JPH02283300A - Ｄｎａプローブ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプローブ、更に詳しくは生きている試料又は材
料（ｌｉｖｉｎｇ　＠ａｔｅｒｉａｌ）を特徴付け（Ｃ
ｈａｒａｃ−ｔｅｒｉｚｅ）する即ちそれの特有性質か
ら識別する探索用に有用である高変動性ＤＮＡを含むプ
ローブに関する。

周知のように、生物体のゲノムは１つ又はそれ以上のＤ
ＮＡ鎖からなる。これらのＤＮＡ鎖は。

生きている細胞の機能を遂行する蛋白質をコードして作
り畠す複数の遺伝子を含有する。前記遺伝子と組合わさ
って、その上流と下流には制御領域が夫々存在し、これ
らの制御領域は例えば遺伝子の鋤らきを始動させたり、
停止させたりするのに役立ち得るものである。遺伝子や
制御配列に含まれる上記のようなりＮＡの有する機能は
、少なくとも原則の点では理解されている。しかしなが
ら、上記のような遺伝子や制御配列に含まれるＤＮＡは
、高等生物のゲノム中に存在するＤＮＡ全体のうちの全
く僅かな一部を成しているのにすぎない。

はとんどの生物体においては、全ＤＮＡのうちの大部分
は遺伝子又は制御配列という部分を成していない、遺伝
子や制御配列を成していないＤＮＡの大部分の機能は未
だ理解されておらず、事実何らかの重要な生物学的な機
能も有しないかもじれない、そのような大部分のＤＮＡ
は１つの世代から次の世代へと単にｖＩ製されるだけで
あって、それは、あたかも、原本の紙の上の無意味な汚
れを複写機が複写するようであるかもしれない、このよ
うに機能をもたないかもしれないＤＮＡのうちの若干は
、同一で長さの短かい塩基配列を何回か反復してなる構
造を有する。細胞レベルで生物機能を（外見上は）有し
ないので、上記のように反復された塩基配列をもつ前記
の領域は、それの長さ、構成及びゲノム中の位置の点で
ばらつきが大きく変動性が高い０本明細書では上記のよ
うな長さ、構成１位置が大きくばらつく塩基配列を“高
変動性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）”配列と称する
。タンデム（ｔａｎｄｅｍ）的に反復された配列の２つ
の重要な型として“サテライト″ＤＮＡと゛ミニサテラ
イト”ＤＮＡがあると認められている。サテライトＤＮ
Ａは成る染色体領域１例えばセントロメア（ｃｅｎｔｒ
ｏｍｅｒｅｓ）やテロメアー（ｔｅｒｏｍｅｒｅ）の近
くにあり、しかもその典型例では各々の所在位置で１０
１〜１０’回反復される塩基配列の反復体からなる。

ミニサテライトＤＮＡはを推動物のゲノム中に見出され
ており、しかも各所在位置でより僅かな回数反復される
。塩基配列の反復体（一般に１０又は１００回反復のオ
ーダー）からなるが、それらの所在位置は染色体全体中
に広く分散しでいることが多い。

染色体内の一つの特定の座位（ｌｏｃｕｓ）におけるサ
テライト又はミニサテライトの配列の反復回数もしばし
ば変動する。この結果として、染色体内の各座位で多く
の相異なるアレリックな形態（ａｌｌｅｌｉｃ　ｆｏｒ
ｍｓ）を生じる。そして、そのような座位が数多く存在
するが故にそれらは、−緒になって、−組になったゲノ
ム領域（ｇｅｎｏ■ｉｃ　ｒｅｇｉｏｎｓ）を形成し、
それらゲノム領域は総合的に見ると類縁又は血縁関係の
ない個人あるいは生物個体同志の間では種々様々に広く
変動しているものである。

従って、ｒ高度動性」であるという表現があてはまる。

英国特許筒２．１６６．４４５Ｂ号〔特許権者Ｌｉ５ｔ
ｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国）〕明細書には、ニー　ジエ
イ　シェフリーズ博士（Ｄｒ　ＡＪ　Ｊｅｆｆｒｅｙｓ
）の方法、すなわち、ＤＮＡの高変動性ミニサテライト
の領域から作られた特異化されたＤＮＡプローブを用い
て遺伝子工学的に判定される“指紋”（ｇｅｎｅｔｉｃ
　ｆｉｎｇａｒｐｒｉｎｔｓ）照合を行なう方法が開示
されている。この特異化されたＤＮＡプローブはサザン
プロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析に使用さ
れる。上記のような高変動性ミニサテライトを基本成分
とするＤＮＡプローブは種々様々な多くの個所で供試Ｄ
ＮＡに対してハイブリダイズ化する即ち雑種形成（ｈｙ
ｂｒｉｄｉｓｅ）する、その理由は、そのようなミニサ
テライト領域がゲノム内に在る個所が数多くあり、且つ
種々に異なるからである。従って、一つの未知のＤＮＡ
試料を一つの適当な制限酵素で消化し、電気泳動法で寸
法別に選択し１次いでそれらフラグメントをサザン試験
の標準条件下でミニサテライトプローブとハイブリダイ
ズするすなわち雑種形成させると、多くのバンド（ｂａ
ｎｄｓ）を含む極めて詳細な画像が得られる。そのよう
なバンドの集まりのパターン（ｂａｎｄｉｎｇ　ｐａｔ
ｔｅｒｎ：以下ではバンディング・パターンと言う）は
ゲノムの構造により決定される。

従って、互いに同一である２つのゲノムは互いに同一の
２つのバンディング・パターンを与える。

密接な類縁関係にある２つのゲノム同志は、互いに似て
いるが相異なる２つのバンディング・パターンを与える
からそれら同志の間の類縁関係の度合を評価させること
を可能にする。

前記英国特許筒２，１６６．４４５８明ｍ書（この記載
は本明細書における記載の−・部分として参照される）
にシェフリーズが開示した方法は、類縁又は血縁関係の
ある個体同志（動物の個体同志及び人間の個人同志）の
間にある類似性や相違性をそれら個体のもつＤＮＡに関
する試験に基づいて例証するのに非常に成功して利用さ
れている。特に、この方法は犯行現場に残された犯人の
痕跡遺留物から犯人の身元識別すなわち確認をするため
に司法裁判で使用されており、また親子関係確認の係争
事件（例えば移民（ｉｅ＋ｗｉｇｒａｔｉｏｎ）　Ｌ／
た人間の親子関係確認係争）に使用されている。

英国特許筒２，１６６．４４５号では、ジェフリーズプ
ローブ（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ　ｐｒｏｂｅｓ）がこれ迄に
主に使用されて来た人間や動物と同様に、植物育種にも
応用し得ることを予見している。しかしながら、植物試
料の遺伝子工学的に判定される指紋を作り出す際にシェ
フリーズ　プローブを用いる場合には。

本発明者ら自身の当該分野での研究では、ＤＮＡフラグ
メント塗抹標本（Ｓ■ｅａｒ）に対するバックグランド
のパイプリダイゼーシコン（ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏ
ｎ）の程度が高くなるので、そのバックグランドを越え
てバンドがかすかにしか識別できないので解像力が悪い
、得られたパターンは種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の種類が変
わると多少とも変化するけれども、広範な実用に適しな
いほどにパターンの明瞭性（ｃｌｅａｒ）及び強度が一
般に劣る。

