JPH0226957B2

JPH0226957B2 -

Info

Publication number: JPH0226957B2
Application number: JP57034923A
Authority: JP
Inventors: Yukihiko Kameda; Hiroshi Imai; Satoshi Horii
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-03-04
Filing date: 1982-03-04
Publication date: 1990-06-13
Also published as: JPS58152496A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、バリエナミンおよび（または）バリ
ダミンの製造法に関する。本発明者らのうち亀
田、堀井は先にバリダマイシンＡまたはバリドキ
シルアミンＡにシユードモナス・デニトリフイカ
ンス（Pseudomonas denitrificans）の菌体を作
用させることにより、バリエナミン
〔valienamine；1L−（１，３，４／２）−４−ア
ミノ−６−ヒドロキシメチル−５−シクロヘキセ
ン−１，２，３−トリオール〕およびバリダミン
〔validamine；1L−（１，３，４／２，６）−４−
アミノ−６−ヒドロキシメチル−１，２，３−シ
クロヘキサントリオール〕を単離しうることを報
告した〔ジヤーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサ
イアテイ・ケミカル・コミユニケーシヨン（J.
Chem.Soc.Chem.Commun、）1972年、746〜747
頁〕。しかしながら、上記方法によるバリエナミ
ンおよび（または）バリダミンの製造は、該菌株
がバリダマイシン類を唯一の炭素源としては生育
せず、他の炭素源、例えば、グルコースなどを含
む培地で培養して得られる菌体を用いなければな
らず、またそのバリダマイシン分解能は微弱であ
り、バリエナミンおよび（または）バリダミンの
大量生産には適していない。

化学的な手段による製造法としては、バリダマ
イシンＡやバリドキシルアミンなどの水素化分解
（hydrogenolysis）反応を経由するバリダミンの
製造方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・アンテイバイ
オテイクス（J.Antibiotics）、第24巻、59〜63頁、
（1971年）〕が知られているが、この方法ではバリ
エナミンを得ることはできない。また、２−Ｏ−
メチル−Ｌ−カイロイノシトール（２−Ｏ−
methyl−Ｌ−chiroinositol）よりのバリエナミ
ンの合成（H.パウルゼン（Paulsen）ら、アンゲ
バンテ・ヘミー（Angew.Chem.）第92巻、930〜
931頁（1980年）〕が知られているが工程数が多く
大量生産には適さない。その他、化学的合成手段
によるDL−バリダミンの合成法〔小川ら、ブレ
テイン・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアテイ・オ
ブ・ジヤパン（Bull.Chem.Soc.Jpn.）、第52巻、
1174〜1176頁（1979年およびDL−バリエナミン
〔小川ら、ケミストリー・レター（Chemistry
Letter）713〜716頁（1980年）〕の合成法が知ら
れているが、これらの方法では目的化合物はいず
れもラセミ化合物として得られるのみである。

また、本発明者らのうち亀田、堀井は、石川県
金沢市の水田の土壌より単離した菌株がバリダマ
イシンを効率よくバリダミンおよびバリエナミン
に分解しうることを見出し（特願昭55−128157
（特開昭57−54593号））、今井はこの菌をフラボバ
クテリウム・サツカロフイルム
（Flavobacterium saccharophilum）IFO13984
と命名した〔昭和54年度、日本醗酵工学会講演要
旨集、P242〕。

その後、今井は亀田、堀井と協議して財団法人
発酵研究所の保存株を検索した結果、フラボバク
テリウム・ヘパリナム（Flavobacterium
heparinum）という種名でATCCから名古屋大学
を経て1963年に発酵研究所に受け入れた
IFO12017（ATCC13125）株と、フラボバクテリ
ウム・ケラトリテイクス（Flavobacterium
keratolyticus）という種名で九州大学から1980
年に受け入れたIFO14087株がバリダマイシンま
たはバリドキシルアミンを分解することを見いだ
した。

しかしながら、近年、フラボバクテリウム属に
属する（Bergey′s manual of determinative
bacteriology、第８版による）とされていた菌株
の中に、サイトフアーガーセアエ
（Cytophagaceae）科に移すべきものがあること
が報告され、〔E.カーリース（Callies）ら、アン
トニー・フアン・リユーベンフツク（Antonie
van Leeuwenhoek）第46巻、41〜49頁（1980）〕
またP.クリステンセン（Christensen）は、フラ
ボバクテリウム・ヘパリナムとされていた
ATCC13125株の性状をしらべて、この株をサイ
トフアーガ・ヘパリナ（Cytophaga heparina）
と命名した〔インターナシヨナル・ジヤーナル・
オブ・システマテイツク・バクテリオロジー
（International Journal of Systematic
Bacteriology）第30巻、473〜475頁（1980）〕。

