JPH02273178A - 熱安定リパーゼおよびその製造法 - Google Patents
熱安定リパーゼおよびその製造法Info
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- JPH02273178A JPH02273178A JP1327062A JP32706289A JPH02273178A JP H02273178 A JPH02273178 A JP H02273178A JP 1327062 A JP1327062 A JP 1327062A JP 32706289 A JP32706289 A JP 32706289A JP H02273178 A JPH02273178 A JP H02273178A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素に関する。より詳細には、本発明はリパー
ゼすなわち脂肪分解酵素に関する。
ゼすなわち脂肪分解酵素に関する。
リパーゼはトリー、ジーおよびモノ−グリセリドを加水
分解する酵素である。長鎖脂肪酸のトリグリセリドがリ
パーゼの通常の基質であり、このトリグリセリドは水に
不溶である。リパーゼは不溶性基質層と酵素が溶ける水
層との間の界面において、エステル結合の加水分解をす
みやかに触媒する能力によって特徴付けられる。不溶性
長鎖脂肪酸エステルの加水分解を触媒する能力によりて
、リパーゼは不溶性エステルよりむしろ可溶性エステル
の加水分解を触媒する他のエステラーゼとは区別される
。
分解する酵素である。長鎖脂肪酸のトリグリセリドがリ
パーゼの通常の基質であり、このトリグリセリドは水に
不溶である。リパーゼは不溶性基質層と酵素が溶ける水
層との間の界面において、エステル結合の加水分解をす
みやかに触媒する能力によって特徴付けられる。不溶性
長鎖脂肪酸エステルの加水分解を触媒する能力によりて
、リパーゼは不溶性エステルよりむしろ可溶性エステル
の加水分解を触媒する他のエステラーゼとは区別される
。
リパーゼは植物、動物および微生物種によって生産され
る。多種類の微生物（酵母、カビおよび細菌を含む）が
リパーゼの源である。カンジイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）お
よびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏ−ｐｓｉｓ）の酵母、
リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、 ＜＝７１ 皇す。
る。多種類の微生物（酵母、カビおよび細菌を含む）が
リパーゼの源である。カンジイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）お
よびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏ−ｐｓｉｓ）の酵母、
リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、 ＜＝７１ 皇す。
（Ｓｔａ ｈ Ｉｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌からの微生
物リパーゼが見い出されている。
物リパーゼが見い出されている。
微生’５２７ ＋７パーゼは工業的に多数応用されてい
る。
る。
これらは油脂の加水分解、油脂のインターエステリフ４
ケージ、 ：／ （ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）脂肪酸のエステル化、製品？仕上げる際に用い
るフレーバーの開発および洗剤工業における添加剤とし
ての利用に用いられうる。
ケージ、 ：／ （ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）脂肪酸のエステル化、製品？仕上げる際に用い
るフレーバーの開発および洗剤工業における添加剤とし
ての利用に用いられうる。
卓越した熱安定リパーゼ、特に食品として用いうる程度
の熱安定リパーゼが必要とされている。
の熱安定リパーゼが必要とされている。
本発明は微生物バシラス（Ｂｏｃｉ ｆｌｕｓ）種Ａ３
０−ＩＡＴＣＣＡ５５８４１より得られる熱安定リパー
ゼに関する。
０−ＩＡＴＣＣＡ５５８４１より得られる熱安定リパー
ゼに関する。
本発明のりパー七を生産する微生物は増殖のための最適
温度が約り０℃〜約６５℃であり；最適増殖ｐＨは約Ｚ
Ｏ〜９０であり；とうもろこし油。
温度が約り０℃〜約６５℃であり；最適増殖ｐＨは約Ｚ
Ｏ〜９０であり；とうもろこし油。
オリーブ油およびやし油等の油基質上に増殖する。
リパーゼは細胞外に生産され、安定であり、６０℃で２
時間の間１００％の酵素活性を維持する。ｐＨ５〜１１
では１５時間の間９０〜９５％の活性を維持している。
時間の間１００％の酵素活性を維持する。ｐＨ５〜１１
では１５時間の間９０〜９５％の活性を維持している。
また約４．５〜約１０の広範囲のｐＨでも機能する。活
性最適ｐＨは９５であり、４．５〜１０の間では９０％
の活性を示す。
性最適ｐＨは９５であり、４．５〜１０の間では９０％
の活性を示す。
