JPH02273200A - 化学発光の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は、固相を用いる化学発光の測定方法に関する。

更に詳しくは、酵素として酸又はアルカリホスファター
ゼ及び基質として一般式 （式中、Ａｄはアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基で
あり、Ａｒは芳香族基である。）で表されるジオキセタ
ン誘導体を用い、ｐＨ４〜ｐＨ１０，５で酵素反応させ
た後、その面相のみをアルカリ条件で発光反応させる、
化学発光の測定方法に関する。

（従来の技術） 発光測定法には化学発光および生物発光反応にもとづく
ものとがあり、高感度な超微量分析法として利用されて
いる。例えば化学発光測定法では、■アルカリ存在下、
ルミノール／フェリシアン化カリウムによる！１２（１
２の測定（Ｂｏｓｔｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ。

Ｃｈｅｍ、、　　４７．４４７−４５２（１９７５）　
）■ルミノールーグルコースオキシダーゼによるグルコ
ースの測定及び（Ｂｏｓｔｊｃｋ　ａｔ　ａｌ、、　Ａ
ｎａｌ、、Ｃｈｅｍ、４７．４４７−４５２（１９７５
）　）■アルカリ存在下、ルミノール／Ｈ２０ｇによる
ヘモグロビンの測定（Ｅｗｅｔｚ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、＋
Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７１．５６４−５７０（１９７６
）　）等が知られている。一方、生物発光測定法には、
（イ）ホタルの発光酵素ルシフェリン−ルシフェラーゼ
によるＡＴＰの測定（Ａｄｄａｎｋｉ　ｅｔ　ａｌ、＋
＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１４＋２６１−２６
４（１９６６）　）、（ロ）アクニオリンによる細胞遊
離カルシウムイオンの測定（Ｂｌｉｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ
、。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｒｅｖ、、　２８．１−９３（１
９７６））及び（ハ）バクチリアルルシフェラーゼによ
るＮＡＤ）ｌの測定（Ｈａｓｔｉｎｇ、　Ｊ、Ｗ、　ｅ
ｔ　ａｌ、＋Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、。

■、　５４９（１９７７）　）等が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、前記した化学発光法■の方法は、発光に
使用する酸化剤で試料が分解したり、酸化剤自体が分解
するため正確な測定ができない、■の方法は、発光に使
用する試薬の水溶性が低く、水系での測定は困難である
、■の方法は、発光反応が間けつ的であるため測定のタ
イミングをとるために熟練さを要求される、などの欠点
を有している。又、前記した生物発光法（イ）（ロ）及
び（ハ）の方法は化学発光に比べると使用する酵素が極
めて高価であったり、免疫測定法に利用すると酵素が失
活するなどの欠点を有している。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、高感度、高精度、簡便な化学発光測定法
を見出すべく検討した結果、本発明を見出すに至ったも
のである。

本発明は、固相を用いる化学発光であって酵素として酸
又はアルカリホスファターゼ及び基質として前記一般式
（１）で表されるジオキセタン誘導体を用い、ｐＨ４〜
ｐｉ＋　１０．５において酵素反応させた後、更に固相
のみをアルカリ条件とすることにより発光反応を行なう
化学発光測定法である。

本発明における固相とは、測定系中に存在させる固体で
あって、例えば後述する免疫測定の際には抗体が結合し
た固体などであり、いかなる固体であってもよく、その
形状等も同等限定されるものではない。固相として存在
させるための好まし本発明の化学発光測定法は、酵素と
して酸又はアルカリホスファターゼを用いるものである
。これらのホスファターゼは、動物あるいは植物から分
離情調し、得ることができるが市販品であっても何ら差
支えない。

本発明に用いる基質は、前記一般式（１）で表されるジ
オキセタン誘導体である。ジオキセタン誘導体は、例え
ばヨーロッパ特許公開２５４０５１、ＰＣＴ公開ＷＯ８
８（１０６９５号、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ
、、２８１１５５−１１５８（１９８７）に記載の方法
と同様にして製造することができる。前記一般式中のＲ
としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基
等の低級アルキル基を、Ａｒとしては、フェニレン基、
ナフチル基、アントラニル基等の芳香族基を例示するこ
とができる。

