄し、ついでＨＩＩ Ｉ） Ｏに結合したヤギ抗マウス
ＩｇＧ抗体を加えた。このストリップを室温にてＩ〜２
時間時間インベコベートついで緩衝界面活性剤で洗浄し
た。最後に、新たに二４製１．たＨ Ｒｒ’発色試薬（
バイオラド；１２０ｘｇを４０ｚｕ）水冷メタノール中
に溶解し、ついで１２０１１ｊの３０％過酸化水素を含
む２００ｘ（のトリス緩衝食塩水（ｐＨ７，８）中に希
釈したもの）を加えることにより組換えタンパク質に結
合した抗体を視覚化した。このアッセイにより、ｌ（ｌ
Ｖ −２タンパク質に特異的な抗体が存在することが
示された。Ｈ３７を含む２つのハイブリッドがｇａｇ−
ｐ４１およびＣＫＳ−ＴＭＰの両方に対しブ【１ツト反
応性を示した。残りのハイブリッドはｇａｇ−ｐ４１に
対してのみ反応性であった。
このハイブリッドを、ゴーディング（、Ｊ、Ｗ、Ｇ。
ｄ ｉ ｎｇ）による［モノクローナル・アンヂボディ
ーズ：プリンシプルズ・アンド・ブラクティス（Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉ
ｐｌｅｓ ａｎｄ ｒ’ｒａｃｔｉｃｅ）（アカデミツ
クプレス、Ｎ、Ｙ、＋ ９８３）Ｊ中に略述されている
指針を用いた限界希釈法により展開した。簡単に説明す
ると、このハイブリッドを１細胞／ウエルにて２−９６
マルチウエルプレート中に展開し、約２週間増殖させた
。単一のハイブリッドＨ３７から、細胞増殖およびコロ
ニー生成を含む４６のウェルが同定された。各ウェルか
らの培養液をＥＴＡおよびウェスタンプロットによリス
クリーニングした。これら４６ウエルのうち３つウェル
が抗１目Ｖ−２抗体に関し陽性であると同定された。こ
れら３つのウェルのそれぞれからの細胞を２４マルチウ
エルプレート中に展開し、ついで、さらに２５ｃｘ’フ
ラスコ、ついで７５ｃｚ″フラスコ中に展開した。これ
ら３つの展開したクローンのうちの一つを！（３，７，
ｃ９４と称した。
ーズ：プリンシプルズ・アンド・ブラクティス（Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉ
ｐｌｅｓ ａｎｄ ｒ’ｒａｃｔｉｃｅ）（アカデミツ
クプレス、Ｎ、Ｙ、＋ ９８３）Ｊ中に略述されている
指針を用いた限界希釈法により展開した。簡単に説明す
ると、このハイブリッドを１細胞／ウエルにて２−９６
マルチウエルプレート中に展開し、約２週間増殖させた
。単一のハイブリッドＨ３７から、細胞増殖およびコロ
ニー生成を含む４６のウェルが同定された。各ウェルか
らの培養液をＥＴＡおよびウェスタンプロットによリス
クリーニングした。これら４６ウエルのうち３つウェル
が抗１目Ｖ−２抗体に関し陽性であると同定された。こ
れら３つのウェルのそれぞれからの細胞を２４マルチウ
エルプレート中に展開し、ついで、さらに２５ｃｘ’フ
ラスコ、ついで７５ｃｚ″フラスコ中に展開した。これ
ら３つの展開したクローンのうちの一つを！（３，７，
ｃ９４と称した。
モノクローナル抗体１（３７ｃ９４のアイソタイプはＩ
ｇＧ２ａであると決定された。Ｅ Ｉ Ａアイツタ４１
手順にはヤギ抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンをコーティ
ングしたマイクロタイタープレー１・を用い、これを該
クローンの培養液とともにインキュベートすることによ
り分泌マウス杭体を捕捉した。２時間後、このプレート
を洗浄し、ついでウザギ抗マウスアイソタイプをさらに
２時間適用した。このプレートを再び洗浄し、ＨＩＩＰ
Ｏ結合ヤギ抗つサギＩｇＧを１時間適用した。過剰の
結合体を洗浄により除去し、ついでＯＰＤ基質を加えた
。マウス免疫グロブリンに結合したウザギ抗マウスアイ
ソタイプの川は４９２ｎｒｒｌで測定した吸光度と正比
例した。マウス腹水からのＨ３７ｃ９４抗体を用いてさ
らに特徴付けを行った。
ｇＧ２ａであると決定された。Ｅ Ｉ Ａアイツタ４１
手順にはヤギ抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンをコーティ
ングしたマイクロタイタープレー１・を用い、これを該
クローンの培養液とともにインキュベートすることによ
り分泌マウス杭体を捕捉した。２時間後、このプレート
を洗浄し、ついでウザギ抗マウスアイソタイプをさらに
２時間適用した。このプレートを再び洗浄し、ＨＩＩＰ
Ｏ結合ヤギ抗つサギＩｇＧを１時間適用した。過剰の
結合体を洗浄により除去し、ついでＯＰＤ基質を加えた
。マウス免疫グロブリンに結合したウザギ抗マウスアイ
ソタイプの川は４９２ｎｒｒｌで測定した吸光度と正比
例した。マウス腹水からのＨ３７ｃ９４抗体を用いてさ
らに特徴付けを行った。
−雇人ｍのＨ３７ｃ９４モノクローナル抗体を得るため
に、Ｈ３７ｃ９４クローンをマウス中で増幅させた。０
、５ ｘＱのブリスタン（２，６，Ｉ Ｏ。
に、Ｈ３７ｃ９４クローンをマウス中で増幅させた。０
、５ ｘＱのブリスタン（２，６，Ｉ Ｏ。
１４−テトラメヂルベンタデカン）で前置て腹腔自処理
したＢａ１ｂ／ｃマウスに１〜２ＸＩ０７個のクローン
化１−１３７ｃ９４細胞を接種した（方法は土間バレル
の文献に略述されている）。プリスタン処理によりマウ
スミエローマハイブリッドのマウス腹腔内での増殖が促
進され、生成する腹水は該ハイブリッド細胞により分泌
されたモノクローナル抗体に富んでいる。モノクローナ
ル抗体に富んだ腹水が生成した後、これらマウスを層殺
し、腹腔から採取した腹水を遠心分離により清澄化した
。
したＢａ１ｂ／ｃマウスに１〜２ＸＩ０７個のクローン
化１−１３７ｃ９４細胞を接種した（方法は土間バレル
の文献に略述されている）。プリスタン処理によりマウ
スミエローマハイブリッドのマウス腹腔内での増殖が促
進され、生成する腹水は該ハイブリッド細胞により分泌
されたモノクローナル抗体に富んでいる。モノクローナ
ル抗体に富んだ腹水が生成した後、これらマウスを層殺
し、腹腔から採取した腹水を遠心分離により清澄化した
。
以下に記載する特徴付は手順は、プロティンＡセファロ
ース（バレルの土間文献参照）を含む当該技術分野で公
知の精製法を用い、上記１１１１澄腹水または該腹水か
らの精製抗体を用いて行った。
ース（バレルの土間文献参照）を含む当該技術分野で公
知の精製法を用い、上記１１１１澄腹水または該腹水か
らの精製抗体を用いて行った。
活性および特異性の決定
マウス腹水中のモノクローナル抗体の力価を決定し、ま
た該モノクローナル抗体の特異性を評価するためにアッ
セイを行った。上記手順を用いたＥＴＡにより、腹水中
のモノクローナル抗体を滴定した。上記プレートを腹水
とともに４０℃にて１時間インキュベートした。モノク
ローナル抗体に富んだ腹水は、合成ベブヂドｐ６０４〜
６３６に対してｌ ：５００．０００以上の高い力価を
示した。この腹水はｐ５７７〜６０７に対しては反応性
を示さなかった。