本発明者らは今般、英国特許筒２，１６６．４４５号明
細書に開示されている技術を発展させた方法を見出し、
使用されるＤＮＡプローブとして植物に広範な応用性を
もつプローブであって、しかも短がい＠置時間でも解像
力の良い明瞭なオートラジオグラフを与えることができ
且つ相異なるが類縁性をもつ複数の植物系統の間の差異
を区別又は識別できるＤＮＡプローブを提供する方法を
開発した。

すなわち１本発明の要旨によれば、ターゲットの植物種
から精ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔＩ−調製し、得られた精製Ｄ
ＮＡを複数のＤＮＡフラグメントに切断し、？３られた
複数のフラグメントをクローニングし、クローニングさ
れたフラグメント即ちフラグメントのクローンをジェフ
リーズプローブ（後記に定義した意味を有する）の利用
により選別し、そして該プローブに結合したＤＮＡクロ
ーンの１種又はそれ以上を選択して取り、上記のように
して選択して取った１種又はそれ以上のクローンを増殖
させることからなることを特徴とする。植物の試料をそ
れの特有性により識別するのに有用である高変動性ＤＮ
Ａプローブの製造法が提供される。

また１本発明の別の要旨によれば、植物試料の識別に有
用であり、且つ前記の第一の本発明の方法によって製造
された高変動性ＤＮＡクローンが提供される。

本発明はまた。植物試料の識別（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓａ−ｔｉｏｎ）に有用であって且つ反復タンデム配列
：ＡＧ＾ＧＧＧＣＧＧＣＧＧを有する高変動性ＤＮＡ配
列を包含する。更にまた１本発明は上記高変動性ＤＮＡ
配列と高度（例えば７０％又は８０％）の相同性を有す
る配列も包含する。

更にまた本発明は、上記高変動性ＤＮＡ配列に対しハイ
ブリダイズすなわち雑種形成するのに十分な上記のよう
なりＮＡ配列と成る程度の相同性を有する配列も包含す
る。

２つのＤＮＡ配列のうち、１つのＤＮＡ配列中の各々の
塩基が別のＤＮＡ配列中の対応する各々の塩基とマツチ
（ｍａｔｃｈ）する場合には、それら２つのＤＮＡ配列
は１００％の相同性を有すると言われる。このマツチが
不完全である場合には相同性は１００％よりも低い０本
発明の目的上では１本発明者らは２つのＤＮＡ配列の少
なくとも一方が１８個の塩基の長さを有する２つの類似
したＤＮＡ配列を互いに比較することによってこれら２
つのＤＮＡ配列同士の、相同性を測定する。その場合。

相同性率（％）は、一方のＤＮＡ配列を他方のＤＮＡ配
列と全く同一にするのに必要とされる差異であって、塩
基１００個当りにある差異（塩基の種類の差異、脱落又
は付加をいう）の最少数であると定義される。

本発明者らは、上記の２つの配列が少なくとも７０％、
好ましくは８０％の相同性（前記に定義した意味を表わ
す）を示す場合には一般にそれら２つの配列は雑種形成
すなわちハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｓｅ　）する
ことを見出し、そしてこの知見に基づいて、本発明はま
た１反復したＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧ配列に対し少な
くとも７０％、好ましくは８０％の相同性（前記に定義
した意味を表わす）を有するクローンも包含する。

本発明者らは１本発明の高変動性のＤＮＡ配列が既知の
高変動性ＤＮＡ配列と同じ起源又は同じ機能を有するの
かどうかは確認していないが１本発明の目的に関しては
、それらが類似な仕方で挙動すると認めることで十分で
ある。

本発明は植物外全体に適用することができる。

本発明は作物植物に対して特に有用であり１作物植物は
単子葉植物又は双子葉植物いずれであってもよい、単子
葉作物植物の具体例としては。

イネ、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、ネギ属の種例え
ばタマネギ、マグサ種、トリチケール（丁ｒｉｔｉｃａ
ｌｅ）、モロコシ、キビ及び（特に）トウモロコシ（Ｚ
ａａ　Ｌ！ＬＬ）が挙げられる。双子葉作物植物の具体
例としては、テンサイ、トマト、タバコ、レタス、エン
トウ、インゲン、アルファルファ。

ヒマワリ、ダイズ及びジャガイモ並びにブラシカ（ｂｒ
ａｓｓｉｃａ）種例えばキャベツ、西洋アブラナ及び芽
キャベツが挙げられる。

本発明はまた。喬木や潅木例えば森林 （ｆｏｒｅｓｔｒｙ）種例えば松、モミ、カシ、トネリ
コ。

ブナ、サイモアカエデ；クルミ；園芸作物例えばンゴ、
梨、西洋スモモ、サクランボ、オレンジ。

レモン、バナナ、クロッサスグリ、グズベリーモモ、キ
イチゴ及び果物植物例えばイチビ、並びに観賞植物例え
ばバラが挙げられる。

シェフリーズが用いたプローブは英国特許筒２、１６６
．４５５号明細書の特許請求の範囲第１項に。

以下に示す一般式を有する単離された形か又はクローン
化された形のポリヌクレオチド若しくはそれに対して相
補的な配列のポリヌクレオチドとして定義される。すな
わち、シェフリーズのプローブはヌクレオチド配列の読
み取りの方向が５′→３′の方向で読まれる次の一般式 ％式％（ 〔式中、″′コアー″は前記と同じ方向で読まれる次の
配列 ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＸＧ　　　　（２）ＡＧ
ＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧ　　　　（３）ＧＧＡＧ
ＧＹＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧ　　　　（４）Ｔ（Ｃ）、Ｇ
ＧＡＧＧＡＸＧＧ（Ｇ）ｐＣ（５Ａ）Ｔ　（Ｃ）−Ｇ　
Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　（Ａ）ｑＧ　Ｇ　Ｇ　Ｃ（５Ｂ）
のいずれかの中から選ばれる、６個以上の連続（ｃｏｎ
ｓｅｃｕｔｉｖｅ）するヌクレオチドを有する１つの配
列を表わし、また式中 （１）ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、Ｔは
Ｔ又はＵであり１ｍは０，１又は２であり、ｐは０又は
１であり、９は０又は１であり、ｎは３以上であり； （ｉ）Ｊ及びＫは互いに協同して、前記反復単位（Ｊ・
ファー・Ｋ）内の０〜１５個の追加のヌクレオチドを表
わし； （ｉ）　Ｈ及びＬはそれぞれ、０を表わすか又は前記反
復単位（Ｊ・コアー・Ｋ）の側端に接する即ちフランキ
ング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）する１個以上の追加のヌクレ
オチドを表わし； （−）前記反復単位（Ｊ・ファー・Ｋ）はヌクレオチド
の個数及び種類のいずれについても厳密な反復である必
要はなく〔但し、前記ポリヌクレオチドは認識できるほ
どに反復されたコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配
列（共通塩基配列ともいう）を有するものとする〕； （り“ファー”はまた変異体コアー（ｖａｒｉａｎｔｃ
ｏｒｅ）配列を表わすこともできる（但し、ｎ個の反復
単位の全体中にある実際（ａｃｔｕａｌ）のコアー配列
は前記の式（２）〜（４）、　（５＾）及び（５Ｂ）に
関して前記に定義したような′真（ｔｒｕｅ）″のコア
ー配列と平均して７０％以上の相同性を有するものとす
る）〕を有する。単離された形か又はクローン化された
形のポリヌクレオチド、若しくはそれに対して相補的な
配列をもつ１つのポリヌクレオチド〔但し該ポリヌクレ
オチドは、前記反復単位（Ｊ・コアー・Ｋ）に対応する
１つの配列中では何らかの当面関係のある（ｒｅｌｅｖ
ａｎｔ）程度にまでは開裂させないようなｌｆｉ以上の
制限酵素で１個より多いミニサテライト領域又は高変動
性部位を切断することにより生成された該ミニサテライ
ト領域又は高変動性の部位由来の複数のＤＮＡフラグメ
ントに対してハイブリダイズすなわち雑種形成できるポ
リヌクレオチドとする〕である。

