JPH02283274A

JPH02283274A - 膜型細胞培養装置

Info

Publication number: JPH02283274A
Application number: JP1104294A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Toge; 峠　哲哉; Hiroyuki Hattori; 服部　博行
Original assignee: Nissho Corp
Current assignee: Nissho Corp
Priority date: 1989-04-24
Filing date: 1989-04-24
Publication date: 1990-11-20
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: JP2690144B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は膜型細胞培養装置に関する。

〔従来の技術〕

近年、バイオテクノロジーの進歩にともない微生物や細
胞などを培養する装置が種々提案されている。

たとえば、浮遊細胞を培養する装置として、回分操作の
必要な反応器を一部連続化した半回分反応器、さらには
回分操作を連続操作に改善した連続樽型反応器などの種
型反応器や連続操作に適した前型反応器などが提案され
、利用されてきている。

前記改善は、回分操作を半連続化、連続化するという点
ではそれなりの効果があるが、いずれも浮遊細胞と培地
およびその他必要とされる成分（たとえば血清、リンホ
カインなどの生理活性物質など）とを１つの系とした装
置である。

したがって、培養によりえられた細胞や有用産生物は多
量の培地などと共に存在するため、目的物の分離・精製
が容易でなく、前記細胞や有用産生物の濃度をいかにし
て高めるか、また前記細胞や有用産生物の取出操作の妨
げとなる培地などをいかにして少なくするかなどが、重
要な課題となっている。

このような課題を解決するための装置として、培養槽の
内部に設けられた菌体または細胞は透過しないが培地は
透過する膜製の袋中で菌体または細胞を培養する装置が
提案されている（特開昭６２−１２２５８０号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記従来装置を用いると袋中のものを取出すことにより
、菌体または細胞濃度の高い液を取出すことができ、多
量の培地からこれらを分離・精製する手間が軽減される
という効果が達成され、それなりの成果かえられるが、
供給された血清や細胞活性化物質は袋中にのみ存在する
わけではなく、袋外にも存在し、培地の交換時に排出さ
れ、無駄に使用される。また生理活性物質などの産生物
も袋中にのみ存在するとは限らず、産生物を取出したい
ばあいには分離・精製に手間がかかるなどの問題がある
。その・）え袋中の培地などが必ずしも好ましい状態に
維持し難いなどの問題がある。とくに動物性細胞の培養
のばあいに重要なｐｔ（の安定、！ｌＣＯ３−レベルの
維持（細胞のＦｉｔ類にもよるが、通常２６〜３２１１
ｅｑ＃であることが好ましい）などがはかりにくいとい
う問題があり、従って培養できる細胞の濃度にも制約が
あった。

本発明は」：述の実状に鑑み、とくに培養される浮遊細
胞や所望の産生物の濃度を高め、かつ培地の交換の手間
がかからず、良好な培地条件を提供することを目的とす
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の換型細胞培養装置は、（ａ）　　培地を収容する培地容器と、■　前記培地容
器内に収納配置され、平均ポアサイズ３０〜８０００人
の柔軟な膜で培地と区画された細胞培養チャンバーと、（ｃ）　　流路開閉手段を備え、該流路開閉手段を介し
て細胞培養チャンバーに細胞などを供給し、また回収す
るための供給・回収装置と、（市　流路開閉手段を備え
、該流路開閉手段を介して培地容器に培地を供給する供
給装置と、（ｅ）　　培地容器から培地を取出す取出装
置と、＜ｈ　　取出された培地を回収する回収容器と、
＜ｇ＞　　培地容器にガスを供給するガス供給手段とを
備えたことを特徴とする。

〔作　用〕

本発明の装置では、細胞培養チャンバーの膜が平均ポア
サイズ３０〜８０００人になっている。従って膜の平均
ポアサイズを回収する産生物の大きさ（一般に分子量の
大きさに比例する）に応じて適当に選べば、細胞や回収
しようとする産生物は細胞培養チャンバーの外に透過し
ないので高濃度の細胞や産生物を回収することができ、
細胞や所望の産生物の分離−精製が容易になる。

