JPH02283299A - ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション法およびそれに用いる装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に、特異的結合アッセイを行うための固
相法および装置に関する。さらに詳しくは、核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイへのクロマトグラフィー法の
適用に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）特異
的結合アッセイを使用することは、種々の臨床的応用に
おいて非常に大きな価値があることがわかっている。種
々の生物学的流体および組織を、薬剤、ホルモン、酵素
、タンパク質、抗体、ＤＮＡおよびＲＮＡ断片、および
他の生物学的物質などの広範囲の成分について分析を行
うことができる。

そのような特異的結合アッセイには、リガンドとレセプ
ターとからなる特異的結合ペアの一方の成分である分析
対象物を測定するアッセイが含まれろ。リガンドとレセ
プターとはレセプターがリガンドと特異的に結合すると
いう関係にあり、この関係により、類似した特性を有す
る他の試料成分からリガンドを識別することが可能とな
る。免疫学的アッセイは、種々の化合物および物質（抗
原）とこれら抗原の特異的抗原決定部位と結合可能な免
疫グロブリン（抗体）との間の反応に基づいている。特
異的結合アッセイにもまた核酸ハイブリダイゼーション
反応が含まれるが、これは一本鎖のオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡｋｃ３ＲＮＡ
）が、相補的な塩基及配列を含む他のポリヌクレオチド
の鎖と水素結合の生成によりハイブリダイズするもので
ある。ポルモンレセブターやビオチン−アビジンなどの
ように、免疫学的反応らハイブリダイゼーションも関与
しない他の特異的結合アッセイも知られている。

特定の核酸配列の検出のために種々のタイプの特異的結
合アッセイもまた知られている。そのようなアッセイは
核酸ハイブリダイゼーション手順を利用するらのであり
、この手順では一本鎖核酸ボリマーの相補的ポリヌクレ
オチド配列が互いに認識し合い［核形成（ｎｕｃｌｅａ
ｔｅ）］、相互反応して（アニール）安定な二贋体構造
を生成する。

核酸ハイブリダイゼーションは、均一（溶液相）媒体お
よび不均一（溶液／固体相）媒体の両方で行なわれてい
る（たとえば、ヨーロッパ特許出願公開下２８８，７３
７号、ＷＯ３６１０７３８７号および米国特許第４，７
８７，９６３号各公報を参照）。

均一媒体においては、一般に適当な条件下でハイドロキ
シアパタイトカラムに通すことにより、ハイブリダイズ
したポリヌクレオチド配列をハイブリダイズしていない
配列から分離する。分離はまた、ゲル排除［キューンズ
（Ｋ　ｕｈｎｓ）らのヨーロッパ特許出畷公開第２７８
，２２０号コニポリカチオン結合支持体（ヨーロッパ特
許出願公開下２８１゜３９０号）；または沈澱剤（ヨー
ロッパ特許出願公開下１６７．３６６号）によっても行
うことができる。幾つかの文献には不均一ハイブリダイ
ゼーションが教示されており、たとえばランキ（Ｒａｎ
ｋｉ）らの米国特許第４，５６３，４１９号にはサンド
イッチハイブリダイゼーションが教示されている。

近年における特異的結合アッセイ法に関してなされた大
きな進歩にもかかわらず、これらの方法には、とりわけ
核酸ハイブリダイゼーションの関与する場合にまだまだ
改良の余地は充分に残っている。現在の溶液相ハイブリ
ダイゼーション法では、相補的配列の拡散と核形成に相
当のインキュベーション時間（一般に数時間のオーダー
）が必要とされる。ハイブリダイゼーション促進のため
の公知法を用いてもインキュベージジンには約１〜２時
間が必要である。ついで、二量体を分離するために分離
工程が必要である。固相ハイブリダイゼーション法では
分離が容易であるが、しばしばインキュベージコン時間
が長くなる。２つの相補的核酸のうちの一方のみが自由
に拡散することができるので、拡散および核形成は固相
表面上はどには迅速に起こらない。

？−／コネル（Ｍ　ａｃ　Ｃｏｎｎｅ　Ｉ　ｌ）の米国
特許第４，７８７．９６３号明細書には、不均一ハイブ
リダイゼーションの動力学を改善するための方法および
装置が開示されている。標的配列が結合している膜に核
酸プローブを電気泳動的に濃縮することにより、核形成
およびアニールの機会が増大する。

該文献は、ハイブリダイゼーションが時間のオーダーで
はなく１５〜３０分で起こることを主張している。

ヨーロッパ特許出願公開第２８８，７３７号公報には、
より迅速な不均一ハイブリダイゼーションを達成するた
めの他の方法が開示されている。

プローブが結合したニトロセルロース膜の内部孔へ配列
が拡散していくには一層長いインキュベーション時間が
必要である。それゆえ、該文献では、プローブの結合し
た水懸濁性微細粒子からなる固相が開示されている。拡
散距離が短縮されたことにより約３０分で核形成が可能
となり、微細粒子の分離は濾過により容易に行うことが
できる。

にもかかわらず、動力学の改良された固相アッセイ装置
を含む新しいシステムが強く要望されている。そのよう
な装置は、広範囲の叛酸のアッセイを行うのに使用が簡
単で、１５〜３０分未満でハイブリダイゼーションを行
うことができるのが好ましい。

（課題を解決するための手段） 本発明は、核酸ハイブリダイゼーションを行うための新
規な方法および装置を提供するものである。これらの方
法および装置は洗浄および添加工程が最小限ですみ、種
々の分析対象物（抗体、抗原、ＤＮＡ配列、ＲＮ　Ａ配
列および他の反応性化学物質を含むが、これらに限られ
るものではない）の定性的および定量的特異的結合アッ
セイを迅速に行うのに有用である。

特に、本発明は、固相上でヌクレオチド配列のハイブリ
ダイゼーションを行う方法であって、（ａ）毛管作用に
より溶液を移動させることのできる多孔質媒体上で、該
媒体の接触部位から遠位にある部位に一重項ヌクレオチ
ド配列を固定化し、ついで （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、該遠位部位を
相補的ヌクレオチド配列を含有するかまたは含有すると
思われろ溶液と接触させ、その際、該相補的ヌクレオチ
ド配列は毛管作用により該遠位部位へ移動されたもので
あり、該一本鎖ヌクレオチド配列および該相補的ヌクレ
オチド配列の相補的塩基対間でハイブリダイゼーション
を起こさせる ことを特徴とする方法に関する。

他の側面において本発明は、可溶性の一重項ヌクレオチ
ド配列を固相ハイブリダイゼーションするための装置で
あって、 接触部位； 該接触部位から遠位にあり前原て決定した可溶性ヌクレ
オチド配列に相補的な一重項ヌクレオチド配列を固定化
した遠位部位；および ハイブリダイゼーション条件下で該前原て決定した可溶
性ヌクレオチド配列を含有する溶液を該遠位部位まで移
動させてこれらヌクレオチド配列の相補的塩基対間でハ
イブリダイゼーションを起こさせるための毛管手段 を有する多孔質媒体からなることを特徴とする装置に関
する。

驚くべきことに、微細多孔質媒体などの多孔質媒体は、
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列、タン
パク質および大きなポリペプチド（抗体および種々の抗
原を含む）の迅速なりロマトグラフィー移動およびハイ
ブリダイゼーションを行うのにとりわけよく適している
ことがわかった。

そのような物質の迅速なりロマトグラフィー溶媒移動は
、基体の非特異的結合部位を適当にブロックしたときに
可能であることがわかった。そのようなりロマトグラフ
ィー媒体上での核酸ハイブリダイゼーションでは、効率
および使用の容易さという大きな利点が得られる。ハイ
ブリダイゼーションは溶媒フロントで迅速に起こり、移
動相が同相中を移動していくときに分離が行なわれる。

微細多孔質媒体を使用することは、スピードおよび分離
能が改善されるため特に好ましい。

本発明による好ましい装置は多孔質クロマトグラフィー
物質のストリップからなり、該ストリップはクロマトグ
ラフィー溶媒を選択することにより非固定化試薬および
反応性試料成分を迅速にクロマトグラフィー溶媒移動さ
せる能力を有する。

このストリップには、クロマトグラフィー移動が開始さ
れる第一末端にある接触部位、クロマトグラフィー移動
が終了する第二末端、およびこれら２つの末端の間に位
置し捕捉ヌクレオチド配列を固定した少なくとも１つの
遠位（捕捉）部位が含まれる。

相補的ヌクレオチド配列は、クロマトグラフィー溶媒中
に含まれていてもよい。この場合は、相補的ヌクレオチ
ド配列を含む溶媒は接触部位から遠位部位へと毛管作用
により移動していく。別の態様として、相補的ヌクレオ
チド配列は、接触部位と遠位（捕捉）部位との間の位置
（プローブ部位）にてストリップ自身に含まれていても
よい。この場合には、溶媒は接触部位から進行を始め、
相補的ヌクレオチド配列の位置まで毛管作用により進ん
でゆき、相補的ヌクレオチド配列を可動にして遠位部位
まで移動させ、そこでハイブリダイゼーションが起こる
。相補的ヌクレオチド配列またはハイブリダイズした二
量体はある種の検出手段、一般にある種の標識により検
出することができる。