従って１本明細書において°″シエフリーズプローブ″
いう用語は上記に定義したプローブ、若しくは英国特許
筒２，１６６．４４５８号明細書に別の表現法で開示又
は特許請求されたプローブを意味する。

また１本発明の別の要旨によると、供試植物試料から精
製ＤＮＡをｔＡｌ！ｔ、、得られた精ｌｌＤＮＡを選択
した制限酵素で切断し、得られた切断ＤＮＡを標準的な
分離法で一連の並列されたＤＮＡフラグメントとして相
互に分離し、得られた一連の並列されたフラグメントを
本発明の方法によって製造された高変動性ＤＮＡプロー
ブの１つを利用して探索し、得られた前記ＤＮＡプロー
ブと前記フラグメントとのハイブリダイゼーション物を
可視化し、そして得られた可視のパターンを識別済みの
既知の植物試料から同一の調製条件下で同一の制限酵素
と同一のプローブを用いて得られた対応の可視のパター
ンと比較することからなることを特徴とする。植物試料
をそれの特有性により識別する方法が提案される。

一般に、上記の比較によると、互いに比較された上記２
つのパターン間で認められる同一性と類似性に応じて、
供試植物試料と事前に識別しておいた既知の植物試料と
の間の同−性又は類似性の程度を推定することが可能に
なる。このような比較は、また供試植物材料かへテロ接
合性であるか又はホモ接合性であるかどうかを指示する
こともできる。

本発明者らは、供試植物試料として、同じ属（ｇｅｎｕ
ｓ）の植物に由来した高変動性プローブを用いることに
よって特に良好な結果が得られることを見出した０例え
ばトウモロコシ由来の高変動性プローブは未知のトウモ
ロコシ植物を識別し、すなわちそれの特有性を見分け（
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ）て。

それら未知のトウモロコシ植物を既知のトウモロコシ系
統と比較できる。同様のことがイネでも行なうことがで
きる０本発明の別の要旨によれば、本発明はジェフリー
ズプローブの代わりに本発明の方法で製造したプローブ
を用いて前記植物に類似の植物を識別（ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｓｉｎｇ）するのに有用な高変動性ＤＮＡプロー
ブの製造法を包含する。

本発明のプローブは植物の遺伝子分析に多くの可能的な
用途がある６本発明のプローブは品種登録や同様の工業
所有権を目的とした植物の品種の明細書作成に関連して
、遺伝子工学的な指紋を造成するのに利用する直接の有
用性を有する０本発明のプローブ類はまた植物栽培者に
実用的な価値のある情報を提示できる０例えば、得られ
る遺伝子工学的な指紋は、一つの植物品種について親の
系統であると思われる可能性のある別の植物品種の系統
（ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｐａｒｅｎｔａｌ　１ｉｎｅｓ）
の指紋と比較することによって、前記−つの植物品種の
系統を決定するのに使用できる。ハイブリット（雑種）
の遺伝子組成も同様に決定でき、そしてハイブリッド種
子の各ロフトが純粋なハイブリッドであるか又は親の純
系を含まない種子であるか又は他の汚染（ｃｏｎｔａ■
ｉｎａｔｉｎｇ）を受けた種子であるかを確認できる。

逆に言えば１本発明の生成物及び方法は、育種プログラ
ムで得たホモ接合性の個体を識別同定し、そして種子の
各ロットの遺伝子均一性（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｕｎｉｆｏ
ｒｍｉｔｙ）を確保することによって、純系品種（ｐｕ
ｒｅ　１ｉｎｅ、　ｖａｒｉｅｔｙ）又は近親交雑（ｉ
ｎｂｒｅｄ　ｐａｒｅｎｔ　１ｉｎｅｓ）の製造を助け
ることができる。原則として、上記のような仕事は形態
学的なマーカー顕、アイソザイム（イソ酵素ともいう）
分析又は単一の座ＲＦＬＰ　（制限酵素に対する゛ＤＮ
Ａフラグメントの多量性（Ｒａｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ
ｍ）３法を用いる既知の技術で実行できるが１本発明の
方法は非常により速く。

簡単に、より信頼性があり、従って一般的により。

大きい実用性がある。

本発明の要旨を以下の添付図面を参考にして更に詳しく
説明する。

第１図はシェフリーズの３３．６ヒト高変動性プローブ
でハイブリダイズすることにより探索した（Ｐｒｏｂｅ
ｄ）１１々の品種のトウモロコシのゲノムＤＮへのサザ
ンプロットのオートラジオグラフである。

トウモロコシのゲノムＤＮＡは制限酵素ＤｒａＩで消化
した１図中のａ　＝　ｉの各レーン（ｌａｎｅｓ）は次
の品種のトウモロコシについて得られたレーンを示す、
　ａ−ＰＥ３８；　ｂ−ＲＷＯＩ；　ｃ−ＧＲ３９：　
ｄ−５０６２；　ｅ−ＣＶ３２：ｆ−ＣＩ１５８；　ｇ
−ＡＭ６２；　ｈ−Ｐ７；　１−ＢＥ７０゜第２図はヒ
トのミニサテライトのジェフリーズプローブ３３．１５
を用いて選別及び選択した本発明のイネＤＮＡクローン
のサザンプロット分析図である。５種類のクローンそれ
ぞれについてａ　＝　ｄの４種類の制限酵素（ａ−）１
ｉｎｆ　Ｉ；　ｂ−Ｈａｅｍ；　ｃ−Ｄｒａ工；ｄ−匡
ｍ）を使用した。

第３図は本発明のイネＤＮＡクローン１５．２／２のフ
ラグメントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡ
のサザンプロットのオートラジオグラフである。イネの
ＤＮＡは制限酵素叶ａ　Ｉ（レーンａ〜ｈ）及びＥｃｏ
ＲＩ（レーン１−ｐ）で消化した０図中のａ　＝　ｉの
各レーンは次の品種のイネについて得られたレーンを示
す、　ａ、　１−ＩＲ３６；　ｂ、　ｊ−ＩＲ４５Ｈｃ
。