今井はフラボバクテリウム・ケラトリテイクス
IFO14087株は、その細胞中にメナキノンを含有
することから、サイトフアーガセアエ科の菌種で
ある可能性が大きいことを見い出した。この株の
原記載〔マナブ・キタミカドら、ジヤーナル・オ
ブ・ザ・フアカルテイー・オブ・アグリカルチヤ
ー・キユーシユー・ユニバーシテイー（Journal
of the Faculty of Agriculture、Kyushu
University）第24巻、101−112頁（1979年）〕と
サイトフアーガ・ヘパリナのP.クリステンセンに
よる記載を比較するとゼラチン分解、でん粉分解
などで両株の間に差異がみとめられ、IFO14087
株はサイトフアーガ・ヘパリナとは異る種と考え
られる。

本発明は、これらの知見に基づき鋭意検討の結
果完成されたものであつて、サイトフアーガ属に
属し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミン
に作用してバリエナミンおよび（または）バリダ
ミンを生成しうる酵素を産生する微生物またはそ
の処理物をバリダマイシンまたはバリドキシルア
ミンに作用させることを特徴とするバリエナミン
および（または）バリダミンの製造法である。

本発明方法に用いられるバリダマイシンは、農
業用抗生物質として広く用いられており、その構
造は、バリドキシルアミンとＤ−グルコースとか
ら成り立つている。バリドキシルアミンは現在Ａ
とＢが知られており、そのバリドキシルアミン
Ａ、ＢとＤ−グルコースとの組み合わせによりバ
リダマイシンは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆとして
存在することが知られている〔ザ・ジヤーナル・
オブ・アンテイバイオテイクス（J.Antibiotics）
第25巻、48〜53頁（1972年）〕。

本発明方法においては、このような個々のバリ
ダマイシン、バリドキシルアミンあるいはその混
合物を原料として用いることができ、たとえばバ
リダマイシン生産菌の培養物あるいはその処理物
が有利に用いられる。

本発明の方法で用いられる微生物は、バリダマ
イシンまたはバリドキシルアミンをバリエナミン
および（または）バリダミンに変換する能力を有
するサイトフアーガ属に属する微生物およびその
変異株であればいずれでもよく、たとえば、サイ
トフアーガ・ヘパリナ（Cytophaga heparina、
IFO12017、ATCC13125）、およびIFO14087株等
が用いられる。

本発明の方法における上記の微生物の培養に用
いられる培地は該菌株が利用し得る栄養源を含む
ものなら、液状でも固状でもよいが、大量を処理
するときには液体培地を用いるのがより適当であ
る。培地には上記の微生物が同化し得る炭素源、
消化し得る窒素源、無機物質、微量栄養素等が適
宜配合されてもよい。炭素源としては、たとえば
ブドウ糖、乳糖、シヨ糖、麦芽糖、デキストリ
ン、でん粉、グリセロール、マンニトール、ソル
ビトール等、油脂類（例、大豆油、ラード油、チ
キン油等）その他が、窒素源としては、たとえば
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コー
ン・スチープ・リカー、ペプトン、棉実粉、廃糖
蜜、尿素、アンモニウム塩類（例、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム等）その他が用いられる。さらに
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、コバル
ト、ニツケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸な
どの塩類や酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩
類が適宜用いられる。その他、アミノ酸（例、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、グリシ
ン、リジン、メチオニン、プロリン等）、ペプチ
ド（例、ジペプチド、トリペプチド等）、ビタミ
ン類（例、B₁、B₂、ニコチン酸、B₁₂、Ｃ、Ｅ
等）、核酸類（例、プリン、ピリミジンおよびそ
の誘導体等）等を含有させてもよい。もちろん培
地のPHを調節する目的で無機または有機の酸、ア
ルカリ類、緩衝剤等を加え、あるいは消泡の目的
で油脂類、表面活性剤等の適量を添加してもよ
い。

