JPH02295497A - Ｄｎａプローブ - Google Patents
ＤｎａプローブInfo
- Publication number
- JPH02295497A JPH02295497A JP2091320A JP9132090A JPH02295497A JP H02295497 A JPH02295497 A JP H02295497A JP 2091320 A JP2091320 A JP 2091320A JP 9132090 A JP9132090 A JP 9132090A JP H02295497 A JPH02295497 A JP H02295497A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- fragment
- strain
- probe
- species
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はＬａｃｌｏｂｘｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕ
ｅｃｋｉｉ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプロー
ブ、このようなプローブの調製方法およびこのＤＮＡプ
ローブによるこの種の細菌菌株の同定方法に関する。
ｅｃｋｉｉ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプロー
ブ、このようなプローブの調製方法およびこのＤＮＡプ
ローブによるこの種の細菌菌株の同定方法に関する。
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉおよびＩａｃｌｉｓは食品の醗
酵に対し非常に重要な細菌である。Ｌ． ｂｕｌｇａｒ
ｉｃａｓおよびＬ．Ｉａｃｌｉｓは乳製品の醗酵に主と
して使用され、従ってヨーグルトおよびチーズの製造に
対するスターターカルチャーに見出される。一方 Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉは主として植物醗酵物に
見出される。これらの食品の醗酵および熟成は通例、異
る細菌、多くの場合異るＬａｃｊｏｂａｃｉｌｌｉ，
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃおよび他の細菌種の連合生育および
相互作用の結果として生ずる。大部分のこれらの細菌種
は非常に似た栄養要求性を有し、同じ環境条件下でも生
育するので、Ｌａｃｌｏｂａｃｉｌｌｏａ種内の明白な
同定は往々非常に困難である。従来、これらの種の分類
は非常にたいくつであり、糖醗酵パターンや酸生産のよ
うな多くの信頼し得ない基準を含む。これらの試験のた
め、異る種の区別は困難で、時々疑わし＜、シばしば独
断的である。
酵に対し非常に重要な細菌である。Ｌ． ｂｕｌｇａｒ
ｉｃａｓおよびＬ．Ｉａｃｌｉｓは乳製品の醗酵に主と
して使用され、従ってヨーグルトおよびチーズの製造に
対するスターターカルチャーに見出される。一方 Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉは主として植物醗酵物に
見出される。これらの食品の醗酵および熟成は通例、異
る細菌、多くの場合異るＬａｃｊｏｂａｃｉｌｌｉ，
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃおよび他の細菌種の連合生育および
相互作用の結果として生ずる。大部分のこれらの細菌種
は非常に似た栄養要求性を有し、同じ環境条件下でも生
育するので、Ｌａｃｌｏｂａｃｉｌｌｏａ種内の明白な
同定は往々非常に困難である。従来、これらの種の分類
は非常にたいくつであり、糖醗酵パターンや酸生産のよ
うな多くの信頼し得ない基準を含む。これらの試験のた
め、異る種の区別は困難で、時々疑わし＜、シばしば独
断的である。
特異的ＤＮＡプローブを使用するＤＮＡハイブリド形成
技術は、細菌およびウイルス菌株の同定に対し非常に有
用な手法であり、臨床診断学において既に応用を見出し
た。このようなＤＮＡプローブは既にＹｅｒａｉｎｉａ
ｅｎｊｅｔｏｃｏｌｉｌｉｃ！（Ｊ．Ｔａｇｏｖら
、＾ｐｐｌ， Ｅｎｙｉｒｏｎ， Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ
． ５ １ ． ４ ４ １ 〜４４ ３． １
９ ８ ６） 、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ［ａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ（Ｒ． Ｈ． Ｂ＊ｒｋｅ＋ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２ ３ １． １ ４ ３ ４〜１ ４
３ ６． １ ９ ８ ６） 、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｊｙｐｈｙ（Ｆ．＾， Ｒｕｂｅｎ ら，
Ｊ．ＣＩｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ６
００〜６ ０ ５． １ ９ ８ ５） 、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂ目ｌｉａ（ＬＫｒｘｕｓｓら、ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｌｅｆｔ． ３ ３．
８ ９〜９ ３． １ ９ ８ ６） 、ＨａｅＩＩ
＋ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｘａｅ（Ｆ．
Ｍａｌｏｕｉｎ ら、Ｊ．ＣＩｉｎ．Ｍｉｃｔｏｂｉ
ｏｌ． ２６． ２１３２〜２１３８．１９８８）
および他の細菌種の同定、ＤＮＡウィルス（１， Ｂｔ
ｘｎｄｓｍｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７ ７． ６ ８ ５ １〜６ ８ ５
５ ；Ｐ． Ｓｌｏｌｈａｎｄｓｋｅ ら、Ｊ．ＣＩ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １ ５． ７４ ４
〜７ ４ ７， １ ９ ８ ２ ＨＰ，Ｓｌｏｌ
ｈａｎｄｓｋｅ ら、Ｊ．Ｍｅｄ，Ｖｉｒｏｌ．１２
， ２１３ 〜２１８． １９８５）およびＲＮＡウ
イルス（Ｊ， Ｎｏｒｅｓら、ＬａｎｃＮｉ，５５５〜
５５９．１９８３ ；Ｍ．Ｌｉｎ ら、Ｊ．Ｙｉｒｏｌ
．５５．５０９〜５１２．１９８５）の同定に対し使用
されている。
技術は、細菌およびウイルス菌株の同定に対し非常に有
用な手法であり、臨床診断学において既に応用を見出し
た。このようなＤＮＡプローブは既にＹｅｒａｉｎｉａ
ｅｎｊｅｔｏｃｏｌｉｌｉｃ！（Ｊ．Ｔａｇｏｖら
、＾ｐｐｌ， Ｅｎｙｉｒｏｎ， Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ
． ５ １ ． ４ ４ １ 〜４４ ３． １
９ ８ ６） 、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ［ａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ（Ｒ． Ｈ． Ｂ＊ｒｋｅ＋ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２ ３ １． １ ４ ３ ４〜１ ４
３ ６． １ ９ ８ ６） 、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｊｙｐｈｙ（Ｆ．＾， Ｒｕｂｅｎ ら，
Ｊ．ＣＩｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ６
００〜６ ０ ５． １ ９ ８ ５） 、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂ目ｌｉａ（ＬＫｒｘｕｓｓら、ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｌｅｆｔ． ３ ３．
８ ９〜９ ３． １ ９ ８ ６） 、ＨａｅＩＩ
＋ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｘａｅ（Ｆ．
Ｍａｌｏｕｉｎ ら、Ｊ．ＣＩｉｎ．Ｍｉｃｔｏｂｉ
ｏｌ． ２６． ２１３２〜２１３８．１９８８）
および他の細菌種の同定、ＤＮＡウィルス（１， Ｂｔ
ｘｎｄｓｍｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７ ７． ６ ８ ５ １〜６ ８ ５
５ ；Ｐ． Ｓｌｏｌｈａｎｄｓｋｅ ら、Ｊ．ＣＩ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １ ５． ７４ ４
〜７ ４ ７， １ ９ ８ ２ ＨＰ，Ｓｌｏｌ
ｈａｎｄｓｋｅ ら、Ｊ．Ｍｅｄ，Ｖｉｒｏｌ．１２
， ２１３ 〜２１８． １９８５）およびＲＮＡウ
イルス（Ｊ， Ｎｏｒｅｓら、ＬａｎｃＮｉ，５５５〜
５５９．１９８３ ；Ｍ．Ｌｉｎ ら、Ｊ．Ｙｉｒｏｌ
．５５．５０９〜５１２．１９８５）の同定に対し使用
されている。
Ｌｘｅｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ種では、真空包装肉の変敗
と特異的に関係するＬ． ｃｕ＋ｙａｊｕｓ （Ｈ．
Ａ． Ｒ． Ｐｅｔｒｉｃｋら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉ
ｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５ ４， ４ ０
５〜４ ０ ８．１ ９ ８ ８）に対するプローブ
のみが単離されている。乳酸菌の関連菌株を同定し、分
類するために急速かつ信頼し得る方法を有することは確
かに酪農産業では有用である。
と特異的に関係するＬ． ｃｕ＋ｙａｊｕｓ （Ｈ．
Ａ． Ｒ． Ｐｅｔｒｉｃｋら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉ
ｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５ ４， ４ ０
５〜４ ０ ８．１ ９ ８ ８）に対するプローブ
のみが単離されている。乳酸菌の関連菌株を同定し、分
類するために急速かつ信頼し得る方法を有することは確
かに酪農産業では有用である。
課題を解決するための手段
従って、本発明の第１の目的は特異的ＤＮＡプロープを
供することある。これは細菌のカルチャーで、又は食品
成分として、又は食品製造中、例えば産業醗酵中Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ種に属
する菌株を特異的に同定するためにハイブリド形成方法
に使用することができる。
供することある。これは細菌のカルチャーで、又は食品
成分として、又は食品製造中、例えば産業醗酵中Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ種に属
する菌株を特異的に同定するためにハイブリド形成方法
に使用することができる。
本発明の第２の目的はこのような特異的ＤＮＡプローブ
の調製方法を供するとである。
の調製方法を供するとである。
本発明の第３の目的はこのＤＮＡプローブにより、又は
そのＤＮＡ部分によりＬ． ｄｅｌｂｒｏｅｃｋｉｉ種
に属する菌株を特異的に同定する方法を供することであ
る。
そのＤＮＡ部分によりＬ． ｄｅｌｂｒｏｅｃｋｉｉ種
に属する菌株を特異的に同定する方法を供することであ
る。
このために、第一に、本発明によるＤＮＡプローブはＬ
， ｄｅｌｂ＋ｕｅｃｋｉｉ種菌株の染色体ＤＮＡに対
しハイブリドを形成しうるＤＮＡ断片を含む。このＤＮ
Ａ断片は例えば３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチンのような任
意の適当な手段により標識することが好ましい。好まし
くは、このＤＮＡ断片はＬ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
種の菌株からの染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片を含む。
， ｄｅｌｂ＋ｕｅｃｋｉｉ種菌株の染色体ＤＮＡに対
しハイブリドを形成しうるＤＮＡ断片を含む。このＤＮ
Ａ断片は例えば３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチンのような任
意の適当な手段により標識することが好ましい。好まし
くは、このＤＮＡ断片はＬ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
種の菌株からの染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片を含む。
一層好ましくは、このＥｃｏＲＩ断片はＬｅｕマイナス
損傷を相補しうる大きな読み取り枠を含む。このような
ＤＮＡ断片は例えばプラスミドｐＹ８５の１６３３塩基
対の長さのＥｃｏＲＩ断片である。
損傷を相補しうる大きな読み取り枠を含む。このような
ＤＮＡ断片は例えばプラスミドｐＹ８５の１６３３塩基
対の長さのＥｃｏＲＩ断片である。
第二に、本発明によるＤＮＡプローブの調製方法はＬ，
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種の菌株からＥｃｏＲＩクロ
ーンバンクを製造し、Ｌｅｕマイナス損傷を有するＥ，
ｃｏｌｉ菌株中にＥｃｏＲＩクローンバンクを形質転換
し、Ｌｅｕプラスクローンを選択し、ＥｃｏＲＩ断片が
Ｌ， ｄｅｌｂ＋ｕｅｃｋｉｉ種の菌株の染色体ＤＮＡ
に対しハイブリドを形成しうるクローンをそこから単離
することを含む。
