JPH0227980A - 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製
法に関する。

（従来技術） ｄ−ビオチンはヒトや動物にとって不可欠なビタミンで
あり、医薬品原料或いは飼料添加物として重要なもので
ある。

従来、炭素源や窒素源を含む通常の発酵培地を用いて、
発酵法によりｄ−ビオチンを生産する方法としては、ス
トレプトマイセス属、ミクロモノスポラ属の微生物を用
いる方法（特公昭４１−２１７５６）が知られており、
また遺伝子組み換え技術を利用した方法としてはニジエ
リシア属の微生物を用いる方法（特開昭６１−２０２６
８６、同６２−１５５０８１）が知られている。

（発明の構成及び効果） 本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、全く意外にも、セ
ラチア属の微生物を変異誘導してアクチチアジン酸や５
−（２−チエニル）−ｎ−吉草酸等のビオチン構造類似
物質に対する耐性を付与する、二とによりｄ−ビオチン
の生産能が顕著に増強されること、及びこの変異株から
ｄ−ビオチン生成蓄積を司る染色体デオキシリボ核酸（
以下、ＤＮＡと略称する）断片を切り出し、これをベク
ター・プラスミドに組、み込んだ後、得られる組換えプ
ラスミドをｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属
微生物に移入することにより、ｄ−ビオチン生産能を極
めて顕著に増大させうること、並びに該微生物を用いる
ことによりｄ−ビオチンを工業的に有利に製造し得るこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、かかる知見に基づく本発明は、 （ｉ）セラチア属に属し、ビオチン構造類似物質に対す
る耐性を有し、ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する微生物
、 （ｉｉ）ｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属に
属する微生物から採取したｄ−ビオチン生成蓄積を司る
デオキシリポ核酸をベクター・プラスミドに組み込んだ
組換えプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有せ
しめた微生物、 （ｉｉｉ）ｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属
に属する微生物を培地で培養することにより、培地中に
ｄ−ビオチンを生成蓄積せしめ、。

これを採取することを特徴とするｄ−ビオチンの製法、 である。

本発明の変異株を調製するための親株としてはセラチア
属（バーシーズ・マニュアル・オプ・システマテインク
・バクテリオロジー、第１巻４７７頁１９８４年）の微
生物、特にセラチア・マルセッセンスに属する微生物が
使用される。その菌株は、微生物菌株保存機関から分譲
される既知の菌株であっても自然界から新たに分離され
る菌株であってもよく、例えばセラチア・マルセッセン
ス５ｒ４１　（微工研条寄第４８７号）等があげられる
。更に、野生株から突然変異によって誘導される各種ア
ミノ酸要求株、各種核酸要求株或いはビオチン要求株を
除く各種ビタミン要求株などの変異株であってもよい、
このような菌株の具体例としては、セラチア・マルセッ
センス５ｒ４１のイソロイシン要求株Ｄ−６０（ジャー
ナル・オブ・ジネラル・マイクロバイオロジー、」■、
５１（１９８０）　）等が挙げられる。

かかる親株にビオチン構造類似化合物に対する耐性を付
与することによってｄ−ビオチン生成蓄積能の高い変異
株を取得することができる０例えば野生株であるセラチ
ア・マルセッセンス５ｒ４１を用いる場合、該菌株の細
胞を通常の突然変異誘起操作で処理した後、アクチチア
ジン酸（以下、ＡＣＭと略称する）　、５−　（２−チ
エニル）−ｎ−吉草酸、α−デヒドロビオチンなどのビ
オチン構造類似物質０．１〜ｌＯ■／−含有の最少寒天
平板培地、例えば、デービスとミンジオリの最少培地〔
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、６０．１’７　
（１９５０）〕或いはその炭素源を各種のＩ類、有機酸
類、又はアミノ酸類に変えた培地に２７〜３７℃で２〜
７日間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離するこ
とによってビオチン構造類似物質耐性株を取得する。次
に、ｄ−ビオチン要求性のセラチア属或いはニジエリシ
ア属の変異株を指示菌とするハロー法〔ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー７９、７５４　（１９６０））に
従ってこれらの耐性株のｄ−ビオチン分泌性を調べ、ハ
ローを形成する菌株、即ちｄ−ビオチン生成蓄積能の増
大した菌株を選択する。より具体的に説明すれば、セラ
チア・マルセッセンス５ｒ４１の細胞をエーブルバーブ
らの方法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケーションズ、１８．７８８（１
９６５）　）によってＮ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン１００μｇ／−で３０分間処理した
のち、ａ−ＡＣＭｏ、５■／ｌｌｉ含有の最少寒天平板
培地くフマル酸アンモニウム０．５％、硫酸アンモニウ
ム０．１％、リン酸二カリウム０．７％、リン酸−カリ
ウム０．３％、硫酸マグネシウム７水和物０，０１％、
寒天１．５％）に塗布する。次に３０℃で４日間培養し
、生じた大きなコロニーを釣菌分離すればＡＣＭ耐性株
を取得できる。このような耐性株の中から、ｄ−ビオチ
ン要求株を指示歯とするハロー法によりｄ−ビオチン分
泌能を有する菌株を選択することによって、セラチア・
マルセッセンスのｄ−ビオチン生成蓄積能を有する変異
株を取得できる。また、上記のようなＡＣＭｏ、５■／
Ｍｌ耐性でｄ−ビオチン生成蓄積能を有する変異株の細
胞を上記と同様に変異誘起処理し、例えば２■／ＩＲＩ
ＡＣＭ含有の最少寒天平板培地に塗布、同様の操作を行
った後、得られるＡＣＭ耐性株についてハロー法を行い
、親株よりも顕著に大きいハローを形成する菌株を選択
することにより、ｄ−ビオチン生成蓄積能が増大したＡ
ＣＭ耐性株を取得することができる。なお、このような
ビオチン構造類似物質耐性株の分離に際して複数の構造
類似物質、例えばＡＣＭと５−（２−チエニル）−〇−
吉草酸の両方を添加した最少寒天平板培地を用いること
もできる。