また、膜の平均ポアサイズを３０〜５０人程度に選べば
血清や細胞活性化物質の使用量を少なくすることができ
る。

さらにまた本発明では、供給装置により培地を容器に供
給し、一定期間使用された培地を取出装置で取出せるの
で、培地を連続交換することができる。したがって、培
地の交換に手間がかからず、培地が常に一定の新鮮度を
もっているので、培地条件が良くなる。

〔実施例〕

つぎに本発明の実施例ヘシ明する。

第１図は本発明の一実施例にかかわる培養装置の説明図
、第２〜３図は本発明に用いられる接続手段の説明図で
ある。

第１図において、（１）は培地を収容する培地容器、（
２）は平均ポアサイズ３０〜８０００人の柔軟な膜（３
）および該膜を支持する支持部材（４）からなり、撹拌
装置（５）、細胞や血清や細胞活性化物質を供給するた
めの供給・回収装置［６）　、エアフィルター（７１を
有するガス抜き装置（８）を備えた細胞培養チャンバー
、（９）は２個のエアフィルター（至）を介してエアポ
ンプＱｌ）よりバブル方式でガスを供給するガス供給装
置、０２）は取出装置、■は培地供給装置で、最初に培
地容器（１）に培地を入れるときに使用される。供給さ
れた培地は下部の孔０４）から培地容器中の培地に供給
される。なお、第１図の装置では培地供給装置（２）が
細胞培地チャン／（−（２）の保持手段を兼ねている、
ｈは供給装置、（ト）は撹拌器である。

前記培地容器（１）とは、従来からの浮遊細胞培養装置
におけるいわゆるカルチャーボトルにあたるものであり
、その大きさ、形状、材質などにはとくに限定はなく、
従来からのカルチャーボトルのごとき、形状、材質など
のものであれば使用しつる。

このような容器（１）の好ましい具体例とし°Ｃは、た
とえば容量５００〜５０００　ｍｌ程度の小型のものの
ばあい、硬質ガラス、合成樹脂、金属などから形成され
た底面積５０〜３００ｃｄ程度で高さ１０〜３０４程度
の円筒状容器や、角柱状容器、球状容器などがあげられ
る。

このような小型の装置では、通常、ガス供給装置（９）
、取出装置０２）、供給装置ｂ１細胞培養チャンバー（
２）などの保持手段を兼ねる培地供給装置ｎなどは容器
の口の部分に取付けられるため、口広のものであるのが
好ましい。これらの手段が設けられた口の部分の残りの
部分は、栓、蓋などで密１１され、雑菌などの混入が防
止される。

また、容量が５ｇ程度以上の中〜大型のもののばあい、
合成樹脂や金属などから形成された直径０．１５〜２ｍ
程度で、高さが０．３〜２ｍ程度の円筒状容器や、角柱
状容器、球状容器などがあげられる。

このような大型の容器のばあい、ガス供給装置（９）、
取出装置０２）、供給装置面、ばあいによっては細胞培
養チャンバー（２などの保持手段を兼ねる培地供給装置
ｎなどを容器の栓や蓋などに設ける必然性がないばかり
でなく、むしろこれらに取付けたばあいには、容器の開
閉が必要になったばあいなどには取扱いづらい、重量の
ある装置をつり下げるのは好ましくない、などの理由か
ら、通常は底面にすえつけ台を設けてすえつけたり、側
面に取付手段を設けて取付けるなどするのが好ましい。

前記細胞培養チャンバー（２）は、平均ポアサイズ３０
〜８０００人の柔軟な膜（３）および支持部材（４）か
らなり、撹拌装置（５）を有し、細胞などの供給・回収
装置（６）およびガス抜き装置（８）を有する装置であ
る。

細胞培養チャンバー（２）の大きさ、形状などにはと（
に限定はないが、培地容器（１）の容量の１０〜５０％
程度になるのが好ましく、チャンバーを形成する柔軟な
膜（３）と培地との接触面積が大きくなる方が好ましい
。

