JPH0228099B2 - Ootorajiogurafuiiniokerushingoshorihoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、オートラジオグラフイーにおける信
号処理方法に関するものである。

〔発明の背景〕

支持媒体上において少なくとも一次元的方向に
分布して分布列を形成している放射性標識物質の
位置情報を得るための方法としてオートラジオグ
ラフイーが既に知られている。

たとえば、蛋白質、核酸などのような生物体由
来の高分子物質に放射性標識を付与し、その放射
性標識高分子物質、その誘導体、あるいはその分
解物などをゲル電気泳動などの分離操作にかけて
ゲル状支持媒体において分離展開し、そのゲル状
支持媒体と高感度Ｘ線フイルムとを一定時間重ね
合わせることにより、該フイルムを感光させ、そ
の感光部位から得られるゲル状支持媒体上におけ
る放射性標識物質の位置情報を基にして、その高
分子物質の分離、同定、あるいは高分子物質の分
子量、特性の評価などを行なう方法も開発され、
実際に利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフイー
は、DNA（もしくはDNA断片物、以下同様）の
塩基配列の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフイーを利用してDNA
の塩基配列を決定するための代表的な方法の一つ
として、サンガー・クールソン（Sanger−
Coulson）法が知られている。この方法は、
DNAが二本の鎖状分子からなる二重ラセン構造
を有し、かつその二本の鎖状分子は、各々四種類
の塩基、すなわちアデニン(A)、グアニン（Ｇ）、
シトシン(C)、チミン（Ｔ）なる塩基を有する構成
単位から構成されていること、そしてこの二本の
鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の水素結合
によつて架橋されており、しかも各構成単位間の
水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合
わせのみにおいて実現しているというDNAの特
徴的な構造に着目し、DNA合成酵素によるDNA
断片の合成、ゲル電気泳動およびオートラジオグ
ラフイーの手段を巧みに利用してDNAの塩基配
列を決定する方法である。

サンガー・クールソン法において、塩基配列を
決定しようとしているDNAあるいはDNA断片物
（以後、これらを検体DNAという）と相補的な
DNA断片を合成するためには幾つかの方法があ
るが、基本的には一本鎖の検体DNAを鋳型（テ
ンプレート）とし、上記四種類の塩基を含むモノ
ヌクレオシドトリフオスフエートの存在下で
DNA合成酵素（DNAポリメラーゼ）を作用させ
ることにより、検体DNAと相補的な種々の長さ
のDNA断片を合成する。このとき、一部のモノ
ヌクレオシドトリフオスフエートに放射性標識が
付与されたものを用いること、および合成条件に
工夫を凝らして四種の塩基のいずれか一種に対し
て特異的になるようにすることにより、放射性標
識が付与された塩基特異的合成DNA断片（DNA
合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数のDNA合
成物からなる混合物をゲル電気泳動法により支持
媒体上に分離展開する（ただし、視覚的には見る
ことができない）。従来においては、この支持媒
体上の分離展開列をＸ線フイルム上に可視化して
オートラジオグラフを得、得られたオートラジオ
グラフに基づいて鎖状分子の末端から順にその塩
基配列を決定し、このようにして検体DNAのす
べての塩基の配列を決定している。

なお、上記に要約したサンガー・クールソン法
の特徴および操作については、たとえば次の文献
に記載されている。

〓遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたDNA
の塩基配列解析法〓三浦謹一郎、現代化学、1977
年９月号46〜54頁（(株)東京化学同人刊）Sanger，
F.，Nicklen，S.＆ Coulson，A.R.，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，74，pp.5463−5467（1977） 上述のように従来の放射線写真法を利用するオ
ートラジオグラフイーにおいては、放射性標識物
質の位置情報を得るためにこの位置情報を有する
オートラジオグラフを放射線フイルム上に可視化
することが必須となつている。

従つて、研究者は、その可視化されたオートラ
ジオグラフを自分自身の目で判断することによ
り、試料中の放射性標識物質の分布を測定し、放
射性標識が付与された特定物質についての位置情
報の知見を得ている。すなわち、DNAの塩基配
列は、放射性標識の付与された塩基特異的DNA
合成物もしくはその混合物のそれぞれについて、
分離展開位置を視覚的に判断し、それら塩基特異
的DNA合成物の分離展開列を相互に比較するこ
とにより決定されている。よつて、得られたオー
トラジオグラフの解析は、通常、人間の視覚を通
して行なわれており、そのために多大な時間と労
力が費されている。

また、人間の目に依存しているためそのオート
ラジオグラフを解析して得られる位置情報が研究
者によつて異なるほど得られる情報の精度には限
界がある。特に、試料の量が少ない、放射性標識
物質から放射される放射線エネルギーが弱い、好
適な露光条件が得られないなどのために、放射線
フイルム上に可視化されたオートラジオグラフが
良好な画質（鮮鋭度、コントラスト）を有してい
ない場合には満足できる情報が得られがたく、そ
の精度は低下しがちであるという問題がある。

従来より、位置情報の精度を向上させるために
は、たとえば、その可視化されたオートラジオグ
ラフをスキヤニングデンシトメーターなどの測定
器具を用いて測定することが行なわれている。し
かしながら、このことは、オートラジオグラフの
解析に要する時間をふやし、その操作を煩雑にす
るものである。