上記の如（して得られる変異株としては、例えば本発明
の実施例１で調製されるセラチア・マルセッセンス５Ｂ
３０３　（ｍ工研菌寄第１０１１９号）又はセラチア・
マルセソセンス５Ｂ４１１が挙げられる。

（２）ｄ−ビオチン化　蓄　　を　する組　えプラスミ
ドの作製 ■染色体ＤＮＡの調製 本発明においてｄ−ビオチン生合成を司る染色体ＤＮＡ
とは、微生物においてビオチン合成に係わる酵素のうち
、ビメロイルー補酵素Ａの合成を触媒する酵素、７−ケ
ドー８−アミノペラルゴン酸・シンターゼ、７．８−ジ
アミノペラルゴン酸・アミノトランスフェラーゼ、デチ
オビオチン・シンテターゼ及びビオチン・シンテターゼ
の遺伝情報を担うＤＮＡの全部もしくは一部を含有する
ものを云う。上記の酵素は、ニジエリシア・コリに−１
２においては、ｂｉｏ　Ｃｓ　ｂｉｏ　Ｆ％　ｂｉｏ　
Ａ％　ｂｉ。

Ｄ及びｂｉｏ　Ｂと名づけられた５つの遺伝子によって
規定される酵素に相当する０通常、これらの酵素はｄ−
ビオチンによる強いフィードバック抑制を受けているが
、本発明に用いるｄ−ビオチン合成を司る染色体ＤＮＡ
はフィードバック抑制から解除された変異型であること
が望ましい、かかる染色体ＤＮＡの供与微生物としては
、セラチア属に属し、ｄ−ビオチン生成能を有する微生
物であれば、いかなる菌株でも良く、例えば前記のセラ
チア・マルセッセンス５ｒ４１やフィードバック抑制の
解除された変異株であるセラチア・マルセ、フセンス５
Ｂ３０３及びセラチア・マルセッセンス５Ｒ４１１等が
あげられる。これらの微生物から染色体ＤＮＡを採取す
るには、例えば微生物菌体をリゾチーム処理、界面活性
剤（ラウリル硫酸ナトリウム、ザルコシル（Ｎ−ラウロ
イルサルコシン酸ナトリウム）等）で処理した後、除蛋
白し、エタノールで沈澱せしめる常法〔ジャーナル・オ
プ・モレキュラー・バイオロジー、３．２０Ｂ　（１９
６１）　；　ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ
、７２．６１９　（１９６３）　）により容易に実施す
ることができる。