本発明のリパーゼはさらに以下の物理化学的性質（ｐｈ
ｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を
有する。
ｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を
有する。
（１） 反応性：油脂を加水分解して脂肪酸およびグ
リセロールを生成する。
リセロールを生成する。
（２）阻害剤の影響：活性は過酸化水素またはアルカリ
プロテアーゼによって破壊されない。
プロテアーゼによって破壊されない。
本発明のリパーゼはバシラス種Ａ３０−Ｉ ＡＴＣＣ４
５５８４１の同定物理特性（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐ
ｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を
有する微生物の生産するリパーゼを栄養培地中増殖条件
下で実質的な脂肪分解活性が検出される迄実質上純粋培
養で好気培養し、そうした後熱安定リパーゼを分離する
ことによって生産される。
５５８４１の同定物理特性（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐ
ｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を
有する微生物の生産するリパーゼを栄養培地中増殖条件
下で実質的な脂肪分解活性が検出される迄実質上純粋培
養で好気培養し、そうした後熱安定リパーゼを分離する
ことによって生産される。
本発明の好適な実施態様において、リパーゼはパシ５
ス１１Ａ３０−Ｉ ＡＴＣＣ４５３８４１の生物学的純
粋培養をとうもろこし油基質上で好気的に培養すること
によって生産される。微生物は６０〜６５”ＣｐＨ６〜
９の範囲で増殖可能であり、とうもろこし油を基質とし
て増殖させた場合にリパーゼを細胞外に生産する。酵素
は細胞外に生産されるため、その回収は容易である。バ
シラス種は食品とじて安全であると一般に考えられてい
る（ＧＲＡＳ）ため、食品工業用酵素を生産するための
卓越した微生物である。
ス１１Ａ３０−Ｉ ＡＴＣＣ４５３８４１の生物学的純
粋培養をとうもろこし油基質上で好気的に培養すること
によって生産される。微生物は６０〜６５”ＣｐＨ６〜
９の範囲で増殖可能であり、とうもろこし油を基質とし
て増殖させた場合にリパーゼを細胞外に生産する。酵素
は細胞外に生産されるため、その回収は容易である。バ
シラス種は食品とじて安全であると一般に考えられてい
る（ＧＲＡＳ）ため、食品工業用酵素を生産するための
卓越した微生物である。
本発明を実施するにあたってのさらなる具体的な説明を
以下に記載する： リパーゼの生産はとうもろこし油から遊離した脂肪酸を
モニターすることによって定期的にア。
以下に記載する： リパーゼの生産はとうもろこし油から遊離した脂肪酸を
モニターすることによって定期的にア。
セイした。アッセイはベンゼン溶液中の染料ローダミン
（Ｒｈ ｏ ｄ ａｍ ｉ ｎ ｅ ） ６ Ｇ が
酸と反応して分光光学的に定量可能な発色団を形成する
という事実に基づく。１０−の無細胞培養液（細胞を遠
心分離で除去することによって得られる）を０．０２１
Ｍの２５％と５もろこし油溶液／１００ｍＭ ）リス（
Ｔｒｉｓ） −Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ９，５） と共に
混合し、その後６０℃で１時間インキュベーションした
。
（Ｒｈ ｏ ｄ ａｍ ｉ ｎ ｅ ） ６ Ｇ が
酸と反応して分光光学的に定量可能な発色団を形成する
という事実に基づく。１０−の無細胞培養液（細胞を遠
心分離で除去することによって得られる）を０．０２１
Ｍの２５％と５もろこし油溶液／１００ｍＭ ）リス（
Ｔｒｉｓ） −Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ９，５） と共に
混合し、その後６０℃で１時間インキュベーションした
。
適当な時間の後、反応は０．ＩＮ−Ｈ（Ｊ／９５％エタ
ノールを添加することによって停止させた。その結果得
られた脂肪酸は石油エーテルで抽出し、さらに乾燥する
迄真空下で蒸発させた。次いで希釈したローダミン６Ｇ
原液を添加した。１５分後室温で得られた反応混合物の
吸光度を５１５ｎｍで測定した。１単位のリパーゼはア
ッセイ条件下で１時間当り１μｍｏｌｅの脂肪酸を遊離
する量と定義する。
ノールを添加することによって停止させた。その結果得
られた脂肪酸は石油エーテルで抽出し、さらに乾燥する
迄真空下で蒸発させた。次いで希釈したローダミン６Ｇ
原液を添加した。１５分後室温で得られた反応混合物の
吸光度を５１５ｎｍで測定した。１単位のリパーゼはア
ッセイ条件下で１時間当り１μｍｏｌｅの脂肪酸を遊離
する量と定義する。
別法として、リパーゼはガスクロマトグラフィーによっ
てもアッセイされうる。上述の方法で得られた乾燥抽出
物を２０μｓのへブタデカンｒＲ（Ｃ１７二〇、と５も
ろこし油基質中には存在せず内部標準として使用される
）を含む５０μｅのヘキサン中に溶解する。ヘプタデカ
ン酸の添加は遊離脂肪酸の同定および定量を容易にした
。この調製物をガスクロマトグラフィーに注入する。
