JPH02297064A - 腎症候性出血熱の診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、腎症候性出血熱の診断用試薬に関し、さらに
詳しくは、臨床検査に好適に使用することのできる腎症
候性出血熱の診断用試薬に関する。

［従来の技術と発明が解決しようとする課題］ハンタウ
ィルス（Ｈａｎｔａ　ｖｉｒｕｓｌは１９７８年李らに
よって韓国セスジノネズミ肺から分離されたＢｕｎｙａ
ｖｉｒｉｄａｅ科に属するウィルスである（Ｈ，Ｗ。

Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｔ、：　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ
ｓ、、　１３７：　２９８−。

１９７８）。

このウィルスはヒトに感染して腎症候性出血熱（以下、
単にＨＦＲ５と言うことがある。）の病原となる。

ＨＦＲ５は古くからユーラシア大陸北部に地方病として
存在していたと推定されるが、１９３８年頃から中国東
北部に駐在していた日本陸軍に多発し、また１９５１年
韓国動乱の折りには国連軍に流行して以来、中国などで
多数の発生をみている。

現在、このウィルスは地球上の広い範囲に分布している
ことが知られている。

ＨＦＲ３は臨床的に定型的な出血熱の症候を示すことも
あるが、非定型的な臨床像を示すことも多（、臨床所見
だけで診断することが難しいことが多い。

従来、ＨＦ　ＲＳ’の診断法としては、血清診断法が採
用され、例えば蛍光抗体法、酵素抗体法が常用されてい
る。

しかしながら、両法とも特異性、感度ともに満足すべき
ものではあるが、いずれも操作が煩雑で多くの労力を要
し、また特殊な機器と検査時間を要し、臨床検査に応用
するのは容易ではなかった。

すなわち、本発明の目的は、特殊な機器を用いずとも、
簡単かつ迅速にハンタウィルスに感染しているか否かを
診断することのできる腎症候性出血熱の診断用試薬を提
供することにある。

［課題を解決するための手段１ 本発明の腎症候性出血熱の診断用試薬は、ハンタウィル
ス抗原を不溶性担体粒子に感作して得られる感作不溶性
粒子を含有してなることを特徴とする。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いるハンタウィルス抗原は感染動物臓器、感
染培養細胞などから調製することもできるが、収量、安
全性などの観点から感染哺乳マウス脳またはラット脳か
ら調製することが望ましい。

感染哺乳マウス脳またはラット脳から調製する方法とし
ては、例えば、哺乳マウス脳またはラット脳内にウィル
スを接種して感染させ、この感染脳組織から得られる組
織乳剤を低温で遠心して上清をとり、これをエチルアル
コールおよび硫酸プロタミンで処理し、さらにこれを高
速遠心して上清をとり、ホルマリンで不活化したのちに
係るホルマリンを透析にて除きハンタウィルス抗原を得
る方法を挙げることができる。

本発明に係る不溶性担体粒子は公知疎水性ポリマー粒子
、無機化合物粒子等を好適に使用することができる。

例えば、疎水性ポリマー粒子としては、次式［ＩＩ （但し、Ｒ２は水素原子またはアルキル基であり、Ｒ２
はハロゲン原子、置換もしくは非置換のフェニル基、ア
ルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アルコキシ基
またはシアノ基を表わす。）で示されるモノマー単位お
よび／または次式　［ＪＩコ （但し、Ｒ３は水素原子又はアルキル基を表わす。）で
示されるモノマー単位を有する疎水性ポリマーの粒子を
挙げることができる。

前記Ｒ２としてのフェニル基の置換基は特に限定されな
いが、ハロゲン原子、ハロアルキル基、アルキル基等を
挙げることができる。

なお、これらの中でもＲ２が置換若しくは非置換のフェ
ニル基、塩素原子、またはアルコキシカルボニル基であ
るモノマー単位が好ましい。

前記式［ＩＩに示すモノマー単位を与える単量体として
は、例えば、スチレン、ビニルトルエン、クロロメチル
スチレン、クロルスチレン、塩化ビニル、臭化ビニル、
メチルメタアクリレート、エチルメタアクリレート、プ
ロピルメタアクリレート、酢酸ビニル、エチルビニルエ
ーテル、プロピルビニルエーテル、ブチルビニルエーテ
ル、アクリロニトリル、メタアクリロニトリル等を挙げ
ることができる。

なお、これらの中でも好ましいのは、スチレン、ビニル
トルエン、クロロメチルスチレン、塩化ビニル、メチル
メタアクリレート、エチルメタアクリレートである。

前記［ＩＩ　］式で示されるモノマー単位を与える単量
体としては、例えばグリシジルアクリレート、グリシジ
ルメタアクリレート等を挙げることができる。

なお、前記式［ＩＩに示すモノマー単位および前記式［
ＩＩ　］モノマー単位を有する疎水性ポリマー粒子にあ
っては、前記［ＩＩ］式で示されるモノマー単位の含有
量をポリマー粒子中に０．０１〜２０モル％、好ましく
は、０．０５〜５モル％となる範囲から選ぶことが好適
である。