このほかに、上記の位置情報を有するオートラ
ジオグラフを放射線フイルム上に可視化するため
には、試料と放射線フイルムとを長時間（たとえ
ば、数日時間）重ね合わせて露光する必要があ
る。また、放射線フイルムの感光成分である銀塩
が試料中の各種の物質によつて受ける化学カブリ
を低減するために、露光操作は低温（０〜−90
℃）で行なわなければならなく、その露光条件に
は種々の制限がある。さらに、放射線フイルムの
感光成分の銀塩は、物理的な刺激にも影響されや
すい、すなわち物理カブリを受けやすいために、
その取り扱いには高度の熟練と注意を要し、従つ
てオートラジオグラフイーの操作を一層複雑にし
ている。

また、このようにして得られる画像は、上記の
化学カブリおよび物理カブリのほかに、長時間の
露光操作の間に放射性標識物質以外の試料中に含
まれる自然放射能、あるいは環境放射能によつて
画質が低下する傾向がある。

〔発明の要旨〕

本発明者は、従来のオートラジオグラフイーに
おいて利用されている放射線フイルムを用いる放
射線写真法の代りに、蓄積性螢光体シートを用い
る放射線像変換方法を利用することにより、放射
性標識物質の位置情報を有するオートラジオグラ
フを可視画像とすることなくデジタル信号として
得、そして得られたデジタル信号に好適な信号処
理を施すことにより、DNAもしくはDNA断片物
の塩基配列を簡易に決定することを実現した。さ
らに所望により、上記放射線像変換方法を利用す
ることにより得られた電気信号またはデジタル信
号からオートラジオグラフに対応する可視画像を
も得ることを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、DNAもしくはDNA断片
物の塩基配列を決定するためのオートラジオグラ
フイーにおける信号処理方法であつて、該DNA
もしくはDNA断片物と相補的な塩基配列を有し、
かつ放射性標識が付与されてなる、 １） 少なくともグアニン特異的DNA合成物を
含む塩基特異的DNA合成物、 ２） 少なくともアデニン特異的DNA合成物を
含む塩基特異的DNA合成物、 ３） 少なくともチミン特異的DNA合成物を含
む塩基特異的DNA合成物、 ４） 少なくともシトシン特異的DNA合成物を
含む塩基特異的DNA合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的DNA合成物
のそれぞれが、支持媒体上に平行関係を以つて一
次元的に分離展開されて形成された分離展開列の
放射性標識物質群から放出される放射線エネルギ
ーを蓄積性螢光体シートに吸収させることによつ
て、この蓄積性螢光体シートに該放射性標識物質
群の位置情報を有するオートラジオグラフを蓄積
記録したのち、該蓄積性螢光体シートを電磁波で
走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放
出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すこ
とにより得られるそれぞれの分離展開列のオート
ラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ） 該分離展開列のそれぞれについて信号処理
のための走査方向を決定する工程、 ） 該分離展開列の走査方向上のサンプリング
点を該分離展開列のそれぞれについて検出する
工程、 ） 少なくとも該四群の分離展開列のそれぞれ
について、走査方向上の対応する位置間でサン
プリング点の照合を行なうことにより、グアニ
ン、アデニン、チミン、シトシンのそれぞれの
位置情報を得る工程、 を含むオートラジオグラフイーにおける信号処理
方法を提供するものである。

また、本発明は、上記のDNAもしくはDNA断
片物の塩基配列を決定するための信号処理を行
い、一方で、該輝尽光を光電的に読み出すことに
より得られる該オートラジオグラフに対応する電
気信号またはデジタル信号より、該オートラジオ
グラフを可視画像として得ることからなるオート
ラジオグラフイーにおける信号処理方法も提供す
るものである。

なお、本発明において「位置情報」とは、試料
中における放射性標識物質もしくはその集合体の
位置を中心とする各種の情報、たとえば、支持媒
体中に存在する放射性物質の集合体の存在位置と
形状、その位置における放射性物質の濃度、分布
などからなる情報の一つもしくは任意の組合わせ
として得られる各種の情報を意味する。

ここにおいて、従来の放射線写真法に代る放射
線像変換方法とは、たとえば、特開昭55−12145
号公報に開示されているように、輝尽性螢光体を
有する蓄積性螢光体シートを用いるもので、被写
体を透過した、あるいは被検体から放出される放
射線エネルギーをこの蓄積性螢光体シートの輝尽
性螢光体に吸収させ、そののちに輝尽性螢光体を
可視光線および赤外線などの電磁波（励起光）で
走査することにより、輝尽性螢光体中に蓄積され
ている放射線エネルギーを螢光（輝尽発光）とし
て放出させ、この螢光を光電的に読み取つて電気
信号を得るか、さらにこの電気信号を可視画像と
して再生するか、あるいはＡ／Ｄ変換してデジタ
ル信号として得るものである。

また、蓄積性螢光体シートは、たとえば、二価
ユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン
化物系螢光体などの輝尽性螢光体を含有するもの
である。輝尽性螢光体は、Ｘ線、α線、β線、γ
線、紫外線などの放射線の照射を受けてその放射
線エネルギーの一部を蓄積したのち、可視光線お
よび赤外線などの電磁波（励起光）の照射を受け
るとその蓄積エネルギーに応じて輝尽発光を示す
性質を有している。

すなわち、本発明は、オートラジオグラフイー
において上記放射線像変換方法を利用することに
より、支持媒体上に分離展開された放射性標識物
質の位置情報を、直接にデジタル信号として得る
ものである。またさらに所望により、デジタル信
号に基づいてあるいはＡ／Ｄ変換されてデジタル
信号を得る前の電気信号に基づいて、放射性標識
物質の位置情報を示すオートラジオグラフを可視
画像としても得るものである。