尚、前記一般式（１）で表されるジオキセタン誘導体の
陽イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金
属、アンモニウム、ＮＣＲ”）４”″　（式中、１は、
メチル、エチル等のアルキル基、ベンジル等のアラルキ
ル基を表わす。）で表される四級アンモニウムを例示す
ることができる。

本発明における酵素反応は、ｐＨ４〜ｐＨ１０，５にお
いて行うことを必須の要件とするものであるが酸ホスフ
ァターゼの場合は、ｐＨ４〜ｐ）１７で酵素反応するこ
とが好ましく、アルカリホスファターゼの場合はｐＨ７
〜ｐｉ（１０，５で酵素反応することが好ましい。即ち
、前記したホスファターゼの至適ｐ）Ｉ内において酵素
反応を行うものである。

本発明は、酵素反応後更にアルカリ条件下において発光
反応を行い化学発光を誘導するものである。酵素反応の
終了は、基質の反応した程度により判断するものである
が酵素の存在量と基質の量との関係などを考慮し、適宜
決定すればよい。

又、この反応の終了は、停止剤を添加し、強制的に行う
こともできる。ここで停止剤として使用できるものとし
て、酵素阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴ＾等のキレ
ート化剤、フェニルリン酸エステル、ナフチルリン酸エ
ステル等の有機リン酸エステルあるいはオルト正リン酸
等の無機リン酸を挙げることができる。停止剤の使用量
は、酵素阻害剤のにｉを考慮し、その１０倍以上が好ま
しく例えば、ＥＤＴＡの場合は１ｍＭ以上であり、又、
フェニルリン酸エステルの場合は３０ｍＭ以上である。

尚、酵素としてアリカリホスファターゼを使用している
場合は、酸性条件に設定することにより酵素反応を停止
することができる。この場合には、再び前記した如くの
アルカリホスファターゼの至適ｐＨ内に条件を設定する
ことにより酵素反応を再開させることもできる。

次いで、本発明は、固相のみをアリカリ条件とすること
により発光反応を行い、得られる化学発光を測定するも
のである。「固相のみ」とは酵素反応後に、反応溶液を
除去し、例えば水等で洗浄した固相を指すものである。

本発明におけるアルカリ条件とはｐＨ８以上を指すもの
であり、より好ましくはｐＨｌ０以上である。アルカリ
条件の設定は、ＮａＯＨ，にＯＨ、Ｍｇ（Ｏｆｆ）ｚな
どのアルカリ金属あるいはアルカリ土類金属の水酸化物
、水酸化アンモニウム、エタノールアミン等の水酸化物
イオンを有する化合物を系中に添加することにより行う
ことができる。

アルカリ条件設定と同時に発光反応が開始されるが、発
光量の測定は、市販されているルミノメータ−を用いて
容易に測定することができる。

尚、この発光反応は、酸性条件にすることにより反応が
停止され、再びもとの反応条件にもどすことにより発光
反応が再開される。即ち、本発光反応は条件設定するこ
とにより０Ｎ−ＯＦＦ状態の反応を行なわせることがで
きる。

又、本発光反応を行う際には、タンパク、ポリアルキル
４級アミン、蛍光剤、ジメチルスルホキシド等をエンハ
ンサ−として用いることができる。

タンパクとしては、例えば、ＢＳＡ、　ＩＳＡ、ヒト免
疫グロブリン、卵白アルブミン等を使用することができ
る。又、ポリアルキル４級アミンとしては、例えば、ポ
リジアリールジメチルアンモニウムクロライド（以下Ｐ
ＤＤＡＣと記す）、ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジ
メチル−アンモニウムクロライド）〕（以下ＢＤＭＧと
記す）等を使用することができる。更に、蛍光剤として
は、例えば、フルオレッセイン、シス−ジクロロビス（
２，２’　−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレ
ート（以下ＴＢＲ−Ｃト記ｔ）又は４−フルオロ−７−
ニトロベンゾフラザン（以下　ＮＢＤ−Ｆと記す）、７
−フルオロ−４−ニトロベンゾキサンアゾール（以下Ｎ
ＢＤ−Ｃと記す）とアミン、アミノ酸、ペプチド若しく
は蛋白質との結合物又は誘導体等を使用することができ
る。エンハンサ−の使用量は、発光反部系の０．（１０
０１ｗＬ％〜１０ｗｔ％である。更に、本発光反応は、
発行量が多く得られる点で有機溶媒中で行うことが好ま
しい。有機溶媒としては、例えば、クロロホルム、ベン
ゼン、ベンジルアルコール、メタキシレン、ジメチルス
ルホキシド等を使用することができる。