また、疎水性ポリマー粒子は、診断用試薬の性質に悪影
響を及ぼさない範囲、例えば、２０モル％以下の範囲で
前記式［ＩＩ］以外の親水性ビニル系モノマー単位を含
んでいても良い。

親水性ビニル系モノマー単位を与える単量体としては、
例えば、メタクリル酸、アクリル酸、スチレンスルホン
酸、スチレンスルホン酸ナトリウム、２−ヒドロキシエ
チル（メタ）アクリレート、ビニルピロリドン、ポリエ
チレングリコール（メタ）アクリル酸エステル等を挙げ
ることができる。

また、疎水性ポリマー粒子には、ジビニルベンゼン、エ
チレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコ
ールジメタクリレート、ビスフェノールＡジグリシジル
エーテル等の架橋性単量体も含有せしめることができる
。

以上に述べた疎水性ポリマー粒子を得るための重合方法
は、公知のいわゆるラテックス粒子の製造方法を好適に
採用することができ、例えば、特開昭５９−１５０３号
に記載の方法を挙げることができる。

本発明に係る疎水性ポリマー粒子の平均粒径は、０．０
１〜１０ｕｍ、好ましくは、０．０５〜５μｍである。

疎水性ポリマー粒子の形状は、多面体、柱体、両雄体、
球体等、特に制限するものではないが、好ましくは球体
、さらに好ましくは真球体である。

前記無機化合物粒子としては、公知のものを好適に使用
することができ、例えば、シリカ、アルミナ、チクニア
、ジルコニア、酸化第二鉄、四三酸化鉄、酸化コバルト
、酸化ニッケル等の周期律表第１ＩＩ族、第１Ｖ族また
は第■族の金属の酸化物；水酸化アルミニウム、水酸化
第二鉄、水酸化クロム等の水酸化物：臭化銀、塩化銀等
のハロゲン化物：硫化カドミウム等の硫化物：炭酸カル
シウム、炭酸マグネシウム等の炭酸塩：硫酸バリウム、
硫酸ストロンチウム等の硫酸塩等を挙げることができる
。

なお、これらの中でも好ましいのは、シリカ、アルミナ
、チタニア、ジルコニアまたはこれらを主な構成成分と
する複合酸化物である。

また、無機化合物粒子として、シリカと結合可能な周期
律表第１族、第１Ｉ族、第１ＩＩ族及び第１■族からな
る群より選ばれた少なくとも１種の金属酸化物とシリカ
とを主な構成成分とする無機酸化物を使用することもで
きる。その無機酸化物の具体例としては、例えば酸化リ
チウム、酸化ナトリウム、酸化カリウム、酸化マグネシ
ウム、酸化カルシウム、酸化ストロンチウム、酸化バリ
ウム、酸化アルミニウム、酸化チタニウム、酸化ジルコ
ニウム、酸化ゲルマニウム、酸化ハフニウム、酸化錫、
酸化鉛等を挙げることができる。

なお１本発明に係る無機化合物粒子にあっては、このよ
うな材質からなりかつ本発明の目的を阻害しない限りに
おいて、特にその無機化合物粒子の構造を制限するもの
ではなく、前記材質からなる粒子であってもよいし、ま
たその粒子を核とし、その核を１または２以上の層、例
えば後述する染料を含有する色素層等で被覆してなる無
機化合物粒子であってもよい。

無機化合物粒子の平均粒子径は、０．１〜１０．０ｇｍ
、好ましくは、０．８〜５．０ｕｍである。

無機化合物粒子の比重は、通常１．５〜４、Ｏ１好まし
くは１．８〜２．５である。

なお、このような無機化合物粒子の中でも特に好ましい
のは、前記材質、例えば、シリカを主な構成成分とする
複合酸化物を核とし、その核を後述する染料を含有する
色素層で被覆し、所望により、さらに前記複合酸化物で
被覆し、その表面なシランカップリング剤、チタンカッ
プリング剤等で処理することによりその表面に反応基を
担持せしめた無機化合物粒子であって、その平均粒子径
が０，１〜ｌＯμｍでありかつ比重が、１．５〜４．０
である、いわゆる高比重複合体粒子（以下、単にＨＤＰ
ということがある。）である。

さらに１本発明においては、前記無機化合物粒子の粒子
分散性が８０％以上好ましくは９０％以上のものが好適
である。

なお、本発明にいう粒子分散性とは、全粒子中に占める
非凝集粒子、すなわち、単一粒子の個数の割合（％）で
あり、通常、コールタ−カウンター社製モデルＺＤ−１
よって測定することができる。