〔発明の効果〕

上記放射線像変換方法は、従来の放射線写真法
と比較して極めて広い放射線露出域（ラチチユー
ド）にわたつて放射線像を記録しうるという非常
に実用的な利点を有している。すなわち、この方
法において用いられる輝尽性螢光体は、放射線露
光量に対し、その放射線エネルギーを蓄積したの
ち励起光の照射によつて放射される輝尽光の光量
が極めて広い範囲にわたつて比例することが認め
られている。従つて、上記の方法によれば、被検
体のオートラジオグラフに対応する高精度のデジ
タル信号を直接的に得ることができる。

また、被検体のオートラジオグラフを有する輝
尽光を光電的に読み取つて電気信号として得る段
階で読み取りゲインを適当な値に設定することに
より、被検体の条件にによる露光量の変化、輝尽
性螢光体の感度のバラツキ、光検出器の感度のバ
ラツキなどの原因によつて蓄積性螢光体シートに
蓄積される放射線エネルギーのレベルが異なつて
も、これらの因子の変動に影響されないデジタル
信号を得ることができる。さらには被検体から放
出される放射線量を従来より低減させることが可
能となり、これにより、研究者の健康に有害な試
料中の放射性標識物質の量を減少させることを可
能にするものである。

そして、上記の蓄積性螢光体シートを用いる放
射線像変換方法により得られる放射性標識物質の
位置情報を有するデジタル信号を、信号処理機能
を有する適当な信号処理回路を通すことによつ
て、放射性標識物質の位置情報を人間の視覚に頼
ることなく自動的に所望の記号および／または数
値で表示することができる。そして、上記信号処
理回路において、この記号および／または数値で
表示される位置情報にさらに適当な演算処理およ
び他の関連情報を与えることにより、人間の手を
経ることなく所望の情報、すなわちDNAの塩基
配列を決定することが可能である。

従つて、本発明は、放射性標識物質の位置情報
を有するオートラジオグラフに対応するデジタル
信号を、デジタル信号処理することによりオート
ラジオグラフの解析を自動化し、従来の方法にお
いて要する時間、労力の大幅な短縮を可能とする
ものである。また、高精度の位置情報を得ること
を可能とするものである。

上記に述べた種々の利点のほかに、本発明は、
放射性標識物質の位置情報を記号および／または
数値として入手することを可能にすると同時にそ
の位置情報を有するオートラジオグラフを画像と
して視覚化することをも可能にする。

このことにより、信号処理により記号および／
または数値として得られた位置情報（DNAの塩
基配列）と可視画像とを比較することができる。
また、他の可視化されたオートラジオグラフとの
比較を可能にするものである。特に、これまでの
ところ、オートラジオグラフイーには放射線写真
法がもつぱら利用されており、この従来法により
得られた可視画像との比較を可能にする。また、
可視画像として保存できることにより、記号およ
び／または数値として磁気テープ等に保存する以
外に別の形での記録・保管が可能となるものであ
る。

さらに、この画像化は、試料のオートラジオグ
ラフに対応する電気信号および／またはデジタル
信号を得たのちに行なわれるものであるから、必
要に応じて、得られるデジタル信号に好適な画像
処理を施すことができ、これにより観察読影性能
が特に優れた可視画像を得ることも可能となる。

また、試料の蓄積性螢光体シートへの露光操作
は、従来の写真画像を得るための露光操作と比較
して大幅に緩和された露光条件（時間、温度な
ど）で行なうことができるという長所をも有して
いる。すなわち、環境温度あるいはその付近の温
度という温度条件であつても放射性標識物質の位
置情報の精度を低下させることなく露光を行なう
ことができる。そして、蓄積性螢光体シートは高
感度であるため、露光時間を大幅に短縮化するこ
とができる。この点においても、オートラジオグ
ラフイーの精度の向上および操作の簡略化をもた
らすものである。

〔発明の構成〕

本発明において用いられる試料の例としては、
DNAもしくはDNA断片物をテンプレートとし
て、放射性標識が付与されたデオキシヌクレオシ
ドトリフオスフエート（dNTP）とDNA合成酵
素とを用いて合成される各塩基特異的DNA合成
物および／またはそれらの混合物が、一次元的に
分離展開されて分離展開列を形成している支持媒
体を挙げることができる。

特に、この塩基特異的DNA合成物が、サンガ
ー・クールソン法において汎用されているジデオ
キシ法（鎖停止法）により合成される場合には、
DNAの合成反応を停止させる機能を持つジデオ
キシヌクレオシドトリフオスフエート（ddNTP）
を使用することにより、一般に下記四種からなる
排他的な組合わせとして得ることができる。

１） グアニン特異的DNA合成物 ２） アデニン特異的DNA合成物 ３） チミン特異的DNA合成物 ４） シトシン特異的DNA合成物 また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて
分離展開するための方法としては、たとえば、ゲ
ル状支持媒体（形状は層状、柱状など任意）、ア
セテートなどのポリマー成形体、あるいは濾紙な
どの各種の支持媒体を用いる電気泳動、そしてシ
リカゲルなどの支持媒体を用いる薄層クロマトグ
ラフイーなどが挙げられる。このうちで、ゲル状
支持媒体を用いる電気泳動法が代表的な分離展開
方法であり、本発明の実施にとつて好ましい。