上記の如くして得られる染色体ＤＮＡはそのまま、或い
はビオチン合成に不要な部分を削除した後、組換えＤＮ
Ａの調製に用いることができる。

■ベクター・プラスミドＤＮＡの調製 上記の如き染色体ＤＮＡを組み込むベクター・プラスミ
ドとしてはセラチア属に属する微生物の細胞に移入でき
、かつ移入細胞中で複製可能なプラスミドであれば特に
限定されないが、例えばｐＳＣＩＯＩ　（プロシーデイ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエ
ンス　Ｕ　Ｓ　Ａ、　７０．３２４０　（１９７３）　
）　、ｐＬＧ３３９　（ジーン、■、　３３２　（１９
８２））　、ｐＢＲ３２２（ジーン、１、９５　（１９
７７）　）　、ｐＢＲ３２５〔ジーン、４．１２１　　
（１９７Ｂ））　、　ｐＡｃＹｃ１？７　（ジャーナル
・オブ・バタテリオロジー、Ｕ（，１１４１（１９７８
））及びｐＫＰＴ１１２４　（ジャーナル・オブ・バイ
オテクノロジー、３．４７（１９８５））等、コピー数
、プロモータ及び／又は薬剤耐性マーカーの異なる種々
のベクター・プラスミドを用いることができる。上記の
プラスミドはこれらを保持するニジエリシア・コリの菌
体からクリヤード・ライセイト法〔遺伝子操作実験法１
２５頁（高木康敬著、講談社、１９８０年）　；　モレ
キュラー・クローニング、８６頁（マニアナイスら編、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９
８２年）〕などの常法によって調製することができる。

■　組換えプラスミドＤＮＡの調製 上記で得られる染色体ＤＮＡとベクター・プラスミドＤ
ＮＡとからの組換えプラスミドの調製は、制限エンドヌ
クレアーゼ（例えばＩＩ！ｃｏＲＩ　％旧ｎｄＤＩ、Ｂ
ａｍＨＩ　、Ｓａｌ　ｒ等）を用いて染色体Ｄ　Ｎ　Ａ
　ｔｉとプラスミドＤＮＡ鎖を切断した後、ＤＮＡリガ
ーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼや大腸菌ＤＮＡリガー
ゼ等）で処理するか、或いはその切断末端によってはタ
ーミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼ等で
処理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結
合する等の常法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー、
餞、４１　（１９７９）：遺伝子操作実験法、１３５頁
（高木康敬著、講談社、１９８０年）〕により実施する
ことができる。

■ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミドの
選択とそのＤＮＡの調製 ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミドの選
択は、上記■で得られる組換えプラスミドＤＮＡを用い
て、制限エンドヌクレアーゼ欠損性でかつｄ−ビオチン
要求性のニジエリシア・コリの変異株〔例えば、ニジエ
リシア・３９１１７７６株（ＡＴＣＣ３１２４４、モレ
キュラー・クローニング・オプ・リコンビナントＤＮＡ
、２４８頁、スコツトとウェーナー編、アカデミツク・
プレス、１９７７年）等〕の細胞を形質転換し、次いで
、得られる形質転換処理細胞を、上記ニジエリシア・コ
リの変異株が生育可能な培地からｄ−ビオチンを除去し
た寒天平板培地に塗布した後、２７〜３７℃で２〜４日
間培養し、得られるコロニーを釣菌分離することにより
実施することができる。この際、形質転換は、例えば低
温下で細胞を塩化カルシウム溶液で処理して宿主細胞の
膜透過性を増大させ、組換えプラスミドＤＮＡを宿主細
胞中に取り込ませる方法〔ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー、競、１５９　（１９７０）　）に
より行うことができる。

上記の如くして得られる形質転換株の細胞からの組換え
プラスミドＤＮＡの調製は、例えば該形質転換株から迅
速法〔モレキュラー・クローニング、３６５１　（マニ
アテイスら編、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−１１９８２年）〕で抽出したプラスミドＤＮＡ
により、ｄ−ビオチン要求性のニジエリシア・コリの変
異株の細胞を形質転換して得られる菌株がｄ−ビオチン
非要求性であることを確認した後、上記形質転換株から
クリヤード・ライセイト法によりプラスミドＤＮＡを抽
出することにより実施することができる。かくして、セ
ラチア・マルセソセンスのｄ−ビオチン生成蓄積能を有
する染色体ＤＮＡ断片がベクター・プラスミドＤＮＡに
挿入されてなる組換えプラスミドＤＮＡが得られる。

本発明の微生物、即ちｄ−ビオチン生成蓄積能を有する
セラチア属微生物から採取したｄ−ビオチン生成蓄積能
を司る染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラスミド
をセラチア属に属する微生物に含有せしめた微生物は、
例えば次の如くして調製することができる。