前記細胞培養チャンバー（′２Ｊにおける膜（３）は、
平均ポアサイズを３０〜８０００人の範囲で適当に選ぶ
ことにより、細胞および所望の産生物を効率よく回収す
ることができる。また、平均ポアサイズを３０〜５０人
程度の範囲で選べば細胞や産生物は勿論、供給された血
清や生理活性物質をも透過し、ないので血清や生理活性
物質を節約することができる。

前記膜を構成する材料には、とくに限定はないが、培地
を透過させる必要があるから、表面は親水性のものであ
ることが必要である。それゆえ、膜を構成する材料の好
ましい具体例としては、たとえば再生セルロースなどの
親水性材料があげられる。たとえばセルローストリアセ
テート、セルロースジアセテート、ポリプロピレン、ポ
リエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホ
ン、ポリアミドまたはポリエステルなどの親水性でない
材料からなる膜のばあいには、たとえばエタノールに浸
漬させたり、水酸基を膜表面にグラフト重合などにより
導入するなどの方法で膜を親水性にしうる。

前記支持部材（４）は、膜（３）が充分な強度を有さず
、僅かな力で変形するため、膜（３）のみでチャンバー
を形成したばあいにはチャンバーを支持したり、撹拌装
置（５）を設けたりするのが困難であるために使用する
部材である。それゆえ、適度の強度、硬さなどを有する
ものであることが必要であるが、このようなものである
かぎり支持部材（４）の形状、大きさ、材質などにはと
くに限定はなく、膜（３）とともに形成する細胞培養チ
ャンバー（２）の形状などに応じて適宜選択して使用す
ればよいが、膜（３）と培地とが充分接触し、チャンバ
ー内の培地交換のおこりやすいものであるのが好ましい
。

たとえば第１図に示す細胞培養チャンバー（′２Ｊにお
いてはチャンバーの上面および底面が支持部材（４）か
らなり、側面が膜（３）から形成されている。上面の支
持部材（４）は適度の強度、硬さなどを有するため、支
持手段を兼ねる培地供給装置にで上方から細胞培養チャ
ンバー（′２Ｊを支持することができ、細胞培養チャン
バー（２）に撹拌装置（５）、細胞などの供給・回収装
置（６）、ガス抜き装置（８）などの装置が容易に取付
けられうる。

上面の支持部材（４）は板状の部材であるのが好ましい
が、板状である必要はない。支持部材（４）が格子状や
スリット状などのように空隙を有するようなばあいには
、この空隙部分には膜（３）をはるなどしてチャンバー
の内外を区切るようにする必要がある。また底面も支持
部材からなるばあいには、底面の支持部材の材質は比重
が培地より若干大きいものが好ましく、底面の支持部材
の比重が培地の比重より過大であったり、培地の比重よ
り軽いばあいには、上面の支持部材と底面の支持部材と
が相互に支持されるように両者を一体的に形成しておく
方が、底面が浮上したり、強度が充分でない膜（３）に
直接大きな力がかかるなどの問題がなくなるので好まし
い。

第１図においては細胞培養チャンバー（２）を上から支
持しているが、下または横から支持してもよいことは当
然のことである。

第１図の（６）は細胞培養チャンバー（′２Ｊに浮遊細
胞や血清や細胞活性化物質を供給し、増殖した細胞やそ
の産生物である生理活性物質などを回収する供給・回収
装置である。この装置（６）は上端にインジェクション
プラグ（２１）、流路開閉手段としての三方活栓のが設
けられ、その下端が細胞培養チャンバー（２）の最下部
付近まで達している。

前記ガス供給装置（９）は培養に必要なガス、たとえば
０２をバブル方式により供給する装置であり、培養によ
り生ずるガス、たとえばＣＯ２は取出装置（１２）から
排気される。