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種の菌株からＥｃｏＲＩクロ
ーンバンクを製造し、Ｌｅｕマイナス損傷を有するＥ，
ｃｏｌｉ菌株中にＥｃｏＲＩクローンバンクを形質転換
し、Ｌｅｕプラスクローンを選択し、ＥｃｏＲＩ断片が
Ｌ， ｄｅｌｂ＋ｕｅｃｋｉｉ種の菌株の染色体ＤＮＡ
に対しハイブリドを形成しうるクローンをそこから単離
することを含む。
第三に、本発明によるＬ， ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種
の細菌菌株を同定する第１の方法は、同定すべき菌株の
染色体ＤＮＡを調製し、本プローブ又は本方法により調
製したプローブに対しこのＤＮＡがハイブリドを形成す
るかどうかをチェックするこを含む。
の細菌菌株を同定する第１の方法は、同定すべき菌株の
染色体ＤＮＡを調製し、本プローブ又は本方法により調
製したプローブに対しこのＤＮＡがハイブリドを形成す
るかどうかをチェックするこを含む。
第２方法は同定すべき菌株の染色体ＤＮＡを製造し、本
プローブ又は本方法により製造したプローブのＤＮＡ配
列部分と同一のＤＮＡ配列部分を有するこのＤＮＡに対
しポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む。これら
の方法の好ましい態様では、染色体ＤＮＡは醗酵性炭素
源を補足した培養基に同定する菌株の細胞を生育させ、
プロティナーゼの存在でインキユベートし、Ｎ−アセチ
ル−ムラミダーゼにより処理し、さらに乳化剤、キレー
ト剤およびプロティナーゼの存在でインキユベートシ、
そこからＤＮＡをフェノールにより抽出し、抽出ＤＮＡ
をエタノールにより沈澱させ、このＤＮＡをＲＮａｓｅ
により処理し、ＲＮａｓｅ処理ＤＮＡをクロロホルムに
により抽出することにより調製する。好ましくは上記好
ましい態様を含む上記第２の方法は、いくつかの基質に
きわめて低濃度でのみ存在する細胞の菌株の同定に特に
供される。他方、非常に高い感度を有することが判った
上記第１の方法は、カルチャーから又は、例えば濾紙又
はニトロセルロース紙のような固体支持体上で、同定す
べき菌株の細胞を単に溶解することにより調製した染色
体ＤＮＡに対し同定試験を実施するために使用すること
もできる。
プローブ又は本方法により製造したプローブのＤＮＡ配
列部分と同一のＤＮＡ配列部分を有するこのＤＮＡに対
しポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む。これら
の方法の好ましい態様では、染色体ＤＮＡは醗酵性炭素
源を補足した培養基に同定する菌株の細胞を生育させ、
プロティナーゼの存在でインキユベートし、Ｎ−アセチ
ル−ムラミダーゼにより処理し、さらに乳化剤、キレー
ト剤およびプロティナーゼの存在でインキユベートシ、
そこからＤＮＡをフェノールにより抽出し、抽出ＤＮＡ
をエタノールにより沈澱させ、このＤＮＡをＲＮａｓｅ
により処理し、ＲＮａｓｅ処理ＤＮＡをクロロホルムに
により抽出することにより調製する。好ましくは上記好
ましい態様を含む上記第２の方法は、いくつかの基質に
きわめて低濃度でのみ存在する細胞の菌株の同定に特に
供される。他方、非常に高い感度を有することが判った
上記第１の方法は、カルチャーから又は、例えば濾紙又
はニトロセルロース紙のような固体支持体上で、同定す
べき菌株の細胞を単に溶解することにより調製した染色
体ＤＮＡに対し同定試験を実施するために使用すること
もできる。
第１図はプラスミドｐＹ８５のＥｃｏＲＩＤＮＡ断片の
制限地図である。
制限地図である。
目盛は塩基対（ｂ ｐ）で示す。付着末端又はプラント
末端制限部位は各酵素に対し示す。
末端制限部位は各酵素に対し示す。
切断しない酵素は：
ＢｃＩ［、ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＶ，ＫｐｎＩ，Ｍ１ｕＩ
，ＮｄｅＩ．ＮｒｕＩ，ＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩであ
る。
，ＮｄｅＩ．ＮｒｕＩ，ＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩであ
る。
Ｌ． ｂａｌｇｉｒｉｃｕｓのクローンバンクをＧＥ８
９１に形質転換することにより、個々のクローンを単離
するこ七が可能であり、これはこのＥ．ｃｏｌｉ菌株の
Ｌｅｕマイナス損傷を補足できる。これらのクローンの
１つ、ｐＹ８５はＬａｃｊｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂ
ｒ＋＋ｅｃｋｉｉ種を特に同定するためにハイブリド形
成分析における遺伝プローブとして非常に有用であるこ
とがわかった。ドットープロット ハイブリド形成を適
用する選別試験では、異る起源からの３０以上の異るＬ
！ｃｊｏｂ＊ｃｉｌｌｕｓ菌株を試験した。Ｌ． ｄｅ
ｌｂｔｕｅｃｋｉｉ種、すなわちその亜種ｂｕｌｇｎｒ
ｉｃｕｓ， ｄｅｌｂｔｕｅｃｋｉｉおよびＩｘｃｔ
ｉａに対しｐＹ８５のみが特異的にハイブリド形成する
ことを示すことができた。任意の他の試験細菌（第Ｉ表
）に対するハイブリド形成は検知できなかった。
９１に形質転換することにより、個々のクローンを単離
するこ七が可能であり、これはこのＥ．ｃｏｌｉ菌株の
Ｌｅｕマイナス損傷を補足できる。これらのクローンの
１つ、ｐＹ８５はＬａｃｊｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂ
ｒ＋＋ｅｃｋｉｉ種を特に同定するためにハイブリド形
成分析における遺伝プローブとして非常に有用であるこ
とがわかった。ドットープロット ハイブリド形成を適
用する選別試験では、異る起源からの３０以上の異るＬ
！ｃｊｏｂ＊ｃｉｌｌｕｓ菌株を試験した。Ｌ． ｄｅ
ｌｂｔｕｅｃｋｉｉ種、すなわちその亜種ｂｕｌｇｎｒ
ｉｃｕｓ， ｄｅｌｂｔｕｅｃｋｉｉおよびＩｘｃｔ
ｉａに対しｐＹ８５のみが特異的にハイブリド形成する
ことを示すことができた。任意の他の試験細菌（第Ｉ表
）に対するハイブリド形成は検知できなかった。
本プローブの特異性を試験するために、ドットープロッ
トの洗滌條件を室温（２０℃）に下げ、ＳＳＣ濃度を２
ＸＳＳＣに増加した。これらの低緊縮條件下でさえ、任
意の非Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種によるｐＹ８５
のハイブリド形成を見出すことは全くできなかった。
トの洗滌條件を室温（２０℃）に下げ、ＳＳＣ濃度を２
ＸＳＳＣに増加した。これらの低緊縮條件下でさえ、任
意の非Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種によるｐＹ８５
のハイブリド形成を見出すことは全くできなかった。
Ｌ． ｄｅｌｂｒｔｅｃｋｉｉを検知するｐｙｓ５の感
度は連続稀釈した適当な染色体ＤＮＡに対しハイブリド
の形成により試験した。フィルターに対しＸ一線フィル