まず、前記（２）で得られるｄ−ビオチン生成蓄積能を
有する組換えプラスミドＤＮＡを、例えばセラチア・マ
ルセフセンスの制限エンドヌクレアーゼ欠損株（例えば
セラチア・マルセッセンス５ｒ４１の７７３９２株〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６１．１　　（
１９８５）　）等）の細胞にタカギとキスミの方法〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー、旦１　、　ｌ　　
（１９８５）　）により取り込ませ、形質転換株を得る
。この形質転換株を焙養した後、得られる細胞からクリ
ヤード・ライセイト法によりプラスミドＤＮＡを単離精
製する。かくして得られるｄ−ビオチン生成蓄積能を有
する組換えプラスミドＤＮＡはセラチア・マルセッセン
スの修飾系によって修飾されたものである。次いで、上
記組換えプラスミドＤＮＡを宿主菌株の細胞にタカギと
キスミの方法により導入し、薬剤耐性のコロニーを釣菌
分離することにより形質転換株を得る。この宿主菌株と
しては、セラチア属に属する微生物であれば、野生株又
は変異株のいずれでもよいが、特にｄ−ビオチン生成蓄
積能のより高い菌株が好適に用いられる。

かくすることにより本発明の微生物、即ちｄ−ビオチン
生成蓄積能を有するセラチア属微生物から採取したｄ−
ビオチン生成蓄積能を司る染色体ＤＮＡ断片を組み込ん
だ組換えプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有
せしめた微生物を得ることができる。かかる微生物とし
ては、例えばセラチア・マルセッセンスＴＡ５０２１　
、ＴＡ５０２２、ＴＡ５０２３　（微工研菌寄第１０１
１８号）及びＴＡ５０２４等があげられる。

上記組換え菌株のうち、ＴＡ５０２１とＴＡ５０２２は
セラチア・マルセッセンス５ｒ４１にｐＢＲ３２２又は
ｐＬＧ３３９をベクターとするｄ−ビオチン生成蓄積能
を有する組換えプラスミドを含有せしめた微生物であり
、ＴＡ５０２３とＴＡ５０２４はセラチア・マルセッセ
ンスの５Ｂ２Ｏ３株と５Ｂ４１１株のそれぞれにｐＬＧ
３３９をベクターとするｄ−ビオチン生成蓄積能を有す
る組換えプラスミドを含有させた微生物であり、いずれ
の菌株もセラチア・マルセッセンス５ｒ４１の形態的特
徴を有するものである。

（４）ｄ−ビオチンの製造 かくして得られた微生物を培地で培養し、培地中に生成
蓄積せしめたｄ−ビオチンを採取することによりｄ−ビ
オチンを製造することができる。

本発明において使用されるｄ−ビオチン生産用培地とし
ては、炭素源としてブドウ糖、蔗糖、糖蜜の如きＩｉ類
、フマル酸やクエン酸の如き有機酸またはグリセロール
の如きアルコール類等を１０〜２０％、窒素源として酢
酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモ
ニウムや塩化アンモニウムの如き無機アンモニウム塩又
は尿素を１〜２％さらに有機栄養物としてコーン・ステ
イープ・リカー、ペプトン、酵母エキス、カゼイン加水
分解物質等を０〜１％の範囲でそれぞれ適当量含有する
培地を好適に用いることができる。これらの他にリン酸
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、モリブデン
酸ナトリウム等を少量加え１、更に培地のｐＨを６〜８
に保つため炭酸カルシウムを、或いは必要に応じアンモ
ニア等を添加してもよい。

本発明によれば、上記培地に本発明の微生物を接種し、
２５℃〜３７℃にて振盪培養あるいは通気攪拌の如き好
気的条件下で２〜７日間培養することによって培地中に
ｄ−ビオチンを著量蓄積せしめることができる。

生成したｄ−ビオチンの精製は、培養終了後、菌体その
他の不溶物を除去し、次いで、公知の方法、例えば特公
昭４２−８９１８に記載の方法に従って実施することが
できる。即ち、菌体を除去した溶液中のｄ−ビオチンを
活性炭に吸着し、アンモニア含有エタノールの如き溶媒
で溶出した後、濃縮し、次いで陰イオン交換樹脂に供す
ることにより実施することができる。

以下、実施例をあげて本発明を説明するが、実施例中ｄ
−ビオチンの定量はラクトバチラス・プランタラムによ
る微生物定量法〔生化学実験講座、第１３巻３５５頁（
能勢善嗣ら編、東京化学同人（１９７５年））〕により
行った。また、デチオビオチン・シンテターゼ活性はク
レルとエイセンバーブの方法（ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、」的、６５５８　（１
９７０）　）に記載の方法により測定した。

実施例　１ （ＡＣＭ耐性株の取得） （１）ＡＣＭ低−ｒ＃百　株の取′尋 セラチア・マルセッセンス５ｒ４１　　（Ｉｔ工研条寄
第４８７号）の細胞をエーブルバーブらの方法により変
異誘起処理し、栄養培地（グルコース０．５％、ペプト
ン１．０％、肉エキス０．３％、酵母エキス１．０％、
塩化ナトリウム０．５％）で１時間培養する。この培養
液を遠心分離し、得られる細胞を生理食塩水で遠心分離
法によって３回洗浄する。