ｋ−Ｔａｉｐｅｉ　３０９：　ｄ、　ｌ−０５６；　ａ
、　ｍ−５ｍ−５ｉｌｅ：　ｆ、　ｎ−Ｆｕｊｉｓａｋ
ａ　　６５：　　ｇ、　　ｏ−Ｙａｓ＋ａｓｓｉｋｏＨ
ｈ、　　ｐ−丁ａｉｃｈｕｎｇ６５゜ 第４図は本発明のイネのクローン１５．２／２のフラグ
メントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡのサ
ザンプロットのオートラジオグラフである。イネのＤＮ
Ａは制御１９素Ｂａｗｌ（Ｉ（レーンａ　〜ｈ　）及び
旧ｎｄｍ（レーン１＝ｐ）で消化した０図中の６−％−
Ｐの各レーンは次の品種のイネについて得られたレーン
を示す、　ａ、　ｉｌ−Ｔａ１ｃｈｕｎ　６５；　ｂ、
　ｊ−Ｙａｅ＋ａｓｓｉｋｏ：　　ｃ、　　ｋ−Ｆｕｊ
ｉｓａｋａ　　６５；　　ｄ、　　ｌ−５ｉｌｅｖａｈ
；６、　　ｍ−０５６；　　ｆ、　　ｎ−Ｔａ１ｐａｉ
　　３０９：　　ｉ　　ｏ−ｌＲ４５：　　ｈ、　　ｐ
−ｌＲ３６゜ 第５図は本発明のイネのクローン１５．４／２のフラグ
メントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡのサ
ザンプロットのオートラジオグラフである。イネのＤＮ
Ａは制限酵素Ｄｒａ　Ｉで消化した。

図中のａ　”　ｈの各レーンは次の品種のイネについて
得られたレーンを示すｍ　ａ−ｌＲ４５；　ｂ−Ｆｕｊ
ｉｓａｋａ６５：　ｃ−５ｉｌｅｖａｈ：　ｄ−Ｖａｍ
ａｓｓｉｋａ；　ｅ−τａｉｃｈｕｎｇ　６５；ｆ−０
６５；　ｇ−Ｔａｉｐａｉ　３０９：　ｈ（Ｒ３６ｓ第
６図は本発明のイネのクローン１５．７／１のフラグメ
ントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡのサザ
ンプロットのオートラジオグラフである。イネのＤＮＡ
は制限酵素Ｄｒａ　Ｉで消化した。

図中のａ　”　ｈの各レーンは次の品種のイネについて
得られたレーンを示す、　ａ−ｌＲ３６；　ｂ−Ｔａｉ
ｐａｉ　３０９：ｃ−０５６：　　ｄ−丁ａｉｅｈｕｎ
ｇ　　６５；　　ｅ−Ｙａｍａｓｓｉｋｏ；　　ｆ−５
ｉｌｅｖａｈ：ｇ−Ｆｕｊｉａｓｋａ　６５；　ｈ−ｌ
Ｒ４５゜第７図は本発明のイネのクローン１５．７／１
のフラグメントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤ
ＮＡのサザンプロットのオートラジオグラフである。イ
ネのＤＮＡは制限酵素ＢａｍＨＩ（レーンａ　＝　ｈ　
）及びｔｌｌｎｄｍ（レーンｉ”ｐ）で消化した０図中
のａ〜ｐの各レーンは次の品種のイネについて得られた
レーンを示す＊　ａ、　１−ｌＲ３６；　ｂ、　ｊ−ｌ
Ｒ４５；　ｃｗ　ｋ−Ｔａｉｐｅｉ　　３０９：　　ｄ
ｏ　　ｌ−０５６：　　１！、　　ｍ−５ｉｌａｖａｈ
；　　Ｌ　　ｎ−Ｆｕｊｉｓａｋａ　　６５；　　ｇ、
　　ｏ−Ｙａｍａｓｓｉｋｏ；　　ｈ、　　ｐ−丁ａｉ
ｃｈｕｎｇ６５゜ 第８図は第３図の数字変換（デジタル化）して表わした
レーンの表示図であり、図中のレーン２〜１７は第３図
のレーンａ　”　ｐに対応する。

第９図は本発明のイネのクローン１５．２／２のＢａ鵬
）ＩＩフラグメントの一部分のヌクレオチド配列を示す
。

第１０図は本発明のトウモロコシのクローン３３．６Ｃ
のＢａｗｌ（Ｉフラグメントのヌクレオチド配列を示す
図である。

第１１図は本発明のイネのゲノムクローン１５．２／２
とトウモロコシのゲノムクローン３３．６ｃの比較を模
式的に表わす図である。

第１２図は本発明のイネのクローン１５．２／２及びト
ウモロコシのクローン３３．６ｃ中における転写解読枠
（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉＢ　ｆｒａｓ＋ｅｓ）でコード
したアミノ酸配列の比較を示すリストである。

第１３図はイネの５種類の近親交配系統（ｉｎｂｒｅｄ
ｌｉｎｅｓ）　（ａ＝ｅ）由来のゲノムＤＮＡを制限酵
素Ｅｃ。

ＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、後記のクローンＥ１５．
２ｆ５ｄ（Ａ）及びクローンＡＮＩ（Ｂ）で探索した前
記５′！Ｉｉ類の系統のイネのゲノムＤＮＡのサザンプ
ロットのオートラジオグラフである０図中のａ−ｅの各
レーンは次の系統のイネについて得られたレーンを示す
＠　ａ−５ｉｌｅｖａｈ；　ｂ−０５６；　ｃ−ＴｅＯ
２，ｄ−ｌＲ４５；　ｅ−ｌＲ３６゜第１４図は６ａ順
の制限酵素Ｈｉｎｆ　１．シ＋ａ　１．シｐＩＩＩ　、
　Ｘｂａ　１．　ＤＢＨＩ　、及びＡｃｃ　Ｉで消化し
、クローン＾Ｎｌで探索された３種類の近親交配系統（
ａ　＝　ｅ　）由来のイネのゲノムＤＮＡのサザンプロ
ットのオートラジオグラフである１図中の対照（ｃｏｎ
ｔｒｏｌ）及びａ−Ｃの各レーンは次の系統のイネにつ
いて得られたレーンを示す、対照クローンＡＮＩ　を含
む一本鎖化したＭ１３；　ａ−５ｉｌｅｖａｈ：　ｂ−
ＴｅＯ２：　Ｃ−０５６６第１５図は６種類の制限酵素
肛旺工、む１工、む！■、肋互１．　！ｌ！ＩＬ　Ｉ及
び紅旦工で消化し、クローンＥ１５．２ｆ５ｄで探索さ
れた３種類の近親交配系統（ａ＝Ｃ）由来のイネのゲノ
ムＤＮＡのサザンプロットのオートラジオグラフである
０図中の対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びａＮＣの各レーン
は次の系統のイネについて得られたレーンを示す、対照
−２１５，２ｆ５ｄクローンを含む一本鎖化したＭ１３
；　ａ−５ｉｌｅｖａｈ：ｂ−Ｔ３０９；　ｃ−０５６
゜ 第１６図は制限酵素Ｂａ１ｔ）ＩＩで消化し、クローン
ＡＮＩで探索された７種類の近親交配系ＩＲ（ＰＩ及び
Ｐ３〜Ｐ８）由来のイネのゲノムＤＮＡのサザンプロッ
トのオートラジオグラフである。Ｐｌ及びＰ３〜Ｐ８の
レーンは次の系統のイネについて得られたレーンを示す
、Ｐｌ−ｌＲ３６：　Ｐ３−ＩＲ３９３３４：　Ｐ４−
ＴＮＩ；　Ｐ５−ＩＲ３９３５７；Ｐ６−ＩＲ３９３８
５；　　ＰツーｌＲ３９４２２：　　Ｐ８−にｖａｎｇ
　　Ｌｕ　　Ａｉ　　４＋＋（実施例） イネ（虹Ｌ３ｓｔａｖｔａ）の−品種Ｉｎｄ１ｅａ　Ｔ
ＮＩ由来のゲノムＤＮＡ及びトウモロコシ（Ｚｅａ　肚
■）の−品種ＢＥＩＯのゲノムＤＮＡを夫々に制限ｙＪ
素５ａｕ３Ａで部分的に消化した消化物を夫々に、中性
糖勾配法（Ｍａｎｉａｔｉｓ＋Ｈａｒｄ１ｓｏｎ、　Ｌ
ａｃｙ、　Ｌａｕｅｒ、　Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ。