本発明は酵素免疫測定法として採用することができる。

その際測定できる抗原としては、血清あるいは尿などに
含まれる薬物、ホルモンあるいは各種疾患に由来する微
量成分などである。又、使用する抗体は、公知の方法に
従い取得したものを使用することができる。例えば、兎
、山羊、馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に、
リガンド又は酵素を体重１ｋｇ当り０．３〜２ｍｇ程度
１〜数回背中皮下、フットバッド、大腿筋等にアジュバ
ントとともに注射して当該動物の体内に抗体を形成させ
ることができる。得られた抗体はペプシン等の蛋白分解
酵素でＦ　（ａｂ’　）ｔ＋　Ｆａｂ’　＋　Ｆａｂな
どに分解して用いることもできる。

一方、モノクローナル抗体として取得することもできる
。その場合には、マウスに前記のりガントあるいは酵素
をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓細胞
を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウス
ミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞の
なかから当該抗体を産生ずるものをクローニングによっ
てモノクローン細胞として増殖させ、得られたモノクロ
ーン細胞をマウス腹腔中で増殖させることによって得た
モノクローナル抗体を使用することができる。

免疫測定のための方法としては、「酵素免疫測定法」医
学書院（１９８７年版）に記載の各方法、例えば固定化
抗体上に抗原を反応させその抗原に酵素標識した抗体を
反応させ測定する方法等を採用することができる。

又、本発明は、ポリヌクレオチド測定法として採用する
ことができる。その方法としては、「Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ＰｒｏｂｅＪＶｏｌ、
　１１？？（１９Ｂ？）に記載の各方法、例えばニトロ
セルロースフィルターに固定させた検体のＤＮＡにハブ
テン標識相補プローブＤＮＡを反応させ、さらに抗ハプ
テン抗体アルカリホスファターゼ結合体を作用させる。

このアルカリホスファターゼ活性をジオキセタン誘導体
を基質として用いて測定することができる。

（作　用） 本発明は、酵素反応をさせた際に存在した固相を更に、
その固相のみを更にアルカリ条件とすることにより発光
反応させ得られる化学発光を用いる。

実施例１ （ＴＳＩＩの測定） １５ｕｌのＴＳＩＩを含むサンプル２μ（１／＋ｆ！に
抗ＴＳＨＦａｂ’を結合したアルカリホスファターゼコ
ンジュゲート１３５μ！（コンジュゲート濃度０．５　
ｕｇ／　ｍｌ、　　０．１Ｍ　　トリス塩酸、２％ＢＳ
＾。

１ｍＭ　ＭｇＣｆｚ　、　０．１ｉＭ　ＺｎＣ１ｔ　、
　ｐＨ７，５）を混合し、これに抗ＴＳＩ（マウスＩｇ
Ｇをコートしたポリスチレンビーズ１個（直径１／８イ
ンチ）添加し、室温で２時間放置した。このビーズを蒸
留水で３回洗浄し、３−　（２’−スピロアダマンタン
）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フ
ェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（以下
へＭＰＰＤと記す。） １（１０μｇ　／　ｍｌを含む基質液（０，１Ｍ　　ト
リス塩酸。

１＋＋Ｍ　ＮｇＣｌｔ　、　０．１ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ　
ｐＨ９，８）　２（１０　ｕ　１を加え、室温で２０分
間反応させた。このビーズを蒸留水１　　ｍｌで３回洗
浄し、ついでｐＨ８，０〜１４．０の各アルカリ溶液を
２（１０μ！添加し、ただちにルミノメータ−（ベルト
ールド社製）で発光量をカウントし、１０秒間の積算値
を求めた。

