JPH02276570A - 組織等価物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 几ｊ目と東が 本発明は、その格子内で前駆細胞を外因的化学誘導なく
して分化させることにより生産された細胞を含む組織等
価’ｊ’ｌＪ　（ｔｉｓｓｕｅ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ
ｓ）と、生体宿主における組織の増大（ａｕｇｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ）、修復または置換を含む、かかる等価物を
製造及び使用する方法とに関する。更に本発明は、外因
的化学誘導なくして前駆細胞を分化させる方法にも関す
る。

組織等価物を形成する例えば腺維芽細胞または血小板と
いった収縮剤によって収縮された水和コラーゲン格子か
ら製造された組織等価物が、米国特許筒４，４８５，０
９６号、第４，４８５，０９７号、第４，５３９，７１
６号、第４．５４８．５００号、第４，６０４，３４６
号、第４，８３５，１０２号及び第４，８３７，３７９
号（前記特許の全ては参照のため本明細書に包含される
ものとし、以下総称的に「参照特許」と記述する）に開
示されている。これらの組織等価物としては、限定的で
はないが、上皮組織、結合組織、軟骨、骨、血液、器官
、腺及び血管を挙げることができる。組織等価物は、ま
た生細胞及び細胞外マトリックス分子、主としてコラー
ゲンを含むが、必要によっては、正常組織中に一最的に
は見られない成分を含んでもよい。

異常細胞または形質転換細胞を含む種々のタイプの細胞
をかかる組織等価物中またはその上で成育させることが
できる。

上記組織等価物は、長期間生存することができ、且つ生
産された単位が実質的に均一であるという保証のもとに
大量に産生され得る細胞を集団形成し得る。かかる組織
等価物中の細胞は、それらの構造的配置、生合成生産物
及び透過性において正常組織の細胞と類似している。上
記組織等価物はヒトのものである必要はなく所望の任意
の動物のものとすることができる。

かかる組織等価物は広範囲にわたる用途が見込まれ、医
学、薬学、化粧品、工業及び他の研究開発において、製
品の安全性の試験及び製品開発、組織の増大、修復及び
置換並びに器官交換といった用途を有する。

ある種の組織増大に使用するには、組織等価物を予め形
成し、次いで増大されるべき部位に外科的に移植する。

別の用途においては組織等価物の成分、即ち組織前駆体
混合物を、組織等価物格子のゲル化が防止される条件下
に混合し、次いで、宿主内の増大させるべき部位に、ゲ
ル化する条件下に注入する。

組織前駆体混合物の注入を含む動物モデル実験から、−
旦宿主組織と接触すると、混合物はゲル化しスペースを
充填することが判った。ゲル化は、例えば予め冷却され
た混合物の温度が宿主のより高い周囲温度によって上昇
されるとすぐに始まる。

組織前駆体を頭皮下に注入することで、例えば、形成さ
れる組織のスペース充填特性が、肉眼観察及び０組織学
的生検によって研究された。注入された組織前駆体は１
塊の組織の形をなし、それに３〜７日以内に血管が分布
し、長期間（数カ月）生存した。

ラットにおける実験から、前記参照特許に従つて製造さ
れた組織等価物は優れた移植可能性を示すことが判った
。格子を首の項に移植し、６〜８日間維持し、次いで回
収し、検査した。血管が高度に分布しており、組織等価
物の移植の能力において鍵となる事項には、所定の機能
細胞、例えば脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）が取得
されることが含まれる。

組織等価物を製造する上で有効な、生検から誘導される
所定のタイプの細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養されると
分化する。これらの細胞は、適当な環境下で分化し、安
定した分化表現型の子孫を与えるので、前駆細胞と考え
られ得る。

前駆細胞は、所与のタイプの細胞を脱分化することによ
り得ることができる（例えばＮｅｇｒｅ　ｌらのＭｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０９：
３７７−３８５（＾ｃａｄｅ＋１ｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎ
ｃ、１９８５’）、Ｖａｎ及びＲｏｎｃａｒｉのＣｅ１
ｌ　Ｔｉ５ｓ。