た該モノクローナル抗体の特異性を評価するためにアッ
セイを行った。上記手順を用いたＥＴＡにより、腹水中
のモノクローナル抗体を滴定した。上記プレートを腹水
とともに４０℃にて１時間インキュベートした。モノク
ローナル抗体に富んだ腹水は、合成ベブヂドｐ６０４〜
６３６に対してｌ ：５００．０００以上の高い力価を
示した。この腹水はｐ５７７〜６０７に対しては反応性
を示さなかった。
加えて、モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９４の特異性を放
射性免疫沈降アッセイ（ＩＩＩＰＡ）により確認した。
射性免疫沈降アッセイ（ＩＩＩＰＡ）により確認した。
ウィルスタンパク質の免疫沈降アッセイについではすで
に記載されている［デバレ（Ｄｃｖａｒｅ）ら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ（１９８６
）、８３：５７１８〜５７２２］。これらの研究に用い
た細胞株は、非感染１−１９細胞または）ｌ Ｔ Ｖ−
２感染［１９細胞であった。細胞を培養液から回収し、
メヂオニンおよびシスティンを欠＜ ＲＰ Ｍ１１６４
０（ギブコ・ラボラトリーズ）で１回洗浄し、ついで同
じ培地中に１〜２．５Ｘ１０Ｌ′細胞／峠にて懸澗した
。洗浄細胞を６％ＣＯ１下、３７℃にて３０〜４５分間
インキュベートし、ついで各５０〜１００μＣｉの［”
Ｓ］メチオニンおよびビ８ｓｌシスティン（アマ−ジャ
ム）を培地に加えた。
に記載されている［デバレ（Ｄｃｖａｒｅ）ら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ（１９８６
）、８３：５７１８〜５７２２］。これらの研究に用い
た細胞株は、非感染１−１９細胞または）ｌ Ｔ Ｖ−
２感染［１９細胞であった。細胞を培養液から回収し、
メヂオニンおよびシスティンを欠＜ ＲＰ Ｍ１１６４
０（ギブコ・ラボラトリーズ）で１回洗浄し、ついで同
じ培地中に１〜２．５Ｘ１０Ｌ′細胞／峠にて懸澗した
。洗浄細胞を６％ＣＯ１下、３７℃にて３０〜４５分間
インキュベートし、ついで各５０〜１００μＣｉの［”
Ｓ］メチオニンおよびビ８ｓｌシスティン（アマ−ジャ
ム）を培地に加えた。
細胞を３７℃にて４〜８時間放射性標識し、遠心分離に
より回収し、ＩｍＭＰＭＳＦ、アブ口ヂニン（バッファ
ー１１１２当たり１００カリクレイン不活化単位）、１
．０％トリトンＸ−１００，０，１％ＳＤＳおよび０．
５％デオキシコール酸ナトリウム（すべての試薬はシグ
マから入手）を含むＰＢＳ （ｐＨ７、４）中溶解させ
た。この溶解物を１００゜ｏｏｏｘｙにて４０分間遠心
分離にかけることにより清澄化し、−７０℃にて貯蔵し
た。
より回収し、ＩｍＭＰＭＳＦ、アブ口ヂニン（バッファ
ー１１１２当たり１００カリクレイン不活化単位）、１
．０％トリトンＸ−１００，０，１％ＳＤＳおよび０．
５％デオキシコール酸ナトリウム（すべての試薬はシグ
マから入手）を含むＰＢＳ （ｐＨ７、４）中溶解させ
た。この溶解物を１００゜ｏｏｏｘｙにて４０分間遠心
分離にかけることにより清澄化し、−７０℃にて貯蔵し
た。
細胞溶解物の１００μｇアリコートを１０μＣのモノク
ローナル抗体に富んだ腹水または１００μＱの組織培養
液とともに４℃にて３０〜６０分間インキュベートする
ことにより免疫沈降を行った。
ローナル抗体に富んだ腹水または１００μＱの組織培養
液とともに４℃にて３０〜６０分間インキュベートする
ことにより免疫沈降を行った。
抗体−抗原複合体を、ＢＳΔ（１１９／ｚＱ）を含む溶
解バッファー中で前辺て洗浄した２００μＱの前膨潤プ
ロティンΔ−セファロース（ファルマシア、ＩｇＧ結合
能：５０〜２００μｇ／２００μクプロテインΔ）を加
えることにより回収した。この反応混合物を４℃にて１
時間激しく＠盪し、ついで溶解バッファーを用いてこの
プロティンΔ−セファロースを３回洗浄した。ついでプ
ロティンＡ−セファロースを遠心分離により回収し、つ
いで、２−メルカプトエタノールを含有するＳＯＳゲル
試料バッファー中、９５℃にて加熱することにより免疫
複合体を解離させた（ラムリらの土間文献参照）。この
試料を５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供した。このゲルをエンハンス（Ｅ ｎｈａｎｃｅ）
（デュポン）中で３０分間インギュベートし、乾燥し、
免疫沈降放射性標識タンパク質のオートラジオグラフィ
ーのためにＸ線フィルム１こ暴露した。１４１ Ｖ −
２ｇｐｌ １内のエピトープに対するＨ３７ｃ９４抗体
の特異性は、Ｈ［Ｖ −２感染Ｈ９細胞溶解液からの［
３Ｓｓ］メヂオニン／［３１ｉｓ］システィン生合成標
識ウィルス糖タンパク質ｇｐ１６０（未開裂エンベロー
プ前駆体）およびｇｐ４１の免疫沈降により確認された
。その結果、上記モノクローナル抗体により１（Ｉ Ｖ
−２感染細胞溶解液からｇｌ）１６０およびｇｐｌ
１は沈降したがｇｐ１２０は沈降せず、また放射性標識
細胞タンパク質の非特異的免疫沈降は検出されないこと
が示された。それゆえ、このモノクローナル抗体Ｉ４３
７ｅ９４はｉ−Ｔ ｒ Ｖ −２ｇｐｌ ６０／４ Ｉ
に特異的に結合した。バンドパターンは、）ＩＩＶ−２
血清陽性血清での沈降に対応するｇｐ１６０、ｇｐｌ
１および小バンド（ｇｐｌ １の可能な断片）の沈降を
示し、他の研究者による他の１−１１ Ｖ −２経膜タ
ンパク質に関する報告を確認した。Ｈ３７ｃ９４は、Ｈ
Ｉ Ｖ２血清陽性の患者に見られるのと同じタンｌ＜り
質を認識する。
解バッファー中で前辺て洗浄した２００μＱの前膨潤プ
ロティンΔ−セファロース（ファルマシア、ＩｇＧ結合
能：５０〜２００μｇ／２００μクプロテインΔ）を加
えることにより回収した。この反応混合物を４℃にて１
時間激しく＠盪し、ついで溶解バッファーを用いてこの
プロティンΔ−セファロースを３回洗浄した。ついでプ
ロティンＡ−セファロースを遠心分離により回収し、つ
いで、２−メルカプトエタノールを含有するＳＯＳゲル
試料バッファー中、９５℃にて加熱することにより免疫
複合体を解離させた（ラムリらの土間文献参照）。この
試料を５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供した。このゲルをエンハンス（Ｅ ｎｈａｎｃｅ）
（デュポン）中で３０分間インギュベートし、乾燥し、
免疫沈降放射性標識タンパク質のオートラジオグラフィ
ーのためにＸ線フィルム１こ暴露した。１４１ Ｖ −
２ｇｐｌ １内のエピトープに対するＨ３７ｃ９４抗体
の特異性は、Ｈ［Ｖ −２感染Ｈ９細胞溶解液からの［
３Ｓｓ］メヂオニン／［３１ｉｓ］システィン生合成標
識ウィルス糖タンパク質ｇｐ１６０（未開裂エンベロー
プ前駆体）およびｇｐ４１の免疫沈降により確認された
。その結果、上記モノクローナル抗体により１（Ｉ Ｖ
−２感染細胞溶解液からｇｌ）１６０およびｇｐｌ