無機化合物粒子の形状は、使用される無機化合物の結晶
構造、製法によって異なり、多面体、柱体、両錐体、球
体等が存在し、これらすべて使用可能であるが、好まし
くは球体、特に好ましくは真球体がよい。

このような無機化合物粒子は、公知の製造方法、例えば
特開昭５２−１３８０９４号、特開昭６１−１４９６４
４号公報等に記載の方法により好適に得ることができる
。

このような不溶性担体粒子には、染料を含ませることも
可能である。

前記染料としては、特に制限されるものではなく、公知
の染料を使用することができ、例えば、マラカイトグリ
ーン、ローダミンＢ、メチレンブルー等のカチオン染料
：ダイアニックス（三菱化成■の登録商標）、ディスバ
ゾール（アイ・シー・アイ社の登録商標）、ミケトンボ
リエステル（三井東圧化学■の登録商標）等の分散染料
：コンゴーレッド、ダイレクトディープブラックＥＷ、
クリソフェニンＧ等の直接染料：アリザリンサフィロー
ルＢ、アリザリンダイレクトブルーＡ、アリザリンシア
ニングリーンＧ等の酸性束Ｎ：ダイヤモンドブラックＦ
、クロムファストネビーブルーＢ、パラチンファストブ
ルーＢＮ等の酸性媒染染料：アシドール（ＢＡＳＦ社の
登録商標）、アイゼンオバル（保土谷化学■の登録商標
）、オレオソール（田岡化学の登録商標）等の含金属染
料：ダイアミラ、ミカシロン（三菱化成■の登録商標）
、スミフィックス（住友化学■の登録商標）等の反応染
料：ミカホワイト（三菱化成■の登録商標）、ホワイテ
ックス（住友化学■の登録商標）等の蛍光増白染料など
を挙げることができる。

これらの中でも好ましいのは、含金属染料、カチオン染
料であり、さらに好ましくは、カチオン染料である。

また、これらの染料中でメタノール１００重量部に対す
る溶解度が１重量部以上、好ましくは５重量部以上、特
に好ましくは１０重量部以上であるものが好適である。

前記不溶性担体粒子における染料の量は、特に制限され
るものではないが、通常０．５〜８重量％、好ましくは
１．０〜５．０重量％である。

染料の量をこのような範囲に設定することにより、前記
凝集反応の判定を容易に行うことができるとともに、特
に不溶性担体粒子が無機化合物粒子である場合には、染
料の溶出を防止することができる。

本発明に係る感作不溶性粒子は、前記パンクウィルス抗
原を前記不溶性担体粒子に感作して得ることができる。

パンクウィルス抗原を不溶性担体粒子に感作するために
は、不溶性担体粒子とパンクウィルス抗原とを水性媒体
（例えば生理食塩水、ＰＢＳなど）中で接触させるのが
よく、通常、不溶性担体粒子の水性媒体懸濁液とパンク
ウィルス抗原とを混合し、振盪して感作する。

不溶性担体粒子を感作するに際してのパンクウィルス抗
原の用量としては、不溶性担体粒子１ｇに対して、パン
クウィルス抗原を１００〜４００ＨＤＰ凝集単位、好ま
しくは１５０〜２５０ＨＤＰ凝集単位である。

なお、本発明においてＨＤＰ凝集単位とは、ＨＤＰの凝
集に必要な最低濃度をＩＨＤＰ凝集単位という。

この感作はｐＨ６，０〜８．０．４℃〜２０°Ｃでおこ
なうのが望ましい。

感作後は水性媒体で洗浄して未感作のパンクウィルス抗
原を除去し、さらに不溶性担体粒子に吸着される物質、
例えばウシ血清アルブミンなどで粒子の残余面を飽和す
る。

本発明の診断用試薬は、前記感作不溶性粒子を、例えば
、水性溶液に懸濁せしめて得ることができる。

上記感作不溶性粒子の含有量としては ０．００５〜２重量％、好ましくは０，０５〜１重量％
である。

なお、本発明に係る感作不溶性粒子は安定であるが、こ
れを凍結乾燥することにより更に長期間保存することが
できる。凍結乾燥品は使用に際して純水を加えて溶解さ
せるだけで新鮮製品と全く同様にして使用することがで
きる。

本発明の診断用試薬はバンクウィルス抗体により凝集さ
れるので、ヒトまたは動物の血清などの体液もしくはそ
の希釈液と本発明の診断用試薬とをマイクロタイター用
のプレート上で接触させ、感作不溶性粒子の管底凝集像
を観察することによりバンクウィルス抗体の存在を判定
することができる。