てもアッセイされうる。上述の方法で得られた乾燥抽出
物を２０μｓのへブタデカンｒＲ（Ｃ１７二〇、と５も
ろこし油基質中には存在せず内部標準として使用される
）を含む５０μｅのヘキサン中に溶解する。ヘプタデカ
ン酸の添加は遊離脂肪酸の同定および定量を容易にした
。この調製物をガスクロマトグラフィーに注入する。
ガスクロマトグラフィーの条件は次の通りであるニ
ガラスカラム、外径０．２５インチ、内径２龍、長さ６
フイート、充てん剤： １００／１２０Ｓｕｐｅｌｃｏ
ｐｏｒｔ担体上に５％ＤＥＧＳ−ｐｓ 、インジェク
ター温度２２０℃、オーブン温度２２０℃、検出器温度
２５０℃、キャリアーガス：窒素（流速： ２５ｍ／／
ｍ１ｎ）、検出器：炎光イオン化（ｆｌａｍｅｉｏｎｉ
ｚａｔｉｏｎ）検出器。
フイート、充てん剤： １００／１２０Ｓｕｐｅｌｃｏ
ｐｏｒｔ担体上に５％ＤＥＧＳ−ｐｓ 、インジェク
ター温度２２０℃、オーブン温度２２０℃、検出器温度
２５０℃、キャリアーガス：窒素（流速： ２５ｍ／／
ｍ１ｎ）、検出器：炎光イオン化（ｆｌａｍｅｉｏｎｉ
ｚａｔｉｏｎ）検出器。
１単位のリパーゼはアッセイ条件下で１時間当り１μｍ
ｏｌｅの脂肪酸を遊離する量と定義する。
ｏｌｅの脂肪酸を遊離する量と定義する。
以下の実施例は好熱性バシラス種Ａ３０−１（ＡＴＣＣ
、％５３８４１ ）からの脂肪分解酵素の生産について
具体的に説明している。
、％５３８４１ ）からの脂肪分解酵素の生産について
具体的に説明している。
実施例１
パシラス種Ａ３０−１ （ＡＴＣＣ、％５３８４１ ’
）のコロニーは１０％グリセロールバイアル中（−８０
℃）寒天斜面培地（１％とうもろこし油を含む基本培地
）上に保存されている。保存培養物は２５ｍ１の液体培
地〔０，５％と５もろこし油Ｗ１０．ツウィーン（Ｔｗ
ｅｅｎ）８０を含む基本培地〕を含むフラスコ（容量２
５０ｍ１）に移植し、次いでフラスコを６０℃で振と５
（２００ｒＰＩ）させながら１５〜２４時間インキュ
ベーションした。
）のコロニーは１０％グリセロールバイアル中（−８０
℃）寒天斜面培地（１％とうもろこし油を含む基本培地
）上に保存されている。保存培養物は２５ｍ１の液体培
地〔０，５％と５もろこし油Ｗ１０．ツウィーン（Ｔｗ
ｅｅｎ）８０を含む基本培地〕を含むフラスコ（容量２
５０ｍ１）に移植し、次いでフラスコを６０℃で振と５
（２００ｒＰＩ）させながら１５〜２４時間インキュ
ベーションした。
発酵は１ｅの発酵槽を用い操作容量（ｗｏｒｋｉｎｇｖ
ｏｌｕｍｅ） ５００成で行なった。接種物（１％）は
培地（１％と５もろこし油、ツウィーンｓｏ、ｏ、ｉ％
酵母エキスを含む基本培地）を含む発酵槽に無菌的に移
植した。発酵は初発ｐＨ８，０で通気（０，６ｅ／分）
しながら６０℃、６ＱＱｒｐｓで混合して行なった。分
光光度計によって６６０ｎｍの濁度として測定した０、
Ｄ、は増殖によって０．５〜３．０に増加した。脂肪分
解酵素活性は前述のアッセイ方法に従って定量した。細
胞は遠心分離によって培養液から分離した。脂肪分解酵
素は上澄液を限外ｒ過し次いで透析することによって回
収し、最終的に透析調製物を凍結乾燥した。
ｏｌｕｍｅ） ５００成で行なった。接種物（１％）は
培地（１％と５もろこし油、ツウィーンｓｏ、ｏ、ｉ％
酵母エキスを含む基本培地）を含む発酵槽に無菌的に移
植した。発酵は初発ｐＨ８，０で通気（０，６ｅ／分）
しながら６０℃、６ＱＱｒｐｓで混合して行なった。分
光光度計によって６６０ｎｍの濁度として測定した０、
Ｄ、は増殖によって０．５〜３．０に増加した。脂肪分
解酵素活性は前述のアッセイ方法に従って定量した。細
胞は遠心分離によって培養液から分離した。脂肪分解酵
素は上澄液を限外ｒ過し次いで透析することによって回
収し、最終的に透析調製物を凍結乾燥した。
実施例２
バシラス種Ａ３０−１（ＡＴＣＣ腐５３８４１）の接種
物（１％）を２［］Ｑｍ／の発酵培養液〔０，５％とう
もろこし油、０．５％ツウィーン８０および０．１％酵
母エキスを含む基本培地、ｐＨ９，０）を含む１ｅ振と
うフラスコに移植し、６０℃、２００’ｌｌ■で１５〜
１８時間振とう培養した。増殖０．Ｄ６６０は０．４〜
２．０に増加した。最終発酵培養液の脂肪分解酵素活性
は０．５Ｕ／Ｍであった。次いで脂肪分解酵素を分離し
、実施例１記載の方法に従って調製した。
物（１％）を２［］Ｑｍ／の発酵培養液〔０，５％とう
もろこし油、０．５％ツウィーン８０および０．１％酵
母エキスを含む基本培地、ｐＨ９，０）を含む１ｅ振と
うフラスコに移植し、６０℃、２００’ｌｌ■で１５〜
１８時間振とう培養した。増殖０．Ｄ６６０は０．４〜
２．０に増加した。最終発酵培養液の脂肪分解酵素活性
は０．５Ｕ／Ｍであった。次いで脂肪分解酵素を分離し
、実施例１記載の方法に従って調製した。
本発明のリパーゼは脂肪分解酵素を培地中に排出するバ
シラス種Ａ３０−Ｉ ＡＴＣＣＡ３３８４１の生物学的
に純粋な培養物を好気培養することによって生産した。
シラス種Ａ３０−Ｉ ＡＴＣＣＡ３３８４１の生物学的
に純粋な培養物を好気培養することによって生産した。
使用される株は特にＡＴＣＣＡ３３８４１株、または選
択もしくは人工突然変異によってＡＴＣＣ，％５３８１
株より誘導される微生物であり、適切な培養液で培養す
ることによって脂肪分解酵素の生産をコードする他の宿