１は沈降したがｇｐ１２０は沈降せず、また放射性標識
細胞タンパク質の非特異的免疫沈降は検出されないこと
が示された。それゆえ、このモノクローナル抗体Ｉ４３
７ｅ９４はｉ−Ｔ ｒ Ｖ −２ｇｐｌ ６０／４ Ｉ
に特異的に結合した。バンドパターンは、）ＩＩＶ−２
血清陽性血清での沈降に対応するｇｐ１６０、ｇｐｌ
１および小バンド（ｇｐｌ １の可能な断片）の沈降を
示し、他の研究者による他の１−１１ Ｖ −２経膜タ
ンパク質に関する報告を確認した。Ｈ３７ｃ９４は、Ｈ
Ｉ Ｖ２血清陽性の患者に見られるのと同じタンｌ＜り
質を認識する。
実施例２
モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９４により認識されるエピ
トープのマツピングおよび特徴付け：ハイブリッドのＥ
ＩＡスクリーニグにより、１■３７ｃ９４はｐ５７７〜
６０７を認識しないことが確立された。さらに、Ｈ３７
ｃ９４腹水は、ウェスタンブロッティングにおいてＣＫ
Ｓ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質を認識した。
トープのマツピングおよび特徴付け：ハイブリッドのＥ
ＩＡスクリーニグにより、１■３７ｃ９４はｐ５７７〜
６０７を認識しないことが確立された。さらに、Ｈ３７
ｃ９４腹水は、ウェスタンブロッティングにおいてＣＫ
Ｓ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質を認識した。
免疫ペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＨＴＴＶｒ’ＷＶＮＤＳＬＡｒ’ＤＷＤＮＭＴＷＱＥＷ
ＥＫＱＶｒｔＹＬＥＡＮ 非交差反応ペプチドｐ５７７〜６０７のアミノ酸配列は
以下の通りである。
ＥＫＱＶｒｔＹＬＥＡＮ 非交差反応ペプチドｐ５７７〜６０７のアミノ酸配列は
以下の通りである。
ＡｎＶＴＡ Ｉ ＥＫＹ ＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ Ｃ
ＡＦ ＲＱＶ ＣＩ−ＩＴＴＶ ＣＫＳ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質のアミノ
酸配列は以下の通りである。
ＡＦ ＲＱＶ ＣＩ−ＩＴＴＶ ＣＫＳ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質のアミノ
酸配列は以下の通りである。
ＹＳＳ・・・ＷＤＷＡＲＬＮＳＷＧＣΔＦＲＷＶＣＨＴ
ＴＶＰＷ／５ＴＬＥＤＰＩＩＶ・・・（スラッシュの後
のアミノ酸はクローン中のナンセンスコードを示す） モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９４は、アミノ酸配列１−
Ｉ Ｔ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗを有するエピトープを認識する
が、このアミノ酸配列は上記免疫ペプチドと上記融合タ
ンパク質の両方に共通している。上記免疫ペプチドと上
記融合タンパク質との間に６個のアミノ酸がオーバーラ
ツプしていることにより、ｌ−ｌ３７ｃ９４が認識する
エピトープが提供される。ｐ５７７〜６０７の配列ＨＴ
Ｔ Ｖは、Ｈ３７ｃ９４の認識するエピトープを生成
するには不充分である。
ＴＶＰＷ／５ＴＬＥＤＰＩＩＶ・・・（スラッシュの後
のアミノ酸はクローン中のナンセンスコードを示す） モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９４は、アミノ酸配列１−
Ｉ Ｔ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗを有するエピトープを認識する
が、このアミノ酸配列は上記免疫ペプチドと上記融合タ
ンパク質の両方に共通している。上記免疫ペプチドと上
記融合タンパク質との間に６個のアミノ酸がオーバーラ
ツプしていることにより、ｌ−ｌ３７ｃ９４が認識する
エピトープが提供される。ｐ５７７〜６０７の配列ＨＴ
Ｔ Ｖは、Ｈ３７ｃ９４の認識するエピトープを生成
するには不充分である。
ＨＴＴＶＰＷＶＮＤＳＩ、ＡＰＤＷＤＮＭＴＷＱＩＪＥ
ＫＱＶＲＹＩ、ＥＡＮＹＳＳ・４ＤＷＡＲＩ、Ｎ５ＷＧ
ＣＡＦＲＷＶＣＩＩＴＴＶＩ４／ＳＴＩ、ＥＤＩ’ＲＶ
−・さらに、ｌ（Ｉ Ｖ−１の対応領域中の配列と比較
したところ、６個のアミノ酸のうち２個が異なることが
わかった。この変化は、Ｈ３７ｃ９４がＩ■ＩＶ−１ｇ
ｐ４１を認識させなくするのに充分である。
ＫＱＶＲＹＩ、ＥＡＮＹＳＳ・４ＤＷＡＲＩ、Ｎ５ＷＧ
ＣＡＦＲＷＶＣＩＩＴＴＶＩ４／ＳＴＩ、ＥＤＩ’ＲＶ
−・さらに、ｌ（Ｉ Ｖ−１の対応領域中の配列と比較
したところ、６個のアミノ酸のうち２個が異なることが
わかった。この変化は、Ｈ３７ｃ９４がＩ■ＩＶ−１ｇ
ｐ４１を認識させなくするのに充分である。
ｉ−ｒ ＋ ｖ −ｉ ・・Ｈ’［” Ｔ Ｖ Ｐ
Ｗ・・ＨＩＶ−２・ −ＴＴＡＶＰＷ ・ 一
実施例３ ■（ＩＶ−１およびＩ−１１Ｖ −２の識別：本発明に
従って、Ｈ３７ｃ９４はＩ（Ｉ Ｖ −２血清陽性試料
の検出のための競合プローブとして有用であることが示
された。さらに本発明に従って、Ｈ３７ｃ９４は患者の
ｌ−Ｉ Ｉ Ｖ −１へのａＮからＨＩＶ−２への暴露
を識別するのに利用することができる。というのは、Ｈ
３７ｃ９４はＨＩ Ｖ −２ｇＰ’ｌ ｌに対する抗体
を含有する試料とは競合するが、）［ｒＶ −１ｇｐ４
１に対する抗体を含有する試料とは競合しないからであ
る。Ｉ−ｆ Ｉ Ｖ −１血清陽性血清は競合イムノア
ッセイにおいてＴ−Ｔ ３７ ｃ９４と容易に競合しな
いが、ＨＩ Ｖ−２血清陽性血清は競合する。
Ｗ・・ＨＩＶ−２・ −ＴＴＡＶＰＷ ・ 一
実施例３ ■（ＩＶ−１およびＩ−１１Ｖ −２の識別：本発明に
従って、Ｈ３７ｃ９４はＩ（Ｉ Ｖ −２血清陽性試料
の検出のための競合プローブとして有用であることが示
された。さらに本発明に従って、Ｈ３７ｃ９４は患者の
ｌ−Ｉ Ｉ Ｖ −１へのａＮからＨＩＶ−２への暴露
を識別するのに利用することができる。というのは、Ｈ
３７ｃ９４はＨＩ Ｖ −２ｇＰ’ｌ ｌに対する抗体
を含有する試料とは競合するが、）［ｒＶ −１ｇｐ４
１に対する抗体を含有する試料とは競合しないからであ
る。Ｉ−ｆ Ｉ Ｖ −１血清陽性血清は競合イムノア
ッセイにおいてＴ−Ｔ ３７ ｃ９４と容易に競合しな
いが、ＨＩ Ｖ−２血清陽性血清は競合する。
１−１３７ｃ９４競合アッセイの好ましい態様におイテ
、組換えＣＫＳ−ト［ＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク
質を固体支持体上にコーティングし、試験試料およびモ
ノクローナル抗体）［３７ｃ９４とともにインキュベー