ムを一夜曝露することにより２ｐｇ程の少量の目標ＤＮ
Ａに対しハイブリドの形成を容易に検知できることは注
目される。さらにＬａｃｌｏｂｉｃｉｌｌｕｓに対する
ｐＹ８５のサブ断片、２００ｂｐおよび５００ｂｐの長
さの断片を試験し、完全な断片の場合と同一の結果を得
た。従って、ｐＹ８５断片の任意の部分はＬ． ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉの特異的同定に対し十分であると結論
できる。
度は連続稀釈した適当な染色体ＤＮＡに対しハイブリド
の形成により試験した。フィルターに対しＸ一線フィル
ムを一夜曝露することにより２ｐｇ程の少量の目標ＤＮ
Ａに対しハイブリドの形成を容易に検知できることは注
目される。さらにＬａｃｌｏｂｉｃｉｌｌｕｓに対する
ｐＹ８５のサブ断片、２００ｂｐおよび５００ｂｐの長
さの断片を試験し、完全な断片の場合と同一の結果を得
た。従って、ｐＹ８５断片の任意の部分はＬ． ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉの特異的同定に対し十分であると結論
できる。
これらのデータからｐＹ８５ ＤＮＡ配列の部分を使
用するＰＣＲ （ポリメラーゼ連鎖反応）（Ｓｉｉｋｉ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ３ ０． １ ３
５ ０ 〜１ ３ ５４． １９８５ＨＳａｉｋｉ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ３ ９． ４ ８７〜４
９１．１９８８）はこの特異的 Ｌａｃｊｏｂ＊ｃｉｌｌｕｓ種の同定に同様に作用でき
ると仮定することができる。その大きな拡大効果のため
に、ＰＣＲ法は例えば食品試料中におけるような微少量
のＬｉｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌を追跡しなければな
らない場合非常に興味ある可能性があると見做すことが
できる。
用するＰＣＲ （ポリメラーゼ連鎖反応）（Ｓｉｉｋｉ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ３ ０． １ ３
５ ０ 〜１ ３ ５４． １９８５ＨＳａｉｋｉ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ３ ９． ４ ８７〜４
９１．１９８８）はこの特異的 Ｌａｃｊｏｂ＊ｃｉｌｌｕｓ種の同定に同様に作用でき
ると仮定することができる。その大きな拡大効果のため
に、ＰＣＲ法は例えば食品試料中におけるような微少量
のＬｉｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌を追跡しなければな
らない場合非常に興味ある可能性があると見做すことが
できる。
ＤＮＡ配列分析およびさらに遺伝子分析によりｐＹ８５
断片は構造遺伝子をコードすることがわかった。必須遺
伝子生成物は通例それらの機能の選択を受けやすいので
、これらの遺伝子は主としてＤＮＡの良好な保存領域で
ある。従って、ｐＹ８５断片の構造的機能のため、この
ＤＮＡ断片はＬａｃｊｏｆ＋ａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉ種に対しこのような良好な、非常に特
異的プローブとして作用するらしい。
断片は構造遺伝子をコードすることがわかった。必須遺
伝子生成物は通例それらの機能の選択を受けやすいので
、これらの遺伝子は主としてＤＮＡの良好な保存領域で
ある。従って、ｐＹ８５断片の構造的機能のため、この
ＤＮＡ断片はＬａｃｊｏｆ＋ａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉ種に対しこのような良好な、非常に特
異的プローブとして作用するらしい。
後記する例で使用する乳酸菌菌株は第Ｉ表に示す。Ｅ．
ｃｏｌｉ菌株はＨＢ１０１ （ｌｅｕＢ６ｐｒｏＡ２
ｒｅｃＡ１３ ｔｈｉｌ１．４５９〜４７２．１９
６９）およびＧＥ８９１ （Ｆ ｅｎｄＡ１
ｔｈｉｌ ｈｓｄＲ１７ｓｕｐＥ４４ １ ｅＪ２
９１ ｉ １ｖＤ１４５）（Ｇ．ＥｇｇｅＮｓｓｏｎ
， Ｉｎｓ口ｊｕｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ７，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓＮ７ ｏｆ Ｉｃｅｌａｎｄ，Ｒｅ７ｋｉ！ｗｉ
ｋ， Ｉｃｅｌａｎｄ，未発表）である。ベクターとし
て使用したプラスミドはＹＲＰ １ ７ （Ｈｏｔ＋ｉ
ｎｇｅｔ ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ，１８
８．２１９〜２２４．１９８２）であった。
ｃｏｌｉ菌株はＨＢ１０１ （ｌｅｕＢ６ｐｒｏＡ２
ｒｅｃＡ１３ ｔｈｉｌ１．４５９〜４７２．１９
６９）およびＧＥ８９１ （Ｆ ｅｎｄＡ１
ｔｈｉｌ ｈｓｄＲ１７ｓｕｐＥ４４ １ ｅＪ２
９１ ｉ １ｖＤ１４５）（Ｇ．ＥｇｇｅＮｓｓｏｎ
， Ｉｎｓ口ｊｕｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ７，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓＮ７ ｏｆ Ｉｃｅｌａｎｄ，Ｒｅ７ｋｉ！ｗｉ
ｋ， Ｉｃｅｌａｎｄ，未発表）である。ベクターとし
て使用したプラスミドはＹＲＰ １ ７ （Ｈｏｔ＋ｉ
ｎｇｅｔ ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ，１８
８．２１９〜２２４．１９８２）であった。
培地
異るＬａｃｌｏｂａｃｉｌｌｉ， Ｌａｃｔｏｅｏｃｃ
ｉおよびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃ＋ｅ＋ｉａの生育に対
しＭＲＳブロス（Ｄｉｌｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）を１％乳糖を補足して使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株
はＬＢ培地に生育した。
ｉおよびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃ＋ｅ＋ｉａの生育に対
しＭＲＳブロス（Ｄｉｌｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）を１％乳糖を補足して使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株
はＬＢ培地に生育した。
ＤＮＡの調製
（ｉ） Ｌｘｃｔｏｂａｅｉｌｌｏｓ ， Ｌａｃｊ
ｏｃｏｃｃｕｓおよびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｘからの染色体ＤＮＡ０一夜のカルチャーからの細胞は