主に前記バシラス種Ａ３０−１からの遺伝情報を挿入す
ることによってＡＴＣＣＡ３３８１株より誘導された他
の微生物である場合もある。微生物は第１表に規定した
単純培地上ですみやかに増殖しつる。酵素の生産はとう
もろこし油を基質として用いる場合、ツウィーン８０（
１％）を添加することによって強化される。
択もしくは人工突然変異によってＡＴＣＣ，％５３８１
株より誘導される微生物であり、適切な培養液で培養す
ることによって脂肪分解酵素の生産をコードする他の宿
主に前記バシラス種Ａ３０−１からの遺伝情報を挿入す
ることによってＡＴＣＣＡ３３８１株より誘導された他
の微生物である場合もある。微生物は第１表に規定した
単純培地上ですみやかに増殖しつる。酵素の生産はとう
もろこし油を基質として用いる場合、ツウィーン８０（
１％）を添加することによって強化される。
培養は温度範囲４５〜６５’Ｃ，ｐＨ範囲６．０〜９０
で実行し得るが、増殖の温度は６０〜６５℃、ｐＨはＺ
Ｏ〜９０が望ましい。精製リパーゼは等電点電気泳動に
よって単一バンドの蛋白質（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｎ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ） として同定され、さらにＨＰ
ＬＣによっても単一であることが確認されている。リパ
ーゼは５．１５の等電点をもつ。
で実行し得るが、増殖の温度は６０〜６５℃、ｐＨはＺ
Ｏ〜９０が望ましい。精製リパーゼは等電点電気泳動に
よって単一バンドの蛋白質（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｎ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ） として同定され、さらにＨＰ
ＬＣによっても単一であることが確認されている。リパ
ーゼは５．１５の等電点をもつ。
第１表−続 き
第１表：保存培養および種培養の調製、ならびにリパー
ゼ生産のためのバシラス種Ａ３０−ＩＡＴＣＣ，％５！
＋８４１の増殖に使用した増殖培地組成 種培地 Ｃａ（Ｊ２−２Ｈ２０ Ｃｏｒｎｏｉｌ ＫＨ２ＰＯ４ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ Ｈ４Ｃｅ ｐＨ ａＣｇ 微量無機質溶液 ビタミン溶液 酵母エキス ０．０５ １０．００ ｍＬ／Ｌ ０．５０ ０．５０ １．００ １．００ １０．００ ｍＬ／Ｌ １０．００ ｍＬ／Ｌ Ｏｌｌｏ ３ＢＯ３ ＣａＣｇ２・２Ｈ２０ ＣｏＣ＃２．６Ｈ２０ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０ ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０ Ｉ Ｍｎ（Ｊ ２−４Ｈ２Ｏ Ｎａ ２Ｍｏ０４ Ｎａ２Ｓｅ０３ Ｎ ａ ２ＷＯ４ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２０ ＺｎＣｅ２ ・２Ｈ２０ 微量無機質溶液 ０．５０ ２０．００ ２００．００ ０．４０ １５０．００ ０．１０ １００．００ ｉｏ、ｏ。
ゼ生産のためのバシラス種Ａ３０−ＩＡＴＣＣ，％５！
＋８４１の増殖に使用した増殖培地組成 種培地 Ｃａ（Ｊ２−２Ｈ２０ Ｃｏｒｎｏｉｌ ＫＨ２ＰＯ４ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ Ｈ４Ｃｅ ｐＨ ａＣｇ 微量無機質溶液 ビタミン溶液 酵母エキス ０．０５ １０．００ ｍＬ／Ｌ ０．５０ ０．５０ １．００ １．００ １０．００ ｍＬ／Ｌ １０．００ ｍＬ／Ｌ Ｏｌｌｏ ３ＢＯ３ ＣａＣｇ２・２Ｈ２０ ＣｏＣ＃２．６Ｈ２０ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０ ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０ Ｉ Ｍｎ（Ｊ ２−４Ｈ２Ｏ Ｎａ ２Ｍｏ０４ Ｎａ２Ｓｅ０３ Ｎ ａ ２ＷＯ４ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２０ ＺｎＣｅ２ ・２Ｈ２０ 微量無機質溶液 ０．５０ ２０．００ ２００．００ ０．４０ １５０．００ ０．１０ １００．００ ｉｏ、ｏ。
２０．００
２０．００
３０．００
ｉｏｏ、ｏ。
第１表−続 き
ビタミン溶液
ビオチン ２．００
結晶ジアノコバラミン（Ｂ、２） ０
．１０葉！！！ ２．００ リボ（チオクト）酸 ５．００
ニコチン酸（ナイアシン） ５．０
０パントテン１ｍ！ ５
．００ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）
５．００ピ１７ ドキＶン Ｈ（Ｊ （Ｂ６）
１０．００リボフラビン （Ｂ２）
５．００ｆ７ミｙ Ｈ（Ｊ （
Ｂｌ） ５．００バシラス種Ａ３
０−１（ＡＴＣＣ／１６５３８４１）の生産するリパー
ゼは以下の特性をもつ。
結晶ジアノコバラミン（Ｂ、２） ０
．１０葉！！！ ２．００ リボ（チオクト）酸 ５．００
ニコチン酸（ナイアシン） ５．０