本発明に用いられる蓄積性螢光体シートは、基
本構造として、支持体、螢光体層および透明保護
膜とからなるものである。螢光体層は、輝尽性螢
光体を分散状態で含有支持する結合剤からなり、
たとえば、二価ユーロピウム賦活弗化臭化バリウ
ム（BaFBr：Eu²⁺）螢光体粒子をニトロセルロ
ースと線状ポリエステルとの混合物中に分散含有
させて得られる。蓄積性螢光体シートは、たとえ
ば、支持体としてポリエチレンテレフタレートな
どのシートを用い、このシート上に上記螢光体層
を設け、さらに螢光体層上に保護膜としてポリエ
チレンテレフタレートシートなどを設けたもので
ある。

本発明において、放射性標識物質を含有する支
持媒体から放出される放射線エネルギーの蓄積性
螢光体シートへの転写蓄積操作（露光操作）は、
支持媒体と蓄積性螢光体シートとを一定時間重ね
合わせることにより、その支持媒体上の放射性標
識物質から放出される放射線の少なくとも一部を
蓄積性螢光体シートに吸収させて実施する。この
露光操作は、支持媒体と蓄積性螢光体シートとが
近接した状態で配置されていればよく、たとえば
常温もしくは低温で少なくとも数秒間この状態に
置くことにより行なうことができる。

なお、サンガー・クールソン法によるオートラ
ジオグラフイーにおける試料の調製法、蓄積性螢
光体シートおよび露光操作の詳細については、本
出願人による特願昭58−201231号明細書に詳細に
記載されている。

次に、本発明において、蓄積性螢光体シートに
蓄積記録された支持媒体上の放射性標識物質の一
次元的な位置情報をを読み出してデジタル信号に
変換するための方法について、添付図面の第１図
に示した読出装置（あるいは読取装置）の例を参
照しながら略述する。

第１図は、蓄積性螢光体シート（以下において
は、螢光体シートと略記することもある）１に蓄
積記録されている放射性標識物質の一次元的な位
置情報を仮に読み出すための先読み用語出部２
と、放射性標識物質の位置情報を出力するために
螢光体シート１に蓄積記録されているオートラジ
オグラフを読み出す機能を有する本読み用読出部
３から構成される読出装置の例を概略図を示して
いる。

先読み用読出部２においては次のような先読み
操作が行なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフ
イルター６を通過することにより、このレーザー
光５による励起に応じて蓄積性螢光体シート１か
ら発生する輝尽発光の波長領域に該当する波長領
域の部分がカツトされる。次いでレーザー光は、
ガルバノミラー等の光偏向器７により偏向処理さ
れ、平面反射鏡８により反射されたのち螢光体シ
ート１上に一次元的に偏向して入射する。ここで
用いるレーザー光源４は、そのレーザー光５の波
長領域が、螢光体シート１から発する輝尽発光の
主要波長領域と重複しないように選択される。

螢光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照
射下において、矢印９の方向に移送される。従つ
て、螢光体シート１の全面にわたつて偏光レーザ
ー光が照射されるようになる。なお、レーザー光
源４の出力、レーザー光５のビーム径、レーザー
光５の走査速度、螢光体シート１の移送速度につ
いては、先読み操作のレーザー光５のエネルギー
が本読み操作に用いられるエネルギーよりも小さ
くなるように調整される。

螢光体シート１は、上記のようなレーザー光の
照射を受けると、蓄積記録されている放射線エネ
ルギーに比例する光量の輝尽発光を示し、この光
は先読み用導光性シート１０に入射する。この導
光性シート１０はその入射面が直線状で、螢光体
シート１上の走査線に対向するように近接して配
置されており、その射出面は円環を形成し、フオ
トマルなどの光検出器１１の受光面に連絡してい
る。この導光性シート１０は、たとえばアクリル
系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加
工してつくられたもので、入射面より入射した光
がその内部において全反射しながら射出面へ伝達
されるように構成されている。螢光体シート１か
らの輝尽発光はこの導光性シート１０内を導かれ
て射出面に到達し、その射出面から射出されて光
検出器１１に受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領
域の光のみを透過し、励起光（レーザー光）の波
長領域の光をカツトするフイルターが貼着され、
輝尽発光のみを検出しうるようにされている。光
検出器１１により検出された輝尽発光は電気信号
に変換され、さらに増幅器１２により増幅され出
力される。増幅器１２から出力された蓄積記録情
報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に
応じて適正レベルの信号を得、そして濃度および
コントラストの優れた画像が得られるように、増
幅率設定値ａ、収録スケールフアクターｂ、およ
び再生画像処理条件設定値ｃを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した螢光体
シート１は本読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み
操作が行なわれる。

本読み用レーザー光源１４から発せられたレー
ザー光１５は、前述のフイルター６と同様な機能
を有するフイルター１６を通過したのちビーム・
エクスパンダー１７によりビーム径の大きさが厳
密に調整される。次いでレーザー光は、ガルバノ
ミラー等の光偏向器１８により偏向処理され、平
面反射鏡１９により反射されたのち螢光体シート
１上に一次元的に偏向して入射する。なお、光偏
向器１８と平面反射鏡１９との間にはfθレンズ２
０等が配置され、螢光体シート１の上を偏向レー
ザー光が走査した場合に、常に均一なビーム速度
を維持するようにされている。