その結果を第１図に示す。

実施例２ （洗浄回数によるＴＳＨ測定への影響）２０μｌのＴＳ
Ｈを含むサンプル（０，０，５，２，１０゜２０ｕＵ／
ｌｌｌ１）に抗ＴＳｆ（Ｆａｂ’を結合したアルカリホ
スファターゼコンジュゲート３（１０μ！（コンジュゲ
ート濃度０．５μｇ　／　ｍｌ、　　Ｏ，ＩＭ　　）リ
ス塩酸、２％ＢＳＡ　１ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、　０．
１ｍＭ　ＺｎＣｆｚ　ｐＨ７，５）を混合し、これに抗
ＴＳ１１マウスＩｇＧをコートしたポリスチレンビーズ
１個（直径１／４インチ）添加し、室温で２時間放置し
た。このビーズを蒸留水で３回洗浄し、ＡＭＰＰＤ　１
（１０μｇ／ｍｆを含む基質液（０，ＩＭ）リス塩酸、
　　１　ｍＭ　ＭｇＣｌ　Ｌ　０．１　ｍＭＺｎＣｌｚ
　ｐＨ９，８）　２（１０　ｕｌを加え室温で２０分間
反応させた。このビーズを蒸留水２ｍｌで１〜１０回洗
浄し、さらにビーズに４　Ｎ−Ｎａ０１１　３（１０　
ｕ　１（ｐＨ１３，５）を加え、ただちにルミメーター
（ベルトールド社製）で発光量を力うントし、１０秒間
の積算値を求めた。

その結果を第２図に示す。

実施例３ （Ｄ？ｌＳＯ添加ＴＳＨの測定） ２０μｆのＴＳＨを含むサンプル（０，ｌ、　１０μｔ
ｌ／ｍｊりに抗ＴＳＨＦａｂ’を結合したアルカリホス
ファターゼコンジュゲート３（１０μ２（コンジュゲー
ト濃度０．５　ｕｇ　／　ｍｌ、　　Ｏ，ＩＭ　　）リ
ス塩酸、２％ＢＳ＾１ｍＭ　ＭｇＣｌ！ｚ　、　　Ｏ，
ＬｍＭ　ＺｎＣｊ２ｚ　ｐＨ７，５）を混合し、これに
抗ＴＳＩ（マウスＩｇＧをコートしたポリスチレンビー
ズ１個（直径１〕４インチ）添加し、室温で１時間放置
した。このビーズを蒸留水で３回洗浄し、ＡＭＰＰＤ　
１（１０μｇ／　ｃｌ、を含む基質液（０，ＩＭ　　）
リス塩酸、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、　０．１ｍＭ　Ｚｎ
ＣＪ！ｚ　ｐＨ９，８）３（１０μ２を加え室温で２０
分間反応させた。このビーズを蒸留水で３回洗浄し、乾
燥させついで２Ｎ　ＮａＯＨ／ＤＭＳＯの各混合液（混
合比２／１　、１／１　。

１／２　）　３（１０μｌを添加し、ただちにルミノメ
ータ−（ベルトールド社製）で発光量をカウント１０秒
間の積算値を求めた。その結果を第１表に示す。

第１表　１）ＭＳＯ添加ＴＳ１１の測定実施例４ （各種ビーズを用いたＥＩＡによるＡＦＰの測定）２０
ｕｌのＡＦＰを含むサンプル（ｌｎｇ／　ｍｌ１）に抗
ＡＦＰ　Ｆａｂ’を結合したアルカリホスファターゼコ
ンジュゲート３（１０μＩｌ（コンジュゲート濃度０．
５μｓ／　ｍ（１，Ｏ，ＬＭ　　）リス塩酸、２％ＢＳ
Ａ１ｍＭＨｇＣ１ｚ　、　０．１　ｍＭ　ＺｎＣ１２１
）８７．５　）を混合し、これに抗ＡＦＰマウスＩｇＧ
をコートしたポリスチレン、ポリフルオロエチレン、ポ
リアクリロニトリル、ビーズ１個（直径１／４インチ）
添加し、室温で２時間放置した。このビーズを蒸留水で
３回洗浄し、ＡＭＰＰＤ　１（１０μｇ／ｍｌ！を含む
基質液（０，１Ｍ　トリス塩酸、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　
、　０．１ｍＭ　ＺｎＣｊ！ｚ　ｐＨ９，８）２（１０
μｌを加え室温で２０分間反応させた。このビーズを蒸
留水で３回洗浄後、４Ｎ　ＮａＯＨ，３（１０μｌと蒸
留水１（１０ｕｊ！とを加えただちにルミノメータ−（
ベルトールド社製）で発光量をカウントし、１（１０秒
間の積算値（Ｂ）を求めた。対照として４Ｎ−ＮａＯＨ
を加えず蒸留水だけを添加したときの値（Ａ）を求め、
各ビーズにおける増幅率を求めた。