Ｑｕｏｎ、　Ｓｉ−及びＥｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓら、
　ｒｃｅｌｌＪ　Ｉｓ、６８７（１９７ｇ））で寸法別
に分別した。こうして得た１５〜２０にｂの範囲の大き
さのＤＮＡフラグメントを。

Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから精
製品として得たバクテリオファージλＥＭＢＬ３の左右
両端のアームの制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位に結合した
。得られた組換え体バクテリオファージをイン・ビトロ
（封ｖｉｔｒｏ）で（Ａｍａｒｓｈａｍキット）に詰め
込み１次いで大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）　Ｎ８６２１株に
感染させることにより複数のＤＮＡライブラリーを作成
した。各々のＤＮＡライブラリーの一部は、プラーク−
釣り上げ（ｐｌａｑｕｅ−１１ｆｔ）法［Ｍａｎｉａｔ
ｉｇ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ及び５ａｓｂｒｏｏｋらｒＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＪ、　Ｃ５ＨＬ　Ｐｒ
ｏｓ発行（１９８２））を用いて夫々にシェフリーズの
ヒトのプローブ３３．１５及び３３．６でハイブリダイ
ゼーションすることによって選別（スクリーニング）し
た。

陽性のクローンの複数が第１表に示す頻度（ｆｒｅｑｕ
ｅｎｃｙ）で得られたことが確認された。

（２）植物ミニサテライト配列の単離 イネＤＮＡとバクテリオファージλとの組換え体から得
られた陽性のクローンの５個、並びにトウモロコシＤＮ
Ａとバクテリオファージλとの組換え体から得られた陽
性のクローンの４個を分析した（第２表参照Ｌ　Ｈ（ｏ
ｒｉｇｉｎａｌ）の陽性プラークは、大腸＠　（Ｅ、Ｃ
ｏ１１）　Ｎ８６２１株に再感染させ、低密度で再培養
（ｒａｐｌａｔｉｎｇ）　Ｌ／、次いでヒトのミニサテ
ライトプローブを用いて再選別（ｒａｓｃｒｅｅｎｉｇ
）することによって精製した０組換え体バクテリオファ
ージＤＮＡはＹａｍａｓ＋ｏｔｏ、　Ａｌｂａｒｔｓ、
　Ｂｅｎｚｉｎｇｅｒ。

Ｌａｗｈｏｒｎｅ及びＴｒｅｉｂａｒらの方法（ｒＶｉ
ｒｏｌｏｇｙＪ　４０゜）３４（１９７０））で調整し
１次いで塩化セシウム密度勾配法でＰＥＧ沈澱を平衡的
遠心分離法にかけた。

各々のファージＤＮＡの約１μｇを用いて、これが前記
ヒトのプローブを使用するサザンプロット・ハイブリダ
イゼーション法［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　ｒＪ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｊ、　９３．５０３（１９７５）］
で分析され、ヒトのミニサテライト配列に対して相同性
の配列を含むＤＮＡフラグメントがあることを確認した
（第２図）０次いで、これらのＤＮＡフラグメントを低
融点アガロースゲル（Ｉｓｌｓｌａｎｄｅｒ、ｒＡｎａ
ｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈａｍ、　９８，３０５（１９
７９））から単離することによって精製し１次いでそれ
ら精製品は、プローブとして使用するか、あるいはＤＮ
Ａ配列分析用にサブクローンした。

（３）植物プローブを用いるサザンプロット・ハイブリ
ダイゼーシヨン イネ、トウモロコシ、小麦及び大麦を含めた種々の植物
種から由来のゲノムＤＮＡを種々の制限Ｍ素で消化し、
０．８％アガロースゲル中で電気泳動させ１次いでアル
カリ性プロッティング条件（ゼータプローブ）を用いて
ナイロン膜に移した。前項（２）に記載のようにして単
離したところのクローンされたイネＤＮＡ配列を、無作
為オリゴヌクレオチド・ブライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ
）法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、
１３７．２６６（１９８４））を用いて３２ｐで標識し
た。夫々のフィルターは、（Ａ）　５ＸＳＳＣ（塩化ナ
トリウム／クエン酸塩）、５０％ホルムアミド、１％Ｃ
ａｄｂｕｒｙの“Ｍａｒｖｅｌ”粉末ミルク、０．０２
％アジ化ナトリウム及びｌ／４０Ｍリン酸ナトリウムの
混合液（４２℃でｐ）１６．５）若しくは（Ｂ）　２ｘ
ｓｓｃ、　ｓｏ％ホルムアミド、１％Ｃａｄｂｕｒｙの
”Ｍａｒｖｅｌ”粉末ミルク。

０．０２％アジ化ナトリウム及び１／４０Ｍリン酸ナト
リウムの混合液（６５℃でｐｉ（６，５）である２種の
混合液のいずれか一方の混合液中で６時間プリハイブリ
ダイズさせた。

ハイブリダイゼーションは１０％デキストラン硫酸及び
前記の１１威されたＤＮＡプローブ（４０ｎｇＤＮＡ／
■ｇ、放射能比活性２．５Ｘ１０＠ｃｐ■／μｇ）を加
えて存在させながら４２℃の前記混合液Ａ中か、あるい
は６５℃の前記混合液Ｂのいずれかの中で１６時間行っ
た。夫々のフィルターは、２ＸＳＳＣｍ液、０．１％５
Ｏ５（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液で６５℃で３０分
間２回洗い１次いで０．ｌＸ５ＳＣ溶液、０．１％ＳＯ
５溶液中で６５℃で３０分間１回洗った。それらのフィ
ルターを一７０℃で２〜２４時間オートラジオグラフ化
した。

イネのプローブはイネのゲノムＤＮＡに対し非常に強く
ハイブリダイズし、１晩の放射線曝露でも鮮明なシグナ
ルのパターンを与えている（第３図〜第８図）、一連の
相異なるイネ培養物（ｒｉｃｅｃｕｌｔｉｖｏｒｓ）を
相互に比較した場合に多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）
パターンが得られ、を椎動物の研究でヒトの高変動性の
プローブを用いて観察した多型パターンに類似した多型
パターンであった。

上記で用いた相異なるイネ・プローブ（同一であるヒト
のプローブで同定識別されたイネ・プローブを含めて）
は、夫々に互いに異なる“指紋”を与える。

（４）植物の高変動性ＤＮＡの塩基配列の分析前項（２
）に記載のようにして単離したＤＮＡフラグメントを、
配列決定用ベクター（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇνａｃｔｏ
ｒ）　Ｍ１３■ｐ１８中にサブクローンし１次いでサン
ガーらの方法（ｒＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ　Ｓｃｉ
　ＵＳＡＪ、　７４゜５４６３−５４６７、　（１９７
７））で塩基配列を決定した。また。