都合のよい検出手段は、３１Ｐのような放射性標識で直
接標識した相補的ヌクレオチド配列である。

さらに、相補的ヌクレオチド配列および指示試薬や検出
試薬のような他の物質をＩｉり以て定めた順序に従って
移動させることができるように複数のクロマトグラフィ
ー溶媒経路を利用することも可能であり、場合により、
これら相補的ヌクレオチド配列および他の物質の分離は
、部分的に一致しないクロマトグラフィー溶媒移動経路
に従って椎持す・ることもできる。このような複数の経
路は、液体微細回路を構築するように生成させてよく、
この液体微細回路は、種々の試薬を特定の位置へ逐次ク
ロマトグラフィー溶媒移動させることにより種々の多工
程アッセイ法を行うべく「プログラム」することができ
る。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、多孔質媒体、特に微細多孔質クロマトグラフ
ィー媒体中で核酸ハイブリダイゼーションを行うための
方法および装置に関する。本発明の方法および装置は、
ハイブリダイゼーション効率および分離の容易さを顕著
に損なうことなく、相補的ヌクレオチド配列の迅速なハ
イブリダイゼーションを可能にするものである。さらに
、前辺て多孔質媒体上に沈積させておいた試薬物質をク
ロマトグラフィー溶媒移動させることにより、従来のア
ッセイシステムで必要であった数多くの添加および洗浄
工程を省略することが可能となる。

固相中を通過する溶媒フロントは本来的に備わった洗浄
機能として働き、未結合物質をゾーンから除去する。

装置 第１図〜第３図に一般的に示すように、本発明の装置１
０は、固定化されていない試薬および物質をクロマトグ
ラフィー溶媒移動させる能力を有する多孔質クロマトグ
ラフィー物質の基体または媒体からなる。クロマトグラ
フィー媒体については以下にさらに詳しく記載するが、
一般に、クロマトグラフィー溶媒移動が開始される第二
末端または接触部位１４、クロマトグラフィー溶媒移動
が終了する第二末端１６、および該第−末端１４および
第二末端１６の間に位置する少なくとも１つの遠位部位
またはゾーン（第三ゾーン月８を有するストリップ１２
である。

遠位ゾーン１８（以下、［捕捉Ｊゾーンとも称する）に
は、捕捉ヌクレオチド配列（第二試薬）を含浸させてあ
り、これは溶媒移動に対して固定化されている。本明細
書において捕捉ヌクレオチド配列はまた「捕捉配列Ｊま
たは「捕捉試薬」とも称し、相補的ヌクレオチド配列ま
たはプローブ（第一試薬）とハイブリダイズして該捕捉
ゾーン１８中に固定化させることかできる。

ストリップＩ２を接触部位（第一末端）１４にて溶媒２
０と接触させると、溶媒は移動相を形成し毛管作用によ
りストリップを第二末端Ｉ６の方へ登っていく。溶媒フ
ロント（先端部）が捕捉部位１８に到達したときには、
溶媒フロントは可溶性の相補的配列を含んでいて、ハイ
ブリダイゼーション条件下でクロマトグラフィーを行っ
たときにハイブリダイゼーションが起こりうる。

相補的ヌクレオチド配列はクロマトグラフィー溶媒２０
中に含まれていてよい。この場合は、相補的ヌクレオチ
ド配列を含む溶媒は接触部位から捕捉部位へと毛管作用
により移動していく。別の態様として、相補的ヌクレオ
チド配列は、接触部位と捕捉部位との間のプローブゾー
ン（第一ゾーン）２２にてストリップ自身に含まれてい
てもよい。この場合には、溶媒は接触部位から進行を始
め、プローブゾーン２２まで毛管作用により進んでゆき
、相補的ヌクレオチド配列を可動にして遠位部位まで移
動させ、そこでハイブリダイゼーションが起こる。

本発明の第二に重要な側面は、捕捉ゾーンにおいてプロ
ーブ相補的ヌクレオチド配列の好ましくない結合を引き
起こすかもしれない妨害物質および非分析対象物成分が
、溶媒移動により除かれることである。洗浄工程が捕捉
ゾーン上で必然的に行なわれるというこの特徴により、
相補的ヌクレオチド配列を適用した後に該ゾーンを手作
業で洗浄する工程を省くことができる。このように洗浄
工程を省くことができることにより、アッセイ手順中に
おいて溶媒を流す前にプローブや他の試薬物質（すなわ
ち検出手段）などのクロマトグラフィーにより可動な試
薬物質をストリップ物質に前辺て適用することもまた可
能になる。

サンドイッチハイブリダイゼーションを本発明に従って
行うことらでき、その際、「分析対象物」は特定のヌク
レオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖からなる。

捕捉試薬は、ストリップ物質に固定化した一本鎖ＤＮＡ
またはＲＮＡプローブであって、分析対象物を固定化す
ることができるように該分析対象物であるヌクレオチド
配列の第一の部分とハイブリダイズすることのできるヌ
クレオチド配列を供する。つぎに、相補的ヌクレオチド
配列は、該分析対象物により固定化されるように、分析
対象物であるヌクレオチド配列の第二の近位部分とハイ
ブリダイズすることのできるヌクレオチド配列を有する
標識ＤＮＡまたはＲＮ　Ａプローブなどのような標識特
異的結合物質であってよい。

第２図に示すように、捕捉ゾーンは、それぞれ明確に異
なるプローブまたは分析対象物と結合することのできる
捕捉試薬を固定化した１または２以上の部位を含んでい
てよい。このように複数の分析対象物を単一の試料から
同時に検出することができ、特定の分析対象物はストリ
ップ上の位置で示されることになる。以下の実施例でも
示すように、単一のストリップ上に幾つかの捕捉部位を
設けることができ、それぞれの捕Ｗｆｌｌ１位には異な
る分析対象物配列に相補的な配列を固定化しである。溶
媒フロントが毛管作用によりストリップを上昇していく
につれ、該流体中に相補的な配列が存在している場合に
各部位でハイブリダイゼーションが起こる。別のやり方
として、これら部位が捕捉領域内で溶媒フロントに平行
になるように配置させて、各部位で試料が連続的にでは
なく同時に接触するようにすることもできる。

麦迭 本発明の方法には、クロマトグラフィーストリップの捕
捉ゾーンに捕捉配列を固定化し、溶媒ブロントが該ゾー
ンを通過するにつれて相補的ヌクレオチド配列を該捕捉
配列と接触させるようにすることが含まれる。すでに述
べたように、相補的ヌクレオチド配列は溶媒溶液中に存
在していてもよいし、またはプローブ部位に乾燥らしく
は含浸させてストリップ上に存在させてもよい。

第一の方法においては、相補的ヌクレオチド配列を放射
性同位元素で標識し、該相補的ヌクレオチド配列が捕捉
配列とハイブリダイズしたときに二組複合体を生成させ
る。別法においては、捕捉配列（第二試薬）、分析対象
物配列（分析対象物または試料）、および該分析対象物
または二量体を同定するための標識プローブまたは他の
検出手段（第一試薬）の間で玉量複合体を生成させる。

これら２法のそれぞれについて以下にさらに詳しく説明
する。

これら方法のいずれにおいても、溶液がクロマトグラフ
される間、すなわち多孔質媒体上を毛管作用により上昇
していく間に少なくとも１回のハイブリダイゼーション
が起こる。相補的ヌクレオチド配列プローブは、溶媒フ
ロントにて、または溶媒フロントの直前にて移動してい
く（以下では溶媒フロントにて移動していくものとする
）。その結果、ハイブリダイゼーシぢンの起こる時間の
長さは、該フロントが捕捉部位と接触している時間（以
下、「フロント滞留時間」と称する）に依存する。捕捉
ゾーンのサイズが一定であるときは、フロント滞留時間
は、クロマトグラフィー移動が開始される第一末端と捕
捉ゾーンとの間の距離に関するダーシーの法則（Ｄａｒ
ｃｙ’ｓ　Ｌａｗ）により関係付けられる［Ｉｎｄ、Ｅ
ｎｇ、Ｃｈｅｍ、６１：１４〜２８（１９６９）参照］
。第一末端に近接した捕捉ゾーンでは、ハイブリダイゼ
ーションは極めて急速に起こり、少なくとも迅速な移動
に有利な条件下では１５〜３０秒という短時間で起こる
。ストリップをさらに上昇していくと、溶媒ゾーンは捕
捉ゾーンを横切るのに５〜１０分もかかり、ハイブリダ
イゼーションが起こる時間が一層長くなる。実際のスト
リップのサイズでは、実施例でも示すように溶媒通過時
間が２分を越えることはほとんどない。

たとえ２分間でも、従来の公知方法に比べればハイブリ
ダイゼーションは有為に速く起こる（ヨーロッパ特許出
願公開第２８８，７３７号公報、第２図を参照、公知の
ハイブリダイゼーション法およびハイブリダイゼーショ
ンから分離までのそれぞれの時間がまとめである。コラ
ム２３には１０分という促進されたハイブリダイゼーシ
ョン時間が示されている）。

従来の知見によれば、不均一系から期待できるのは５０
％の効率までである。驚くべきことに、本発明の方法に
よるハイブリダイゼーションの効率は、接触時間が有為
に短くなっているにもかかわらず、条件を最適にすれば
これに匹敵するかまたは上回るのである。オリゴヌクレ
オチドプローブを固定化標的ＤＮＡに対して大モル過剰
（たとえば約１６：Ｉまたはそれ以上）で用いる条件下
では、３０−ｍｅｒｓの範囲の所定の長さのプローブに
対してハイブリダイゼーション効率は５０〜７５％であ
る。およそ等モルレベルでは、ハイブリダイゼーション
効率は約２０％である。少量の捕捉配列を用いる場合は
、等モル飛の３０−ｍｅｒｓプローブによりハイブリダ
イゼーション効率はわずかに約４〜！０％となる。実施
例に示すように、ハイブリダイゼーション効率は開始点
から捕捉ゾーンまでの距離によっては有為に変化するこ
とはない。