トした。試験試料中に存在するｒ−ｒ ｉ ｖ −２ウ
ィルス特異的抗体は、固体支持体上の組換えタンパク質
への結合に対してトｌ３７ｃ９４と競合した。組換えタ
ンパク質に結合したＨ３７ｃ９４の量は、ＨＲＰ Ｏに
結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンを用いることによ
り定量した。
、組換えＣＫＳ−ト［ＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク
質を固体支持体上にコーティングし、試験試料およびモ
ノクローナル抗体）［３７ｃ９４とともにインキュベー
トした。試験試料中に存在するｒ−ｒ ｉ ｖ −２ウ
ィルス特異的抗体は、固体支持体上の組換えタンパク質
への結合に対してトｌ３７ｃ９４と競合した。組換えタ
ンパク質に結合したＨ３７ｃ９４の量は、ＨＲＰ Ｏに
結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンを用いることによ
り定量した。
血清試料（１５個のｌ−１１Ｖ−１，＋５（１，！ｊの
１−目Ｖ−２および５個の「両者」）をｌ−１３７ｃ９
４競合アッセイ法により試験した。Ｉ−＋ １ Ｖ −
１、Ｉ−［Ｉ Ｖ −２または「両者Ｊ（ＨＩ Ｖ −
１およびＩ−１１Ｖ −２に対する別々の抗体集団を含
む）という血清の分類は、生合成的に標識したｇｐ１２
０のＩ−ｒ Ｉ Ｖ感染細胞溶解液からの沈降（ＲＩＰ
Ａ）、またはウェスタンプロットにより評価されるよう
にウィルスｇｐ＋２０に対する反応性により、ｇｐ１２
０に対する抗体の存在に基づいている。
１−目Ｖ−２および５個の「両者」）をｌ−１３７ｃ９
４競合アッセイ法により試験した。Ｉ−＋ １ Ｖ −
１、Ｉ−［Ｉ Ｖ −２または「両者Ｊ（ＨＩ Ｖ −
１およびＩ−１１Ｖ −２に対する別々の抗体集団を含
む）という血清の分類は、生合成的に標識したｇｐ１２
０のＩ−ｒ Ｉ Ｖ感染細胞溶解液からの沈降（ＲＩＰ
Ａ）、またはウェスタンプロットにより評価されるよう
にウィルスｇｐ＋２０に対する反応性により、ｇｐ１２
０に対する抗体の存在に基づいている。
Ｈ３７ｃ９４競合アッセイにおいて、陽性コントロール
の吸光度と陰性コントロールの吸光度との合計を２で割
った値に等しい吸光度値はカットオフ値と考えた。この
カットオフ値よりも高い吸光度値を示ず試料はＨ３７ｃ
９４とは競合しないしのと考えられ、［非１−（Ｉ Ｖ
−２Ｊと分類した。カットオフ値よりも低い吸光度値
を示ず試料は■１３７ｃ９４と競合すると考えられ、ｒ
Ｈｌｌ−２Ｊと分類した。それゆえ、「非ＨＩＶ−２Ｊ
血清の試料／カットオフ吸光度値（Ｓ／Ｃｏ）が１．０
に等しいかまたはそれより大きく、ｒＨＩＶ−２Ｊ血清
のＳ／Ｃｏは１．０未満である。
の吸光度と陰性コントロールの吸光度との合計を２で割
った値に等しい吸光度値はカットオフ値と考えた。この
カットオフ値よりも高い吸光度値を示ず試料はＨ３７ｃ
９４とは競合しないしのと考えられ、［非１−（Ｉ Ｖ
−２Ｊと分類した。カットオフ値よりも低い吸光度値
を示ず試料は■１３７ｃ９４と競合すると考えられ、ｒ
Ｈｌｌ−２Ｊと分類した。それゆえ、「非ＨＩＶ−２Ｊ
血清の試料／カットオフ吸光度値（Ｓ／Ｃｏ）が１．０
に等しいかまたはそれより大きく、ｒＨＩＶ−２Ｊ血清
のＳ／Ｃｏは１．０未満である。
第１表に示されるように、ｌ−１３７ｃ９４をプローブ
として用いた競合アッセイは、）Ｉ Ｉ Ｖ−２血清陽
性試料とＨｆＶ−１血清陽性試料とを識別するために有
効な方法である。ＨＩＶ−２ｇｐ４１に対するｌ−１３
７ｃ９４の特異性は、それが抗Ｉ−［［Ｖｉ抗体とは競
合しないことにより示された。
として用いた競合アッセイは、）Ｉ Ｉ Ｖ−２血清陽
性試料とＨｆＶ−１血清陽性試料とを識別するために有
効な方法である。ＨＩＶ−２ｇｐ４１に対するｌ−１３
７ｃ９４の特異性は、それが抗Ｉ−［［Ｖｉ抗体とは競
合しないことにより示された。
１５個のすべてのＩ−１１Ｖ−１試料は、Ｈ３７ｃ９４
競合アッセイにおいて「非１−ｒ Ｉ Ｖ−２Ｊと同定
された。１５個のト目Ｖ−２試料に関しては、すべて正
しく同定された。両者として分類された試料は競合アッ
セイにおいて検出され、ｒＩ−（Ｉ Ｖ −２Ｊと同定
された。
競合アッセイにおいて「非１−ｒ Ｉ Ｖ−２Ｊと同定
された。１５個のト目Ｖ−２試料に関しては、すべて正
しく同定された。両者として分類された試料は競合アッ
セイにおいて検出され、ｒＩ−（Ｉ Ｖ −２Ｊと同定
された。
（注）ＮＤ：決定Ｕず
＊ ：ウエスタンプロットにより決定したｇｐ１２０と
の反応性 ＊＊：ＨＩＶ−１陽性として知られるラツンコ・プレス
ビテリアン・セント・ルーカス・メディカル・センター
（Ｒｕｓｈ Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ Ｓｔ、 Ｌｕ
ｋｅ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）、シカゴ、
Ｔ Ｌからの米国血清陽性試料 加えて、」二足Ｈ３７ｃ９４６Ａ合アッセイを用い、正
常集団からの６３個の試料をスクリーニングした。この
アッセイは、平均Ｓ／Ｇｏ値り月、６（ＳＤ＝Ｏ，ｌ
１４、ＣＶ＝７．２％）を示した。
の反応性 ＊＊：ＨＩＶ−１陽性として知られるラツンコ・プレス
ビテリアン・セント・ルーカス・メディカル・センター
（Ｒｕｓｈ Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ Ｓｔ、 Ｌｕ
ｋｅ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）、シカゴ、
Ｔ Ｌからの米国血清陽性試料 加えて、」二足Ｈ３７ｃ９４６Ａ合アッセイを用い、正
常集団からの６３個の試料をスクリーニングした。この
アッセイは、平均Ｓ／Ｇｏ値り月、６（ＳＤ＝Ｏ，ｌ
１４、ＣＶ＝７．２％）を示した。
Ｉ−＋３７ｃ９４競合アッセイをさらによく特徴付ける
ため、第１表からの幾つかの血ｍ試料についで（ａ）組
換え経模タンパク質に対する反応性、（ｂ）ＨＩＶ−１
およびｔ（Ｉ Ｖ −２の経膜タンパク質の免疫優性領
域（目）！１）を示す合成ペプチドに対する反応性、お
よび（ｃ）下記に記載するペプチド抑制アッセイにおけ
る反応性を分析した。使用した組換えタンパク質は、Ｈ
Ｉ Ｖ −１に関しては１．４１Ｖ−１ｇｐ４１のＢｇ
ｌ ＩＩ−Ｋｐｎ Ｉ制限断片、ＨＩＶ −２１，：関
してはＣＫＳ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質で
あった。使用した合成ペプチドは、Ｉ−１１Ｖ −１＋
、：関してはｐ５８４〜６１１０１Ｔ Ｌ Ｖ−ｉｌｌ
Ｂ ）、ｌ−１１Ｖ−２ＴＩ）Ｉｔに関してはｐ５７
７〜６０７であった。両ＥｌΔアッセイとも、−１−記
方法の欄で説明した■シＩΔ手順と同様の手順を用いて