螢光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照
射下において、矢印２１の方向に移送される。従
つて、先読み操作におけると同様に螢光体シート
１の全面にわたつて偏向レーザー光が照射される
ようになる。

螢光体シート１は、上記のようにしてレーザー
光の照射を受けると、先読み操作におけると同様
に、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例
する光量の輝尽発光を発し、この光は本読み用導
光性シート２２に入射する。この本読み用導光性
シート２２は先読み用導光性シート１０と同様の
材質、構造を有しており、先読み用導光性シート
２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝尽発
光はその射出面から射出されて、光検出器２３に
受光される。なお、光検出器２３の受光面には輝
尽発光の波長領域のみを選択的に透過するフイル
ターが貼着され、光検出器２３が輝尽発光のみを
検出するようにされている。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気
信号に変換され、前記の増幅率設定値ａに従つて
感度設定された増幅器２４において適正レベルの
電気信号に増幅されたのち、Ａ／Ｄ変換器２５に
入力される。Ａ／Ｄ変換器２５は、収録スケール
フアクター設定値ｂに従い信号変動幅に適したス
ケールフアクターでデジタル信号に変換される。

なお、本発明における蓄積性螢光体シートに転
写蓄積された支持媒体上の放射性標識物質の位置
情報を読み出すための方法について、上記におい
ては先読み操作と本読み操作とからなる読出し操
作を説明したが、本発明において利用することが
できる読出し操作は、上記の例に限られるもので
はない。たとえば、支持媒体上の放射性標識物質
の量、およびその支持媒体についての蓄積性螢光
体シートの露光時間が予めわかつていれば、上記
の例において先読み操作を省略することも可能で
ある。

また、本発明における蓄積性螢光体シートに転
写蓄積された支持媒体上の放射性標識物質の位置
情報を読み出すための方法は、上記に例示した以
外に限られるものではない。

このようにして得られた放射性標識物質のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号は、次
に、信号処理回路２６に入力される。信号処理回
路２６では、放射性標識物質の位置情報を記号お
よび／または数値化し、目的のDANの塩基配列
を決定するための信号処理が行なわれる。すなわ
ち、信号処理のための走査方向を決定したのちサ
ンプリング点を検出し、次いでサンプリング点の
比較同定を行なう。また、必要に応じて、再生画
像処理条件設定値ｃに基づいた画像化のための信
号処理が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたDANの
塩基配列決定のためのオートラジオグラフイーに
おける信号処理の実施態様を、前記のサンガー・
クールソン法のジデオキシ法を利用した場合を例
にとり、次の四種類の塩基特異的DAN合成物の
組合わせにより形成された泳動列（分離展開列）
を用いた場合について説明する。

１） グアニン（Ｇ）特異的DAN合成物 ２） アデニン(A)特異的DNA合成物 ３） チミン（Ｔ）特異的DNA合成物 ４） シトシン(C)特異的DNA合成物 まず、常法に従つて、一本鎖の検体DNA（テン
プレートDNA）およびこのDNAの一部に対して
相補的な短いDNA断片（プライマー）を用意し、
テンプレートDNAにプライマーをハイブリダイ
スさせたのち、四種のデオキシヌクレオシドトリ
フオスフエート（dNTP）と一種のジデオキシヌ
クレオシドトリフオスフエート（ddNTP）を用
い、DNAポリメラーゼを作用させてテンプレー
トDNAと相補的なDNAの合成を行なう。四種の
dNTPのうちの少なくとも一種に ³²Pなどの放射
性元素で標識化したものを用いることにより、放
射性標識が付与された上記四群の塩基特異的
DNA合成物を調製する。たとえば、グアニン特
異的DNA合成物は、ddNTPとしてddGTPを用
いることによつて得られる。他の塩基についての
特異的DNA合成物も同様にして、対応する
ddNTP（すなわちddATP、ddTTP、または
ddCTP）を用いることによつて得られる。

これをゲル状支持媒体上で電気泳動により分離
展開させて試料を得る。次に、この試料（支持媒
体）と蓄積性螢光体シートとを室温で数分間重ね
合わせることにより露光操作を行ない、試料に形
成されているDNAの分離展開列を蓄積性螢光体
シートにオートラジオグラフとして蓄積記録す
る。

第２図は、放射性標識の付与された塩基特異的
DNA合成物が分離展開されている上記四種類か
らなる泳動列のオートラジオグラフを示す。すな
わち、第２図の第１列から第４列は順に、 (1)−（Ｇ）特異的DNA合成物 (2)−(A)特異的DNA合成物 (3)−（Ｔ）特異的DNA合成物 (4)−(C)特異的DNA合成物 の各列（泳動列）を示す。

蓄積性螢光体シートに蓄積記録されたオートラ
ジオグラフを第１図に示した読出装置に装填して
読み出すことにより、信号処理回路２６に入力さ
れたデジタル信号は、蓄積性螢光体シートに固定
された座標系で表わされた番地（ｘ，ｙ）とその
番地における信号のレベルＺとを有しており、そ
の信号のレベルは輝尽光の光量に対応している。
すなわち、そのデジタル信号は第２図のオートラ
ジオグラフに対応している。従つて、信号処理回
路２６には上記放射性標識物質の位置情報を有す
るデジタル画像データが入力されることになる。
本明細書において、デジタル画像データとは、放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号の集合体を意味する。