本発明のハイブリダイゼーションサンドイッチアッセイ
法によれば、アブセイストリップのプローブゾーンに相
補的ヌクレオチド配列を含浸させるが、該相補的ヌクレ
オチド配列は、標識していてもよく、一般に分析対象物
核酸の塩基配列の第一部分に相補的な塩基配列を有する
ポリヌクレオチドプローブ（第一試薬）からなる。捕捉
ゾーンには捕捉試薬（第二試薬）を固定化するが、該捕
捉試薬は、一般に分析対象物核酸の塩基配列の第二の近
接部分に相補的な塩基配列が暴露されたポリヌクレオチ
ドからなる。

分析対象物を含有する試料をストリップの中間ゾーン（
第二ゾーン）に加え、ハイブリダイゼーション条件下で
捕捉ゾーンまでクロマトグラフィーにより移動させ、分
析対象物の塩基配列の第二部分と捕捉試薬の塩基配列と
がハイブリダイズすることにより分析対象物が固定化さ
れるようにする。

ついで、ハイブリダイズ条件下で相補的ヌクレオチド配
列をクロマトグラフィーにより捕捉ゾーンまで移動させ
、該捕捉ゾーンで相補的ヌクレオチド配列は、その塩基
配列と分析対象物分子の塩基配列の第一部分とがハイブ
リダイズすることにより固定化される。試料成分および
相補的ヌクレオチド配列の相対的移動度または中間ゾー
ンと捕捉ゾーンとの位置関係は、相補的ヌクレオチド配
列が捕捉ゾーンに達する前に分析対象物が捕捉ゾーンに
配置され溶媒移動に対して固定化させるようなものであ
る。さらに、相補的ヌクレオチド配列と反応し得る試料
の妨害成分および非分析対象物成分は、相補的ヌクレオ
チド配列が捕捉ゾーンに到達する前に捕捉ゾーンから取
り除かれる。

別のサンドイッチアッセイ法においては、捕捉ゾーンに
固定化された捕捉試薬のところまで試料をクロマトグラ
フィーによりストリップを上昇させ、そこで固定化させ
る。ついで、分析対象物配列かまたは二本鎖配列を検出
することのできる標識相補的ヌクレオチド配列をクロマ
トグラフィーにより捕捉ゾーンのところまで移動させ、
分析対象物を検出する。ヨーロッパ特許出願公開第１６
３．２２０号公報［マイルズ・ラボラトリーズ（Ｍｉｌ
ｅｓ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）コには後者の方法
が記載されている。

さらに別のサンドイッチアッセイ法においては、分析対
象物ヌクレオチド配列を含有する試料を、分析対象物配
列の第一部分に相補的な標識ヌクレオチドプローブと溶
液中で混合する。これをハイブリダイゼーシジン条件下
で行い、溶液中で標識分析対象物二量体を生成させる。

この溶液を、スポット添加（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）、浸漬
または同等の手段によりストリップに加え、ついで、分
析対象物配列の第二部分に相補的なヌクレオチドを固定
化したゾーンまでクロマトグラフィーにより移動させる
。

ついで、標識を検出する。

これらの場合においてもクロマトグラフィー媒体上の溶
媒フロントにて少なくとも１回のハイブリダイゼーショ
ンが起こり、それゆえ本発明の利点が得られろ。

競合ハイブリダイゼーシタンアッセイは、均一系で知ら
れている（ヨーロッパ特許出願公開第２３２．９６７号
公報）。本発明の装置および方法を１１１用して競合不
均一アッセイを行うことも本発明の範囲に含まれる。

多孔質ストリップ物質 本発明に有用な多孔質ストリップ物質としては、毛百作
用、およびグロマトグラフィー溶媒を選択することによ
り非固定化試薬および反応性試料成分をクロマトグラフ
ィー溶媒移動する能力を有する物質が挙げられる。ペー
パークロマトグラフィーに用いられるような広範囲のク
ロマトグラフィー基体物質を本発明に使用することもで
きるが、多孔質媒体または基体は本発明によるアッセイ
のスピードおよび分離能を改善するので好ましい。

ストリップ物質は不活性でなければならず、一般に分析
対象物、試薬または反応生成物のいずれとも物理的もし
くは化学的に反応しないのが好ましい。ストリップ物質
は、ペーパークロマトグラフィー法に使用するのに適し
た繊維物質（織布および不織布を含む）であってもよい
。より好ましいストリップ物質は、微細多孔質構造また
は微細顆粒構造を有するものである。

本発明に適したストリップ物質には、シリカまたは微細
顆粒セルロースなどの顆粒薄層クロマトグラフィー物質
が含まれる。好ましい非顆粒微細多孔質物質としては、
微細多孔質セルロースエステル（たとえば、炭素数が１
〜７のアルカンカルボン酸、たとえば酢酸、プロピオン
酸、いずれかの酪酸または吉草酸などの脂肪族カルボン
酸とのセルロースエステル）；ナイロン６６（デュポン
、ウィルミントン、ＤＥから市販されている製品）およ
びその誘導体などの微細多孔質ナイロン：ミリポア（Ｍ
　ｉ　１１１ｐｏｒｅ）、ベツドフォード、ＭＡおよび
ボール・バイオセバレーシジンズ・グループ（Ｐａｌｌ
　Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ）から市
販されているポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）
とじて知られている多孔質ポリマー膜；および誘導紙（
ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ　ｐａｐｅｒ）が挙げられる。

特に好ましいものはニトロセルロース（セルロースのあ
らゆる硝酸エステルを包含する）から製造した微細多孔
質物質である。適したストリップ物質には、ニトロセル
ロースを上記カルボン酸セルロースエステルのいずれか
と組み合わせたものが含まれる。それゆえ、６個の炭素
原子当たり約３個の硝酸基を有するセルロースエステル
を構成するものとして純粋なニトロセルロースエステル
を用いることができる。

孔径は広範囲内であってよいが、約０．２ミクロン〜１
０ミクロンが好ましく、約１ミクロン〜８ミクロンであ
るのが特に好ましく、約５ミクロンであるのが最も好ま
しい。孔径と基体の厚さとの組合わせは、所望のスピー
ドおよび分離能特性を得るために、使用した特定の試薬
の特性に従って変化してよい。孔径が大きくなると、ハ
イブリダイゼーション効率と結合能が低下するのと引き
換えに流速と動力学もまた増大する。最も好ましい媒体
は、孔径か５．０ミクロンのシュライヒャー＆シュエル
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｃｈｕｅｌｌ）［キーン（
Ｋｅｅｎｅ、　Ｎ　、　Ｈ、）］ニトロセルロースであ
る。

支持体が溶媒と相溶性であることを条件として、種々の
クロマトグラフィー物質をフィルム、ストリップまたは
シートなどの適当な形態で使用することができる。クロ
マトグラフィー物質はまた、紙、ガラス、プラスチック
、金属または繊維などの適当な不活性支持体物質上にコ
ーティングし、もしくは結合もしくはラミネートしても
よい。そのような不活性支持体物質の１つとしてミラー
（Ｍｙｌａｒ）が挙げられる。支持体物質は、クロマト
グラフィー物質に構造上の支持を与える効果を有するの
みならず、アッセイ手順中の試薬および溶媒の蒸発を軽
減する。多孔質固相基体は、厚さが好ましくは約０．０
１ｍｍ〜約０，５■、最も好ましくは約０．１ｍｍのス
トリップの形態であるのが好ましい。

ストリップの他のサイズについては大きく変えることが
できるが、アッセイの展開時間を短縮し物質の使用を最
小限に抑えるためかなり小さくするのが好ましい。スト
リップが極めて小さいときは、取り扱いおよび結果の観
察を容易にするために適当なハンドルまたはホルダーに
結合させてもよい。本発明の単一経路装置を製造するに
は、幅が約５１Ｔｌｆｆｌで長さが５５ｍｎ＋までのス
トリップが適していることがわかった。もっと小さいス
トリップ（たとえば長さが３５開）もまた、経費を節減
し操作時間を短縮するために好ましい。複数経路装置の
場合は、大きなストリップを用いてその上に複数の経路
を生成させてよい。

本発明のストリップ物質の形態を形作るに当たって、該
物質中での流れが一様でなくなるような該物質または該
物質の樟の不規則性を避けるのが好ましい。ストリップ
物質を製造する好ましい手段としては、炭化タングステ
ンの回転刃を有するベーパーカッターを使用することか
挙げられる。他の適当な手段としては、大量生産に使用
するのに特に適したレーザーカッティングなどの方法が
挙げられる。