行った。
ため、第１表からの幾つかの血ｍ試料についで（ａ）組
換え経模タンパク質に対する反応性、（ｂ）ＨＩＶ−１
およびｔ（Ｉ Ｖ −２の経膜タンパク質の免疫優性領
域（目）！１）を示す合成ペプチドに対する反応性、お
よび（ｃ）下記に記載するペプチド抑制アッセイにおけ
る反応性を分析した。使用した組換えタンパク質は、Ｈ
Ｉ Ｖ −１に関しては１．４１Ｖ−１ｇｐ４１のＢｇ
ｌ ＩＩ−Ｋｐｎ Ｉ制限断片、ＨＩＶ −２１，：関
してはＣＫＳ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質で
あった。使用した合成ペプチドは、Ｉ−１１Ｖ −１＋
、：関してはｐ５８４〜６１１０１Ｔ Ｌ Ｖ−ｉｌｌ
Ｂ ）、ｌ−１１Ｖ−２ＴＩ）Ｉｔに関してはｐ５７
７〜６０７であった。両ＥｌΔアッセイとも、−１−記
方法の欄で説明した■シＩΔ手順と同様の手順を用いて
行った。
ペプチド抑制アッセイ法
１−１１ Ｖ−１１Ｄ ＲかまたハＨＩ Ｖ−２１Ｄｌ
ｌの合成ペプチドを８８％ギ酸中に可溶化し、０５ＭＮ
ａＣｌおよび０．００２２％トリ）・ンＸ−１００を含
むＯ，１Ｍトリスバッファー中に５ｆｌｙ／ｘＱに希釈
し、ｐ ＋−１を８．５に調節した。このペプチドをポ
リスチレンビーズとともに３７℃にて２時間インキュベ
ートした。このビーズをＩ） Ｂ Ｓ中の０．１％トリ
トン（ｐ＋−１７、４）で４０℃にて１時間洗浄した。
ｌの合成ペプチドを８８％ギ酸中に可溶化し、０５ＭＮ
ａＣｌおよび０．００２２％トリ）・ンＸ−１００を含
むＯ，１Ｍトリスバッファー中に５ｆｌｙ／ｘＱに希釈
し、ｐ ＋−１を８．５に調節した。このペプチドをポ
リスチレンビーズとともに３７℃にて２時間インキュベ
ートした。このビーズをＩ） Ｂ Ｓ中の０．１％トリ
トン（ｐ＋−１７、４）で４０℃にて１時間洗浄した。
このビーズをＰ Ｂ Ｓで洗浄し、Ｐ １３ Ｓ中の５
％ＢｓΔを４０°Ｃにて１時間コーティングし、Ｐ Ｕ
Ｓで洗浄し、ＰＢＳ中の５％ショ糖で室温にて２０〜
３０分間コーティングした。
％ＢｓΔを４０°Ｃにて１時間コーティングし、Ｐ Ｕ
Ｓで洗浄し、ＰＢＳ中の５％ショ糖で室温にて２０〜
３０分間コーティングした。
−ｒｙｓＶ−２”＋７々、目 ヘフ壬Ｋ Ｊｎｌ １ｉ
１１７−＋ セＩ ノｂｇ度を最適化するために血清を
滴定した。適当な希釈液（１０μｍ２）を、Ｉ−［Ｉ
Ｖ −１かまたはｌ−［Ｉ Ｖ −２１ＤＲ’＜プチド
（１０ｕ ｇ／ｘＱヘブチドを１００μＣ１または１０
０１１／峠ペプチドを１００μＱ）、および０．０９Ｍ
ＮａＣ１，０，２％トリトンＸ−１００，２０％ＮＧ
Ｓおよび１０％ＦＯＳを含有”４゛る１１ｍＭリン酸ナ
トリウムバッファー（３００μｍ２）と混合した。４０
°Ｃにて１時間後、ビーズに結合したペプチドを加え、
この混合物を４０℃にて２時間インキコベートした。ビ
ーズはまた単独で血清ととらにインキュベートし、コン
トロールとした。これらビーズを蒸留水で洗浄１２、」
―記血清に富んだバッファー中で希釈したヤギ抗ヒト１
ｇＧ （Ｈ−＋−Ｌ） −ＨＲＰ Ｏと反応させ、発
色させた。
１１７−＋ セＩ ノｂｇ度を最適化するために血清を
滴定した。適当な希釈液（１０μｍ２）を、Ｉ−［Ｉ
Ｖ −１かまたはｌ−［Ｉ Ｖ −２１ＤＲ’＜プチド
（１０ｕ ｇ／ｘＱヘブチドを１００μＣ１または１０
０１１／峠ペプチドを１００μＱ）、および０．０９Ｍ
ＮａＣ１，０，２％トリトンＸ−１００，２０％ＮＧ
Ｓおよび１０％ＦＯＳを含有”４゛る１１ｍＭリン酸ナ
トリウムバッファー（３００μｍ２）と混合した。４０
°Ｃにて１時間後、ビーズに結合したペプチドを加え、
この混合物を４０℃にて２時間インキコベートした。ビ
ーズはまた単独で血清ととらにインキュベートし、コン
トロールとした。これらビーズを蒸留水で洗浄１２、」
―記血清に富んだバッファー中で希釈したヤギ抗ヒト１
ｇＧ （Ｈ−＋−Ｌ） −ＨＲＰ Ｏと反応させ、発
色させた。
これら分析の結果を第２表にまとめである。両方のＥＩ
Ａアッセイとも、非希釈試料の５ｌＣＯ値として終点希
釈の逆数を括弧内に入れて結果を示した。終点希釈とは
、血清が陽性結果を示す最大希釈として定義される。さ
らに第１図に示すように、ベブヂド抑制アッセイにおｌ
ｊる反応性に従って血清をｔｌ Ｉ Ｖ −１、Ｉ−（
Ｉ Ｖ −２、ＨＩ Ｖ −１と反応性のｌ−１１Ｖ−
２（２ＸＩ）または両者として分類した。ＩＩ Ｉ Ｖ
−２抗体陽性であるがｌ−ｒ Ｉ ＶＩＤＲペプチドを
も弱く認識した血ｔ１ｇは２ＸＩと分類した。
Ａアッセイとも、非希釈試料の５ｌＣＯ値として終点希
釈の逆数を括弧内に入れて結果を示した。終点希釈とは
、血清が陽性結果を示す最大希釈として定義される。さ
らに第１図に示すように、ベブヂド抑制アッセイにおｌ
ｊる反応性に従って血清をｔｌ Ｉ Ｖ −１、Ｉ−（
Ｉ Ｖ −２、ＨＩ Ｖ −１と反応性のｌ−１１Ｖ−
２（２ＸＩ）または両者として分類した。ＩＩ Ｉ Ｖ
−２抗体陽性であるがｌ−ｒ Ｉ ＶＩＤＲペプチドを
も弱く認識した血ｔ１ｇは２ＸＩと分類した。
ベブヂド抑制アッセイに括づく試料の分類は、Ｒ１１）
Ａデータ、および第１表に示したＩ−１３７ｃ９・１競
合アッセイ結果と対応するものであった。
Ａデータ、および第１表に示したＩ−１３７ｃ９・１競
合アッセイ結果と対応するものであった。
加えて、直接Ｅ Ｉ Ａアッセイにおいて、抗原標的と
して組換え経膜タンパク質またはより短いＩＤ［２ベブ
ヂドのいずれを用いたかにかがイつらず、２×１と分類
された試料は！−１１Ｖ −１および［１１Ｖ−２標的
の両方と反応した。２ＸＩ試料は、＋（３７ｃ９４ＱＡ
合アッセイにおいてｌ−１３７ｃ９４と明らかに競合し
た。これらの■Σ［Ａデータは、組換えｐ４１タンパク
質または免疫優性萌域を含むベブヂドが、Ｉ−１１Ｖ
−１からＩＩ Ｉ Ｖ −２を必ずしも識別することが
できるものではないことを明確に示している。これとは
対照的に、ｌ−１３７ｃ９４競合７ツセイは１４１ Ｖ
−１から１−１１ Ｖ −２を識別し、Ｉ−（Ｉ Ｖ
−１と交差反応性のＨＩ Ｖ −２試料および両者感染
試料中で■目Ｖ−２を検出することができる。それゆえ
、Ｈ３７ｃ９４競合アッセイは、組換えタンパク質また
は合成ベブヂドに比べて識別試薬として優れたものであ
る。
して組換え経膜タンパク質またはより短いＩＤ［２ベブ
ヂドのいずれを用いたかにかがイつらず、２×１と分類
された試料は！−１１Ｖ −１および［１１Ｖ−２標的
の両方と反応した。２ＸＩ試料は、＋（３７ｃ９４ＱＡ
合アッセイにおいてｌ−１３７ｃ９４と明らかに競合し
た。これらの■Σ［Ａデータは、組換えｐ４１タンパク
質または免疫優性萌域を含むベブヂドが、Ｉ−１１Ｖ
−１からＩＩ Ｉ Ｖ −２を必ずしも識別することが
できるものではないことを明確に示している。これとは
対照的に、ｌ−１３７ｃ９４競合７ツセイは１４１ Ｖ