まず、上記デジタル信号に対してデジタル信号
処理のための走査方向の決定を行なう。ここで、
第２図において垂直方向（分離展開方向）をｙ軸
方向、水平方向をｘ軸方向とすると、走査方向は
たとえば次のようにして決定することができる。
すなわち、得られたデジタル画像データについ
て、ｙ軸方向の任意の点（ｙ＝y_aに位置）におい
てｘ軸方向に数値的に走査して、信号のレベルが
極大値を示すｘ座標（x_a）を求める。ただし、ａ
は正の整数であり、各列の番号を表わす。このと
き、走査するｙ軸方向の幅の大きさは、少なくと
も一つの放射性標識物質の分離展開部位（通常、
〓泳動帯〓と呼ばれる）を含みうるような大きさ
をもつて走査する必要がある。この走査幅をただ
一つの泳動帯を含みうる大きさとしたときには極
大値は通常一つ見出され、これは、上記四つの泳
動列のいずれか一つのｘ座標と対応している。次
に、y_aの値を変えて少なくとも四回上記の走査お
よび極大値を見出す操作を繰り返すことにより、
異なる四つの泳動列に対応するｘ座標を求めるこ
とができる。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性
螢光体シートを読み出して得られたデジタル信号
は、信号処理回路２６において一旦メモリーに記
憶される（すなわち、バツフアーメモリーあるい
は磁気デイスク等の不揮発性メモリーに記憶され
る）。信号処理において、デジタル画像データ上
を走査するとは、この走査箇所のデジタル信号の
みをメモリーから選択的に取り出すことを意味す
る。

従つて、ｘ座標（x_a）は、たとえば、上記の走
査幅内のデジタル信号を各ｘ座標ごとにｙ軸方向
に繰り返し取り出してその信号レベルを加算した
ときに、得られた信号のレベルが極大となるｘ座
標（x_a）とすることができる。あるいは、上記の
走査幅内のデジタル信号をｘ軸方向に繰り返し取
り出して各ｙ座標ごとに信号のレベルが極大とな
るｘ座標を見出したのち、これらのｘ座標の平均
座標を算出し、これをｘ座標（x_a）とすることが
できる。なお、このような走査の際に混入してく
る雑音のピークをとらないようにするために、信
号のレベルを予め設定した閾値で二値化しておい
てもよい。

このようにして、各列の走査方向は、たとえば
検出されたｘ座標（x_a）を通り、ｙ軸方向に平行
な直線を以下の信号処理のための走査方向として
決定することができる。

次に、この走査方向上のサンプリング点の検出
を行なう。放射性標識物質の分離展開部位を検出
するためのサンプリング点は、走査方向上のデジ
タル信号のみを取り出したときに、その信号のレ
ベルが極大となる全ての点とすることができる。
上記の走査においても、一定の幅をもつて走査す
ることが望ましい。従つて、信号のレベルの極大
点とは、たとえば横軸に走査方向上の位置（ｙ）
をとり、縦軸にその走査幅内の信号のレベルの平
均値（ｚ）をとつたグラフで表わしたときに、こ
のグラフに現われる全てのピーク点を意味する。
以下、走査方向上の各位置における信号のレベル
の平均値を、単にその位置における信号のレベル
と略す。

第３図は、第２図に示された一泳動列について
上記のようにして横軸に走査方向上の位置（ｙ）
をとり、縦軸に信号のレベル（ｚ）をとつたグラ
フを示している。

このようにして、座標点およびこの座標点にお
ける信号のレベル（x_a，y_ao，z_ao）を有するサン
プリング点S_aoが決定される。ここで、ｎは正の
整数であり、サンプリング点の番号を表わす。

上述のようにしてデジタル信号に信号処理を施
すことにより、各泳動列について放射性標識物質
の一次元的な位置情報を一次元的方向の位置とそ
の位置における信号のレベル（y_ao，z_ao）で表わ
すことができる。ここで、各位置における信号の
レベル（Z_ao）は、放射性標識物質の相対量（濃
度）を表わすとみなすことができる。

あるいはさらに、たとえば、放射性標識物質を
分離展開するための開始位置を放射性標識物質を
含むマーカーによつて蓄積性螢光体シートに記録
しておくことにより、デジタル画像データ上でこ
の開始位置（y_p）を上記と同様にして検出するこ
ができる。また、開始位置（y_p）は、たとえば、
蓄積性螢光体シート自体をパンチで孔を設けるな
どの物理的手段を用いて加工しておくことによ
り、露光操作においてその開始位置を設定するこ
とによつても検出が可能である。そしてこのy_pを
用いて｛y_ao−y_p＝y_ao′｝の減算を行なうことに
より、上記位置情報を分離展開開始位置からの移
動距離とその位置における信号のレベル（y_ao′，
z_ao）で表わすことができる。

また、放射性標識物質の相対量の評価について
は、上記のサンプリング点における信号のレベル
のほかに、たとえば、各極大点近傍の積分値など
各種の算定が可能である。

次に、上記四列について相互に位置（y_ao）を
比較してy_aoの大きい順に並べる。たとえば次の
ように表わされる図式を得ることができる。

S₁₁，S₄₁，S₃₁，S₂₁，S₄₂，S₁₂，S₃₂，S₂₂，S₂₃，
…… 上記の図式において、S_1o＝Ｇ、S_2o＝Ａ、S_3o
＝Ｔ、S_4o＝Ｃと置き換えることにより、次のよ
うな図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−…… このようにして、検体DNAと相補的なDNA鎖
状分子についての塩基配列を決定することができ
る。なお、得られたDNAの塩基配列についての
情報は、上記の表示形態に限られるものではな
く、任意の表示形態が可能である。たとえば、所
望により、同時に上述の信号処理におけるサンプ
リング点の信号のレベル（z_ao）を、分離展開さ
れた各合成物の相対量として表示することも可能
である。あるいは、第４図に示されるような図表
化も可能である。