本発明の装置のストリップ物質は化学的に不活性である
のが好ましいので、溶媒移動に対して捕捉試薬を捕捉ゾ
ーンに固定化することができるように該捕捉ゾーンで活
性化してもよい。ストリップ物質および核酸の特定の化
学的性質に従って、捕捉試薬を固定化するのに種々の方
法が必要となるであろう。一般に、ストリップ物質かニ
トロセルロースまたは混合ニトロセルロースエステルで
あるときは、固定化に特別の化学的結合を必要としない
。他の物質および試薬のために種々の方法を用いること
ができ、そのよ・うな方法としては、カルボニルジイミ
ダゾール、グルタルアルデヒドまたはコハク酸などの物
質で官能化すること、または臭化シアンなどの物質で処
理することが挙げられる。他の適当な反応としては、シ
ッフ塩基反応およびアルデヒド基、カルボニル基および
アミノ基のホウ化水素還元が挙げられろ、、ＤＮＡはス
トリップ物質上に焼き付けることにより溶媒移動に対し
て固定化してよい。焼き付けは、完全に乾燥させた後に
、約り０℃〜約１２０℃の温度で約３０分から約１２時
間、好ましくは約８０℃で約２時間行う。紫外線の照射
により一本鎖核酸をニトロセルロースに架橋させること
も可能である。

核酸ハイブリダイゼーション物質 本発明に有用な核酸ハイブリダイゼーション物質として
は、ＲＮＡ％ＤＮＡ、ｃＤＮＡその他が挙げられる。ハ
イブリダイゼーション物質は、股に相補的塩基配列を存
する標識または非標識ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオ
チドプローブからなる。本発明のプローブは、一般に約
１２〜約１゜０００、好ましくは約１２〜約１００の塩
基を有する。多数の塩基対を有するポリヌクレオチドは
標的遺伝子の塩基配列と完全に相捕的である必要はなく
、両塩基対間に約７０％またはそれ以上の相同性があれ
ば一般にハイブリダイズするであろう。しかしながら、
塩基対の少ないオリゴヌクレオチドの場合は、完全な相
補性を有することが重要であると思われる。

ヌクレオチドのハイブリダイゼーションのハイブリダイ
ゼーション条件は当業者には−・般に知られでいる。そ
のような文献としては、クロサ（Ｃｒｏｓａ）らのＪ　
、Ｂａｃｔ、　Ｉ　Ｉ　５　（３）、９０４〜９１１（
１９７３）、マニアティス（Ｍｎｉａｔｉｓ）らのモレ
キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏ
ｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＸｔ　９８２）：およ
びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー（ＣｕｒｒｅｎＬＰ　ｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ
ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、オース
ベル（Ａｕｓｕｂｅりら編、ジヲン・ウィリー＆サンズ
（１９８７）が挙げられる。

ポリヌクレオチドプローブは大学または他の機関から入
手することもできるし、当該技術分野でよく知られた方
法により合成することもできる［たとえば、カルサーズ
（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、２３０．
２８１〜２８５（１９８５）；コーンバーブ（Ｋｏｒｎ
ｂｅｒｇ）、ＤＮＡレプリケーシヲン（ＤＮＡ　Ｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ
　Ｇｏ、、サンフランシスコ、６７０〜６７９（１９７
８）：ダラス（Ｄａｌｌａｓ）ら、Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　Ｉ　３９．８５０〜８５８（＋９７９）およ
びソ（Ｓｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　、２７７、・１５３
〜４５６（＋９７９）を参照］。

ブロッキング剤 ブロッキング剤とは、バックグラウンドシグナルを減少
させるあらゆる剤をいう。おそらくバックグラウンドシ
グナルの減少はストリップ上の非特異的結合部位の減少
または除去の結果によるものであろうが、本出願人はこ
の理論に拘泥するつもりはない。ブロッキングされてい
ない非特異的結合部位は、プローブまたは試料試薬のク
ロマトグラフィー移動を妨害する。ブロッキング剤はブ
〔ｙ−ブと捕捉ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ションを妨害してはならず、前処理工程でストリップに
加えるかまたは操作中の溶媒系に含まｔ１゛る。

ハイブリダイゼーションアッセイのために好ましいブロ
ッキング剤は、種々の強度のデンハルト溶液（Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）である。１×デンハ
ルト溶液は、０．０２％のフィコール、０．０２％のポ
リビニルピロリドンおよび０．２Ｈ／ｙ（ｌのラン山１
清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）からなる。３×および５×
の強度のデンハルト溶液（それぞれ、１×デンハルト溶
液の３倍および５倍の濃度）が本発明には有用である。

０．５〜２．０％のアルカリ変性カゼイン溶液もまた有
用である。５×デンハルト溶液がこの場合は最も好まし
い。面処理ブロッキングは、室温で１０〜２０分から６
５℃で２時間の範囲の条件下でストリップを蜜月バッグ
中のブロッキング溶液中に置くことにより行う。

操作中の溶媒系中に含ませるのに有用なブロッキング剤
としては、上記デンハルト溶液、ショ糖溶液およびポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）溶液が挙げられる。ショ
糖は約１％の溶液として用いることができる。３００〜
８０００ＭＷのＰＥＧは溶液中に約５％で用いることが
でき、３００ＭＷが好ましい。この場合は、５×デンハ
ルト溶液が最も好ましい。

幾つかの下記実施例にもかかわらず、前処理ブロッキン
グ溶液中には塩（たとえばＮａＣりは存在していてはな
らない。それゆえ、標準塩類／す：／酸／エチレンジア
ミン四酢酸（ＳＳＰＥ）などの溶液は、ブロッキング／
操作溶媒系においては用いることができるが前ブロッキ
ングには現在のところ好ましくない。

溶媒系 本発明のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイに適したクロマトグラフィー溶媒系としては、相補
的ヌクレオチド配列およびその他の試薬および物質を可
溶化でき、それらを捕捉ゾーンまで移動させることので
きる溶媒が挙げられる。

ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイに使
用するのに好ましい溶媒は、５ＸＳＳＰＥバツフアー（
すなわち、０．７５Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭＮ　ａＨｔ
　Ｐ　Ｏａおよび５　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ（ｐＨ７，
４））、５％ＰＥＧ（ＭＷ３００）および０〜５０％脱
イオンポルムアミドからなる。ＰＥＧはある場合には５
×デンハルト溶液で置き換えてらよい。好ましい溶媒に
は、Ｉ　００　ｘ９／ｘＱのヒト胎盤ＤＮＡやサケ精子
ＤＮＡなどの担体ＤＮＡ、および０．ｌ〜０．５％ＳＤ
Ｓが任意に含まれていてよい。

溶媒系を最適化することは、ハイブリダイゼーション条
件の適度の厳重さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を得るため
に重要である。ＤＮＡ二盾らせんまたはＤＮＡ／ＲＮＡ
ハイブリッドの融点（Ｔｍ）は、二重らせんの相補鎖の
５０％が解離する温度である。一般に′ｒｍは、ヌクレ
オチド数が増加するにつれて、またはグアノシン／シト
シン含量が増大するにつれて大きくなる。溶媒系にホル
ムアミドを添加することは二重らせんを不安定にし、温
度を上昇させたのと類似の条件を生成する。ホルムアミ
ド濃度が充分に大きいと、ハイブリダイゼーションは起
こらないであろう。−層厳重でない条件下では、特定の
所望のハイブリダイゼーションは起こるが所望でない非
特異的ハイブリダイゼーションは抑制されるか妨害され
るようにホルムアミド濃度を最適化することができる。

約２０％よりも大きい濃度のホルムアミドは、以下の実
施例に示すように、ヒトゲノムＤＮＡを含む捕捉ゾーン
での非特異的ハイブリダイゼーションシグナルを排除し
た。

しかしながら、約４０％を越える濃度のホルムアミドは
ニトロセルロースストリップに悪影響ヲ与え始めた。

像班土段 捕捉ゾーンに結合した相補的ヌクレオチド配列を検出す
るために種々の検出手段を用いることかできる。これら
の手段には、一般に、検出可能なシグナルを生成するこ
とのできる「シグナル１分子で相補的ヌクレオチド配列
を標識することが含まれる。ソゲナル分子は相補的ヌク
レオチド配列に直接または間接に結合させてよい。

放射性同位元素は検出可能なシグナルを放出するのに特
に存効であり、本発明のヌクレオチドハイブリダイゼー
ンヨンに白゛用である。これらは比較的小さな標識であ
り、相補的ヌクレオチド配列に直接結合さ仕ることがで
きろ。結果はオートラジオグラフィーで調べることがで
きる。

別法として、相補的ヌクレオチド配列をビオチンなどの
レポーター化合物で間接的に標識してらよく、該レポー
ター化合物が今度はシグナル系と特異的に結合すること
ができる。そのような標識系はつ十−ド（Ｗａｒｄ）ら
の米国特許第４．７１１゜９５５号明細書に開示されて
いる。間接シグナル系は、レポーター分子のｌまたは２
以上のレセプターを有する成分（ｍｅｍｂｅｒ）に結合
した検出可能な基を含んでいる。検出可能な基としては
、酵素標識、蛍光化合物、化学発光化合物、金属キレー
トおよびコロイド粒子が挙げられる。レポーターのレセ
プターを何する成分はレセプターと特異的な相互反応を
することのできるあらゆる化合物であってよいが、抗体
が好ましい。たとえば、ビオチンがレポーターである場
合は該成分はストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体
であってよい。

本発明においてシグナル系として９用な酵素としては、
アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよ
びβ−ラクタマーゼが挙げられる。シグナル生成系に有
用な他の酵素およびＮ１ｉ酵素としては、米国特許第４
，２７５，１４９号（コラム１９〜２３）および同第４
，３１８，９８０号（コラム１０〜１４）各明細書に記
載されたちのか含まれ、該文献を参照のためここに引用
する。