この細胞を生理食塩水に懸濁し、ａ−ＡＣＭＯ，５曙／
−を含む最少寒天培地（フマル酸アンモニウム０．５％
、リン酸−カリウム０．３％、リン酸二カリウム０．７
％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１％、寒天１．５
％）に１平板当り１〜１０　Ｘ　１０’個の細胞を塗布
する。３０℃で３〜５日間培養した後、生じた大きなコ
ロニーを釣菌分離することによりＡＣＭ耐性株を得る。

次いで、セラチア・マルセッセンス５ｒ４１のｄ−ビオ
チン要求株を指示菌とするハロー法により、該ＡＣＭ耐
性株のｄ−ビオチン分泌性を調べ、大きなハローを形成
する菌株の一株としてセラチア・マルセッセンス５Ｂ３
０３（微工研菌寄第１０１１９号）を得る。

なお、本菌株のデチオビオチン・シンテターゼ活性を調
べたところ、親株であるセラチア・マルセッセンス５ｒ
４１の１０倍高い活性を示したことから、本菌株のｄ−
ビオチンによるフィードバック抑制は解除されているこ
とがわかった。

（２）ＡＣＭｔ？声　〇′ 、ｆｆ−ＡＣＭ２．０■／−を含む最少寒天培地にセラ
チア・マルセフセンス５Ｂ３０３の細胞を１平板当たり
１〜ｉｏ　ｘ　ｔｏ’個塗布し、３０℃で５〜７日間培
養する。生じた大きなコロニーを釣菌分離することによ
り、ＡＣＭ高濃度耐性株を得る。この高濃度耐性株につ
いて上記（１）に記載と同様のハロー法により、ｄ−ビ
オチン分泌性を調べ、親株に比べ顕著に大きなハローを
形成するＡＣＭ耐性株の一株としてセラチア・マルセッ
センス５Ｂ４１１を得る。

なお、本菌株は５Ｂ３０３の約２倍のデチオビオチン・
シンテターゼ活性を示した。

実施例　２ （ｐＢＲ３２２をベクターとしｄ−ビオチン生成蓄積能
を有する組換えプラスミドの作製） （１）仇色　ＤＮＡ０量− 実施例１−（１）で得たセラチア・マルセッセンス５Ｂ
３０３をＬ−ブロス（ペプトン１％、酵母エキス０．５
％、塩化ナトリウム０．５％、ｐｎ　７．０）　１．Ｏ
ｌに接種し、３０℃で４時間振とう培養し、対数増殖期
の菌体を遠心分離により集める。この菌体をリゾチーム
処理後、ラウリル硫酸ナトリウムで処理することにより
溶菌し、フェノール処理により除蛋白する。次いでエタ
ノール処理して染色体ＤＮＡを沈澱させ、この沈澱にリ
ボ核酸分解酵素（ＲＮａｓｅ、最終濃度１０μｇ／ｄ）
を加え、３７℃で１時間処理することにより精製染色体
ＤＮＡ７゜０■を得る。

（２）ベクター・プラスミドＤＮＡの ベクター・プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１
７）を保持するニジエリシア・コリに−１２のＣ６００
ｒｆ株（ＡＴＣＣ３３５２５）を０．２％グルコースを
含有するＬ−プロス８００１＃！ｌに接種し、３７℃で
１６６時間振う培養した後、菌体を遠心分離により集め
る。得られる菌体をリゾチーム処理及びラウリル硫酸ナ
トリウムで処理して溶菌した後、最終濃度がＩＭとなる
ように塩化ナトリウムを加えて遠心分離（１００，００
０ｘ　ｇ　、　３０分間）する。上清を採取しフェノー
ル処理した後、エタノールを加え、遠心分離する。沈澱
を１０ｓＭ）リス塩酸−１＋＋＋Ｍエチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム（ｐＨ７，５）水溶液に溶解し、塩化
セシウム−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法（
２００，０００ｘ　ｇ、　１６時間）によりプラスミド
ＤＮＡを分離精製する。かくしてベクター・プラスミド
ｐＢＲ３２２のＤＮＡ０．５■を得る。

（３）　　　えプラスミドＤＮＡの 前記（１）で得た染色体ＤＮＡ２０μｇに制限エンドヌ
クレアーゼＨｉｎｄｕとＥｃｏＲＩを同時に通常の条件
で作用させＤＮＡ鎖を部分的に切断する。また、上記（
１）で得たベクター・プラスミドＤＮＡ７μｇにＨｉ　
ｎｄ［ｌとＥｃ　ｏＲＩを同時に通常の条件で作用させ
ＤＮＡ１３ｍを完全に切断する。両者を６５℃、１０分
間の熱処理後、混合しＴ４ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼ通常の条件で作用させＤＮＡ鎖を連結することにより
組換えプラスミドＤＮＡを得る。