あるいはさらに、DNAの二本の鎖状分子両方
についての塩基配列を表示することもできる。す
なわち、上記の記号で表わされた図式において各
塩基に対応する組合わせとして、Ａ→Ｔ、Ｇ→
Ｃ、Ｃ→Ｇ、Ｔ→Ａなる情報を与えることによ
り、次のような図式で表わされるDNAの塩基配
列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−… Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−…… 上記のような信号処理により決定されたDNA
の塩基配列についての情報は、信号処理回路２６
から出力されたのち、次いで直接的に、もしくは
必要により、磁気テープなどの保存手段を介して
記録装置（図示なし）へ伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に電子的に表示するもの、CRT等に表示
された記号・数値をビデオ・プリンター等に記録
するもの、熱線を用いて感熱記録材料上に記録す
るものなど種々の原理に基づいた記録装置を用い
ることができる。

さらに本発明においては、所望により、得られ
たデジタル信号またはＡ／Ｄ変換される前の電気
信号から、支持媒体上の放射性標識物質のオート
ラジオグラフを画像化することができる。

なお、信号処理回路２６では、再生画像処理条
件設定値ｃに基づいて、デジタル信号に濃度およ
びコントラストが適正で観察読影性能の優れた可
視画像が得られるように信号処理（画像処理）を
行なつてもよい。この画像処理としては、たとえ
ば、空間周波数処理、階調処理、加算平均処理、
縮小処理、拡大処理などが挙げられる。

画像処理が施されたデジタル信号は、必要によ
り磁気テープなどの保存手段を介して、第５図の
再生記録装置に伝送される。

次に、画像処理された放射性標識物質の位置情
報を有するデジタル信号を画像化するための方法
について、第５図に示した再生記録装置の例を参
照しながら略述する。

第５図は、第１図の読出装置から出力されるデ
ジタル信号を（可視）画像化するための再生記録
装置の例の概略図を示している。

放射性標識物質の位置情報を画像化するために
は、次のような再生記録操作が行なわれる。

Ｄ／Ａ変換器２７に入力された上記デジタル信
号は、濃度を表わすアナログ信号に変換され、光
変調器２８に入力される。このアナログ信号によ
つて光変調器２８が変調される。記録用のレーザ
ー光源２９からのレーザー光３０はこの光変調器
２８で変調されたのち、走査ミラー３１によつて
写真フイルム等の感光材料３２上で走査され、こ
の感光材料３２上に画像が再生される。

なお、デジタル信号を再生記録するための方法
は、上記の方法に限られるものではなく、たとえ
ば、前記の記録装置を用いる方法などを利用して
もよい。

また、上記オートラジオグラフの可視画像は、
デジタル信号がＡ／Ｄ変換される前の電気信号を
再生記録することによつても得ることが可能であ
る。すなわち、第１図の読出装置における増幅器
２４で得られる電気信号を直接に、第５図の再生
記録装置の光変調器２８に伝送することにより、
得ることもできる。

なお、上記の（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組合わせを
利用したDNAの塩基配列決定法は、DNAの塩基
配列決定法の一例であつて、本発明の信号処理方
法は、上記の組合わせに限定されるものではな
く、種々の組合わせが可能であり、またその組合
わせを利用し、上記の方法に準じる方法により同
様にして塩基配列を決定することが可能である。
たとえば、サンガー・クールソン法の別法である
プラス・マイナス法により得られる組合わせを利
用しても、DNAの塩基配列を決定することがで
きる。あるいは、少なくとも一群の塩基特異的
DNA合成物と適当な参照物質（たとえば、各塩
基特異的DNA合成物の混合物）との組合わせか
ら、特定の塩基についての配列を決定することも
可能である。

また、上記の例においては、支持媒体上で一次
元的方向に分離展開している四列の放射性標識物
質群を用いて説明したが、分離展開列は四列に限
定されるものではなく、四列以上であつてもよい
し、またそれ以下であつてもよい。あるいは、一
つの支持媒体を用いて同時に二種類以上のDNA
の塩基配列を決定することも可能である。