過酸化水素を生成する酵素を使用し、生成された過酸化
水素が染料前駆体を染料に酸化することは当該技術分野
でよく知られている。適当な組合わせとしては、糖類オ
キシダーゼ（グルコースオキシダーゼおよびガラクトー
スオキシダーゼなど）および異項環オキシダーゼ（ウリ
カーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）およびキサンチンオキシダー
ゼなど）をペルオキシダーゼおよびチトクロムＣオキシ
ダーゼなどの酵素と組み合わせて過酸化水素を生成させ
、染料前駆体を酸化するものが挙げられる。他の酸化還
元酵素を使用することもまた、加水分解酵素および転位
酵素を使用することと同様に適している。

ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ，ピリドキサルリン酸、ＦＡ　Ｄ
　ＨおよびＦＭＮＨなどの種々の補酵素は、特に酸化還
元酵素と組み合わせて用いることができろ。

最後に、相捕的ヌクレオチド配列の捕捉試薬へのハイブ
リダイゼーションは、二本鎖ヌクレオチドを一本鎖ヌク
レオチドから識別することのできる試薬により検出する
ことができる。そのような試薬としては、ヨーロッパ特
許出願公開第１６３２２０号公報に記載されている抗二
本鎖抗体が挙げられる。これらの試薬は、上記の検出可
能な基に結合させてもよい。

複数経路および溶媒バリアー（ｂａｒｒｉｅｒｓ）本発
明による装置は、種々のアッセイ手順を行うために単一
または複数のクロマトグラフィー溶媒を利用する。最も
簡単な（単一経路）装置が本発明には好ましく、本明細
書に記載した。

複数経路装置は、別々に捕捉ゾーンに通じる２つの一致
しない経路を含む。これらは、本出願人による米国特許
出願第９１２，８７８号明細書に「ダイオード」、「ト
リオードＪおよび「テトロード」装置として詳細に記載
しである。該明細書を参照のため本明細書に引用する。

複数経路を定めるバリアーおよび複数経路を生成する手
段もまた該明細書中に開示されている。

つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。なお、
下記実施例において、５ＳＰＥとは、標準塩類１０．１
５Ｍ　ＮａＣ１，ｌ　ＯｍＭ　Ｎａ１−１２ＰＯ，およ
びＩ＋ｎＭＥＤＴＡをａするリン酸バッファー（ｐＨ７
，４）である。５×から６×の強度を用いたが、これら
はそれぞれ上記濃度の５倍および６倍の濃度を有する。

デンハルト溶液（１ｘ）は、００２％フィコール、０゜
０２％ポリビニルピロリドンおよび０　、２　Ｍ９／肩
ＱＢＳＡからなる。３×から５×の強度のデンハルト溶
液は、それぞれ上記濃度の３倍から５倍の濃度を有する
。

Ｘ入り」− ３０−ｍｅｒｓの迅速なハイブリダイゼーション：Ａ　
ストリップ上の捕捉ゾーンの調製：０４５ミクロンのニ
トロセルロース膜のシート（ノユライヒャー＆シュエル
、キーン、ＮＨ）（６３Ｘ２２ｃｆｆ）を二重蒸留水（
ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ）中で
前辺て湿ら仕、ついで１Ｍ酢酸アンモニウム中に浸漬し
た（１分間）。この湿った膜を１Ｍ酢酸アンモニウム中
で飽和したファツトマン（ｗｈａｔｍａｎ）　３　Ｍ　
Ｍ紙上に置き、シュライヒャー＆シュエルスロットプロ
ット（Ｓｌｏｔ　Ｂｌｏｔ）装置中に挿入した。二本鎖
プラスミドＤＮＡ（ＰＳＦ２００ｈクラミゾイア・トラ
コマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａＬ
ｉｓ）の全未解明プラスミドの挿入を含有、スタンレー
・フォーカラ（Ｓｔａｎｌｅｙ　Ｆａｌｋｏｗ）、スタ
ンフォード大学より入手）を０．４Ｎ水酸化ナトリウム
中、６５℃にて６０分間変性し、ついで２Ｍ酢酸アンモ
ニウム（Ｉ容１）を加えて中性にした。

この変性ＤＮＡを直ちに１００μＱアリコートに分配し
、各アリコートが１２．５ｆｍｏｌのｐｓＦ２００１Ｄ
ＮＡおよび約０．５μ９のヒトゲノムＤＮＡを組み立て
スロットプロット装置上の隣接ウェル（０，７５ｃ＋ｙ
幅）に含有するようにした。コントロールとして約８μ
９のヒトゲノムＤＮＡを上記と同様にして変性させ、ス
ロットプロット装置の別のウェルの膜に加えた。穏やか
で間欠性の真空を装置に適用してＤＮＡをニトロセルロ
ースに結合させた。ウェルを１Ｍ酢酸アンモニウム（１
５０μＱ）で濯いだ。膜を装置から除去し、空気乾燥し
、８０℃で２時間焼き付けて（真空下）一本鎖ＤＮＡを
固定化した。

ストリップ（約０．６×５．５ｃｍ）を、捕捉ＤＮＡ（
ｌ　Ｏｆｍｏｌ　ｐＳＦ　２００１または６．４１ｔ９
ヒトゲノム）を固定化した４つの「捕捉」ゾーンが該ス
トリップの第一末端から約１４．２３．３２および４１
１の位置になるようにニトロセルロースシートからカッ
ティングした（第１図）。

Ｂ、標識プローブの適用： 第一末端から約１０ｘｙｔにあるプローブゾーンにおい
て、すべてのストリップに＆　ｌ　Ｇ　Ｏｒｍｏｌの４
種の合成オリゴヌクレオチドプローブ（アムゲン（ＡＭ
ｇｅｎ、　Ｉ　ｎｃ、、）、サウザンドオークス、ＣＡ
）を含浸させた。該プローブは、ニトロセルローススト
リップ上の捕捉ゾーンに固定化したクラスミゾイア・ト
ラコマティス未解明プラスミドＤＮＡ配列に相捕的であ
った。該プローブオリゴヌクレオチドの配列は以下のよ
ってあった。

５゛３゛ （ａ）　　ＧＧＧ　　ＴＴＡ　　ＣＡＡ　　ＡＡＧ　　
＾丁ｆｉ、　　ＣＧＴ　　ＧＡＡ　　ＴＴＣＴＴＡ　　
ＡＧ（ｂ）　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＡＡＣ
ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＡＡＣＣＡＡ（ｃ）　ＡＡＡ　ＴＴＡ
　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　
ＧＡＡ　ＣＣＴ（ｄ）　　ＡＡＧ　ＡＡＣＡＣＡ　　Ｔ
ＴＣＴＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＡＧ　　Ｃ丁Ｔ　　ＴＧＴ
　　ＣＴオリゴマープローブを５°末端で放射性核種３
２Ｐにて標識し、５Ｘデンハルト溶液（０，３μＱ；各
０．７μＭ）中で適用した。ついで、このストリップを
室温にて１１やかな空気流中で５分間乾燥させた。

Ｃ，クロマトグラフィーハイブリダイゼーシジン：非コ
ーテイングストリップの第一末端を５×デンハルト溶液
、６ｘＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）、１００μ２／ズｅのサケ精子ＤＮＡおよび２０
％ホルムアミドを含有するクロマトグラフィー溶媒（脱
イオン）（約１５０μＱ）中に浸漬することにより、ハ
イブリダイゼーション条件下で上昇クロマトグラフィー
を開始した。

クロマトグラフィーは、溶媒の蒸発を最小にするために
ガラス管下で３７℃にて垂直で行った。溶媒フロントが
オリゴヌクレオチドプローブゾーンを通過すると４種の
オリゴマープローブが可動にされ、これらオリゴマーは
ついで溶媒フロシトとともに移動していった。クロマト
グラフィーか進行していくにつれて、溶媒フロントはス
トリップ上の４つの捕捉ゾーンのそれぞれに逐次接触し
ていった。

第１図に示すように、プローブは、捕捉ゾーン中の相捕
的な捕捉Ｄ　Ｎ　Ａ配列との特異的ハイブリダイゼーシ
ョンにより、各捕捉ゾーンの中央領域に固定化された。

未反応の（すなわちハイブリダイズしなかった）オリゴ
ヌクレオチドプローブは、クロマトグラフィー溶媒の移
動により該捕捉ゾーンからストリップの上端へ運ばれ、
かくして捕捉ゾーンの本来的な洗浄が可能となった。溶
媒フロントは約３０分でストリップの上端に達した。つ
いで、ストリップを溶媒だめから除き、空気乾燥し、コ
ダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ　Ａ　Ｒ−５または５Ｂ−５フ
イルムを用いたオートラジオグラフィーに供した。捕捉
ゾーンにおけるハイブリダイゼーションシグナルの定量
は、ストリップのデンシトメータースキャンかまたは切
り取った捕捉ゾーンの液体ンンチレーンヨンカウントに
より行った。そのデータを下記第１表に圭とめである。

コントロールとして捕捉ゾーン中にヒト胎盤ＤＮＡを含
有するニトロセルロースストリップを同一実験条件下で
クロマトグラフィーを行ったところ、捕捉ゾーンにハイ
ブリダイゼーションシグナルは示されなかった。