１％の乳糖を補足した１０ｍｌＭＲｓに稀釈し、４３℃
で中間対数相まで生育させた。次に細胞は遠心分離によ
り採集し、冷ＬＭ ＮａＣｌ水で１回洗滌し、プロテ
ィナーゼＫ （２ ５ ０ ｔｔ ｇ／ｍｌ）およびプ
ロナーゼＥ（５００μｇ／ｍｌ）の存在で１時間３７℃
で培養した。
ｏｃｏｃｃｕｓおよびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｘからの染色体ＤＮＡ０一夜のカルチャーからの細胞は
１％の乳糖を補足した１０ｍｌＭＲｓに稀釈し、４３℃
で中間対数相まで生育させた。次に細胞は遠心分離によ
り採集し、冷ＬＭ ＮａＣｌ水で１回洗滌し、プロテ
ィナーゼＫ （２ ５ ０ ｔｔ ｇ／ｍｌ）およびプ
ロナーゼＥ（５００μｇ／ｍｌ）の存在で１時間３７℃
で培養した。
細胞はＴＥ（１０ｍＭ｝リス塩酸塩ｐＨ７．４：１ｍＭ
ＥＤＴＡ）中で洗滌し、１時間３７℃でＴＥの存在
でミュータノリシン（２００μｇ ／ ｍｌ ）により
処理した。ＳＤＳ，ＥＤＴＡおよびプロティナーゼＫを
それぞれ０．１％、７５ｍＭおよび２００μｇ ／ ｍ
ｌの最終濃度まで添加し、６５℃で４時間培養した。次
にＤＮＡはフェノールにより抽出し、エタノールにより
沈澱させ、無菌つまようじ上に巻いた，ＤＮＡはＲＮａ
ｓｅ Ａ（２００μｇ ／ ｍｌ ）の存在でＴＥ中
に再懸濁させ、クロロホルムにより抽出し、エタノール
中に再沈澱させ、再度つまようじ上に巻いた。次にＤＮ
Ａは１００μ！のＴＥ中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。
ＥＤＴＡ）中で洗滌し、１時間３７℃でＴＥの存在
でミュータノリシン（２００μｇ ／ ｍｌ ）により
処理した。ＳＤＳ，ＥＤＴＡおよびプロティナーゼＫを
それぞれ０．１％、７５ｍＭおよび２００μｇ ／ ｍ
ｌの最終濃度まで添加し、６５℃で４時間培養した。次
にＤＮＡはフェノールにより抽出し、エタノールにより
沈澱させ、無菌つまようじ上に巻いた，ＤＮＡはＲＮａ
ｓｅ Ａ（２００μｇ ／ ｍｌ ）の存在でＴＥ中
に再懸濁させ、クロロホルムにより抽出し、エタノール
中に再沈澱させ、再度つまようじ上に巻いた。次にＤＮ
Ａは１００μ！のＴＥ中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。
（ｉｉ） Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡ０Ｅ
．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡを単離し、必要な場
合Ｍｘｎｉｘｌｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：ｘａｂｏｒａｌｏｒ７ ｍａｎｕａｌ．ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｔｂｏｒＬａｂｏｒｘｔｏｔ７
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｔｋ， １ ９８２）に従ってＣｓＣｌ勾配により
精製した。化学品はＥ，Ｍｅ＋ｃｋ Ｃｈｅｍｉｃｉｌ
ｓ Ｉｎｃ．および酵素はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．から購入した。
．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡを単離し、必要な場
合Ｍｘｎｉｘｌｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：ｘａｂｏｒａｌｏｒ７ ｍａｎｕａｌ．ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｔｂｏｒＬａｂｏｒｘｔｏｔ７
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｔｋ， １ ９８２）に従ってＣｓＣｌ勾配により
精製した。化学品はＥ，Ｍｅ＋ｃｋ Ｃｈｅｍｉｃｉｌ
ｓ Ｉｎｃ．および酵素はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．から購入した。
Ｌ， ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓタイプからの染色体ＤＮＡ
はＥｃｏＲＩにより完全に消化し、独特のＥｃｏＲ１部
位で分割することにより予め線状化し、ホスファターゼ
処理したベクターＹＲＰ１７中に連結した。次に連結混
合物はＨＢ１０１中に形質転換し、その６６％が約１．
９ｋｂの平均寸法の挿入を有する約２０’ ０００コ
ロニーの代表数を集め、増幅した。
はＥｃｏＲＩにより完全に消化し、独特のＥｃｏＲ１部
位で分割することにより予め線状化し、ホスファターゼ
処理したベクターＹＲＰ１７中に連結した。次に連結混
合物はＨＢ１０１中に形質転換し、その６６％が約１．
９ｋｂの平均寸法の挿入を有する約２０’ ０００コ
ロニーの代表数を集め、増幅した。
酵素は供給者の指示に従って使用し、
Ｅ．ｃｏｌｔの形質転換はｌａｎｉａｆｉ富らに従って
行なった。
行なった。
Ｌｅｕ一相補クローンに対する選択
ＥｃｏＲＩ クローンバンクはＧＥ８９１に形質転換
した。形質転換細胞を豊富化するために、カルチャーは
先づ第一に３７℃で一夜７０ｇ／ｍｌアンピシリンを含
有するＬＢ培地に生育させた。
した。形質転換細胞を豊富化するために、カルチャーは
先づ第一に３７℃で一夜７０ｇ／ｍｌアンピシリンを含
有するＬＢ培地に生育させた。
次に細胞は最少培地中で洗滌し、適当な稀釈物はそれぞ
れ２０ｔｔｇ／ｍｌ，２０ｔｔｇおよび／■／ｍｌでイ
ソロイシン、バリンおよびグルコースを含有する最少寒
天プレート上に薄くかぶせた。
れ２０ｔｔｇ／ｍｌ，２０ｔｔｇおよび／■／ｍｌでイ
ソロイシン、バリンおよびグルコースを含有する最少寒
天プレート上に薄くかぶせた。
ＤＮＡ断片の標識
ＤＮＡを放射能により標識するためにフィル−インーリ
プレースメント（ｆｉｌｌ−ｉｎ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅ
ｎＬＩＤＮＡ合成（Ｍａｎｉｘｔｉｓら）を使用した。
プレースメント（ｆｉｌｌ−ｉｎ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅ
ｎＬＩＤＮＡ合成（Ｍａｎｉｘｔｉｓら）を使用した。
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼはＢｏｃｈ＋ｉｎｇｅ＋−Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍから、（（２−”Ｐ）ｄＡＴＰはＡｍｅｒ
山ｍ Ｃｏ，から購入した。
ｎｎｈｅｉｍから、（（２−”Ｐ）ｄＡＴＰはＡｍｅｒ
山ｍ Ｃｏ，から購入した。
ハイブリド形成方法
（ｉ） ドットブロット ハイブリド形成。ＴＥ中の
２００ｎＨの染色体ＤＮＡの試料を５分間９５℃で加熱