［実施例］ 以下に実施例を示し本発明をさらに具体的に説明する。

なお、この実施例によって本発明は、何ら制限されるも
のではない。

（パンクウィルス抗原の調製） 生後１日の補乳ラット脳内に、ハンタウィルス感染哨乳
うット脳の１％乳剤０．０１ｍｊ２を接種し、８日後に
脳を摘出し、生理食塩水で２０％乳剤を調製した。

この乳剤を４℃で６０００ｒｐｍ３０分間遠心して上清
をとり、これに１０容量のエチルアルコールを加え、低
温で撹拌し、減圧で乾燥した。

ついで、生理食塩水で再び原遺にもどし、これに２０％
の硫酸プロクミンを加えて低温で撹拌し、これを１０．
ＯＯＯｒｐｍで６０分遠心したのち、その上清をとった
。これにホルマリンを０．０５容量％加え、４℃で１４
日問おいた後、生理食塩水に対して透析し、パンクウィ
ルス抗原を得た。

なお、力価は１２０ＨＤＰ凝集単位／　ｍ　（２であっ
た。

（）（ＤＰの作製） 撹拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール２８００ｍ
Ｉ２、アンモニア水（２５重量％）６１６ｍｆｆおよび
水酸化ナトリウム水溶液（５モル／Ｉ２）２１ｍＩ２を
加え１０℃に保った後に、テトラエチルシリケートのメ
タノール溶液（２２重量％）２５６ｍｇを２５．５＋ｎ
Ｊ２／ｈｒの速度で嫡々添加し、シリカ粒子（平均粒子
径０．９１％ｍ）をつくった、このシリカ粒子を含む反
応液中にさらにテトラエチルシリケートのメタノール溶
液（４４重量％）６２４ｍＩ２とメチレンブルーのメタ
ノール溶液（１，２５重量％）６２５ｒｒｉ氾を同時に
２５．５ｍＪ２／ｈｒの速度で滴々添加し、該テトラエ
チルシリケートのメタノール溶液と該染料のメタノール
溶液の滴々添加を同時に終了させ、染料で着色したシリ
カ粒子を合成した。得られたシリカ粒子をメタノールで
デカンテーションによる精製と洗浄を繰り返した。

このように得られた２層構造からなるシリカ／染料複合
体の平均粒子径は１．５７μｍであった。

次いで、得られたシリカ粒子を１０重量％濃度になるよ
うにメタノール中に分散し、その分散液Ｌｏｏｍβにフ
ェニルトリエトキシシランを０．５重量％濃度になるよ
うに添加し、１０℃、１６時間反応させて表面処理を行
い、表面処理したシリカ粒子を得た。

（感作ＨＤＰの調製） 得られたパンクウィルス抗原を、 Ｍ／６０．ｐＨ７，２ｃ７）ＰＢＳを用いて２日ＤＰ凝
集単位の溶液とし、この抗原溶液５ｍＩ２と０．５％Ｈ
ＤＰ／ＰＢＳ　　５ｍＩ２とを混合し、室温でゆっくり
スターラーで撹拌しながら６０分間感作した。感作後Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、希釈液５ｍ９に懸濁して感作ＨＤＰ
とした。希釈液はＰＢＳに非動化ウサギ血清を１％添加
したものである。

（抗体価の測定） Ｖ型マイクロプレートに希釈液を０．０２５ｍｐずつ分
注し、第１番目のウェルに１：１０供試血清０．０２５
ｍ４を加えた。

これをグイリュータ−で倍数希釈を行ったのち、各ウェ
ルに感作ＨＤＰを０．０２５ｍｆｆ滴下した。

よく混和後、室温で４０分間静置した後、管底凝集像を
判定し、凝集を示す血清の最大希釈倍数をＨＤＰ抗体価
とした。

このような操作で供試血清２０検体につきＨＤＰ抗体価
を求めた。

結果を表に示す。

なお、表のＨＤＰ抗体価の欄において、（−）とは、供
試血清のＨＤＰ抗体価が５０以下の場合を表わす。

（比較例） 前記ＨＤＰ法に用いた供試血清２０検体について、蛍光
抗体法（ＦＡ）により、検知しつる供試血清の最大希釈
倍数をそのＦＡ抗体価として求めた。

結果を表に示す。

なお、表のＦＡ抗体価の欄において、（＝）とは、供試
血清のＦＡ抗体価が１６以下の場合を表わす。

［発明の効果］ 本発明によると、 ＋ｌ）不溶性担体粒子に対する抗体はありえないことか
ら、検体とする血清等に前処理を行なう必要がなく、 （２）また、特殊な機器を用いずとも、簡単かつ迅速に
バンクウィルスに感染しているか否かを診断することが
できる等の利点を有する腎症候性出血熱の診断用試薬を
提供することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ハンタウィルス抗原を不溶性担体粒子に感作して得られ
   る感作不溶性粒子を含有してなることを特徴とする腎症
   候性出血熱の診断用試薬。