結果を第２表に示す。

実施例５ （卵白アルブミン添加による固相発光ＥＴＡの増感法） ＡＦＰ　（０，５ｎｇ／　ｍｉ！、）を含むサンプル５
０μ！を試験管に取り、抗ＡＦＰマウスＩｇＧ感作ビー
ズ１個を加え、続いて抗ＡＦＰマウスＩｇＧ　Ｆａｂ結
合アルカリフォスファターゼ（０，０８μｇ／＋＋／２
）を４（１０μ２添加した。室温で３０分放置し、生理
食塩水で４回洗浄し、１（１０μｇ／ｍｊ２のＡＭＰＰ
Ｄを含む０．１　Ｍ　トリス−ＨＣｊ２緩衝液（ｐＨ９
，８）　２（１０ｍ１加えた。２０分後、この上清を吸
引除去し蒸留水で２回洗浄した。

このビーズに０〜２０ｍｇ／　ｍｌの蛋白溶液１（１０
μ！、更に４　Ｎ　Ｎａ０ＩＩ　１（１００μｌを加え
、その５秒間の発光量を計測した。蛋白としてＢＳＡ、
　ｌｌ５Ａ、ヒ目ｇＧあるいは卵白アルブミンを用いた
。第３図はその蛋白濃度と発光量の関係を示している。

実施例６ （有機溶媒中での増感発光免疫測定法）ＴＳＩＩ　（０
，５ｕ　Ｕ／　ｍｅ　）を含むサンプル５０μ２を試験
管に取り、抗ＴＳＩＩマウスＩｇＧ感作ビーズ１個を加
え、続いて抗ＴＳＩＩマウスＩｇＧ　Ｆａｂ結合アルカ
リフォスファターゼ（０，０８μｇ／ｍｆ）を４（１０
μｌ添加した。室温で３０分放置し、生理食塩水で４回
洗浄し、１（１０μｇ／ｍｆｆ１のＡＭＰＰＤを含む０
．１　Ｍ　トリス−１１０！緩衝液（ｐＨ９，８）　２
（１０ｍ１加えた。２０分後、この上清を吸引除去し蒸
留水で２回洗浄した。完全に蒸留水を除去し、これにク
ロロホルム、ベンゼン、”ベンジルアルコール、メタキ
シレン、あるいはジメチルスルホキシド溶７夜（０，０
１％ナトリウムメチラート含有）を１（１００μ！加え
、その１０秒間の発光量を計測した。

表３は各有機溶媒で発光させたときの発光量を示してい
る。

表３　各種有機溶媒を用いたときの発光量＊ｔ／２；発
光半減期 積算値ｉ１０秒間の積算値 相対比；積算値の相対積算値 （クロロホルムを１とした場合） 実施例　７ （ヒト肝炎Ｂ型ウィルス表面抗原（ＩＩＢＶｓ）　ＤＮ
Ａの検出） ｔｌＢＶｓ　ＤＮＡ　（１（１０，１０，１，０，１μ
ｇ／　ｍｆ）を等量の０．６Ｎ　Ｎａ０ｔｌを添加する
ことにより変性させ、弱く吸引することによりナイロン
メンプラン（［１ｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマジャム社製）に
プロットした。

このメンプランを２Ｍアンモニアおよび５Ｘｓｃｃで洗
浄後、このＤＮＡをＵｖ照射によりメンプランに固定し
た。固定化したメンプランをプレハイブリダイゼーショ
ン緩衝液（５×ｓｃｃ、５×デンハート溶液、０．１％
５ＯＳ）で１５分間、５０”Ｃでインキュベートした。

この溶ｔ（１２ｍｌに１Ｏｕｉ！のプローブＤＮＡ　（
アルカリ性ホスファターゼ標識オリゴヌクレオチドＤＮ
Ａ、　Ｄｕｐｏｎｔ社製）を加え、５０°Ｃで３０分間
ハイブリダイゼーションした。その後、このメンプラン
を１Ｘｓｓｃ、１％ＳＤＳを含む溶液で１回につき室温
で５分間浸して２回洗浄し、更にｌ　Ｘ５ｓｃ　％　　
１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１（１０を含む溶液で１回につ
き５０°Ｃで５分間浸して２回洗浄した。