０パントテン１ｍ！ ５
．００ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）
５．００ピ１７ ドキＶン Ｈ（Ｊ （Ｂ６）
１０．００リボフラビン （Ｂ２）
５．００ｆ７ミｙ Ｈ（Ｊ （
Ｂｌ） ５．００バシラス種Ａ３
０−１（ＡＴＣＣ／１６５３８４１）の生産するリパー
ゼは以下の特性をもつ。
１、 最適ｐＨ条件：
リパーゼの活性を前述のアッセイ方法に従って測定した
。酵素はｐＨ４，５〜１０．０の広い範囲で機能する。
。酵素はｐＨ４，５〜１０．０の広い範囲で機能する。
最適活性はｐＨ９，５であるが、本酵素は４．５〜１０
．０の異なるｐＨで最適活性の９０％を示した。
．０の異なるｐＨで最適活性の９０％を示した。
２、最適温度条件：
活性を２５℃〜９５℃の温度で試験した。リパーゼは６
０℃で最適活性を示し、また７０℃および８０℃でそれ
ぞれ最適活性の９０％および４５％を示した。
０℃で最適活性を示し、また７０℃および８０℃でそれ
ぞれ最適活性の９０％および４５％を示した。
３、ｐＨ安定性：
リパーゼのｐＨ安定性を調べるために、さまざまなｐｕ
の酵素溶液を３７℃に保ち、１５時間インキュページ、
ンした後活性を調べた。酵素はｐＨ５〜１１で１５時間
インキュベーションした後も最初の活性の９０〜９５％
を保持していた。
の酵素溶液を３７℃に保ち、１５時間インキュページ、
ンした後活性を調べた。酵素はｐＨ５〜１１で１５時間
インキュベーションした後も最初の活性の９０〜９５％
を保持していた。
４、温度安定性：
酵素の温度安定性についても調べ、その結果を第２表に
示した。酵素は７５℃で３０分間加熱した後、初発活性
の１００％、９０℃で１０分間加熱した後６５％の活性
を保持する。７５℃での半減期は８時間であった。
示した。酵素は７５℃で３０分間加熱した後、初発活性
の１００％、９０℃で１０分間加熱した後６５％の活性
を保持する。７５℃での半減期は８時間であった。
＠２表：バシラス種ＡろＯ−Ｉ ＡＴＣＣ属５５８４１
の熱安定性 ２６℃ ６０°Ｃ ７５℃ ５、単一の酸からなるトリアジルグリセリドに対する脂
肪酸特異性： 異なる長さの炭素鎖をもつ脂肪酸からなるさまざまな種
類のトリアジルグリセリドを用いてリパーゼの特異性に
ついて研究した。
の熱安定性 ２６℃ ６０°Ｃ ７５℃ ５、単一の酸からなるトリアジルグリセリドに対する脂
肪酸特異性： 異なる長さの炭素鎖をもつ脂肪酸からなるさまざまな種
類のトリアジルグリセリドを用いてリパーゼの特異性に
ついて研究した。
第６表に、単一脂肪酸からなるある種のトリグリセリド
に対する本リパーゼの相対脂肪分解活性をトリオレイン
（ｔｒｉｏｌｅｉｎ）に対する活性を１００％として示
した。本リパーゼはＣ１６：０．Ｃ１８：０の炭素細長
をもつ飽和脂肪酸からなるトリグリセリドに対して活性
を示し、より長い炭素鎖長、例えばＣ２０：Ｏ，Ｃ２２
：０のそれに対しても同様に活性を示した。
に対する本リパーゼの相対脂肪分解活性をトリオレイン
（ｔｒｉｏｌｅｉｎ）に対する活性を１００％として示
した。本リパーゼはＣ１６：０．Ｃ１８：０の炭素細長
をもつ飽和脂肪酸からなるトリグリセリドに対して活性
を示し、より長い炭素鎖長、例えばＣ２０：Ｏ，Ｃ２２
：０のそれに対しても同様に活性を示した。
９０℃
第３表：バシラス種Ａ３０−Ｉ ＡＴＣＣ／１６５５８
４１によるさまざまなトリグリセリドの加 水分解の相対速度 トリグリセリド トリカプリリン トリカプリン トリラウリン トリミリスチン トリパルミチン トリステアリン トリオレイン トリカプリン トリラウリン トリペへニン ′″Ｃ″ 況 平均活性Ｃ％） Ｃ８：０ ９７ ＣＩＯ：０ １１６ ＣＩ２：０ １６０ Ｃ１４：０ ９７ Ｃ１６：０ ５５ Ｃ１８：０ ４８ Ｃ１８：１ １００ Ｃ１８：２ ９９ Ｃ２０：０ ３７ Ｃ２２：０ ６．７ 第４表：バシラス種Ａ３０−Ｉ ＡＴＣｃ、％５３８４
１による油脂の加水分解の相対速度 油 活性（％） とうもろこし オリーブ 綿 実 や し 落花生 大 豆 亜麻仁 小麦胚芽 バター 牛 脂 豚ラード １０′５ ３、天然油脂に対する特異性： ある天然油脂に対する本リパーゼの相対酵素活性を、オ
リーブ油に対する活性を１００％として第４表に示した
。
４１によるさまざまなトリグリセリドの加 水分解の相対速度 トリグリセリド トリカプリリン トリカプリン トリラウリン トリミリスチン トリパルミチン トリステアリン トリオレイン トリカプリン トリラウリン トリペへニン ′″Ｃ″ 況 平均活性Ｃ％） Ｃ８：０ ９７ ＣＩＯ：０ １１６ ＣＩ２：０ １６０ Ｃ１４：０ ９７ Ｃ１６：０ ５５ Ｃ１８：０ ４８ Ｃ１８：１ １００ Ｃ１８：２ ９９ Ｃ２０：０ ３７ Ｃ２２：０ ６．７ 第４表：バシラス種Ａ３０−Ｉ ＡＴＣｃ、％５３８４
１による油脂の加水分解の相対速度 油 活性（％） とうもろこし オリーブ 綿 実 や し 落花生 大 豆 亜麻仁 小麦胚芽 バター 牛 脂 豚ラード １０′５ ３、天然油脂に対する特異性： ある天然油脂に対する本リパーゼの相対酵素活性を、オ
リーブ油に対する活性を１００％として第４表に示した
。
Ｚ 過酸化水素：
本酵素は０．５％過酸化水素で１時間および１９時間イ
ンキュベーションした後、初発活性のそれぞれ１００％