Ｄ、ハイブリダイゼーション動力学お上び効率：溶媒フ
ロントにおけるプローブと捕捉ゾーン中の捕捉ＤＮＡと
の間の相互反応時間は、約０．２〜２分と観裏された。

これは、ダーシーの法則に従い、溶媒の粘度、ニトロセ
ルロースの多孔性、およびストリップの第一末端からの
捕捉ゾーンの距離に依存する。

第１表は、得られた実験的ハイブリダイゼーション効率
を示す。捕捉１）　Ｎ　Ａに対してプローブがモル過剰
である上記条件下では、ＤＮＡ：ＤＮＡ／＼イブリダイ
ゼーション効率はプローブゾーンと捕捉ゾーンとの間の
距離により有為に変化しない。

第１表に示したハイブリダイゼーション効率の条件は、
下記のとおりである。

捕捉ＤＮＡ；ＩＯｆｍｏｌのｐｓＦ２００１を添加／捕
捉ゾーン 非特異的捕捉ＤＮＡ：６．４μ９のヒトゲノムＤＮＡを
添加／捕捉ゾーン プローブＤＮＡ：各１５７　ｒｍｏｌの４種の［３！ｐ
］オリゴヌクレオチド（２７−ｍｅｒｓ〜 ３０−ｍｅｒｓ） 比活性：　２　、６　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ／　ｆｍｏｌ
（以下余白） 実施例２ ７４−ｍｅｒｓの迅速なハイブリダイゼーション＝７４
−ｍｅｒｓの均一な移動および迅速なハイブリダイゼー
ションのための条件は、下記に述べる変更を例外として
実施例１に記載したものと同じである。未処理の乾燥し
た５、０ミクロンのニトロセルロース膜に、上記のよう
にスロットプロット装置中にて捕捉ＤＮＡを含浸させた
。−末鎖捕捉ＤＮＡ（Ｍｌ　３ｍｐｆ　８（１）、５０
　ｆｍｏｌ、ファルマンアＬＫＢ）を水酸化ナトリウム
および酢酸アンモニウム溶液（１０μＱ）中にてスロッ
トプロット装置の選択したウェルに加えた。上記実施例
１に記載したようにしてアルカリ変性させたコントロー
ルＤＮＡとしてのヒトゲノムＤＮＡ（約５μｇ）を同様
にして隣接するウェルに加えた。それゆえ、各ストリッ
プは、該ストリップの第一末端からそれぞれ約１８ｉｘ
および２７ｘｍのところに１つの特定の捕捉ゾーンおよ
び１つのコントロール捕捉ゾーンを含んでいた。

Ｍ　１３ｍｐｌ　８（１）の普遍クローニング部位に相
補的なオリゴヌクレオチドプローブ（すなわち７４−ｍ
ｅｒｓ）を公知の方法を用いて合成した［たとえば、カ
ルサーズ、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０：２８１〜２８５（
１９８５）を参照］。ヌクレオチド配列は下記のとおり
であった。

５°　ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＣＴＴＧ
　ＣＡＴ　ＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＴＡ
　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＣＣＧＧ　ＧＴＡ　ＣＣＧ　Ａ
ＧＣＴＣＧＡＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＡ　ＴＣ３’ 上記プローブＤＮＡ（１５（Ｂｍｏｌ）を５×デンハル
ト溶液（０，３μ＋２）中にてストリップの第一末端か
ら約１０ｚｘのところに加えた。このストリップを、５
％ポリエチレングリコール（ＭＷ３００）、６ＸＳＳＰ
Ｅ（１）Ｈ７，４）、０．１％ＳＤＳおよび３０〜５０
％ホルムアミドからなるクロマトグラフィー溶媒（１５
０μａ）中に直ちに浸漬した。ストリップを実施例１の
ようにして室温にて逆さにしたガラス管中で展開した。

溶媒フロントがストリップの上端に達したとき、すなわ
ち約１０分でクロマトグラフィーが終了した。この場合
もシグナルは捕捉ゾーンの位置とは無関係で、非常に迅
速なハイブリダイゼーション動力学が示された。

本実施例の５ミクロンストリップでは孔径が一層大きい
ためにクロマトグラフィー流が約６倍速かったという事
実にもかかわらず、実施例１の０．４５ミクロンストリ
ップで得られたものに匹敵するハイブリダイゼーション
効率が得られた。

実施例３ 復改捕捉ゾーン上での１２−ｍｅｒｓの特異性：本実施
例では、野性型（ｗｔ）かまたはスパースファー　（ｓ
ｐａｒｓｅ　ｆｕｒ）（ｓｐＤ　マウスからのオルニチ
ントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子の相補的Ｄ
ＮＡ（ｃＤＮＡ、１２キロベース）を、トーツス・カス
キー（Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｃａ５ｋｅｙ）らの方法［ベ
イラー・カレッジ・オブ・メディスン（Ｂａｙｌｏｒ　
Ｃｏｌｔｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ヒユース
トン、ＴＸ］に従いプラスミドｐＴＺＩ９Ｒ（ファルマ
シア、ＬＫＢ）中にクローニングした。この組換えプラ
スミドを０．４Ｎ水酸化ナトリウム中で変性させ、２Ｍ
酢酸アンモニウム中で中性にした。約４０　ｆｍｏｌの
ＤＮＡを第２図に示すようにストリップの捕捉ゾーンに
加えた。各ストリップは、該ストリップの下端すなわち
第一末端からそれぞれ１８■、２７■および３６屑ｘの
位置にある（　１　）ｗｔ変異体マウスからのクローニ
ングｃＤＮＡ、（２）ａｐｒ変異体マウスからのクロー
ニングｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　％および（３）プラスミドｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡを含む３つの捕捉ゾーンを有するように
形成した（第２図）。

ｖｔ捕捉ＤＮＡまたはｓｐｆ捕捉ＤＮＡのいずれかに相
補的で３１Ｐで標識した対立遺伝子特異的オリゴヌクレ
オチド（ＡＳＯ）プローブを、トーツス・カスキーらの
方法（ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン、ヒユー
ストン）に従って合成した。

ヌクレオチド配列は以下のとおりであった。

（ａ）５’　　ＣＡＡ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＧＴＣ３’　
　＝　　ｗｔプローブ（野性型ＯＴＣｃＤＮＡと完全に
相補的）（ｂ）５°　ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＡＡＴ　ＧＴＣ
３’　　＝　　ｓｐｒプローブ（スパースファーＯＴＣ
ｃＤＮＡと完全に相補的）これら２つのＡＳＯプローブ
は、内部位置においてわずかに１つのヌクレオチドが互
いに異なっている（すなわち、５゛末端から６番目の塩
基対がＧまたはｒ）。ｈｔプローブ（５０ｆｍｏｌ）を
５×デンハルト溶液（０，３μＱ）中にてストリップ＃
１の下端から約１０ｊＩｍのところにあるプローブゾー
ンに加えた（第２図参照）。ｓｐｒプローブ（５０ｆｍ
ｏｌ）もまた同様にして他のストリップ（＃２）に加え
た。

クロマトグラフィーを５％ポリエチレングリコール（３
００ＭＷ）および６ｘＳＳＰＥ（ｐＨ７，４）中、室温
にて行った他は実施例１と同じ条件で行なった。

第２図に示すように、ストリップ＃１（放射性標識ｗｔ
プローブを含有）は、第一の捕捉ゾーン（ｗｔｃＤＮＡ
を含む）では特異的なハイブリダイゼーションシグナル
を示したが、ｓｐｆ捕捉ゾーンまたはｐＢＲ３２２（コ
ントロール）捕捉ゾーンではシグナルは示されなかった
。放射性標識ｓｐｆプローブでクロマトグラフィーを行
ったストリップ＃２は、ｓｐｆ捕捉ゾーンおよびｐＢＲ
３２２ＤＮＡ捕捉ゾーンでは特異的なハイブリダイゼー
ションシグナルが示されたが、ｗｔ捕捉ゾーンではシグ
ナルは示されなかった。下記のようにｓｐｆ　ｌ　２−
ｍｅｒｓの最初の９つの３′末端ヌクレオチドとｐＢＲ
３２２ＤＮＡ配列中の２つの別々の９ヌクレオチドの連
なりとが偶然にも完全に相補的であったことが、これら
２つのＤＮＡの間での「交差ハイブリダイゼーション」
を引き起こした。

（Ａ）ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（位置＃　Ｉ　９６９）ｓｐ
「プローブ （Ｂ）ｌ）ＢＲ３２２ＤＮＡ（位置＃４３１１）ｓｐｆ
プローブ ｖｔ　Ｉ　２−ｍｅｒｓと上記２つのｐＦ３Ｒ３２２Ｄ
ＮＡ配列の間では下記のように１対の内部塩基対が相補
的でなかっただけで、１２塩基対の二本鎖を不安定にす
るのに充分であった。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（位置＃１９６９）５”・　ＧＡＣ
ＡＴＴａＡＣｇｃｔ　”・３゜３’　　　　ＣＴＧＴＡ
ＡｇＴＧａａｃ　　　５’豐もプローブ それゆえ、ストリップ＃２では第三の（ｐＢＲ３２２）
捕捉ゾーンでハイブリダイゼーションシグナルが検出さ
れなかった。

１−記のように、ハイブリダイゼーション条件下、室温
にてＡＳＯプローブ（約１２ヌクレオチド）をクロマト
グラフィーにかけたときに、高度の特異性が達成される
。本実施例において理論値の１％未満のハイブリダイゼ
ーション効率が観察されたことは、短いＤＮＡ二本鎖（
すなわち約１２塩基対）が相対的に非常に不安定である
（低Ｔ＋＋１）ことによるものと思われる。