ガス供給装置（９）の構造などにはとくに限定はなく、
一般に使用されているバブル方式のガス供給装置であれ
ば使用しうる。また培地容器（１）内に設けられるガス
供給装置（９）は１個でもよいが、要すれば２個以上設
けてもよい。

このようにして細胞培養を行なうと、バブル方式でガス
が供給されるため、供給時に培地にゆれが生じ、培地の
状態の均一化、さらには細胞培養チャンバー（２）内と
の培地の交換もおこりやすくなる。

本発明の装置には、第１図に示すように、撹拌装置（５
）が設けられているが、撹拌装置（５）を設けて細胞培
養チャンバー（２内を撹拌するため、細胞培養手段（ａ
内外の培地などの交換がおこりやすくなり、培地を一定
の状態に維持しやすくなる。また膜（３）などを常にゆ
らし、細胞を浮遊させやすくするため、細胞が膜（３）
の表面に付着するのが防止され、増殖しやすくなる。

前記撹拌装置（５）は１秒間当り１７１０〜１回転の割
合で回転し、かつ１分間当り１〜６０回転の割合で回転
する装置である。撹拌は連続的に行なわれる必要はなく
、前記条件を満たす撹拌であればよく、低速で撹拌する
ため細胞を傷めることなく細胞培養チャンバー（′２Ｊ
内の液を均一にしうるとともに培地が膜（３）を透過し
やすくなり、細胞培養チャンバー（２）内外の液の交換
がおこりやすくなる。

第１図には培養中の培地の状態をモニターする手段など
は記載されていないが、随時設置しうろことは当然のこ
とである。

四は培地の供給装置で、上端にインジェクションプラグ
のと、流路開閉手段としての三方活栓（２４）を設えて
おり、その下端は培地容器（１）内に入っている。前記
インジェクションプラグのには培地供給バッグ（２５）
がチューブ四を介して接続されており、チューブ（至）
には必要に応じクランプのが取りつけられる。

なお、チューブ■とインジェクションプラグのとの接合
は第２図のようになっている。第２図において、（３１
）はチューブ■に接続された針、（３２）はプラグのを
構成するゴム栓であり、針（３１）をゴム栓（３２）に
穿刺して連通される。またインジェクションプラグのの
代わりに第３図ににおけるような結合手段を用いてもよ
い。（３３）はチューブ（２）側の結合部材であり、（
３４）はルアーコネクタである。結合部材（３３）をル
アーコネクタ（３４）に挿入して連通される。

以上のいずれの接続方法においても、接続時に汚染が生
じにくいという利点がある。

この装置により、常時新鮮な培地を一定量づつ供給して
、培地条件を良好に保つことができる。

０２）は取出装置で、容器（１）内に挿入されたパイプ
の下端は細胞培養時の培地の液面の高さになるように位
置決めされている。また外部に導出されたパイプには回
収容器（２８）が接続されている。培地容器（１）内に
供給・回収装置（６）から培地を供給すれば、供給され
た培地の量と等量の培地が取出装置Ｏｚから取出される
。また、細胞培養チャンバー（２）の膜（３）の平均ボ
アーサイズを回収しようとする産生物を透過させる範囲
に選べば培地内にも産生物がチャンバー（２）内から流
出しているので、産生物も取出すことができる。

前記膜（３）が平均ボアーサイズ３０〜５０人のもので
あれば産生物はチャンバー（２）から外に流出しないの
で、取出装置０りからは培地のみ取出すことになる。

取り出された培地や産生物は、回収容器ノ内に回収され
る。この回収容器■、取出装置０２＋および培地容器（
１）は一つの系として密封をされていることが好ましい
がこの場合には、回収容器■にはガス抜きのためのエア
ーフィルタ（至）を取りつける必要がある。

つぎに、本発明の細胞培養装置の使用例を第１図に示す
装置に基づいて説明する。まず最初の培地の供給は培地
供給装置により行なわれる。

この際、培地容器（１）内の空気は取出装置Ｏｚから放
出しながら行なうとスムーズに培地を供給することがで
きる。

一方、培養する細胞、血清、リンホカインなどの細胞活
性化物質などを含む細胞浮遊液が細胞などの供給装置（
６）少ら供給される。この際、細胞培養チャンバー（２
）内の空気を抜くためガス抜き手段（８）の開放下で行
なうと細胞などの供給をスムーズに行なうことができる
。