−１から１−１１ Ｖ −２を識別し、Ｉ−（Ｉ Ｖ
−１と交差反応性のＨＩ Ｖ −２試料および両者感染
試料中で■目Ｖ−２を検出することができる。それゆえ
、Ｈ３７ｃ９４競合アッセイは、組換えタンパク質また
は合成ベブヂドに比べて識別試薬として優れたものであ
る。
第１図は、夏ＨＶ−１血清、ＨＩ Ｖ −２血清、両者
゛、およびＨＩＶ−１と交差反応性のＨＩ Ｖ −２血
清（２ＸＩ）における、固体支持体上のＬＩ Ｉ Ｖ−
Ｉ ＩＤＲおよび固体支持体上の夏１１Ｖ−２１ＤＩ
との競合ペプチド不在、ＨＪＶ−１１ＤＲペブヂドおよ
びＨｒ Ｖ −２［Ｄ ｒ（ペプチドの反応性を吸光度
（４９２ｎｍ）で示すグラフである。 特許出願人 アボット・ラボラトリーズ化 理 人 弁
理士 青 山 葆ほか１名吸光！ｆ（４９２ｎｍ） 吸光＋、ｔ（、ｉ ９２ ｎｍ）
゛、およびＨＩＶ−１と交差反応性のＨＩ Ｖ −２血
清（２ＸＩ）における、固体支持体上のＬＩ Ｉ Ｖ−
Ｉ ＩＤＲおよび固体支持体上の夏１１Ｖ−２１ＤＩ
との競合ペプチド不在、ＨＪＶ−１１ＤＲペブヂドおよ
びＨｒ Ｖ −２［Ｄ ｒ（ペプチドの反応性を吸光度
（４９２ｎｍ）で示すグラフである。 特許出願人 アボット・ラボラトリーズ化 理 人 弁
理士 青 山 葆ほか１名吸光！ｆ（４９２ｎｍ） 吸光＋、ｔ（、ｉ ９２ ｎｍ）
Claims (12)
- （１）アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを実質的に有するＨＩ
Ｖ−２ｇｐ４１上のエピトープに対する特異性を特徴と
するモノクローナル抗体。 - （２）請求項（１）に記載のモノクローナル抗体を産生
する哺乳動物抗体産生細胞株。 - （３）ミエローマ細胞株ＳＰ２／０に融合させたマウス
脾臓細胞の細胞ハイブリッドからなるハイブリドーマで
ある請求項（２）に記載の細胞株。 - （４）マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ１
００１２。 - （５）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ ＨＢ１００１２
により産生されたモノクローナル抗体。 - （６）患者のＨＩＶ−１に対する暴露からＨＩＶ−２に
対する暴露を識別する方法であって、 該患者からの生物学的試料を、実質的にＨＩＶ−２のア
ミノ酸５７８からアミノ酸６０３の領域からなるアミノ
酸配列に結合した、アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを実質的
に有するエピトープを含む抗原、および該エピトープに
特異的な抗体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、
ついで 生成した該複合体の量を測定してＨＩＶ−２に対する暴
露を決定する ことを特徴とする方法。 - （７）該生物学的試料と該抗原および該抗体との接触を
、該抗原を固体支持体に固定し、ついで該試料を該固体
支持体に固定した該抗原、および該抗体と接触させるこ
とにより行う請求項（６）に記載の方法。 - （８）抗体がモノクローナル抗体である請求項（６）に
記載の方法。 - （９）モノクローナル抗体が請求項（１）から（５）の
いずれかに記載のモノクローナル抗体である請求項（８
）に記載の方法。 - （１０）モノクローナル抗体を検出可能な標識で標識し
てある請求項（９）に記載の方法。 - （１１）標識が、放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化
学発光化合物および特異的結合成分のペアよりなる群か
ら選ばれたものである請求項（１０）に記載の方法。 - （１２）生物学的試料中のＨＩＶ−２ｇｐ４１に対する
抗体の存在または量を検出する方法であって、該試料を
、実質的にＨＩＶ−２のアミノ酸５７８からアミノ酸６
０３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミノ酸
配列ＨＴＴＶＰＷを実質的に有するエピトープを含む抗
原、および該エピトープに特異的な抗体と接触させて抗
原抗体複合体を生成させ、ついで 生成した該複合体の量を測定して試料中のＨＩＶ−２ｇ
ｐ４１に対する抗体の存在または量を決定する ことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30636689A | 1989-02-03 | 1989-02-03 | |
| US306366 | 1989-02-03 | ||
| US36173989A | 1989-06-02 | 1989-06-02 | |
| US361739 | 1989-06-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02268696A true JPH02268696A (ja) | 1990-11-02 |
| JP2958346B2 JP2958346B2 (ja) | 1999-10-06 |
Family
ID=26975121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2025000A Expired - Lifetime JP2958346B2 (ja) | 1989-02-03 | 1990-02-02 | 抗ＨＩＶ―２モノクローナル抗体およびそれを用いた抗ＨＩＶ―２ｇｐ４１抗体の検出方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5374518A (ja) |
| EP (1) | EP0388602B1 (ja) |
| JP (1) | JP2958346B2 (ja) |
| AT (1) | ATE113989T1 (ja) |
| AU (1) | AU4906590A (ja) |
| CA (1) | CA2009198C (ja) |
| DE (1) | DE69013950T2 (ja) |
| ES (1) | ES2066887T3 (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6514691B1 (en) | 1986-01-22 | 2003-02-04 | Institut Pasteur | Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2 |
| US4839288A (en) * | 1986-01-22 | 1989-06-13 | Institut Pasteur | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes |
| DE69129207T2 (de) * | 1990-01-16 | 1998-10-08 | Orgenics Ltd | Peptide, von Virus-HIV-Hüllen-Glycoproteinen abstammend, deren Verwendung zum Nachweis einer Infektion dieser Viren und für die Impfung gegen AIDS |
| WO1992003579A1 (en) * | 1990-08-16 | 1992-03-05 | Diagnostic Biotechnology, Inc. | An augmented western blot format and immunoassay for detection of viral antibodies |
| US5256561A (en) * | 1991-12-20 | 1993-10-26 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibody to HIV-2 and uses thereof |
| US6074646A (en) * | 1993-10-26 | 2000-06-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Nondenatured HIV envelope antigens for detecting early HIV-specific antibodies |
| DE69632535T2 (de) * | 1995-06-07 | 2005-06-02 | Abbott Laboratories, Abbott Park | Peptide zur detektion von hiv-1 |
| DE19622088A1 (de) * | 1996-05-31 | 1997-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Anti-HIV-Antikörper als Kontrollproben |
| CA2288869A1 (en) * | 1998-03-04 | 1999-09-10 | Mary Ann Childs | Rapid confirmatory test for microbial infections |
| US6852491B2 (en) * | 2001-09-04 | 2005-02-08 | Abbott Laboratories | Amplification and detection reagents for HIV-1 |
| WO2003073992A2 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and composition for detecting early hiv antibody |
| AU2011230619C1 (en) | 2010-03-25 | 2016-06-23 | Oregon Health & Science University | CMV glycoproteins and recombinant vectors |
| HUE037408T2 (hu) | 2011-06-10 | 2018-08-28 | Univ Oregon Health & Science | CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok |
| CA2789539A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-12 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3069730A3 (en) | 2015-03-20 | 2017-03-15 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| US9931394B2 (en) | 2015-03-23 | 2018-04-03 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341423C (en) * | 1984-10-31 | 2003-03-04 | Paul A. Luciw | Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome |
-
1990
- 1990-01-31 EP EP90101860A patent/EP0388602B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-31 ES ES90101860T patent/ES2066887T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-31 DE DE69013950T patent/DE69013950T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-31 AT AT90101860T patent/ATE113989T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-02 AU AU49065/90A patent/AU4906590A/en not_active Abandoned
- 1990-02-02 CA CA002009198A patent/CA2009198C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-02 JP JP2025000A patent/JP2958346B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-09-28 US US07/952,482 patent/US5374518A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2958346B2 (ja) | 1999-10-06 |
| CA2009198C (en) | 2000-02-01 |
| DE69013950D1 (de) | 1994-12-15 |
| AU4906590A (en) | 1990-09-20 |
| EP0388602A1 (en) | 1990-09-26 |
| DE69013950T2 (de) | 1995-03-30 |
| US5374518A (en) | 1994-12-20 |
| ATE113989T1 (de) | 1994-11-15 |
| CA2009198A1 (en) | 1990-08-03 |
| EP0388602B1 (en) | 1994-11-09 |