することにより変性した。ＳＳＣを試料に添加し、１６
ＸＳＳＣの最終濃度を得、次に混合物は２０ＸＳＳＣ湿
潤ジエネスクリーン紙上にスポットし、２０×ＳＳＣで
１回すすいだ。
２００ｎＨの染色体ＤＮＡの試料を５分間９５℃で加熱
することにより変性した。ＳＳＣを試料に添加し、１６
ＸＳＳＣの最終濃度を得、次に混合物は２０ＸＳＳＣ湿
潤ジエネスクリーン紙上にスポットし、２０×ＳＳＣで
１回すすいだ。
Ｂｉｏ−Ｒａｄ ドットプロット装置を使用した。
次にフィルターは６５℃で５ ｘ Ｓ Ｓ Ｃ，次に６
５℃でｏ．ｉｘｓｓｃにより洗滌し、ハイブリド形成に
よる標準方法を使用してＤＮＡハイブリド形成の準備を
整えた（Ｅ． Ｓｏｌｈｅｒｎ， Ｉ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｉｏｌ。９８、５０３〜５１７、１ ９ ７ ５）。ハ
イブリド形成シグナルを検知するために、フィルターは
Ｘ線フィルムに曝露するために使用した。
５℃でｏ．ｉｘｓｓｃにより洗滌し、ハイブリド形成に
よる標準方法を使用してＤＮＡハイブリド形成の準備を
整えた（Ｅ． Ｓｏｌｈｅｒｎ， Ｉ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｉｏｌ。９８、５０３〜５１７、１ ９ ７ ５）。ハ
イブリド形成シグナルを検知するために、フィルターは
Ｘ線フィルムに曝露するために使用した。
（肖） Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−プロット ハイブリド形
成。
成。
Ｓｏｕｌｈｅｒｎ−プロット ハイブリド形成は標準方
法（Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）に従って行なった。ハイブ
リド形成および洗滌は６５℃であった。
法（Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）に従って行なった。ハイブ
リド形成および洗滌は６５℃であった。
制限マッピングおよびＤＮＡ配列
制限酵素はＢｏｅｒｉｎｇｅ＋−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃ
ｏ，およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
Ｃｏ．から購入し、供給者が推せんするように使用した
。ＤＮＡ配列はＭ１３ファージ誘導体を使用して連鎖停
止反応方法により行なった（Ｆ．３ａｎｇｅ＋ら、Ｊ，
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９４．４ ４ １〜４ ４ ８
． １ ９ ７ ５ ； Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら、Ｐ＋
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｘｄ．Ｓｃｉ．７４． ５４６
３ 〜５４６７， １９７ ７ ； Ｊ．Ｍｅｕｉｎ
ｇ ら、Ｇｅｎｅｌ ９． ２ ６ ９ 〜２ ７
６．１９８２）。
ｏ，およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
Ｃｏ．から購入し、供給者が推せんするように使用した
。ＤＮＡ配列はＭ１３ファージ誘導体を使用して連鎖停
止反応方法により行なった（Ｆ．３ａｎｇｅ＋ら、Ｊ，
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９４．４ ４ １〜４ ４ ８
． １ ９ ７ ５ ； Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら、Ｐ＋
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｘｄ．Ｓｃｉ．７４． ５４６
３ 〜５４６７， １９７ ７ ； Ｊ．Ｍｅｕｉｎ
ｇ ら、Ｇｅｎｅｌ ９． ２ ６ ９ 〜２ ７
６．１９８２）。
例１
１． １．
ＬｘｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからＧＥ８９１ Ｌｅｕ
一相補クローンの単離 Ｌ．ｂｕｌｇｘｔｉｃｕｓ ＮＣＤＯ １４８９の
ＥｃｏＲＩ消化染色体ＤＮＡはベクターＹＲＰ１７にク
ローンバンクを定着させるために使用した。
一相補クローンの単離 Ｌ．ｂｕｌｇｘｔｉｃｕｓ ＮＣＤＯ １４８９の
ＥｃｏＲＩ消化染色体ＤＮＡはベクターＹＲＰ１７にク
ローンバンクを定着させるために使用した。
このクローンバンクは上記のようにＧＥ８９１を形質転
換するために供した。最少寒天プレート上に生育した数
個の個々のコロニーを単離し、分析した。スクリーニン
グから自然の１ｅｕ２９１復帰細胞を排除するために、
これらのコロニーのプラスミドＤＮＡを単離し、アミノ
酸置換最少寒天プレートで次に選択することにより再形
質転換ＧＥ８９１に対し使用した。この第２形質転換に
おけるＧＥ８９１のＩｅｕ２９１損傷の高頻度の相補性
は相補因子がプラスミド上に位置することを示した。こ
の方法で単離したクローンの１つはｐＹ８５である。
換するために供した。最少寒天プレート上に生育した数
個の個々のコロニーを単離し、分析した。スクリーニン
グから自然の１ｅｕ２９１復帰細胞を排除するために、
これらのコロニーのプラスミドＤＮＡを単離し、アミノ
酸置換最少寒天プレートで次に選択することにより再形
質転換ＧＥ８９１に対し使用した。この第２形質転換に
おけるＧＥ８９１のＩｅｕ２９１損傷の高頻度の相補性
は相補因子がプラスミド上に位置することを示した。こ
の方法で単離したクローンの１つはｐＹ８５である。
■．２．
制限マッピングおよびＤＮＡ配列
ｐＹ８５の制限マップは数個の制限酵素を使用して測定
した。しかし、一層詳細な調査のために、ｐＹ８５のＥ
ｃｏＲＩ断片の全体のＤＮＡ配列を測定した。ＤＮＡ配
列の分析により断片は１つの大きな読み取り枠を含有す
ることが判った。これはＬｅｕマイナス突然変異の相補
性の原因となる。
した。しかし、一層詳細な調査のために、ｐＹ８５のＥ
ｃｏＲＩ断片の全体のＤＮＡ配列を測定した。ＤＮＡ配
列の分析により断片は１つの大きな読み取り枠を含有す
ることが判った。これはＬｅｕマイナス突然変異の相補
性の原因となる。
ＤＮＡ配列により、ｐＹ８５の１６３３塩基対の長さの
ＥｃｏＲＩ断片の一層詳細な制限マップを作成できる。
ＥｃｏＲＩ断片の一層詳細な制限マップを作成できる。
第１図に示す。
１．３．
プローブｐＹ８５の特異性および感度
Ｌ．ｂｕｌｇＩｒｉｃｕｓタイプ菌株ＮＣＤＯ １４
８９のゲノムＤＮＡに対しＳｏｌｈｅｒｎ−プロット上
のプローブとしてｐＹ８５のＥｃｏＲＩ断片のハイブリ
ド形成は１個の対立遺伝子を単離することが判った。し
かし、すべてのＬａｃ（ｏｂｉｃｉｌｌｕｓ菌株がプロ
ーブに対しハイブリドを形成するものでないことが観察