Ｒｅｓ、１９５：３１７−３２９（１９７８）参照）。

今までに報告された前駆細胞を分化させる方法は典型的
には誘導剤の使用を含み、これには、例えば、デキサメ
タシン、メチルイソブチルキサンチン及び５−アザシチ
ジンが使用されている。所定の用途、例えば組織等価物
の製造では、外因的化学誘導を使用するのが望ましくな
いことがある。即ち、かかる薬剤を使用せずに前駆細胞
を分化する方法が望まれる。

九匪五１１ 本発明は、外因的化学誘導なしに前駆［胞を分化させる
ことで得られるタイプの細胞を含む組織等価物を製造す
る方法を提供する。前駆細胞の分化の外因的化学誘導は
所定の用途においては望ましくない。デキサメタシンの
ごとき誘導剤は、例えば形成する組織等価物の収縮能力
に悪影響を及ぼす、更にかかる誘導剤は細胞機能に干渉
し得る。

本発明の組織等価物を製造する方法の１つは、ａ、コラ
ーゲン溶液、少なくとも１種の収縮剤及び少なくとも１
種のタイプの前駆細胞を含む組織前駆体混合物を、前記
収縮剤及び前記前駆細胞を分散して含むゲルを形成する
ための条件下に構成するステップと、次いで、ｂ、ステ
ップ（ａ）で製造したゲルを、（ｉ）組織等価物を形成
するためにゲルが収縮し、且つ（ｉｉ）外因的化学誘導
なしに前記前駆細胞が分化する条件下に維持するステッ
プ とを含むン 本発明に使用する前駆細胞は、脂肪細胞前駆体（ｐｒｅ
ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）、未分化の胚細胞、未分化の胎
児細胞、細胞培養中に脱分化した組織細胞または細胞培
養中に脱分化した器官細胞を含む。

更に本発明は、宿主内で組織を増大、置換及び修復する
組成物及び方法を提供する。幾つかの実施態様において
は、上記のごとく製造した組織等個物を増大されるべき
部位に移植することができる。本発明の更に別の実施態
様においては、組織等個物をその場で形成し得る。本発
明の生体宿主内で組織を増大させる方法の１つは、 ａ、コラーゲン溶液、少なくとも１種の収縮剤及び少な
くとも１種のタイプの前駆細胞を含み、外因的化学誘導
剤を含まない組織前駆体混合物を、増大させるべき部位
に、前記収縮剤及び前記前駆細胞を分散して含むゲルを
形成する条件下に投与する ことを含む。

本発明の好ましい実施態様においては、前駆細胞は脂肪
細胞前駆体である。予測可能な数の脂肪細胞を含む組織
等価物は今までのところ実現するのが困難であった。組
織等個物中の脂肪細胞含有量を調節すると、例えば対応
する天然のものにより類似の組織等価物を提供できる。

更に本発明は、外因的化学誘導なしに前駆細胞を分化さ
せる方法を提供する。かかる方法の１つは、 ａ、コラーゲン溶液、少なくとも１種の収縮剤及び少な
くとも１種の前駆細胞を含む混合物を、前記収縮剤及び
前記前駆細胞を分散して含むゲルを形成するための条件
下に構成するステップと、次いで、 ｂ、ステップ（ａ）で製造したゲル混合物を、（ｉ）ゲ
ル混合物が収縮し、且つ（ｉｉ）外因的化学誘導なしに
前記前駆細胞が分化する条件下に維持するステップ とを含む。

九肌座■」 収縮剤によって収縮された水和コラーゲン格子から製造
される組織等価物が前記参照特許に開示されている。組
織等価物は、かかる分化を外因的化学誘導せずとも組織
等個物格子内で組織前駆細胞を分化させることによって
製造できることが予期せずして見いだされた。即ち、本
発明の組織等価物は、前記参照特許に開示されたものと
製造方法及び用途の両方で類似ではあるが、更に外因的
化学誘導なしに組織等個物内で分化させた細胞を包含し
ている。