| ES2066887T3 (es) | 1995-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH02268696A (ja) | 抗ＨＩＶ―２モノクローナル抗体およびそれを用いた抗ＨＩＶ―２ｇｐ４１抗体の検出方法 | |
| JP2761376B2 (ja) | リンパ節症／後天性免疫不全症候群ウイルスの抗原 | |
| Papsidero et al. | Human immunodeficiency virus type 1-neutralizing monoclonal antibodies which react with p17 core protein: characterization and epitope mapping | |
| JP3102643B2 (ja) | 抗ＨＩＶ―１ｐ２４マウスモノクローナル抗体、その産生細胞株およびそれを用いたイムノアッセイ法 | |
| JPH03500483A (ja) | Ｈｉｖ抗原に特異な単クローン性抗体 | |
| EP0251612B1 (en) | Human monoclonal antibody to lymphadenopathy-associated virus | |
| US5777074A (en) | Human monoclonal antibodies directed against the transmembrane glycoprotein (GP41) of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) | |
| US6008044A (en) | Human monoclonal antibodies directed against the transmembrane glycoprotein (gp41) of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) and detection of antibodies against epitope (GCSGKLIC) | |
| KR19990022114A (ko) | 추출되어 미처리된 폴리펩타이드를 사용하는 양성 스트랜드 ｒｎａ 바이러스의 진단 및 이에 대한 백신화 방법 | |
| EP0317804B1 (en) | HIV peptides and methods for detection of HIV | |
| EP0335134B1 (en) | Mouse monoclonal antibody to human immunodeficiency virus gp41 protein | |
| US5610035A (en) | Methods for the preparation of hybridomas producing lymphadenopathy-associated virus (LAV) GP110-specific monoclonal antibodies and methods for the purification of GP110 employing said monoclonal antibodies | |
| JP2598245B2 (ja) | Ｈｔｌｖ−ｉｉｉ／ｌａｖウイルス関連ペプチドに対する抗体 | |
| CA1339363C (en) | Monoclonal antibodies to specific antigenic regions of the human immunodeficiency virus and methods for use | |
| CA2007567A1 (en) | Monoclonal antibodies and method for identifying different aids-relating viruses | |
| US20030118985A1 (en) | Mouse monoclonal antibody (5-21-3) to human immunodeficiency virus gp41 protein | |
| JP2006321746A (ja) | 抗ＨＢｓモノクローナル抗体 | |
| WO1994018232A1 (en) | Methods for generating broadly neutralizing anti-hiv antibodies and antigens capable of eliciting same | |
| WO1989010416A1 (en) | PROTECTIVE PEPTIDES DERIVED FROM HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS-1 gp160 | |
| US5407811A (en) | Monoclonal antibodies to GP110 of HIV and hybridomas secreting these antibodies | |
| JPS62500592A (ja) | リンパ節症及び後天性免疫不全症候群のウイルスの抗原，特にエンベロ−プ抗原，及びウイルス，ウイルスエンベロ−プ抗原の産生方法，免疫原組成物の調製用叉は該ウイルスに対する抗体の存在の診断用としての該抗原の | |
| JP2008156350A (ja) | Ｈｉｖ−２型ヒトレトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性を有する抗原 | |
| JPH04505621A (ja) | Ｔリンパ球向性レトロウイルス単クローン抗体 | |
| AU646460B2 (en) | Monoclonal antibody for differentiating HIV-2 from HIV-1 seropositive individuals | |
| JP2824429B2 (ja) | ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）のコアタンパク質を認識するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070730 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080730 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090730 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100730 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100730 Year of fee payment: 11 |