最後にこのメンプランを撹拌しなから１Ｘｓｓｃを含む
溶液で１回につき室温で５分間浸して２回洗浄した。ア
ルカリ性ホスファターゼの活性測定はＡＭＰＰＤ　（１
（１０ｕ　ｇ／　ｍｆ）およびＢＤＭＱ　（０，（１２
％）を含む基質液を用い室温で５分間浸すことにより行
い、５分後にこのメンプランを０．　ＯＩ　Ｍ　ＩＪン
酸１　ｍ　ＭＥＤＴＡ　ｐＨ６，０に浸して洗浄し、更
にこのメンプランをＩ　Ｎ　ＮａＯＨ溶液に浸した。そ
の後、直ちにＸ線フィルムにこのメンプランを３分間感
光させた。対照として０．１　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐｌ
＋５．２）に浸し、フィルムに感光させた。表５はその
ときの各濃度に対する感光スポットを示している。

表５ １１ＢＶ　ｃｏｎｃ、　　１０ｐｇ　１（１０ｐｇ　１
（１００ｐｇＮａＯＨ（−）十 Ｎａ１ｌ（（＋）　　＋　　　＋　　柑（−）目で判定
できない。

（モ）目で感光スポットをよみとれる。

（＋）目でスポットが黒くよみとれる。

（１１）スポットが広く外部に及んでいる。

（発明の効果） 本発明は、酵素反応させ、更に面相のみをアルカリ条件
とすることにより生ずる発光反応を組合せた化学発光測
定法である。極めて多量の光量を得ることができるため
高感度、高精度の測定ができる。又、発光を任意の時間
及び場所で行なわせることもできるため極めて有用な測
定法である。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｌ＋を変化させた時の発光量を示したもので
あり、第２図は、洗浄回数による影響を示したものであ
り、第３図は固相発光時に蛋白とＮａ０）１を添加した
時の発光量を示す図である。 第１図

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）固相を用いる化学発光の測定方法において、酵素
   として酸又はアルカリホスファターゼ及び基質として一
   般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるジオキセタン誘導体を用い、ｐＨ４〜ｐＨ１
   ０．５で酵素反応させた後、その固相のみをアルカリ条
   件で発光反応させる該測定方法（式中、Ａｄはアダマン
   チル基、Ｒは低級アルキル基であり、Ａｒは芳香族基で
   ある。）。
2. （２）化学発光測定法を酵素免疫測定法に用いた、特許
   請求の範囲第（１）項に記載の方法。
3. （３）化学発光測定法をポリヌクレオチド測定法に用い
   た、特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。
4. （４）酵素反応を停止剤を添加し、反応を停止させた後
   にアルカリにおいて発光反応を行う、特許請求の範囲第
   （１）、（２）又は（３）項に記載の方法。
5. （５）停止剤が酵素阻害剤又は酸である、特許請求の範
   囲第（４）項に記載の方法。
6. （６）アルカリで反応を行う際にエンハンサーを共存さ
   せる、特許請求の範囲第（１）、（２）又は（３）項に
   記載の方法。
7. （７）エンハンサーがタンパク、ポリアルキル４級アミ
   ン又は蛍光剤である、特許請求の範囲第（６）項に記載
   の方法。
8. （８）タンパクがＢＳＡ、ＨＳＡ、ヒト免疫グロブリン
   又は卵白アルブミンである、特許請求の範囲第（７）項
   に記載の方法。
9. （９）蛍光剤がフルオレッセイン、シス−ジクロロビス
   （２，２′−ビピリジン）ルテニウム（II）ハイドレー
   ト又は４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン、７−
   フルオロ−４−ニトロベンゾキサンアゾールとアミン、
   アミノ酸、ペプチド若しくは蛋白質との結合物又はその
   誘導体である、特許請求の範囲第（７）項に記載の方法
   。
10. （１０）固相発光を有機溶媒中で行なう特許請求の範囲
    第（１）、（２）又は（３）記載の方法。
11. （１１）有機溶媒がクロロホルム、ベンゼン、ベンジル
    アルコール、メタキシレン、あるいはジメチルスルホキ
    シドである特許請求の範囲第（１）、（２）又は（３）
    記載の方法。
12. （１２）固相がポリスチレン、ポリフルオロエチレン、
    ナイロン、ポリアクリロニトリル、ジュラコン、ポリメ
    チルペンテン、又はポリアセタールである特許請求の範
    囲第（７）項記載の方法。