された。従って、ｐＹ８５は Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属および何か他の乳酸菌の
異る代表に対しドットーブロット ハイブリド形成によ
り試験した。これらの試験に対するプローブとしてｐＹ
８５の３２Ｐ標識ＥｃｏＲＩ断片を使用した。
８９のゲノムＤＮＡに対しＳｏｌｈｅｒｎ−プロット上
のプローブとしてｐＹ８５のＥｃｏＲＩ断片のハイブリ
ド形成は１個の対立遺伝子を単離することが判った。し
かし、すべてのＬａｃ（ｏｂｉｃｉｌｌｕｓ菌株がプロ
ーブに対しハイブリドを形成するものでないことが観察
された。従って、ｐＹ８５は Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属および何か他の乳酸菌の
異る代表に対しドットーブロット ハイブリド形成によ
り試験した。これらの試験に対するプローブとしてｐＹ
８５の３２Ｐ標識ＥｃｏＲＩ断片を使用した。
要約は第■表に示す。
α ｃｃ：
一一一一一一一一一一ｔ． ｔ． ４ ｔ． ｔ． ｔ
． ４ ４ ４ ４−ｄ １１ Ｑ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ
Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ． ｌ． ｃｎ
ｖｉ ｗ ｗ Ｗハイブリド形成結果からｐＹ８５が特
異的にＤＮＡのみを照し出すことがわかる。異るＬａｃ
ｔａｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｌｏｃｏｃｃｕｓおよ
びＰ＋ｏｐｉｏｎｉｂａｃｌｅｒｉａのすべての他の試
験菌株は陰性であった。
． ４ ４ ４ ４−ｄ １１ Ｑ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ
Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ Ｚ． ｌ． ｃｎ
ｖｉ ｗ ｗ Ｗハイブリド形成結果からｐＹ８５が特
異的にＤＮＡのみを照し出すことがわかる。異るＬａｃ
ｔａｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｌｏｃｏｃｃｕｓおよ
びＰ＋ｏｐｉｏｎｉｂａｃｌｅｒｉａのすべての他の試
験菌株は陰性であった。
例２
ｐＹ８５クローンからの２００ｂｐおよび５００ｂｐの
長さの２つのＮｃｏｌ断片（第１図）を単離し、ハイブ
リド形成に対するプローブとして例１に開示の方法で使
用した。同じ高特異性ハイブリド形成はこれらの一層短
かいプローブにより得られることを認めた。
長さの２つのＮｃｏｌ断片（第１図）を単離し、ハイブ
リド形成に対するプローブとして例１に開示の方法で使
用した。同じ高特異性ハイブリド形成はこれらの一層短
かいプローブにより得られることを認めた。
例３
例１および例２で行なったドットープロット試験の感度
を試験するためにＬ．Ｉａｃｔｉｓタイプの染色体ＤＮ
Ａの連続稀釈を行ない、稀釈ＤＮＡは次にｐＹ８５
ＥｃｏＲＩ断片によりハイブリドを形成した。正のシグ
ナルは１ｐｇの目標ＤＮＡで容易に検知できた。さらに
、ハイブリドの形成は１Ｙ８５プローブに対し異るＬａ
ｅｔｏｂｘｃｉｌｌｕｓ菌株ヨ使用して低緊縮洗滌条件
下で試験した。２０℃で２ＸＳＳＣ中で洗滌後、Ｌａｃ
ｊｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒａｅｃｋｉｉ種のＤＮ
Ａによりハイブリド形成のシグナルを検知できるのみで
あった。しかし、例１および２に記載のＬａｃｊｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓスクリーニングに対し、少なくとも２００
ｎＨのＤＮＡ／試料および緊縮洗滌条件を使用した。
を試験するためにＬ．Ｉａｃｔｉｓタイプの染色体ＤＮ
Ａの連続稀釈を行ない、稀釈ＤＮＡは次にｐＹ８５
ＥｃｏＲＩ断片によりハイブリドを形成した。正のシグ
ナルは１ｐｇの目標ＤＮＡで容易に検知できた。さらに
、ハイブリドの形成は１Ｙ８５プローブに対し異るＬａ
ｅｔｏｂｘｃｉｌｌｕｓ菌株ヨ使用して低緊縮洗滌条件
下で試験した。２０℃で２ＸＳＳＣ中で洗滌後、Ｌａｃ
ｊｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒａｅｃｋｉｉ種のＤＮ
Ａによりハイブリド形成のシグナルを検知できるのみで
あった。しかし、例１および２に記載のＬａｃｊｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓスクリーニングに対し、少なくとも２００
ｎＨのＤＮＡ／試料および緊縮洗滌条件を使用した。
第１図はプラスミドｐＹ８５のＥｃｏＲＩＤＮＡ断片の
制限マップである。
制限マップである。
Claims (25)
- （１）Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種の菌株の染色体Ｄ
ＮＡに対しハイブリドを形成しうるＤＮＡ断片を含むこ
とを特徴とする、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂ
ｒｕｅｃｋｉｉ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプ
ローブ。 - （２）ＤＮＡ断片を標識する、請求項１記載のＤＮＡプ
ローブ。 - （３）ＤＮＡ断片を＾３＾２ｐにより標識する、請求項
２記載のＤＮＡ断片。 - （４）ＤＮＡ断片はＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種又は
その亜種の菌株由来の染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片を
含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡプ
ローブ。 - （５）ＥｃｏＲＩ断片はＬｅｕマイナス損傷を相補し得
る大きな読み取り枠を含む、請求項４記載のＤＮＡプロ
ーブ。 - （６）ＥｃｏＲＩ断片は１６３３塩基対の長さである、
請求項４又は５記載のＤＮＡプローブ。 - （７）ＥｃｏＲＩ断片はＥ．ｃｏｌｉ菌株に形質転換し
得るベクターに連結する、請求項４から６のいずれか１
項に記載のＤＮＡプローブ。 - （８）ＥｃｏＲＩ断片はプラスミドＹＲＰ１７に連結す
る、請求項４から７のいずれか１項に記載のＤＮＡプロ
ーブ。 - （９）ＤＮＡ断片は菌株￥Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ￥
ＮＣＤＯ１４８由来の染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片で
ある、請求項４から８のいずれか１項に記載のＤＮＡプ
ローブ。 - （１０）ＤＮＡ断片はプラスミドｐＹ８５のＥｃｏＲＩ
断片である、請求項４から９のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡプローブ。 - （１１）ＤＮＡ断片はプラスミドｐＹ８５のＥｃｏＲＩ