および６０％を保持する。４％過酸化水素で５時間イン
キュベーションした後の残存活性は７５％であった。
ンキュベーションした後、初発活性のそれぞれ１００％
および６０％を保持する。４％過酸化水素で５時間イン
キュベーションした後の残存活性は７５％であった。
８．ズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）の影響：二
種類のプロテアーゼ、ズブチリシン（洗剤プロテアーゼ
）およびサーモライシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）を
酵素アッセイ混合物中で使用してリパーゼ活性における
プロテアーゼの影響を定量した。５ Ｕ／ａｊのズブチ
リシンを用いた場合、初発活性の６０％が保持されてい
た。８ Ｕ／ｌ／サーモライシンでは活性の９０％が保
たれていた。
種類のプロテアーゼ、ズブチリシン（洗剤プロテアーゼ
）およびサーモライシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）を
酵素アッセイ混合物中で使用してリパーゼ活性における
プロテアーゼの影響を定量した。５ Ｕ／ａｊのズブチ
リシンを用いた場合、初発活性の６０％が保持されてい
た。８ Ｕ／ｌ／サーモライシンでは活性の９０％が保
たれていた。
９ 分子量：
本酵素は約６５，０００の概算分子量をもつ。
本発明のリパーゼは５０℃〜６０℃で最適活性を示し、
中温性の（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）バシラス種（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、）より得られた他のリパーゼにつ
いては記載されていないような卓越した熱安定性を有す
ることが当業者には明らかであろう。さらに本発明のリ
パーゼはｐＨ４〜１０の広い範囲で活性を示すだけでな
く安定でもある。リパーゼのこのような特有の性質のた
め本酵素は脂肪の加水分解と同様に洗剤調合剤としても
有用である。
中温性の（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）バシラス種（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、）より得られた他のリパーゼにつ
いては記載されていないような卓越した熱安定性を有す
ることが当業者には明らかであろう。さらに本発明のリ
パーゼはｐＨ４〜１０の広い範囲で活性を示すだけでな
く安定でもある。リパーゼのこのような特有の性質のた
め本酵素は脂肪の加水分解と同様に洗剤調合剤としても
有用である。
洗剤成分に含まれる過酸化水素およびアルカリホスファ
ターゼに対するリパーゼの耐性は、本リパーゼが環境的
にも洗剤中での利用に適することを示している。
ターゼに対するリパーゼの耐性は、本リパーゼが環境的
にも洗剤中での利用に適することを示している。
ＩＪ ハーゼの熱安定性およびｐＨ安定性のため、本酵
素は獣脂を加水分解するための有効な候補となる。獣脂
から所望の脂肪酸およびグリセロールを生産するために
は、ｐｎ範囲５〜３、温度５０℃〜６０℃が望ましい。
素は獣脂を加水分解するための有効な候補となる。獣脂
から所望の脂肪酸およびグリセロールを生産するために
は、ｐｎ範囲５〜３、温度５０℃〜６０℃が望ましい。
また、本発明のリパーゼは界面活性剤およびエステル等
の化学製品の特異的な合成に適する場合もある。
の化学製品の特異的な合成に適する場合もある。
脂肪分解生産性は生産する微生物の突然変異を通して、
または遺伝組換え技術如よって強化される場合もあるこ
とが予想される。それ故、同一酵素を生産する能力をも
つ任意の生物は本発明の範囲内に包含されるから、本発
明の範囲は本願明細書に記載した特定株の生物に限定さ
れるべきではない。
または遺伝組換え技術如よって強化される場合もあるこ
とが予想される。それ故、同一酵素を生産する能力をも
つ任意の生物は本発明の範囲内に包含されるから、本発
明の範囲は本願明細書に記載した特定株の生物に限定さ
れるべきではない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、実質上他の酵素活性に干渉されない、￥バシラス￥
（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）種￥Ａ３０−１￥ＡＴＣＣＮ
ｏ．５３８４１の同定特性を有する微生物から得られた
熱安定リパーゼ。 ２、以下の物理化学的性質を有する熱安定リパーゼ。 （ａ）反応性：油脂と反応して脂肪酸およびグリセロー
ルを生成する。 （ｂ）最適ｐＨ値：最適ｐＨは９．５であるが、ｐＨ約
４．５〜約１１で機能する。 （ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ約５〜約１１に１５時間迄放置
しても９０〜９５％の活性を維持する。 （ｄ）最適温度：最適温度は６０℃であるが、７０℃で
も最大活性の９０％の活性を有する。 （ｅ）温度安定性：７５℃で３０分間加熱後の活性１０
０％ （ｆ）阻害剤の影響：過酸化水素またはアルカリ性プロ