本明細書中、（ｉ）「外因的化学誘導」とは、組織等価
物の形成の前、最中または後に、デキサメタシン、メチ
ルイソブチルキサンチン、インドメタシン及び５−アザ
シチジンといった前駆細胞の分化を誘導する薬剤を１種
以上加えることによって前駆細胞を組織等価物中で分化
させることを意味し、（ｉｉ）ｒ前駆細胞」とは、他の
タイプの細胞に分化する能力のある細胞を意味し、且つ
（ｉｉｉ）’脱分化」とは、細胞が成る特徴的な形態及
び／または生化学的特性を失う過程を意味する。

外因的化学誘導は組織等価物中で分化する前駆細胞の割
合を増大させる場合もあり得るが、望ましく、ない副作
用を示すことある。例えば、デキサメタシンは形成組織
等個物が収縮する能力を大いに低下させる（Ｃｏｕｌｏ
ｍｂら、　Ｊ、ＩｎｖｅｓＬ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、８２
：３４１−３４４．１９８４）。外因的化学誘導なくし
て前駆細胞を分化させる長所は、かかる化学誘導剤によ
る干渉なしに組織等価物中又はその上に存在する他のタ
イプの細胞が組織形成、分化及び機能できることである
。

本発明の組織等価物は、本発明の方法においてはかかる
組織等価物の形成に際して１種以上のタイプの前駆細胞
を組織等価物に取り込むまたは加え、次いで、外因的化
学誘導せずに組織等価物内で分化させることを除き、前
記参照特許に記述されたように製造される。

外因的化学誘導の必要がないので多数のタイプの前駆細
胞を組織等価物内で分化させ得ることが期待される。こ
のような前駆細胞には多数のタイプの胎児細胞及び胚細
胞が含まれる。

本発明では、組織等価物格子内で例えば脂肪細胞前駆体
を脂肪細胞に外因的化学誘導なしに分化させることによ
って、組織等価物を形成することができる。この方法に
よって、今までは実現が困難であった予測可能な数の機
能脂肪細胞を含有する組織等価物の製造が可能となる。

予測可能な数の機能脂肪細胞を含む組織等価物は、再構
成組織等価物を製造する上で有効であり、生体宿主内で
一般的な乳房組織、結合組織及び他の組織の増大、置換
及び再構築においては特に有効であり、本明細書中では
以降「充填組織等価物（ｆｉｌｌｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　
ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）」と称することがある。

誘導不可能な腺維芽細胞及び前駆細胞の混合物を使用し
、本発明に従って製造される組織等価物は、脂肪細胞と
腺維芽細胞とを出発時の割合を反映する相対比で含むこ
とが判った。組織等価物中の脂肪細胞含有量を調節する
ことは、対応する天然の物質を模倣する組織等価物の構
築が可能となるので重要である。脂肪細胞は、例えば乳
房組織及びあるタイプの結合組織の組織−貫性及び柔軟
さを決定する上で重要である。

本発明に使用する脂肪細胞前駆体は、黄色脂肪、例えば
副腎上の脂肪から単離される脂肪細胞から得ることがで
きる。脂肪細胞を脂肪から解離、回収、コロニー形成（
ｐｌａｔｉｎｇ）及び継代する。得られた細胞は脱分化
され、即ち全ての脂質小滴を失っており、腺維芽細胞様
となる。これを本明細書では脂肪細胞前駆体と称する。

所望であれば、−貫した表現型を選択するために、脂肪
細胞前駆体をクローン化してもよい。外因的化学誘導に
よって分化するように誘導されたときに脂肪細胞表現型
を発現する脂肪細胞前駆体またはそのクローンが、本発
明の組織等価物の製造用に選択される。