培地、細胞、血清、細胞活性化物質などの供給後、ガス
供給装置（９）より、たとえばＣＯｚを５容量％程度含
有する空気がバブル方式により培地に導入され、取出装
置０２）から排気される。また撹拌装置（５）により細
胞培養チャンバー（２）内の液が１秒間当り１／ｌＯ〜
１回転で、かつ１分間当り１〜６０回転の割合で撹拌さ
れる。

供給されるガスの量は、培養する細胞の種類や密度など
によっても異なり、−［には規定できないが、一般に培
地１００ｍ１当り３０〜１００　ｍｌ　／分程度の割合
でガス供給が行なわれる。

このようにして細胞培養を行なうと、バブル方式でガス
が供給されるため、供給時に培地にゆれが生じ、培地の
状態の均一化、さらには細胞培養チャンバー（２）内と
の培地の交換もおこりやすくなる。また細胞培養チャン
バー（′２Ｊ内の液を撹拌するため、該チャンバー（′
２Ｊ内の液が均一になるとともに膜（３）を透過しやす
くなり、細胞培養チャンバー（２内外の液の交換がおこ
りやすくなる。また、膜（３）として血清や生理活性物
質は透過しないが培地は透過する膜（平均ポアサス４３
０〜５０人）を使用すれば、血清や細胞活性化物質は細
胞培養チャンバー（′２Ｊ内にとどまり、これらの節約
がはかられる。さらに撹拌を１秒間当り１／ｌＯ〜１回
転で、かつ１分間当り１〜６０回転という低速で行なう
ため、細胞を傷めることも少ない。

さらに、バッグ□□□および供給装置δを介して常に新
鮮な培地が供給されて、古い培地が取出装置０２Ｊから
取出される。したがって本発明においては、培地が自動
的に連続交換されるので、バッチ方式で人手により交換
する手間が省ける。

さらに培地が新鮮なので、培地条件がよくなる。

本発明により培養される細胞としては、たとえばリンパ
球、骨髄細胞、マクロファージなどが、その際に使用さ
れる細胞活性化物質とじては、たとえばリンホカインや
インターフェロンなどが、さらに培地としては、たとえ
ば牛胎児血清培地、無血清培地、ヒト血清培地などがあ
げられる。

前記説明においては主として培養細胞をうるばあいを念
頭において説明したが、産生物をうるばあいについても
同様であることは当然のことである。

このようにしてえられる産生物の具体例としては、たと
えばイムノグロブリン間１フィブリノーゲン、アルブミ
ン、リンホカイン、インシュリン、インターフェロン、
ウロキナーゼ、成長ホルモン、モノクローナル抗体など
の生理活性物質などがあげられる。

つぎに本発明を実施例に基づき説明する。

実施例１第１図に示す装置とほぼ同様の装置を用いた。

第１図における培地容器（１）は硬質ガラス製で容量３
３００　ｍｌ、直径約１５０ｍｍｘ高さ約１９０關の円
筒状容器、ガス供給装置（９）はエアポンプＣ１１）と
バイブで連通された孔径ＩＩＩＩＩｍの多数の小孔を有
する筒状容器であった。そして培地容器（１）を外部か
ら遮断する蓋体には、上面および底面がいずれも直径約
７４鰭のポリカーボネート製の円板からなり、側面が直
径的７４ｍｔａ、高さ約４０　ｔａｎの円柱状（内容口
約１６０ｍ１）で、平均ポアサイズ４０人の再生セルロ
ース製の膜（側面の面積約９２ｃｄ）からなる細胞培養
チャンバー（２を保持するための培地供給装置にや、エ
アフィルター（０，２ｂｎｎ）を有するガス抜き装置（
８）および細胞などの供給・回収装置（６）が細胞培養
チャンバー（２）にセットされた状態で取付けられてお
り、さらにガス供給装置（９）、取出装置（１２）、供
給装置面、回収容器のが取付けられていた。