制限エンドヌクレアーゼ欠損性でかつビオチン・オペロ
ン（ｂｉｏＡＢＰｃＤ）を欠失しているニジエリシア・
３９１１７７６株（＾ＴＣＣ３１２４４）をχ１７７６
株用栄養培地〔バタトトリブトン２．５％、酵母エキス
０．７５％、トリス−塩酸（ｐＨ７，５）　２　ｄ、塩
化マグネシウム０．５ｓＭ、ジアミノピメリンＭＯ１Ｏ
１％、チミジン０．００４％、グルコース０．５％〕１
５−に接種、３７℃で振とう培養する。対数増殖期の中
間まで増殖せしめた菌体を遠心分離により集菌する。

該菌体を氷冷した０、　１？ｌ塩化マグネシウム溶液１
５−に懸濁した後、集菌し、氷冷した０、　１Ｍ塩化カ
ルシウム溶液３−に懸濁する。この細胞懸濁液に上記（
３）で得られる組換えプラスミドＤＮＡを加えて３０分
間水冷した後、４２℃で２分間熱処理することにより該
ＤＮＡを細胞内に取り込ませる。次いで、この懸濁液に
χ１７７６株用栄養培地１５ｗ１１を加え、３７℃で１
時間振とう培養した後、集菌し、生理食塩水１５−で３
回洗浄する。該菌体を生理食塩水１５−に懸濁し、この
懸濁液０．１〜０．５−をアンピシリン５０μｇ／−と
〃−デチオビオチン０．１μｇ／−とを含有するχ１７
７６株用最少寒天培地（グルコース０．５％、硫酸アン
モニウム０．１％、リン酸二カリウム０．７％、リン酸
−カリウム０．３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０
１％、ジアミノピメリン酸０．０１％、チミジン０．０
０４％、カゼイン加水分解物０．２％、寒天１．５％）
に塗布し、３７℃で２日間培養する。生じたコロニーを
釣菌分離し、ハロー法によりｄ−ビオチン分泌能を有す
る形質転換株を選択した。かくして得られる菌株をχ１
７７６株用栄養培地１１に接種し、前記（２）と同様に
してプラスミドＤＮＡを抽出精製し、３６０μｇの組換
えプラスミドｐＢＭ２０１のＤＮＡを得る。この組換え
プラスミドＤＮＡは全鎖長約１１．３ｋｂであり、約７
ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されていた。

なお、該プラスミドＤＮＡを用いてニジエリシア・３９
１１７７６株の細胞を形質転換してχ１７７６株用栄養
寒天培地でアンピシリン耐性の再形質転換株ｌＯ株を選
択し、これら菌株について、χ１７７６株用最少寒天培
地での生育を調べたところ、すべての菌株は、７−ケド
ー８−アミノペラルゴン酸、７，８−ジアミノペラルゴ
ン酸或いはデチオビオチンを添加した場合には生育を示
し、それらを添加しない場合には生育を示さなかった。

また、これら１０株はすべてｄ−ビオチン分泌能を示し
た。従って、本プラスミドはｄ−ビオチン生成蓄積能を
有する組換えプラスミドであり、かつその挿入ＤＮＡに
は、ニジエリシア・コリに−１２のビオチン・オペロン
に相当する遺伝子群がコードされているものと考えられ
る。

実施例　３ （ｐＬＧ３３９をベクターとしｄ−ビオチン生成蓄積能
を有する組換えプラスミドの作製） （１）ベタ　−・ブースミドＤＮＡの ニジエリシア・コリに−１２の０６００ｒ−ｍ−株にベ
クター・プラスミドｐＬＧ３３９　（ＡＴＣＣ３７１３
１）　　を含有させた菌株〔ジーン、■、３３５　（１
９８２）　）を用いて、実施例２−（２）に記載した方
法と同様の方法によってベクター・プラスミドｐＬＧ３
３９のＤＮＡ０゜３■を得る。

（２）　　　えプラスミドＤ　Ｎ　Ａの実施例２−（４
）で得られるｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプ
ラスミドｐＢＭ２０１のＤＮＡ２μｇに制［エンドヌク
レアーゼＥｃ　ｏＲＩとＨｉ　ｎｄｕＩを同時に通常の
条件で作用させ、ＤＮＡ鎖を完全分解する。また上記（
１）で得たベクター・プラスミドｐＬＧ３３９のＤＮＡ
１μｇを通常の条件で、まずＥｃｏＲＩを用いて完全分
解し、次に）（ｉｎｄｌ［ｒを用いて部分分解する０再
反応液を６５℃、１０分間の熱処理後、混合し、該混合
物にＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを通常の条件で
作用させ、ＤＮＡ鎖を連結することにより組換えプラス
ミドを得る。