本実施例はまた、単一のストリップ上に複数の捕捉ゾー
ンを設け、各ゾーンにそれぞれ異なる相Ｖ的配列のため
の捕捉配列を固定化することができることを示している
。これらの捕捉配列は、充分な相同性を有するプローブ
配列のみとハイブリダイズし固定化する。

実施例４ プローブＤ　Ｎ　Ａ滞留時間がハイブリダイゼーション
に及ぼず影響： 本実施例では、実施例１に記載したように、０゜４５ミ
クロンニトロセルロース膜のソート・（シュライヒャー
＆シュエル；６．３　Ｘ　２２ＣＪｌｌ）を二重蒸留水
、ついで１Ｍ酢酸アンモニウム中で前辺て湿らせ、つい
でスロットプロット装置中に置いた。

プラスミドｐｓＦ２００１（クラミゾイア・トラコマテ
ィスの未解明プラスミドＤＮＡの挿入を含む）を、上記
膜に加える直前に変性し中性にした（実施例Ｉ参照）。

この変性ＤＮＡを、それぞれ６２ｆｍｏｌのｐｓＰ２０
０１　　ＤＮＡと約１ｕｇのヒト胎盤ＤＮＡを含む約１
２０μｇのアリコートにてスロットプロット装置のウェ
ル（０，７５ｃｍ、幅）に分配した。コントロールとし
て、約６μ９のヒト胎盤ＤＮＡを上記のようにして変性
し、ついでスロットプロットの独立のウェルに加えて非
特異的な捕捉ＤＮＡコントロールとした。間欠的に穏や
かな真空を適用することによりＤＮＡを該膜に吸着さ仕
、ついで１Ｍ酢酸アンモニウム（１００μρ）で各ウェ
ルを濯いだ。この膜を８０℃にて２，４時間焼き付ける
ことによりＤＮＡを固定化した。

第３図に示すように、０．６Ｘ５，３ｃ＋ｖのストリッ
プ（「艮」）と０．６Ｘ３．７ｃｍのストリップ（「短
」）を上記膜から切り取り、各ストリップに変性ｐＳＦ
２００１　　ＤＮＡを含む２つの捕捉ゾーンを設けるよ
うにした。第一の捕捉ゾーンｌ　８（１）および第二の
捕捉ゾーンｔ８（２）は、それぞれ両ストリップの上端
１６から２　、５　ｃｘおよびｌ　、　７　ｃｙｔのと
ころにあり、下端１４から第一の捕捉ゾーンまでの距離
が短ストリップと長ストリップとの間で異なるようにし
た。

第一の捕捉ゾーンから０　、４　ｃｍ下方のところにあ
るプローブゾーン２２にて、ストリップに固定化ｐｓＦ
２００１　　ＤＮＡに相補的な４種の３２Ｐ標識オリゴ
ヌクレオチド（実施例１と同様：それぞれ約６０　ｆｍ
ｏｌ）を含浸させた。プローブＤＮＡを５×デンハルト
溶液（０，３μｇ）中にてストリップに加え、穏やかな
空気流中で３分間乾燥させた。

下端１４を実施例！と同じ（担体ＤＮＡを含まないこと
を例外として）操作バッファー２０中に浸漬し、上昇ク
ロマトグラフィーを開始した。溶媒フロントがプローブ
ゾーンを通過するとプローブＤＮＡが可溶化され可動に
された。この溶媒フロントのところにあるプローブＤＮ
Ａは、両捕捉ゾーンの中央領域（約２１、幅）に移動し
ていった。

それゆえ、捕捉ゾーンのこの領域における有効な捕捉Ｄ
ＮＡニブローブＤＮＡ比は、３．２：Ｉ〜４゜５：１の
範囲と計算される（第１表のように）。ダーシーの法則
に基づき、捕捉ゾーンにおけるプローブＤＮＡの滞留時
間を計算し、プローブか捕捉ゾーンの下端に最初に接触
してから捕捉ゾーンの上端にある未反応プローブＤＮＡ
ｈ＜離れていくときまでの時間を表すものと決定された
（第２表）。

溶媒フロントがストリップの上端１６に達したときにク
ロマトグラフィーは停止した（すなわち、「長」ストリ
ップについては約２７分、「短」ストリップについては
約１３分の展開時間）。クロマトグラムをオートラジオ
グラフィーに供した。捕捉ゾーンにおけるハイブリダイ
ゼーションを液体シンチレーションカウントにより定量
した。

捕捉ゾーンにおけるハイブリダイゼーションの効率は、
第１表に記載したのと同様の仕方で観察されたカウント
数を期待されたカウント数（接触領域での１００％のハ
イブリダイゼーション効率における値）で除して計算し
た。「長」ストリップと「短」ストリップの対応捕捉ゾ
ーンにおけるシグナルを比較したところ、対応捕捉ゾー
ンでの溶媒フロント流速（すなわち滞留時間）の違いに
もかかわらず同等の効率であることがわかった（第２表
）。

第２表のデータを第４図にグラフで示す。

第２表（ハイブリダイゼーション効率に及ぼす溶媒流速
（注）＊：多孔質固相支持体上の溶媒フロント移動の挙
動についてダーシーの法則を用 いて計算。

＊＊：３つの試料の平均値士標準偏差 実ｆ血例５ クラミゾイアＤＮＡについてのストリップハイブリダイ
ゼーションアッセイ（ホルムアミド滴定）：本実施例で
は、単一経路のポリヌクレオチドノ＼イブリダイゼーシ
コンアッセイ装置を、幅が５１肩、長さが５５１１１！
、厚さが約０　、１　ｙｓｍの微細多孔質（０゜４５ミ
クロン）ニトロセルロース物質から構築した。ストリッ
プの第一末端から約２３Ｒｍのところにある捕捉ゾーン
（第三ゾーン）に、５０ｍＭＮａ１−１．ＰＯ，バッフ
ｙ−（ｐＨ７、４）および２ｍＭＥＤＴＡ中に約５ｆｍ
ｏｌの線状熱変性ＤＮＡ（実施例１のようにクラミゾイ
ア・トラコマテイスの未解明プラスミドの挿入を含む組
換えプラスミド）を含む捕捉試薬溶液（約１．５μＱ）
を加えた。コントロールとして、ヒトゲノムＤＮＡ（１
０μｇ）を別のストリップ上の捕捉ゾーンに全く同様に
して加えた。ついで、これらストリップを空気乾燥し、
８０°Ｃで２時間焼き付けた。

捕捉試薬を含むストリップを密封バッグ中に３７℃にて
３０分間入れた後に空気乾燥することにより、これらス
トリップに５０ｍＭ　ＮａＨｔＰＯ４および２ｍＭＥＤ
ＴＡのブロッキング溶液を含浸さ　せノニ。

ストリップの第一末端から約７■のところにあるプロー
ブゾーンに、５０ｍＭ　ＮａＨ，ＰＯ，，２ｒ＠ＭＥＤ
’ｒＡおよび、一般に捕捉試薬のヌクレオチド配列の一
部に相補的なヌクレオチド配列を有する４種の３″Ｐ標
識オリゴヌクレオチド（２７−ｍｅｒｓ　〜３０−５ｅ
ｒｓＸ各５０　ｆｍｏｌ）を含む溶液（０，５μＩ２）
を含浸させた。各相補的ヌクレオチド配列の標識は、■
Ｐ放射性標識およびＴ４キナーゼで処理することにより
５゛末端で行なった。この相補的ヌクレオチド配列物質
を、すべてのストリップ上のプローブゾーンへ空気乾燥
させた。

この装置を、５ＸＳＳＰＥ溶液、３×デンハルト溶液お
よび種々の濃度（すなわち０〜４０％）の脱イオンホル
ムアミドを含むクロマトグラフィー溶媒（約１７５μρ
）中へ浸漬することによりアッセイを行なった。ストリ
ップを３７℃でインキュベートしている間に溶媒は装置
の上方へ進んでいき、相補的ヌクレオチド配列を可溶化
しクロマトグラフィーにより捕捉ゾーンの方まで運んで
いった。

捕捉ゾーンに到達すると、該ゾーンに固定化された捕捉
試薬の相補的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーシ
ョンに誹り相補的ヌクレオチド配列は固定化された。ハ
イブリダイズしなかった物質は、クロマトグラフィー溶
媒移動により捕捉ゾーンから除かれた。溶媒フロントが
ストリップの上端に到達するまで、これらストリップお
よびクロマトグラフィー溶媒を３７℃にてインキュベー
トし、上端に到達したときにストリップを溶媒から除き
空気乾燥した。このストリップをコダックＸＡＲ−５フ
ィルムを用いたオートラジオグラフィーに供した。この
フィルムを露光するとストリップ上の対応する位置にハ
イブリダイゼーションシグナルが観察された。

種々の濃度のホルムアミドを用いて観察した結果、２０
％またはそれ以上の濃度がコントロール（ヒトゲノムＤ
ＮＡ）捕捉ゾーンにおけるハイブリダイゼーションシグ
ナルを排除することがわかった。

実施例６ サンドイツチハイプリダイゼーンヨンアツセイ；本実施
例においては、単一経路のポリヌクレオチドハイブリダ
イゼーションアッセイ装置を構築し使用した。微細多孔
質ニトロセルロース物質（幅：約５１、長さ：約５５＋
ｙｘ、厚さ：約０　、１　ａｍ）の１片を、厚さが約０
．１１の不活性ミラー支持体シート上に型取った。この
ストリップを５ＸＳＳＰＥ／＜ッファー溶液（ｐＨ７，
４）で前以て湿らせた。