断片のＮｃｏＩ部分である、請求項１０記載のＤＮＡプ
ローブ。 - （１２）Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種又はその亜種の
菌株からＥｃｏＲＩクローンバンクを調製し、ＥｃｏＲ
ＩクローンバンクをＬｅｕマイナス損傷を有する￥Ｅ．
ｃｏ￥ｌｉ菌株に形質転換し、Ｌｅｕプラスクローンを
選択し、￥Ｅｃｏ￥ＲＩＤＮＡ断片が￥Ｌ．ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉ￥ｉ種の菌株の染色体ＤＮＡに対しハイブリ
ドを形成し得るクローンをそこから単離することを特徴
とする、￥Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅ
ｋｉｉ￥種の細菌菌株の同定用のＤＮＡプローブの調製
方法。 - （１３）￥Ｅｃｏ￥ＲＩクローンバンクは菌株￥Ｌ．ｂ
ｕｌｇａｒｉｃｕｓ￥ＮＣＤＯ１４８９から調製する、
請求項１２記載の方法。 - （１４）￥Ｅｃｏ￥ＲＩクローンバンクは ￥Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ￥種の菌株の染色体ＤＮ
Ａを￥Ｅｃｏ￥ＲＩにより消化し、￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥菌
株に形質転換しうるベクターに連結し、連結混合物を￥
Ｅ．ｃｏｌｉ￥菌株に形質転換することにより調製する
、請求項１２記載の方法。 - （１５）ベクターはプラスミドＹＲＰ１７である、請求
項１４記載の方法。 - （１６）連結混合物は￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥菌株ＨＢ１０１
に形質転換する、請求項１４又は１５記載の方法。 - （１７）Ｌｅｕマイナス損傷を有する￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥
菌株は、ＧＥ８９１である、請求項１２記載の方法。 - （１８）さらに￥Ｅｃｏ￥ＲＩＤＮＡ断片を標識する、
請求項１２から１７のいずれか１項に記載の方法。 - （１９）さらに￥Ｅｃｏ￥ＲＩＤＮＡ断片を￥３￥２Ｐ
により標識する、請求項１８記載の方法。 - （２０）同定すべき菌株の染色体ＤＮＡを調製し、請求
項１から１１のいずれか１項に記載のプローブ又は請求
項１２から１９のいずれか１項に記載の方法により製造
したプローブに対しこのＤＮＡがハイブリドを形成する
かどうかをチェックすることを特徴とする、Ｌ．ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉ種の細菌菌株の同定方法。 - （２１）同定すべき菌株の細胞を溶解することにより染
色体ＤＮＡを調製する、請求項２０記載の方法。 - （２２）固体支持体上で同定すべき菌株の細胞を溶解す
ることによりＤＮＡを調製する、請求項２１記載の方法
。 - （２３）醗酵性炭素源を補足した培養基に同定すべき菌
株の細胞を生育させ、プロティナーゼの存在で培養し、
Ｎ−アセチル−ムラミダーゼにより処理し、さらに乳化
剤、キレート剤およびプロティナーゼの存在で培養し、
そこからＤＮＡをフェノールにより抽出し、抽出ＤＮＡ
をエタノールにより沈澱させ、このＤＮＡをＲＮａｓｅ
により処理し、ＲＮａｓｅ処理ＤＮＡをクロロホルムに
より抽出することにより染色体ＤＮＡを調製する、請求
項２０記載の方法。 - （２４）同定すべき菌株の染色体ＤＮＡを調製し、請求
項１から１１のいずれか１項に記載のプローブ又は請求
項１２から１９のいずれか１項に記載の方法により調製
したプローブのＤＮＡ配列部分と同一のＤＮＡ配列部分
を有するこのＤＮＡに対しポリメラーゼ連鎖反応を実施
することを特徴とする、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種
の細菌菌株の同定方法。 - （２５）醗酵性炭素源を補足した培養基に同定すべき菌
株の細胞を生育させ、プロティナーゼの存在で培養し、
Ｎ−アセチル−ムラミダーゼにより処理し、さらに乳化
剤、キレート剤およびプロティナーゼの存在で培養し、
そこからＤＮＡをフェノールにより抽出し、抽出ＤＮＡ
をエタノールにより沈澱させ、このＤＮＡをＲＮａｓｅ
により処理し、ＲＮａｓｅ処理ＤＮＡをクロロホルムに
より抽出することにより染色体ＤＮＡを調製する、請求
項２４記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89106016.2 | 1989-04-06 | ||
| EP89106016 | 1989-04-06 | ||
| EP90102651.8 | 1990-02-10 | ||
| EP90102651A EP0391039B1 (en) | 1989-04-06 | 1990-02-10 | A DNA probe for Lactobacillus delbrueckii |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02295497A true JPH02295497A (ja) | 1990-12-06 |
Family
ID=26120047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2091320A Pending JPH02295497A (ja) | 1989-04-06 | 1990-04-05 | Ｄｎａプローブ |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5359049A (ja) |
| EP (1) | EP0391039B1 (ja) |
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| FI (1) | FI93472C (ja) |
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| NO (1) | NO180754C (ja) |
| NZ (1) | NZ233006A (ja) |
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006503374A (ja) * | 2002-10-16 | 2006-01-26 | マイクロソフト コーポレーション | 暗号的にセキュリティ保護された個人識別 |
| WO2004087891A1 (en) * | 2003-04-02 | 2004-10-14 | Axcan Pharma S.A. | Lactobacillus fermentum strain and uses thereof |
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