エキソヌクレアーゼｍによる消化（Ｂｉｙｎｉｋｏｆｆ
、　Ｓ。

ｒＧｅｎａＪ　２８．３５１　（１９８４））で生成さ
せて用意した一連（ｎｅｓｔｅｄ　５ｅｒｉｅｓ）のフ
ラグメントから、別の配列情報を得た。そのようなフラ
グメントの２つはＵ１５．２ｆ５ｄとＡＮＩである。こ
れら２つのフラグメントは両方ともイネのクローン１５
．２／２（第２表参照）から得た。これら２つのフラグ
メント及びその他のフラグメントを第１１図に模式的に
示す。

第９図と第１０図は本発明の方法で単離したクローンさ
れたイネのゲノム配列及びトウモロコシのゲノム配列の
代表的な塩基配列を示す０図示した２つの塩基配列は、
第９図に示した配列がイネのクローン１５．２／２の塩
基配列であり、第１０図に示した配列がトウモロコシの
クローン３３．６ｃ（第２表参照）の塩基配列である。

第１１図はこれらの上記２つのイネ及びトウモロコシ・
プローブと、それらから由来した数個のフラグメントと
の類縁関係を示す。

１５．２／２イネクローン及び３３．６ｃ　トウモロコ
シクローンの両者は、それらを同定するのに用いたジェ
フリーズプローブに対してかなりの相同性を有し、しか
もＧＣ含量の多い領域を含む、第３表は。

これら２つの配列が５′→３′の方向に読まれるコンセ
ンサス配列ＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧを有する一連の連
続する１　２ｂｐの反復体として書き換えできることを
示す。

また、この配列は、より単純であって累代的と思われる
３ｂｐの反復単位も基本成分として含むことが明らかで
ある【第３表は前記のイネの１５．２／２クローンの塩
基配列を示すが、但し第９図に示した配列と反対の方向
で示しである。これは、ヒト配列とバクテリオファージ
配列に対して上記のイネクローン及びトウモロコシクロ
ーンが若干の相同性を示すけれども、それらクローンを
ヒト配列及びバクテリオファージ配列と比較するのを容
易にするためである〕、二の塩基配列分析で明らかにな
ったタンデム反復構造は、　ＧＣ含量の多い領域が典型
的な“ミニサテライト”組織中に配列していることを示
す。

本発明のクローン内にあるＧＣ含量の多い反復単位（以
下単にＧＣ又はＧＣ反復体という）は（これ迄調べた全
ての場合について）転写解読枠（ＯＲＦと略記する）の
３′末端の下流にある（本明細書において。

「下流」とは、ＤＮＡのコーディング（ｃａｒｄｉｎｇ
）領土のコーディング配列の３′末端の所での下流を意
味する；すなわち、一つの遺伝子配列がＲＮＡポリメラ
ーゼで転写される方向について見ると、上記のＧＣ，富
化反復単位の配列がコーディング鎖上の前記遺伝子の後
に来ることを意味する）、前記ＯＲＦは、クローンの完
全な配列情報が入手できるような複数のクローン同士の
間では事実上同一である。

ＯＲＦは第９図と第１０図に示した塩基配列の塩基４５
４〜４５６で終り、　ＯＲＦは上記ＧＣ富化反復単位の
配列が出発する前に始まる（正確には、どこで始まるか
はまだ知られていない）、第１２図にトウモロコシのク
ローンとイネのクローンの蛋白質コード配列の比較を示
す、第１２図において、夫々の文字はアミノ酸残基を表
わし、ここでは慣習的な１字簡略表記法を使用している
。

イネとトウモロコシの両方の種において、ＯＲＦとＧＣ
反復との間の領域は何れも独特のもの（すなわち、クロ
ーンされる領域内では反復的でない）であり且つＡ丁含
量の多い反復配列の複数を含む。

このＡＴの多い反復配列（■ｏｔｉｆ）はトウモロコシ
よりも（第４表に示す）イネの方が濃い、この領域のも
つ機能（たとえ、あるとしても）は未だ知られていない
が、それはＯＲＦ領域の発現のｍｕに関与すると予想さ
れる。

ＧＣ領域とＯＲＦ領域との間に存在しない部位を認識す
る制限酵素（ＢａｍＨＩ及びシ乙ＲＩ）を用い、これで
５種類の品種のイネから由来のイネのゲノムＤＮＡを消
化させた。得られた消化物を電気泳動とサザンプロット
法に供し１次いでクローンＥ１５．２ｆ５ｄとクローン
＾Ｎ１でハイブリダイズさせることにより探索した。得
られた結果を第１３図に示す、上記２種のクローンはそ
れぞれにＧＣ領域と０ＲＦＩＪｔ域を代表する（第１１
図参照）、上記２種類の制限酵素を用いると、これら２
種類のクローンＥＩ５．２ｆ５ｄ及びＡＮｌ、すなわち
プローブは１本質的に同一の一組のフラグメントに対し
てハイブリダイズする。

しかしながら、ある種の９１Ｆ４は、　　ＯＲＦ配列に
隣接するＧＣ反復体から該ＯＲＦ配列の若干又は大部分
を分離できる能力を有する。そのような酵素を複数のゲ
ノムＤＮＡのサザン分析に用いると、　ＧＣプローブに
相同性であるゲノムフラグメントがゲッタイブ（ｇｏｎ
ｏｔｙｐｅ）の間の変動性（ｖａｒｌａｂｉｌｉｔｙ）
を示すことになる。このことは第１４図及び第５図の結
果を導びく実験によって例示される。

３種類の近親交配系統（ａ−ｃ）由来のイネのゲノムＤ
ＮＡを、６種類の制限酵素（Ｈｉｎｆ　１．シυ工。

Ｈａｓ　ＩＩｌ、珈Ｉ、　ＤＢＢ　Ｉ及びＡｃｅ　Ｉ）
で消化し、さらにクローンＡＮＩでハイブリダイズする
ことにより探索した。得られたサザンプロットを第１４
図に示す、第１４図中の対照及びａ−ｃの各レーンは次
の系統のイネについて得られたレーンを示す、対照−Ａ
ＮＩクローンを含む一本鎖化したＮ１３；　−５ｉｌａ
ｖａｈ；ｂ−Ｔ３０９；　ｃ−０５６゜ ３種類の近親交配系統（ａ”ｃ）由来のイネのゲノムＤ
ＮＡを上記と同じ６種類の制限ａ素で消化し。

次いでクローンＥ１５．２ｆ５ｄでハイブリダイズする
ことにより探索させた。得られたサザンプロットを第１
５図に示す０図中の対照及びａ’＝ｃの各レーンは次の
系統のイネについて得られたレーンを表わす。

対照−クローンＥ１５．２ｆ５ｄを含む一本鎖化したＮ
１３；ａ−５ｉｌｅｖａｈ；　　ｂ−丁３０９：　　ｃ
−０５６゜０ＲＦ（クローン２１５．２ｆ５ｄ）を含む
フラグメントは比較的不変異性（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）
である（第１５図）１本発明者らの解釈によると、この
結果は系統間のパターンの変動性がＧＣ領域中の又はＧ
Ｃｑ域に近い場所での変異によることを示している。す
なわち。

このＧＣ領域を含むいかなる制限フラグメントも有効な
変異を示すことができ、そのようなフラグメントに相同
性のプローブは、これも変異を明らかにするためのサザ
ン分析に使用し得る０選択使用したプローブに応じて、
変異が起きていることが全ての座位で又は（単一座のプ
ローブｓ１ｎｇｌｅ−１ｏｃｕｓ　ｐｒｏｂｅを与える
）一つの個の座位で検出されるであろう。