テアーゼによって阻害されない。 ３、約６５，０００の分子量をもつ、請求項２記載のリ
パーゼ。 ４、￥バシラス￥種￥Ａ３０−１￥ＡＴＣＣＮｏ．５３
８４１の同定特性を有する微生物の生産するリパーゼを
栄養培地中で増殖条件下で脂肪酸分解活性が実質上検出
可能になる迄好気的に培養し、その後熱安定リパーゼを
分離することからなる、熱安定リパーゼの製造法。 ５、￥バシラス￥種￥Ａ３０−１￥ＡＴＣＣＮｏ５３８
４１の生物学的に純粋な培養物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/314,677 US5093256A (en) | 1989-02-22 | 1989-02-22 | Essentially purified, thermostable and alkalophilic lipase from bacillus sp. a30-1 atcc 53841 |
| US314677 | 1989-02-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02273178A true JPH02273178A (ja) | 1990-11-07 |
Family
ID=23220966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1327062A Pending JPH02273178A (ja) | 1989-02-22 | 1989-12-16 | 熱安定リパーゼおよびその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5093256A (ja) |
| EP (1) | EP0384717A1 (ja) |
| JP (1) | JPH02273178A (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE59101948D1 (de) * | 1990-04-14 | 1994-07-21 | Kali Chemie Ag | Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren. |
| US5248618A (en) * | 1991-06-05 | 1993-09-28 | Life Technologies, Inc. | Methods for generating light with chemiluminescent dioxetanes activated by anchimeric assisted cleavage |
| DE4329463A1 (de) * | 1993-09-01 | 1995-03-02 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulate |
| AT400036B (de) * | 1993-10-15 | 1995-09-25 | Pittner Fritz | Mit enzym markierte probe oder testsubstanz |
| DE4422433A1 (de) * | 1994-06-28 | 1996-01-04 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulat |
| DE19515072A1 (de) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Cognis Bio Umwelt | Cellulasehaltiges Waschmittel |
| DE19725508A1 (de) | 1997-06-17 | 1998-12-24 | Clariant Gmbh | Wasch- und Reinigungsmittel |
| JP4567334B2 (ja) | 2001-10-22 | 2010-10-20 | ヘンケル・アクチェンゲゼルシャフト・ウント・コムパニー・コマンディットゲゼルシャフト・アウフ・アクチェン | 綿活性汚れ除去性ウレタン系ポリマー |
| EP1572851B1 (de) | 2002-12-20 | 2007-03-21 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Bleichmittelhaltige wasch- oder reinigungsmittel |
| DE502004003835D1 (de) | 2003-02-10 | 2007-06-28 | Henkel Kgaa | Bleichmittelhaltige wasch- oder reinigungsmittel mit wasserlöslichem buildersystem und schmutzablösevermögendem cellulosederivat |
| DE10351325A1 (de) | 2003-02-10 | 2004-08-26 | Henkel Kgaa | Wasch- oder Reinigungsmittel mit wasserlöslichem Buildersystem und schmutzablösevermögendem Cellulosederivat |