クローン化されていない及びクローン化された、選択さ
れた脂肪細胞前駆体を組織培養（’Ｔｅ１）フラスコ内
で培養するか、または前記参照特許に従って製造した組
織等価物中に収り込んだ。あるものにはデキサメタシン
０．２５．Ｍ及びメチルイソブチルキサンチン０．５ｍ
Ｍを用いて４８時間、外因的化学誘導によって分化を誘
導した。

７日後、化学的に誘導されたプレート上の脂肪細胞前駆
体は可視的屈折性の核周辺小滴を含み、誘導されなかっ
たプレート上の脂肪細胞前駆体は脂肪細胞表現型を発現
しないことが判った。これに反して、組織等価物中に取
り込まれた脂肪細胞前駆体は２週間以内に、化学薬品で
外因的に誘導されてもされなくても、着色可能な脂質を
含む脂肪細胞に分化した。組織等価物中の前駆細胞の分
化の外因的化学誘導は、所定の場合に、脂肪細胞の表現
型を発現する細胞の数を２８パーセント増加させること
が判らた。

プレート上で培養された脂肪細胞前駆体は、分化し拡大
したときに離脱し、一方、組織等価物中で分化した細胞
は固定したままであり、形態は放射状であることが観察
された。細胞がマトリックスに付着したままでいる能力
は、ｆｆｌ織成熟のため及び細胞が脂肪細胞へ分化し続
けるために重要である。

本発明は、以下の実施例より更に理解されるであろう。

実施例は単に説明のためのものであり、本発明の範囲を
制限するのに使用される意図はない。

以下の実施例で使用した材料は、実施例中に示した起源
から入手及び表示した出版物に従って製造した。

Ｋ電■ユニ フロートからの　　細　の　　　び ヒト黄色脂肪を細かく刻み、ＤＭＥＭ中のコラーゲンｌ
　ＩＩＦ／＋１１１’内で消化した。消化は、撹拌台上
で温度３５℃で完全に実施した。消化物（ｄｉｇｅｓｔ
）を５００μポリプロピレンメツシユに通し、大粒子を
除去し、室温で遠心分離した。得られた上澄みを以降「
フロート（ｆｌｏａｔ）Ｊと称する。

（脂肪細胞と脂肪細胞から遊離した油分とで構成される
）フロートを別の容器に移し、ベレットから別々に処理
した。フロートを洗浄し、油分く頂部）を排除した。細
胞（フロート５ｍ１）と媒質ＤＭＥＭ−Ｆ１２４１０％
ＣＳ　５ｍｌと混合し、ＴＣフラスコ内で培養した。数
日後、脂質を含む１１１胞がフラシコ表面に付着してい
るのが観察された。細胞が脱分化して腺維芽細胞の形態
をとるにつれて、含有脂質は失われた。

上記実施例１の遠心分離ステップで得られたベレットを
洗浄し、血液量が多い場合には、Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐ
ａｑｕｅ勾配を用いて遠心分離した。（間質腺維芽細胞
と脂肪細胞前駆体とで構成された）細胞をＤＭＥＭ−Ｆ
１２−１０％Ｃ８が入ったＴＣフラスコ中で培養した。

火ｌ目１足・ におＧる　　細　−の 前記参照特許に従って組織等価物を製造した。

典型的には、酸可溶性のラット尾コラーゲンまたは酸可
溶性のウシ社コラーゲンを使用した。典型的にはＩＯＸ
　ＨＥＭ　Ｅａｒｌｅｓ塩（２，４３ｍ１）、グルタミ
ン２ＱＯｍＭ（０，２４ｍ１）、ゲンタミシンＳ　５０
ｍｇ／ｍｆ（０，０３ｎ＋１）、ウシ血清（２，７ｍｆ
ｆ１）、Ｎａ１ｌＣＯ，３，５６％：Ｎａ０１１５０ｎ
＋Ｍ（１，５饋１）及び、０．０５％酢酸中に溶解した
ウシ社コラーゲン１　ｍｇ／ｓｆ（２０ｍｉ’）を含む
混合物を予め調製し、低温に維持した。腺維芽細胞（包
皮から単術したヒト皮膚腺維芽細胞（ＩＩＤＦ））及び
／または上記実施例２に従って得られた脂肪細胞前駆体
（ＰＡ）の混合物を別々の溶液中で低温に維持した（Ｉ
ＩＤＦ及び／またはＰＡ２５０，０００細胞／ｍ１（３
ｕ＋（））。組織等価物を投与する前に、上記２つの溶
液を計量し混合して組織前駆体混合物を構成し、殺菌ベ
トリ皿に移し、３７℃でゲル化し、組織等価物を形成さ
せた。