本発明のプローブは座位について特異的（ｌｏｃｕｓ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ）なプローブを単離するのにも使用で
きる。

座位について特異的なプローブは１本発明によると１本
発明のプローブを用いて特定の植物のＤＮＡフラグメン
トを同定し１次いで該フラグメントをクローニングする
ことによって単離できる。

座位について特異的な有用なりローンを与えるように上
記のようなフラグメントを選択することは。

多くの場合に試行ｔｅｔｘの問題であるが、この技術を
有用に利用可能にするに足る頻度で成功が得られる。一
般に、より微弱なす〆ザン・バンドを与もマ えるようなフラグメントであって、このようなフラグメ
ントが本発明のプローブに対して余り強くハイブリダイ
ズせず従って本発明のプローブの構造と幾分具なる構造
を有することを示すようなフラグメントが選択されるべ
きである。座位について特異的なプローブは、座位特異
的なプローブが極めて良く類似した配列にのみ結合する
ように極めで厳密な条件下で使用されるべきであり、座
位特異的なプローブに関する更に詳しい情報は欧州特許
第２３ＪＩ３２９（Ａ２）号公報（特許出願人ＩＣＩ社
）に示されている。

分Ｊ！！集団（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔ
ｉｏｎｓ）の分析に本発明による座位特異的な高変動性
のプローブを使用すると、遺伝地図の作成時に分子状マ
ーカー間で生じた結合を評価することができ、またハイ
ブリダイゼーションのパターンと耕種学的な表現形質と
の間の相関性を検出できるようになる。さらに前記の高
変動性プローブは植物の繁殖用の生殖質（ｇｅｒｓｐｌ
ａｓ■）を評価するのにも恐らく有用であろうし、この
ことはヒトの遺伝病の診断にＤＮＡプローブが有用であ
ることと似ている。上記ＤＮＡプローブは繁殖中の個体
群（ｐｏｐｕｌａｔｌｏｎｓ）間で特異的な染色体セグ
メントが転移しているのを探知できるし、あるいは新規
な個体群又は外来種の中の遺伝子学的発散性（ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を探知できて、その遺伝
子学的発散性を植物育種業者の保有する生殖質中へ次に
導入するのに役立つであろう。

イネの７種類の近親交配系統（Ｐｉ及びＰ３〜Ｐ８）由
来のイネのゲノムＤＮＡを制限酵素シ＋ｍＨＩで消化し
１次いでクローンＡにｌでハイブリダイズすることによ
り探索した。得られたパターンを第１６図に示す０図中
のＰｌ及びＰ３〜Ｐ８の各レーンは次の系統のイネにつ
いて得られたレーンを表わす、　ＰＩ−ＩＲ３６：　Ｆ
３−ＩＲ３９３３４；　Ｆ４−ＴＮＩ；　Ｆ５−ＩＲ３
９３５７；　Ｆ６−ＩＲ３９３８５：　Ｆ７−ＩＲ３９
４２２：　Ｆ８−にｗａｎｇ　Ｌｕ　Ａｉ　にのオート
ラジオグラムで解像されたハイブリダイゼーションのバ
ンド群のうちの幾つかに対応する分子の大きさを第５表
に示す。

電気泳動条件を種々に変化して用いると、異なる種々の
分子量範囲内で移動する複数のバンドを別々に分けて解
像できる。数多くのバンドが全て植物系統の各々に存在
するが、各系統は、各系統にそれに特有な個々の“指紋
”を付与するところの特徴性のある一組の追加的なバン
ドを有する。

適当なオートラジオグラムの分析によって、プローブＡ
ＮＩ　を用いると、　３０本までのバンドまでに解像で
き、それらバンドの１０〜１５本は数対（ｐａｉｒｓ）
の植物系統の間の変動を示す。

上記のバンドに対応するＤＮＡ配列のゲノム（又は染色
体）内の分布は、古典的な遺伝子分析法で決定できる。

このプローブを用いて明示されたバンド同士の間の結合
、又はこれらのバンドと他の遺伝子学的マーカー（形態
学的又は分子状マーカーもしくは経済的に重要な形のマ
ーカー）との間の結合の検出は、相異なるバンディング
パターンを示す個体間の交雑（ｃｒｏｓｓ）から得られ
る分離中の後代植物（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｌｃｐｒｏ
（ａｎｙ）を調べることによって達成できる。第１６図
に示したＰ５系統イネとＰ８系統イネとの間の交雑から
得られたＦ２イネ植物の２０株における６本の相異なる
バンドを上記のように分析した結果を第６表に示す０分
離パターン（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
ｓ）の分析は下記のａ　Ｐ′ｂのことを示す。

ａ、各々の親に由来するバンドは一塊り（ａ　ｂｌｏｃ
ｋ）としては遺伝しない。

ｂ、バンドのうちの多くの対は互いに独立して遺伝する
ように見え、すなわちそれらは密に連結（ｔｉｇｈｔｌ
ｙ　１ｉｎｋｅｄ）　Ｌ／でいない。

上記の分析と他の遺伝子学的分析とから得られる全般的
な結論は１本発明のプローブに対応する植物ＤＮＡ配列
は、分散して存在するが、−組になった複数のゲノム部
位の全体にわたって分布していることである。

第２表に示したクローン類はＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１
１ａｃ−ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａ
ｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　（ＮＣＩＢ）
、　Ｔｏｒｒｙ　Ｒｅｓ＠ａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ、
　ＰＯＢＯＸ　３１．１３５Ａｂｂｅｙ　Ｒｏａｄ、＾
ｂａｒｄｓｅｎ　ＡＢ９　ｇＤＢ、　５ｃｏｔｌａｎｄ
に寄託されている。対応するＮＣＩＢ寄託番号を第２表
に記載する。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｎ８６２１株（Ｎ
、Ｅ　Ｈｕｒｒａｙ博士。

Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから）もま
た寄託番号ＮＣｌＢ４Ｏ０１０としてＮＣＩＢに寄託さ
れている。

第３表 ＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧ ワ ＧＴＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧ ＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧ ＧＡ ＧＧＡＣＧＧＣＣ；ＧＣＧＧ ＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＴＧ ＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ ＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ ＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧ ＡＧＡＧＧＴＣＧ　−−−− ＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧ ＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧ ＡＴＡＧＧＧＣＧＧ　−−− ＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧ ＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧ ＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧ ＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧ ＡＣｉＡＧＧＴＣＧＡＧＣ− ＣＧ ＧＧ ＧＧ 第４表 ＧＴｃＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＡｇｃ
ＡｃｃＡａＣｔａｇ＾＾ＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡ
ＴＴＡＡＧｃａＡｇＡａｔＡＡｃｃＡｔ ｔｇＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴａ＾＾ａｔｔＡｇＴＡ
ＡＡＡＴＡＡｇＴｇ＾＾Ｇ丁ＧｃＡＡ丁ｔＡｃｔａｃｔ
ｚＴｔＡＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡ１５］
　１００６２００１５０３４５１０コンセンサス配列 ＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴ丁ＡＡ