培養の手段は静置培養でも、振盪培養あるいは
通気撹拌培養法等の手段を用いてもよい。大量の
処理には、いわゆる深部通気撹拌培養によるのが
望ましいことはいうまでもない。培養の条件は培
地の状態、組成、菌株の種類、培養の手段等によ
つて一定しないのは当然であるが、それらは通常
20℃〜45℃の温度で初発PHを中性附近に選択する
のがよい。とりわけ、培養中期の温度は24℃〜37
℃、また初発PHは6.5〜8.5の条件が望ましい。培
養時間は６〜100時間程度で良いが、とくに16〜
60時間で良好である。

本発明で用いられる「培養物」とは、上記の培
養で得られるものをいう。

本発明では、このようにして得られた菌体ある
いはその処理物を用いることができ、ここに「処
理物」とは、上記で得られる培養物を物理化学的
処理たとえばろ過、遠心分離、超音波処理、フレ
ンチプレス処理、アルミナ磨砕、溶菌酵素処理、
界面活性剤または有機溶媒処理などで得た菌体あ
るいは酵素を含む菌体破砕物をいう。また公知の
方法で精製して得られる酵素または公知の方法で
固定化した菌体または酵素も用いることが出来
る。

本発明方法は、原料化合物と上記の微生物また
はその処理物とを接触させて行なわれる。反応液
中の原料化合物の濃度は１〜５％が適当である。
反応温度は20〜45℃、PHは５〜８が適当である
が、特に温度は24〜30℃、初発PHは6.5〜7.5が良
好である。反応時間は分解反応液に加える上記の
微生物の発育状態および菌体量によつても異なる
が、24〜300時間、さらに好ましくは48〜100時間
が適当である。また反応は静止下でも振とう、通
気またはかくはんの条件下でもよいが、振とう、
通気またはかくはんする方が良好である。反応液
中には、所望により反応促進剤、酵素安定化剤、
防腐剤（ペニシリン系抗生物質、アミノグリコシ
ド系抗生物質等）などを添加してもよい。

反応液中から目的物を採取するには、通常微生
物代謝物を採取するのに用いられる手段が単独あ
るいは任意の順序に組み合わせて、または反復し
て用いられる。すなわち、例えば、過、遠心分
離、濃縮、乾燥、凍結乾燥、吸着、脱着、各種溶
媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば、
沈澱、結晶化、再結晶等）、クロマトグラフイー
などが用いられる。またバリエナミンおよびバリ
ダミンが水に可溶で一般の有機溶媒に難溶な塩基
性物質であることを利用して、いわゆる水溶性水
塩基性物質の単離精製に用いられる方法、例えば
イオン交換樹脂、活性炭、ハイポーラスポリマ
ー、セフアデツクス、セフアデツクスイオン交換
体、セルローズ、イオン交換セルローズ、シリカ
ゲル、アルミナ等を用いるクロマトグラフイーや
吸脱着法が有利に用いられる。

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ (a) ２坂口フラスコ中、トリプチカーゼ
（Tripticase、BBL社製）15ｇを水500mlに
溶解し、滅菌後サイトフアーガ・ヘパリナ
（IFO12017、ATCC13125）を接種し、28℃で
24時間振盪培養する。この培養液を、50醗酵
槽中でポリペプトン300ｇ、酵母エキス210ｇお
よび塩化ナトリウム90ｇを水30に溶解し、消
泡剤（アクトコール、Actocol、武田薬品工
業製）15ｇを加え、PH7.1に調整後、滅菌した
前培養培地に加え、28℃で、通気、撹拌下に24
時間培養する。この培養液のうち５を、200
醗酵槽中で硫酸アンモニウム1.0Kg、リン酸
−水素カリウム0.7Kg、リン酸二水素カリウム
0.3Kg、硫酸マグネシウム0.01Kg、およびバリ
ダマイシンＡの粗製液（バリダマイシンＡ含
量：約20％）10を水100に溶解し、消泡剤
（0.05Kg）を加え、PH7.1に調整し、滅菌した主
醗酵培地に移植する。反応は28℃で、通気、撹
拌下に96時間培養して行なう。