（３）　　ＬＧ３３９をベクターとしｄ−ビオチン化　
蓄積ビオチン生産菌株の取得） ニジエリシア・コリχ１７７６株を、実施例２−（４）
に記載した方法により培養し、菌体を得た後、実施例２
−（４）記載と同様の方法により前記（２）で得た組換
えプラスミドＤＮＡを細胞内に取り込ませる０次いで、
実施例２−　（４）と同様の方法で調製した細胞懸濁液
０．１〜０．５−を硫酸カナマイシン１００μｇ／−と
ｄ−デチオビオチン０．２μｇｏｄ含有のχ１７７６株
用最少寒天培地に塗布し、３７℃で２日間培養する。生
じたコロニーを釣菌分離し、ハロー法によりｄ−ビオチ
ン分泌能を有する形質転換法を得る。該形質転換株から
、実施例２−（２）記載の方法に従って、プラスミドＤ
ＮＡを抽出精製し、組換えプラスミドｐＬＧＭ２０１の
ＤＮＡ　１７５μｇを得る。

実施例　４ （ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミドを
保持するセラチア・マルセッセンスのｄ−細胞外ヌクレ
アーゼ欠損性でかつ制限エンドヌクレアーゼ欠損性のセ
ラチア・マルセッセンス５ｒ４１の７７３９２株を宿主
に用い、実施例２−（４）で得られる組換えプラスミド
ｐＢＭ２０１のＤＮＡと実施例３−　（３）で得られる
組換えプラスミドｐＬＧＭ２０１のＤＮＡをタカギとキ
スミの方法により７７３９２株の細胞に取り込ませ、そ
れぞれの形質転換株を得る。次に、各々の形質転換株を
グルコース０．２％含有のＬ−プロス１ｊ！に接種し、
３０℃、１６時間振盪培養した後集菌し、実施例２−　
（２）と同様に処理することによってセラチア・マルセ
ッセンス５ｒ４１によって修飾された９８Ｍ２０１とｐ
ＬＧＭ２０１のＤＮＡを各々２５０μｇと１５０μｇを
得る。

前記（１）で得られる９８Ｍ２０１のＤＮＡとセラチア
・マルセフセンス５ｒ４１とを用い、タカギとキスミの
方法によりアンピシリン耐性で形質転換株セラチア・マ
ルセンセンスＴＡ５０２１を得る。この形質転換株の含
有するプラスミドＤＮＡが実施例２−（４）で得られる
９８Ｍ２０１　Ｄ　Ｎ　Ａと同一であることを制限エン
ドヌクレアーゼの切断部位を利用する方法で確認した。

また、前記（１）で得たρＬＧＭ２０１のＤＮＡとセラ
チア・マルセッセンス５ｒ４１とを用い、上記と同様の
方法により、カナマイシン耐性でセラチア・マルセッセ
ンスＴＡ５０２２を得る。

なお、この形質転換株ＴＡ５０２２の含有するプラスミ
ドＤＮＡはｐＬＧＭ２０１　Ｄ　Ｎ　Ａと同一であるこ
とを制限エンドヌクレアーゼの切断部位を利用する方法
で確認した。

上記（１）で得られるｐＬＧＭ２０１のＤＮＡと実施例
１の（１）で得られるセラチア・マルセッセンス５Ｂ３
０３とを用い、前記（２）と同様にカナマイシン耐性で
形質転換株セラチア・マルセソセンスＴＡ５０２３　（
微工研菌寄第１０１１８号）を得る。

なお、この形質転換株ＴＡ５０２３の含有するプラスミ
ドＤＮＡはｐＬＧＮ２０１　ＤＮＡと同一であることを
制限エンドヌクレアーゼの切断部位を利用する方法で確
認した。

上記（１）で得られるｐＬＧＭ２０１のＤＮＡと実施例
１の（２）で得られるセラチア・マルセッセンス５Ｂ４
１１株とを用い、上記（２）と同様にカナマイシン耐性
で形質転換株セラチア・マルセソセンスＴＡ５０２４を
得る。

なお、この形質転換株ＴＡ５０２４の含有するプラスミ
ドＤＮＡはｐＬＧＭ２０１　ＤＮＡと同一であることを
制限エンドヌクレアーゼの切断部位を利用する方法で確
認した。