２日後、デキサメタシン０．２５１及びインブチルメチ
ルキサンチン０．５＋ａＭの混合物を用いて幾つかの組
織等価物中の脂肪細胞前駆体を分化するように誘導した
。４８時間後、前記混合物を除去し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２
＋１０％Ｃ８中で格子を培養した。１週間以内に、核周
辺に脂質を含む細胞が観察された。翌週にかけて、多数
の脂質を含みより大きな小滴を形成するものが現れ、単
一の大きな小滴を形成するものもあった。他の細胞は変
化がなくより含有物が少ないままであった。これらの小
滴は脂質着色Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏで明らかに着色された
［６０％トリエチルホスフェート水溶液中のＯｉＩ　Ｒ
ｅｄ　Ｏ０，５％］。

フロート及びベレットから誘導された脂肪細胞前駆体は
、異なる頻度で分化することが判った。

ベレットから誘導された脂肪細胞前駆体及び他の結合組
織細胞をクローニングし、応答が極めて高いものを選択
することにより分化を増大することができる。まず９８
ウエルプレート内で細胞をクローン化した場合、デキサ
メタシン及びインブチルメチルキサンチンを用いてクロ
ーンの８．０％を１００％のレベルで脂肪細胞発現に誘
導可能であり、０．６％が誘導されても発現せず、残り
は、デキサメタシン及びイソブチルメチルキサンチンに
よる外因的化学誘導によって１０〜７５％のレベルに誘
導可能であった。

他の実験は、フローＩ・から誘導された脂肪細胞前駆体
がクローニングせずども非常に高い応答を与えることを
示した。以下に示す実施例４のように、フロートから誘
導される脂肪細胞前駆体は、外因的化学誘導があっても
なくても、組織等価物中で９０％以上が誘導可能である
。即ちそれらは、化学誘導があってもなくても、格子中
で実質的に同じ応答を与える。

１北 コラゲナーゼ消化による生検から得られるヒ１〜副腎周
辺脂肪から細胞を単離し、上記実施例１及び２に記述し
たように脂肪細胞前駆体を培養及び継代した。脂肪細胞
前駆体を実施例２に記述したようにＴＣフラスコ内で培
養するかまたは、前記参照特許及び実施例３に記述した
ように、脂肪細胞ペレットから非クローン化脂肪細胞前
駆体を製造し、組織等個物中に含めた。

上記組織等個物を使用し、デキサメタシン及びイソブチ
ルメチルキサンチンを用いた外因的化学誘導をする場合
及びしない場合で、脂肪細胞前駆体を脂肪細胞に分化さ
せた。結果は以下の通りで組織等個物４４４８時間後に
化学誘導 コントロール組織等個物：脂肪細胞への変換率３９％誘
導された組織等価物：格子中で脂肪細胞への変換率５４
％コントロール組織等価物：脂肪細胞への変換率２４％
誘導された組織等価物：格子中で脂肪細胞への変換率４
５％。