ストリップの第一末端から約２７ｊＩｘのところにある
捕捉ゾーンに、分析対象物であるポリヌクレオチドのヌ
クレオチド配列の第一部分と一般に相補的な線状熱変性
ＤＮＡ（約１５　ｒｍｏｌ）を５ＸＳＳＰＥバツフアー
（ｐＨ７，４）中に含む捕捉試薬溶液（約１．５μＱ）
を加えた。ついで、このストリップを空気乾燥し、８０
℃にて２時間焼き付けた。

ついで、捕捉試薬を加えたストリップ物質を５ＸＳＳＰ
Ｅバツフアー溶液中で前以て湿らせ、５ＸＳＳＰＥバツ
フアーおよび５×デンハルト溶液を含むブロッキング溶
液を含浸させた。このストリップを密封バッグ中に６５
℃にて２時間入れ、ついで空気乾燥させた。

ついで、このストリップの第一末端から７ｊ１１にのと
ころにあるプローブゾーンに、分析対象物であるポリヌ
クレオチドのヌクレオチド配列の第二部分と一般に相補
的なヌクレオチド配列を有する線状変性ポリヌクレオチ
ドを含む相補的ヌクレオチド配列物質（約！　ＯＯｒｍ
ｏｌ）を含浸させた。この相補的ヌクレオチド配列は、
３１ｐ放射性標識およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
で処理することにより５°末端を標識しである。ついで
、この相補的ヌクレオチド配列物質を空気乾燥し、第一
ゾーンと捕捉ゾーンとの間の第二ゾーン部分に間隙を有
するミラーカバープレートをニトロセルロースクロマト
グラフィー物質上に置いた。

本発明のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイ装置の第二ゾーンに分析対象物含有試料を加えてア
ッセイを行なった。ついでカバータブを第二ゾーンの上
に置き、アッセイ装置を５×５ＳＰＥバツフアー（ｐｉ
（７，４）、３×デンハルト溶液および５０％脱イオン
ホルムアミドを含むりロマトグラフィー溶媒（約１７５
μｍ２）中に浸漬した。ストリップを３７℃にて（ガラ
ス管の下で垂直に）インキュベートする間に溶媒は装置
の上方へ進んでいき、相補的ヌクレオチド配列を可溶化
し捕捉ゾーンの方へクロマトグラフィーにより運んでい
った。第二ゾーンに到達すると、クロマトグラフィー溶
媒は分析対象物含有試料を可溶化し捕捉ゾーンの方まで
運んでいった。相補的ヌクレオチド配列と試料成分との
相対移動度は、相補的ヌクレオチド配列が捕捉ゾーンに
到達する前に分析対象物が捕捉ゾーンに配置され溶媒移
動に対して固定化されるような関係にあった。さらに、
相補的ヌクレオチド配列と反応し得る妨害試料成分およ
びハイブリダイズしなかった試料成分は、相補的ヌクレ
オチド配列がクロマトグラフィーにより捕捉ゾーンに運
ばれる前に捕捉ゾーンから除かれた。

捕捉ゾーンに到達すると、試料中の分析対象物よ、該ゾ
ーンに固定化された捕捉試薬と第二のヌクレオチド配列
においてハイブリダイズすることにより固定化された。

ハイブリダイズしなかった物質は、相補的ヌクレオチド
配列が到達する前にクロマトグラフィー溶媒移動により
捕捉ゾーンから除かれた。捕捉ゾーンに到達すると、放
射性標識相補的ヌクレオチド配列自身が分析対象物の第
一のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることにより
固定化された。溶媒フロントがストリップの上端に到達
するまでストリップおよびクロマトグラフィー溶媒を３
７℃にてインキュベートし、上端に到達した時点でスト
リップを溶媒から除き、空気乾燥した。ついで、このス
トリップをコダックＸＡＲ−５フィルムを用いたオート
ラジオグラフィーに供した。試料物質中に分析対象物が
存在することは、捕捉ゾーンで接触させたフィルムを露
光することにより示された。本実施例の装置の変更例と
しては、酵素標識および検出系を利用した「ダイオード
」、「トリオード」および「テトロード」装置などを挙
げることができる。

実施例７ 改良サンドイツチハイブリダイゼーシヲンアッセ下記条
件の変更を行なった他は実施例６の手順を繰り返した。

コントロールとしてのストリップをさらに調製し、それ
らの捕捉ゾーンにヒトゲノムＤＮ’Ａ（約２μｇ）を含
ませた。これらストリップをＮａＣ１成分を含まない溶
液、たとえばガラス蒸留水、または５×デンハルト溶液
または５×ＰＥ（すなわち、ＮａＣ１を含まない５ＳＰ
Ｅ）中で前辺て湿らせた。ストリップを５Ｘデンハルト
溶液または０５〜２．０％アルカリ変性カゼインでブロ
ッキングした。実施例１のようにしてストリップのプロ
ーブゾーンに４種のオリゴヌクレオチド（６約１００　
ｆｍｏｌ）を加えた。操作溶媒系としては、２０〜４０
％ホルムアミドを用いた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、幾つかの捕捉ゾーンを有するストリップから
なる本発明の装置を示す模式図：第２図は、ｗｔ捕捉プ
ローブ、ｓｐｆ捕捉プローブおよびｐＢＲ３２２捕捉プ
ローブ（コントロール）を各捕捉ゾーンに固定化さ仕漂
識ｗｔプローブ（ストリップ＃１）または標識ｓｐｆプ
ローブ（ストリップ＃２）をそれぞれプローブゾーンに
含む２つのストリップについてアッセイを行なった結果
を示す模式図； 第３図は、プローブＤＮＡ滞留時間がハイブリダイゼー
ションに及ぼす影響を調べるための「長」ストリップ（
ストリップ＃ｌ）および「短」ストリップ（ストリップ
＃２）を用いた本発明の装置を示す模式図； 第４図は、実施例４で得られた第２表の結果について、
滞留時間（分）に対してハイブリダイゼーション効率を
プロットして示すグラフである。 （図面の主要符号の説明） １０；本発明の装置、１２ニストリツプ、１４：第一末
端、１６：第二末端、１８：捕捉ゾーン、２０：クロマ
トグラフィー溶媒（操作バッファー）、２２ニブローブ
ゾーン 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ代　理　人　弁
理士　青　山　　葆ほか１名第 図 第 図 第 図 滞 留 時 間 （分） 第 図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）固相上でヌクレオチド配列のハイブリダイゼーシ
   ョンを行う方法であって、 （ａ）毛管作用により溶液を移動させることのできる多
   孔質媒体上で、該媒体の接触部位から遠位にある部位に
   一本鎖ヌクレオチド配列を固定化し、ついで （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、該遠位部位を
   相補的ヌクレオチド配列を含有するかまたは含有すると
   思われる溶液と接触させ、その際、該相補的ヌクレオチ
   ド配列は毛管作用により該遠位部位へ移動されたもので
   あり、該一本鎖ヌクレオチド配列および該相補的ヌクレ
   オチド配列の相補的塩基対間でハイブリダイゼーション
   を起こさせる ことを特徴とする方法。
2. （２）相補的ヌクレオチド配列を含有するかまたは含有
   すると思われる溶液を該媒体と接触部位にて接触させ、
   遠位部位へ溶液にて移動させる請求項（１）に記載の方
   法。
3. （３）相補的ヌクレオチド配列を可動にし遠位部位へ溶
   液にて移動させることができるように、接触部位と該遠
   位部位との間の位置にて該相補的ヌクレオチド配列を該
   媒体上に乾燥させる工程をさらに含む請求項（１）に記
   載の方法。
4. （４）相補的ヌクレオチド配列を可動にし遠位部位まで
   移動させることのできる溶媒に接触部位を接触させる工
   程を含む請求項（３）に記載の方法。
5. （５）相補的ヌクレオチド配列を検出する工程を含む請
   求項（１）に記載の方法。
6. （６）溶液フロントが遠位部位と約１０分未満の間接触
   するような速度で相補的ヌクレオチド配列を含有する溶
   液を該媒体中を移動させる請求項（１）に記載の方法。
7. （７）溶液フロントが遠位部位と約２分未満の間接触す
   るような速度で相補的ヌクレオチド配列を含有する溶液
   を該媒体中を移動させる請求項（１）に記載の方法。
8. （８）可溶性の一本鎖ヌクレオチド配列を固相ハイブリ
   ダイゼーションするための装置であって、接触部位； 該接触部位から遠位にあり前置て決定した可溶性ヌクレ
   オチド配列に相補的な一本鎖ヌクレオチド配列を固定化
   した遠位部位；および ハイブリダイゼーション条件下で該前置て決定した可溶
   性ヌクレオチド配列を含有する溶液を該遠位部位まで移
   動させてこれらヌクレオチド配列の相補的塩基対間でハ
   イブリダイゼーションを起こさせるための毛管手段 を有する多孔質媒体からなることを特徴とする装置。
9. （９）接触部位と遠位部位との間の位置にて媒体上に乾
   燥させた可溶性ヌクレオチド配列をさらに含み、該溶液
   により該可溶性ヌクレオチド配列を可動にし毛管作用に
   より該遠位部位まで移動させる請求項（８）に記載の装
   置。
10. （１０）多孔質媒体が、孔径が約５．０ミクロンのニト
    ロセルロースのストリップである請求項（８）に記載の
    装置。