【図面の簡単な説明】

第１図はシェフリーズの３３．６ヒト高変動性プローブ
でハイブリダイズすることにより探索した（ｐ「ｏｂｅ
ｄ）種々の品種のトウモロコシのゲノムＤＮＡのサザン
プロットのオートラジオグラフである。 第２図はヒトのミニサテライトのジェフリーズプローブ
３３．１５を用いて選別及び選択した本発明のイネＤＮ
Ａクローン類のサザンプロット分析図である。 第３図は本発明のイネＤＮＡクローン１５．２／２の゛
フラグメントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮ
Ａのサザンプロットのオートラジオグラフである。 第・１図は本発明のイネのクローン１５．２／２のフラ
グメントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡの
サザンプロットのオートラジオグラフである。 第５図は本発明のイネのクローン１５．４／２のフラグ
メントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡのサ
ザンプロットのオートラジオグラフである。 第６図は本発明のイネのクローン１５．７／１のフラグ
メントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡのサ
ザンプロットのオートラジオグラフである。 第７図は本発明のイネのクローン１５．７／１のフラグ
メントで探索した種々の品種のイネのゲノムＤＮＡのサ
ザンプロットのオートラジオグラフである。 第８図は第３図の数字変換（デジタル化）して表わした
レーンの表示図であり、図中のレーン２〜１７は第３図
のレーンａ　”＝　ｐに対応する。 第９図は本発明のイネのクローン１５．２／２のＦｌａ
ｍＨＩフラグメントの一部分のヌクレオチド配列を示す
。 第１θ図は本発明のトウモロコシのクローン３３．６Ｃ
のＢａｍＨＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す図
である。 第１１図は本発明のイネのゲノムクローン１５．２／２
とトウモロコシのゲノムクローン３３．６ｃの比較を模
式的に表わす図である。 第１２図は本発明のイネのクローン１５．２７２及びト
ウモロコシのクローン３３．６ｃ中における転写解読枠
でコードしたアミノ酸配列の比較を示すリストである。 第１３図はイネの５種類の近親交配系統（ｉｎｂｒｅｄ
ｌｉｎｅｓ）　（ａ＝ｅ）由来のゲノムＤＮＡを制限酵
素シ遼ＲＩ及びシ＋ｍＨＩで消化し、クローンＥ１５．
２ｆ５ｄ　（＾）及びクローンＡＮ　１　（Ｂ）で探索
した前記５種類の系統のイネのゲノムＤＮＡのサザンプ
ロットのオートラジオグラフである。 第１４図は６種類の制限酵素■■Ｉ、Ｒｓａｌ。 Ｈａｅ　ｍ、遅徂ｒ　、　ＤＬＬｆ及びム徂Ｉで消化し
、クローンＡＮＩで探索された３種類の近親交配系統（
ａ　＝　ｃ　）由来のイネのゲノムＤＮＡのサザンプロ
ットのオートラジオグラフである。 第１５図は６種類の制限酵素１１ｉｎｆ　Ｔ　、　Ｒｓ
ａ　Ｉ、１１ａｅｎ１．遵徂１　、０ＢＢ　１及びＬ禿
！で消化し、クローン２１５．２ｆ５ｄで探索された３
種類の近親交配系統（ａ＝ｃ）由来のイネのゲノムＤＮ
Ａのサザンブロットのオートラジオグラフである。 第１６図は制限１１９１ＱＢａｍＨＩで消化し、クロー
ンＡＮＩで探索された７種類の近親交配系統（ＰＩ及び
Ｐ３〜Ｐ８）由来のゲノムＤＮＡのサザンプロットのオ
ートラジオグラフである。 ｍ面のｔ？・） Ｆｉｇｕｒ・　９ １０゜ Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ：１ Ｆｉｇｕｒｅ 図Ｍｌりｒ・虞 Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉｓ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ターゲットの植物種から精製ＤＮＡを調製し、得ら
   れた精製ＤＮＡを複数のＤＮＡフラグメントに切断し、
   得られた複数のフラグメントをクローニングし、クロー
   ニングされたフラグメント即ちフラグメントのクローン
   をジェフリーズプローブの利用により選別し、そしてプ
   ローブに結合したＤＮＡクローンの１種又はそれ以上を
   選択して取り、さらに上記のようにして選択して取った
   １種又はそれ以上のクローンを増殖させることからなる
   ことを特徴とする、植物の試料をそれの特有性により識
   別するのに有用である高変動性ＤＮＡプローブの製造法
   。 ２、前記ターゲットの植物種が作物植物の種類のもので
   ある請求項１記載の方法。 ３、前記作物植物が双子葉植物である請求項２記載の方
   法。 ４、前記作物植物が単子葉植物である請求項２記載の方
   法。 ５、前記作物植物が穀類の植物である請求項４記載の方
   法。 ６、前記穀類植物がトウモロコシ（￥Ｚｅａ￥￥ｍａｙ
   ｓ￥）である請求項５記載の方法。 ７、前記穀類植物がイネ（￥Ｏｒｙｚａ￥￥ｓａｔｉｖ
   ａ￥）である請求項５記載の方法。 ８、前記ジェフリーズプローブがジェフリーズプローブ
   ３３．６又は３３．１５である請求項１〜７のいずれか
   に記載の方法。 ９、植物試料の識別に有用であり且つ請求項１〜８のい
   ずれかに記載の方法によって製造された高変動性ＤＮＡ
   クローン。 １０、植物試料の識別に有用であり且つ反復したタンデ
   ム配列（ＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧ）を有する高変動性
   ＤＮＡクローン。 １１、植物試料の識別に有用であり且つ請求項１０記載
   のクローンの反復したタンデム配列に対して少なくとも
   ７０％の相同性をもつ反復したタンデム配列を有する高
   変動性ＤＮＡクローン。 １２、供試植物試料から精製ＤＮＡを調製し、得られた
   精製ＤＮＡを、選択した制限酵素で切断し、得られた切
   断ＤＮＡを標準的な分離法で一連の並列されたＤＮＡフ
   ラグメントとして相互に分離し、得られた一連の並列さ
   れたフラグメントを請求項９〜１１及び１６のいずれか
   に記載の高変動性ＤＮＡプローブの１つを利用して探索
   し、得られた前記ＤＮＡプローブと前記フラグメントと
   のハイブリダイゼーション物を可視化し、そして得られ
   た可視のパターンを識別済みの既知の植物試料から同一
   の調製条件下で同一の制限酵素と同一のプローブを用い
   て得られた対応の可視のパターンと比較することからな
   ることを特徴とする、植物試料をそれの特有性により識
   別する方法。 １３、前記の高変動性ＤＮＡプローブが供試植物試料の
   属する植物と同一の属又は種の植物体から得たものであ
   る請求項１２記載の方法。 １４、前記植物種がトウモロコシ（￥Ｚｅａ￥￥ｍａｙ
   ｓ￥）である請求項１３記載の方法。 １５、前記植物種がイネ（￥Ｏｒｙｚａ￥￥ｓａｔｉｖ
   ａ￥）である請求項１３記載の方法。 １６、ターゲットの植物種から精製ＤＮＡを調製し、得
   られた精製ＤＮＡを複数のＤＮＡフラグメントに切断し
   、得られた複数のＤＮＡフラグメントをクローニングし
   、クローニングされたフラグメント即ちフラグメントの
   クローンを請求項９〜１１のいずれかに記載の高変動性
   ＤＮＡプローブの１つの利用により選別し、そして該プ
   ローブに結合したクローンの１種又はそれ以上を選択し
   て取り、さらに上記のようにして選択して取ったクロー
   ンを増殖させることからなることを特徴とする、植物試
   料をそれの特有性から識別するのに有用である高変動性
   ＤＮＡプローブの製造法。 １７、得られる前記高変動性ＤＮＡプローブが位置特異
   性である請求項１６記載の方法。