(b) (a)で得られた反応液を遠心分離し、上澄液を
アンバーライトIRC−50（NH⁺ ₄型、ローム・ア
ンド・ハース社製）のカラム（30）に通過吸
着させ、カラムを水（90）で洗浄後、0.5N
アンモニア水で溶出する。溶出画分（フラクシ
ヨンNo.５〜10；各フラクシヨン10）を集め、
約3.8にまで減圧濃縮する。

上記の濃縮液のうちの1/10量（380ml）をダ
ウエツクス１×２（OH^-型、ダウ・ケミカル社
製）のカラムクロマトグラフイー（1.8）に
付し、カラムを水で溶出する。各溶出画分は薄
層クロマトグラフイー〔シリカゲル60F₂₅₄（メ
ルク社製）；展開溶媒、ｎ−プロピルアルコー
ル・酢酸・水（４：１：１）；呈色試薬、ニン
ヒドリン；バリエナミンRf＝0.42、バリダミン
Rf＝0.35〕で調べる。バリダミンの溶出画分
（1.4〜2.0）を集め減圧濃縮後、凍結乾燥す
るとバリダミンの白色粉末3.4ｇが得られる。
結晶はメタノール−エタノールで行なう。バリ
エナミンの溶出画分（2.25〜3.8）を集め減
圧濃縮し、得られたシロツプ状物質にアセトン
を加えるとバリエナミンの結晶（12.7ｇ）が得
られる。

実施例２バリダマイシンA1％、硫酸アンモニウム１％、
リン酸一水素カリウム0.7％、リン酸二水素カリ
ウム0.3％、硫酸マグネシウム0.01％の水溶液
（２）をPH7.1に調整し、滅菌した培地に、サイ
トフアーガ・ヘパリナ（IFO12017、
ATCC13125）を接種し、27℃で４日間振盪培養
する。培養液を遠心分離して菌体を除き、上澄を
アンバーライトIRC−50（NH⁺ ₄型、ローム・アン
ド・ハース社製）のカラム（500ml）に吸着させ、
水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出する。溶出液
を減圧濃縮し、濃縮液をダウエツクス１×２
（OH^-型、ダウ・ケミカル社製）（500ml）のカラ
ムクロマトに付し、水で溶出する。各溶出画分は
実施例１−(b)と同様の方法で薄層クロマトで調べ
る。先に溶出されるバリダミンの溶出画分を集め
減圧濃縮後、凍結乾燥するとバリダミンの白色粉
末（0.76ｇ）が得られ、ついで溶出されるバリエ
ナミンの溶出画分を集め、減圧濃縮乾固し、80％
エタノール水より結晶化するとバリエナミンの結
晶（1.62ｇ）が得られる。

実施例３２坂口フラスコ中、トリプチカーゼ15ｇを水
500mlに溶解し、滅菌後、サイトフアーガ・ヘパ
リナ（IFO12017、ATCC13125）を接種し、27℃
で24時間振盪培養する。培養液を遠心分離して菌
体を集め、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で一回洗
浄して湿菌体約2.1ｇを得る。この菌体をバリド
キシルアミンＡ（3.0ｇ）の0.1Mリン酸緩衝液溶
液（PH7.0、２）に加え、振盪下27℃で72時間
反応を行なう。反応液を遠心分離して菌体を除去
し、上澄液をアンバーライトIRC−50（NH⁺ ₄型、
100ml）に吸着させ、以下実施例２と同様の方法
で処理して、バリダミン（100mg）およびバリエ
ナミン（285mg）を得る。

実施例４硫酸アンモニウム１％、リン酸一水素カリウム
0.7％、リン酸二水素カリウム0.3％、硫酸マグネ
シウム0.01％を含む水溶液（50ml）にバリダマイ
シンＥおよびＦの混合物（約３：２の混合物）
0.50ｇを溶解し、PH７に調整し、滅菌後、サイト
フアーガ・ヘパリナ（IFO12017、ATCC13125）
を接種し、27℃で４日間振盪培養を行う。培養
液を実施例１と同様の方法で処理して、バリダミ
ン（34.5mg）とバリエナミン（14mg）を得る。

Claims

【特許請求の範囲】

１サイトフアーガ属に属し、バリダマイシンま
たはバリドキシルアミンに作用してバリエナミン
および（または）バリダミンを生成しうる酵素を
産生する微生物またはその処理物を、バリダマイ
シンまたはバリドキシルアミンに作用させること
を特徴とするバリエナミンおよび（または）バリ
ダミンの製造法。