実施例　５ （セラチア・マルセッセンスのＡＣＭ耐性株及び組換え
プラスミド保持菌株によるｄ−ビオチンの製造） 実施例１で得られるセラチア・マルセッセンスの５Ｂ３
０３と５Ｂ４１１及び実施例４で得られるセラチア・マ
ルセノセンスのＴＡ５０２１、ＴＡ５０２２、ＴＡ５０
２３とＴＡ５０２４並びに対照株としてセラチア・マル
セッセンス５Ｒ４１をそれぞれアンピシリン５００μｇ
もしくは硫酸カナマイシン１００μｇ／ＩＲ１含有のＬ
〜ブロス、或いはそれらを含有しないしブロス斜面培地
で一夜培養した後、発酵培地〔シ＝ｙｔ１１０％、尿素
１．０％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム７水和物０．１％、硫酸第一鉄７水和物ｏ、ｏ　ｉ％
及び炭酸カルシウム１％を含む溶液１５ｍを５０〇−容
振盪フラスコに注入し、滅菌したもの（ただし、シーｌ
糖は別途加熱滅菌後添加した。ｐＨ７，０）〕にそれぞ
れ−白金耳植菌する。ついで３０℃で往復振盪培養（振
幅？ａｍ、１２０回転／分）する。

９６時間後の培地中のｄ−ビオチンの生成蓄積量は下記
第１表の通りである。

第１表 実施例　６ （ジャーファーメンタ−におけるｄ−ビオチンの製造） 実施例４で得たセラチア・マルセソセンスＴＡ５０２４
を硫酸カナマイシン１００μｇ／ｙｄ含有のＬブロス寒
天斜面培地で一夜培養した後、硫酸カナマイシン１００
μｇ／−含有の前培養培地〔ショ糖１０％、尿素１．０
％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水
和物０．１％、硫酸第一鉄７水和物０．００１％、コー
ン・ステイープ・リカー０．６％及び炭酸カルシウム１
％を含む溶液１５ｄを５００−容振盪フラスコに注入し
、滅菌したもの（ｐＨ７，０）　Ｅに一白金耳植菌する
。３０℃で２４時間振盪培養し、かくして得られる前培
養液４０−を発酵培地〔ショ糖１５％、尿素１．５％、
リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物
０．１％、硫酸第一鉄７水和物０６０１％、コーン・ス
テイープ・リカー〇、６％、酵母エキス０．１％及び炭
酸カルシウム１％（ｐＨ７，０））　１．２１に接種し
、２．４１容ジャーファーメンタ−で３０℃、通気量０
．６１７分、攪拌（７５０回転／分）下で培養し、２０
時間後にＬ−アラニン、Ｌ−システィン塩酸塩、Ｌ−メ
チオニンを各々最終濃度０．０６％となるように添加す
る。培養開始７２時間後にｄ−ビオチン１９０ｔｒｔ／
１１を含む培養液を得る。該培養液１０１を集めて加熱
滅菌処理した後、濾過して不溶物を除去する。次に、活
性炭に吸着、洗浄した後、吸着物をアンモニア含有の５
０％エタノール（ｐＨ９，０）で溶出し、減圧濃縮する
。残査を水に溶解した後、アンモニア水でｐＨ８に調整
し、この水溶液をダウエックスｌＸ２（ギ酸型）を充填
したカラムに通液する。該カラムを水洗後、０．０１Ｍ
ギ酸で溶出する。ｄ−ビオチン含有画分を集めて濃縮し
た後、ｐＨ３，５に調整し、−夜冷却放置する。生じた
結晶をろ取し、乾燥後、水から再結晶することによりｄ
−ビオチン０．９５ｇを得る。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ９８Ｍ２０１プラスミドＤ
ＮＡ及びｐＬＧＭ２０１プラスミドＤＮＡの制限エンド
ヌクレアーゼ切断地図を示し、第３図は９８Ｍ２０１プ
ラスミドＤＮＡ及びｐＬＧＭ２０１プラスミドＤＮＡの
構築を示す。 嬉 図 第

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、セラチア属に属し、ビオチン構造類似物質に耐性を
   有し、ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する微生物。 ２、アクチチアジン酸又は５−（２−チエニル）−ｎ−
   吉草酸のいずれか或いは双方に耐性を有する請求項１記
   載の微生物。 ３、ｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属に属す
   る微生物から採取したｄ−ビオチン生成蓄積を司るデオ
   キシリボ核酸をベクター・プラスミドに組み込んだ組換
   えプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有せしめ
   た微生物。 ４、ｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属に属す
   る微生物を培地で培養することにより、培地中にｄ−ビ
   オチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
   するｄ−ビオチンの製法。