| EP1745129B1 (en) | 2004-04-16 | 2009-04-15 | Idexx Laboratories, Inc. | Antibodies against canine pancreatic lipase |
| DE102005026522B4 (de) | 2005-06-08 | 2007-04-05 | Henkel Kgaa | Verstärkung der Reinigungsleistung von Waschmitteln durch Polymer |
| ATE485370T1 (de) * | 2006-09-14 | 2010-11-15 | Tmo Renewables Ltd | Lipase |
| CA2702582C (en) * | 2007-10-15 | 2013-12-24 | Idexx Laboratories, Inc. | Feline pancreatic lipase |
| KR101761313B1 (ko) * | 2010-12-06 | 2017-07-25 | 삼성전자주식회사 | 로봇 및 로봇의 경로생성방법 |
| WO2016111884A2 (en) | 2015-01-08 | 2016-07-14 | Stepan Company | Cold-water laundry detergents |
| WO2016160407A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Stepan Company | Detergents based on alpha-sulfonated fatty ester surfactants |
| CN120858167A (zh) | 2023-03-09 | 2025-10-28 | 诺福克有限公司 | 单酯糖脂在洗衣洗涤剂中的用途 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5763087A (en) * | 1980-09-30 | 1982-04-16 | Agency Of Ind Science & Technol | Treatment of culture mixture containing heat-resistant lipase |
| US4444886A (en) * | 1982-08-11 | 1984-04-24 | Eastman Kodak Company | Diacetinase from Bacillus subtilis |
| JPS59156282A (ja) * | 1983-02-25 | 1984-09-05 | Daikin Ind Ltd | 新規耐熱性リパーゼおよびその製造法 |
| DK402583D0 (da) * | 1983-09-05 | 1983-09-05 | Novo Industri As | Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf |
| US4732853A (en) * | 1984-11-21 | 1988-03-22 | President And Fellows Of Harvard College | Method of making chiral epoxy alcohols |
| JPH0673453B2 (ja) * | 1985-09-30 | 1994-09-21 | ユニチカ株式会社 | 耐熱性リパ−ゼ |
| JPH0755147B2 (ja) * | 1986-03-12 | 1995-06-14 | 生体機能利用化学品新製造技術研究組合 | 新規リパ−ゼ |
| DE3781192T2 (de) * | 1986-04-22 | 1993-02-18 | Sumitomo Chemical Co | Mikroorganismus, esterase und verfahren zu deren herstellung. |
| JPH0789913B2 (ja) * | 1986-08-06 | 1995-10-04 | 天野製薬株式会社 | リパ−ゼａｍｌの製造法 |
| JPS6344892A (ja) * | 1986-08-13 | 1988-02-25 | Kao Corp | 油脂類のエステル交換反応方法 |
-
1989
- 1989-02-22 US US07/314,677 patent/US5093256A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-16 JP JP1327062A patent/JPH02273178A/ja active Pending
-
1990
- 1990-02-20 EP EP90301827A patent/EP0384717A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5093256A (en) | 1992-03-03 |
| EP0384717A1 (en) | 1990-08-29 |
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