異なる生検から製造された脂肪細胞前駆体を使用し、そ
の他は実施例１及び２に従って第２の実験を実施すると
以下の結果となった： いずれも４８時間後に誘導 ベレッ１−からの脂肪細胞前駆体： コントロール３３％　誘導した場合７０％フロートから
の脂肪細胞前駆体： コントロール９０％　誘導した場合９３％皮膚腺維芽細
胞： コントロール１８％　誘導した場合　９％本明細書中の
実施例及び実施態様は単に説明のためのものであって、
当業者には明らかなこれらの種々の変形及び変更が、本
明細書の主旨及び範囲並びに特許請求の範囲に含まれる
。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ、コラーゲン溶液、少なくとも１種の収縮剤及
   び少なくとも１種のタイプの前駆細胞を含む組織前駆体
   混合物を、ゲル内部に前記収縮剤及び前記前駆細胞を分
   散して含む前記ゲルを形成するための条件下に構成する
   ステップと、次いで、ｂ、ステップ（ａ）で製造したゲ
   ルを、（ｉ）組織等価物を形成するためにゲルが収縮し
   、且つ（ｉｉ）外因的化学誘導なしに前記前駆細胞が分
   化する条件下に維持するステップ とを包含する組織等価物を製造する方法。
2. （２）請求項１に記載の方法に従って形成された組織等
   価物。
3. （３）前記前駆細胞が脂肪細胞前駆体、未分化の胚細胞
   、未分化の胎児細胞、細胞培養中に脱分化した組織細胞
   または細胞培養中に脱分化した器官細胞である請求項１
   に記載の方法。
4. （４）前記組織前駆体混合物が更に誘導不可能な腺維芽
   細胞を包含する請求項１に記載の方法。
5. （５）ａ、コラーゲン溶液、少なくとも１種の収縮剤及
   び少なくとも１種のタイプの前駆細胞を含む組織前駆体
   混合物を、それを増大させるべき部位に、ゲル内部に前
   記収縮剤及び前記前駆細胞を分散して含む前記ゲルを形
   成する条件下に投与することを含む生体宿主内で組織を
   増大させる方法。
6. （６）ａ、コラーゲン溶液、少なくとも１種の収縮剤及
   び脂肪細胞前駆体を含む組織前駆体混合物を、前記収縮
   剤及び前記脂肪細胞前駆体を分散して含むゲルを形成す
   るための条件下に構成するステップと、次いで、 ｂ、ステップ（ａ）で製造したゲル混合物を、（ｉ）組
   織等価物を形成するためにゲルが収縮し、且つ（ｉｉ）
   外因的化学誘導なしに前記脂肪細胞前駆体が脂肪細胞に
   分化する条件下に維持するステップとを包含する組織等
   価物を製造する方法。
7. （７）請求項６に記載の方法に従って形成された組織等
   価物。
8. （８）ａ、コラーゲン、少なくとも１種の収縮剤及び脂
   肪細胞前駆体を含む組織前駆体混合物を、それを増大さ
   せるべき部位に、前記収縮剤及び前記脂肪細胞前駆体を
   分散して含むゲルを形成するための条件下に投与する ことを包含する生体宿主内で組織を増大させる方法。
9. （９）ａ、請求項２に記載の方法に従って形成された組
   織等価物を、それを増大させるべき部位に移植する ことを包含する生体宿主内で組織を増大させる方法。
10. （１０）ａ、請求項６に記載の方法に従って形成された
    組織等価物を、それを増大させるべき部位に移植する ことを包含する生体宿主内で組織を増大させる方法。
11. （１１）ａ、コラーゲン溶液、少なくとも１種の収縮剤
    及び少なくとも１種のタイプの前駆細胞を含む混合物を
    、前記収縮剤及び前記前駆細胞を分散して含むゲル混合
    物を形成するための条件下に構成するステップと、次い
    で、 ｂ、ステップ（ａ）で製造されたゲル混合物を、（ｉ）
    ゲル混合物が収縮し、且つ（ｉｉ）外因的化学誘導なし
    に前記前駆細胞が分化する条件下に維持するステップ とを包含する前駆細胞を分化させる方法。
12. （１２）前記前駆細胞が脂肪細胞前駆体、未分化の胚細
    胞、未分化の胎児細胞、細胞培養中に脱分化した組織細
    胞または細胞培養中に脱分化した器官細胞である請求項
    １１に記載の方法。