なお上記のようにして得られた情報は、このほ
かにも、たとえば、既に記録保存されている他の
DNAの塩基配列と照合するなどの遺伝言語学的
情報処理を行なうことも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性螢光体シート
に蓄積記録された試料中の放射性標識物質の位置
情報を読み出すための読出装置（あるいは読取装
置）の例を示すものである。 １：蓄積性螢光体シート、２：先読み用読出
部、３：本読み用読出部、４：レーザー光源、
５：レーザー光、６：フイルター、７：光偏向
器、８：平面反射鏡、９：移送方向、１０：先読
み用導光性シート、１１：光検出器、１２：増幅
器、１３：制御回路、１４：レーザー光源、１
５：レーザー光、１６：フイルター、１７：ビー
ム・エクスパンダー、１８：光偏向器、１９：平
面反射鏡、２０：fθレンズ、２１：移送方向、２
２：本読み用導光性シート、２３：光検出器、２
４：増幅器、２５：Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処
理回路、 第２図は、DNAの塩基特異的DNA合成物がゲ
ル支持媒体上で分離展開された試料のオートラジ
オグラフの例を示す図である。第３図は、信号処
理のための走査方向上の位置とデジタル信号のレ
ベルとの関係の例を表わすグラフである。第４図
は、本発明の信号処理方法により決定された
DNAの塩基配列の例を模式的に示す図表である。
第５図は、本発明において蓄積性螢光体シートに
蓄積記録された試料中の放射性標識物質の位置情
報を有するデジタル信号を画像化するための再生
記録装置の例を示すものである。 ２７：Ｄ／Ａ変換器、２８：光変調器、２９：
記録用レーザー光源、３０：レーザー光、３１：
走査ミラー、３２：感光材料。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ DNAもしくはDNA断片物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフイーにおける信号
   処理方法であつて、該DNAもしくはDNA断片物
   と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付
   与されてなる、 １） 少なくともグアニン特異的DNA合成物を
   含む塩基特異的DNA合成物、 ２） 少なくともアデニン特異的DNA合成物を
   含む塩基特異的DNA合成物、 ３） 少なくともチミン特異的DNA合成物を含
   む塩基特異的DNA合成物、 ４） 少なくともシトシン特異的DNA合成物を
   含む塩基特異的DNA合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的DNA合成物
   のそれぞれが、支持媒体上に平行関係を以つて一
   次元的に分離展開されて形成された分離展開列の
   放射性標識物質群から放出される放射線エネルギ
   ーを蓄積性螢光体シートに吸収させることによつ
   て、この蓄積性螢光体シートに該放射性標識物質
   群の位置情報を有するオートラジオグラフを蓄積
   記録したのち、該蓄積性螢光体シートを電磁波で
   走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放
   出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すこ
   とにより得られるそれぞれの分離展開列のオート
   ラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ） 該分離展開列のそれぞれについて信号処理
   のための走査方向を決定する工程、 ） 該分離展開列の走査方向上のサンプリング
   点を該分離展開列のそれぞれについて検出する
   工程、 ） 少なくとも該四群の分離展開列のそれぞれ
   について、走査方向上の対応する位置間でサン
   プリング点の照合を行なうことにより、グアニ
   ン、アデニン、チミン、シトシンのそれぞれの
   位置情報を得る工程、 を含むオートラジオグラフイーにおける信号処理
   方法。 ２ 上記DNAもしくはDNA断片物の塩基特異的
   DNA合成物が、 １） グアニン特異的DNA合成物、 ２） アデニン特異的DNA合成物、 ３） チミン特異的DNA合成物、 ４） シトシン特異的DNA合成物、 からなる少なくとも四群の塩基特異的DNA合成
   物を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のオートラジオグラフイーにおける信号処理
   方法。 ３ 上記）の工程において、走査方向において
   信号レベルが極大となる全ての点を走査方向上の
   サンプリング点とすることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載のオートラジオグラフイーにお
   ける信号処理方法。 ４ DNAもしくはDNA断片物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフイーにおける信号
   処理方法であつて、該DNAもしくはDNA断片物
   と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付
   与されてなる、 １） 少なくともグアニン特異的DNA合成物を
   含む塩基特異的DNA合成物、 ２） 少なくともアデニン特異的DNA合成物を
   含む塩基特異的DNA合成物、 ３） 少なくともチミン特異的DNA合成物を含
   む塩基特異的DNA合成物、 ４） 少なくともシトシン特異的DNA合成物を
   含む塩基特異的DNA合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的DNA合成物
   のそれぞれが、支持媒体上に平行関係を以つて一
   次元的に分離展開されて形成された分離展開列の
   放射性標識物質群から放出される放射線エネルギ
   ーを蓄積性螢光体シートに吸収させることによつ
   て、この蓄積性螢光体シートに該放射性標識物質
   群の位置情報を有するオートラジオグラフを蓄積
   記録したのち、該蓄積性螢光体シートを電磁波で
   走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放
   出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すこ
   とにより得られるそれぞれの分離展開列のオート
   ラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ） 該分離展開列のそれぞれについて信号処理
   のための走査方向を決定する工程、 ） 該分離展開列の走査方向上のサンプリング
   点を該分離展開列のそれぞれについて検出する
   工程、 ） 少なくとも該四群の分離展開列のそれぞれ
   について、走査方向上の対応する位置間でサン
   プリング点の照合を行なうことにより、グアニ
   ン、アデニン、チミン、シトシンのそれぞれの
   位置情報を得る工程、 を含む信号処理を行なうことにより、該DNAも
   しくはDNA断片物の塩基配列を得るための信号
   処理を行ない、一方では、該輝尽光を光電的に読
   み出すことにより得られる該オートラジオグラフ
   に対応する電気信号またはデジタル信号より該オ
   ートラジオグラフを可視画像としても得ることか
   らなるオートラジオグラフイーにおける信号処理
   方法。 ５ 上記DNAもしくはDNA断片物の塩基特異的
   DNA合成物が、 １） グアニン特異的DNA合成物、 ２） アデニン特異的DNA合成物、 ３） チミン特異的DNA合成物、 ４） シトシン特異的DNA合成物、 からなる少なくとも四群の塩基特異的DNA合成
   物を含むことを特徴とする特許請求の範囲第４項
   記載のオートラジオグラフイーにおける信号処理
   方法。 ６ 上記）の工程において、走査方向において
   信号レベルが極大となる全ての点を走査方向上の
   サンプリング点とすることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載のオートラジオグラフイーにお
   ける信号処理方法。