なお、細胞培養チャンバー（２）の底面は培地容器（１
）の底から約１０＋ａｍうえになるようにセットされて
おり、上面の支持部材（４）には撹拌板装置（５）が取
付けられていた。

取出装置０′２Ｊから培地容器内の空気を放出しながら
培地としてＲＰ旧−１８４０（味の素沖製）　１０００
　ｍｌを供給したのち、細胞などの供給・回収装置（６
）から細胞培養チャンバー（２）にガス抜き装置（８）
の開放下、リンパ球１０８個／　Ｉ！ＩＪ　Ｘ　１１）
００ｍｌ、血清１０ｍ１、レンホカイン２００単位から
なる細胞浮遊成約１１０ｍ１を供給した。そののち、３
７℃で培養を行なった。なお、培養中、２個のエアフィ
ルター（０，２２虜）を介してエアポンプからＣＯ２ヲ
５容量％含存する空気を流ｆｆｉ５ｈｍ／　１ｎ　％バ
ルブ方式で供給し、排気装置０′２Ｊから排気した。

また、１秒間当り１／２回転かつ１分間当り３０回転で
撹拌した。

培養中、１日ごとに培地のｐｉ、炭酸ガス分圧（ＰＣＯ
２）を測定し、７．２≦ｐＨ≦７．３．３６ｍｍ１１ｇ
≦ｐｃｏ２≦４ｈｍｌ１ｇであることを確かめた。

２０日間培養後、培養液には８Ｘ１０７個／　ｍｌの細
胞が存在していた。

〔発明の効果〕

本発明の装置により細胞を培養すると１０７〜１０６個
／ｍｌという高密度に細胞を培養することができ、培養
された細胞や産生物の分離・精製が容易なる。また培養
時に培地を自動的、連続的に交換することができるので
、培地の交換に手間がかからず、常に良好な培地条件を
維持することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例にかかわる培養の装置の説明
図、第２〜３図は本発明に用いられる接続手段の説明図
である。（図面の主要符号）（１）：培地容器（２）　；細胞培養チャンバー＋３）　、　Ｍ（４）二支持部材（５）：撹拌装置（６）；供給・回収装置（９）：ガス供給装置０２）：取出装置（１’３：供給装置Ｑｌ）、（１３：インジェクションプラグ■、Ｃ４：三
方活栓 ■：回収容器才２回才３

Claims

【特許請求の範囲】１　（ａ）培地を収容する培地容器と、（ｂ）前記培地容器内に収納配置され、平均ポアサイズ
３０〜８０００Åの柔軟な膜で培地と区画された細胞培
養チャンバーと、（ｃ）流路開閉手段を備え該流路開閉手段を介して細胞
培養チャンバーに細胞などを供給し、また回収するため
の供給・回収装置と、（ｄ）流路開閉手段を備え、該流路開閉手段を介して培
地容器に培地を供給する供給装置と、（ｅ）培地容器か
ら培地を取出す取出装置と、（ｆ）取出された培地を回
収する回収容器と、（ｇ）培地容器にガスを供給するガ
ス供給手段とを備えてなる膜型細胞培養装置。２　前記２個の流路開閉手段が三方活栓であり、該三方
活栓にインジェクションプラグを取りつけてなる請求項
１記載の培養装置。３　前記回収容器、取出装置および培地容器が密閉され
た系である請求項１または２記載の培養装置。４　前記膜として、平均ポアサイズ３０〜５０Åの膜を
用いてなる請求項１、２または３記載の培養装置。５　前記膜が、再生セルロース製または親水化されたセ
ルローストリアセテート、セルロースジアセテート、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチ
レン、ポリスルホン、ポリアミドもしくはポリエステル
製の膜からなる請求項１、２、３または４記載の培養装
置。