JPH02299581A - 微生物 - Google Patents

微生物

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JPH02299581A
JPH02299581A JP2099442A JP9944290A JPH02299581A JP H02299581 A JPH02299581 A JP H02299581A JP 2099442 A JP2099442 A JP 2099442A JP 9944290 A JP9944290 A JP 9944290A JP H02299581 A JPH02299581 A JP H02299581A
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Friedrich Schmidt
フリードリツヒ・シユミツト
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    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/32—Ingredients for reducing the noxious effect of the active substances to organisms other than pests, e.g. toxicity reducing compositions, self-destructing compositions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ある種の新規な微生物に関するものである。
精製工場において、不純物として有機合成生成物を含有
する流出液を、活性汚泥法によって分解することは公知
である。この方法においては、流出液を大きな池中で空
気にさらすと、その中に、流出液は、望ましい分解を行
なうある種の微生物に富むようになる。しかしなから、
それによって得られる微生物組成物から、ある種の生成
物を分解することができる安定な製剤を単離することは
できない。その理由は、これらの微生物組成物の分解活
性は、この分解のために不充分であり、その上、その分
解活性は、少なくとも部分的に、仕上げ処理の間に失な
われるからである。
また、パン酵母は、生パンの調製の間に、殿粉と砂糖を
分解することか公知である。しかしなから、これらのパ
ン酵母を、それらの完全な活性を保持しながら、永久的
な粉末として、たとえは乾燥酵母粉として、安定ならし
めることは困難である。その上、乾燥したパン酵母は、
真空中または不活性ガス雰囲気下にのみ、活性の実質的
な低下なしに、保存することができる（リード（Ｇ。
Ｒｅｅｄ）ら、酵母技術、１９７３、ウェストボートア
ヒバブリケーションカンパニー、参照）。
更にまた、土壌中に生存する微生物が、殺虫剤として活
性な化合物、特に燐酸エステルおよびカルバミン酸エス
テル類を分解することが知られている（ラベグリア（　
Ｊ　、Ｌａｖｅｇｌｉａ）らによる総説文献、昆虫学の
アニュアルレビュ−１９７７、λス、４８３頁以下、お
よびその中に記載の参考文献参照）。
微生物の混合培養物は、たとえばパラチオンのような、
殺虫活性化合物の分解のために適していることもまた、
知られている。しかしながら、このような培養物は比較
的不活性であり且つ取扱いが困難である。このような培
養物から従来取得された製剤は、それ自体−１８℃にお
いて不安定であり且つ固体状態で製造することはできな
かった（ム不ツケ（　Ｍｕｎｎｅｃｋｅ）ら、アブライ
ドエンビロンメンタルミクロビオロジー、１９７６、３
２−、７〜１３頁参照）。
■．ここにおいて、工業的有機合成からの生成物の分解
のために用いられる微生物の安定化した活性化混合培養
物から出発して、常法により富化せしめた活性混合培養
物の培養条件を、分解せしめるべき生成物の添加によっ
て、その生成物の分解の速度に従かう通常の方法で、最
適化し且つこの混合培養物を、このようにして定めた最
適条件下に、安定化した活性化混合培養物へと少なくと
も２つの継代接種において転化さしめ、且つそれによっ
て取得した培養物を、その活性を保持しながら、それを
保護することにより貯蔵安定性ならしめるという方法に
よって、微生物の新規な貯蔵安定性製剤を取得しうろこ
とが見出された。
２、更に、この微生物の新規な貯蔵安定性製剤は、微生
物の安定化した活性化混合培養物から出発して、上記ｌ
に記すようにして製造した安定化した活性化混合培養物
を、直接にまたは、それらがその生活力を失なうことな
く貯蔵安定性ならし一：（− めである場合には、それらの保存物の形態で、接種物と
して使用し、且つｌに記した条件下に工業的な生産を遂
行し、かくして取得する培養物を、その活性を保持しな
から、注意深く乾燥するという方法によって、工業的な
規模で製造することができるということが見出された。
３、また、微生物の新規な貯蔵安定性製剤は、工業的有
機合成の生成物の分解のために用いられる微生物の活性
化した純培養物から出発して、上記１において得た混合
培養物の個々の菌株を、常法において用いられる複合培
地上で生長させ、これらの菌株をそれらの活性に従って
選択し且つ活性な菌株を常法に従って滅菌条件下に培養
し、その間に基質中に分解せしめるべき生成物を存在せ
しめ、且つかくして生ずる培養物を、その活性を維持し
ながら、注意深く乾燥するという方法によって、取得し
うろことが見出された。
４、工業的有機合成の生成物の分解に対して用いられ且
つ方法１または２に従って取得される、微生物の安定化
した活性化培養物から出発する、微生物の新規な貯蔵安
定性製剤もまた見出された。
５、工業的な有機合成の生成物の分解に対して用いられ
且つ方法３に従って取得される、微生物の安定化した活
性化培養物から出発する、微生物の新規な貯蔵安定性製
剤が更に見出された。
６、その上、微生物の新規な菌株もまた見出されＩこ。
本発明の方法によって、微生物の貯蔵安定性製剤を取得
することができるということは、意外なことである。従
来は、このような製剤は、可溶化した酵素を、担体、た
とえばガラスに対して結合させることによってのみ、安
定性することが可能であった（ムネツケ、アブライドエ
ンビロンメンタルミクロビオロジー、１９７７、工１、
５０３〜５０７頁参照）。しかしながら、この方法にお
いては、大きな活性の低下が生ずる。本発明の方法によ
ってのみ、工業的な条件下においてすら貯蔵安定性であ
り、長期間にわたって完全な活性を持続し且つ簡単、迅
速に、しかも経済的に使用することができる微生物の製
剤を、製造することが可能である。これらの製剤が、そ
の活性の原因となる酵素を単離する必要なしに、その活
性を持続するということは、驚くべきことである。
微生物の混合培養物を工業的な規模で取扱うことが困難
であることもまた、公知である。それ故、工業的な規模
で取扱うこともまた可能゛な、安定化した活性化混合培
養物を取得することができるということは、驚くべきこ
とである。
本発明の方法によって取得することができる細胞製剤は
、有機合成の生成物を、それらが望ましくない場所にお
いて分解させるために用いられる。
これらの製剤は、たとえば、有機生成物の製造の間に生
ずる流出液の処理のために、輸送用容器の清掃のために
、且つ事故によって生ずる汚染物を排除するため、また
は無害とするために、使用することができる。これらは
、皮膚および土壌の浄化のためにも、適している。
工業的有機合成の生成物とは、化学的な合成方法によっ
て工業的に製造される有機化合物をいうものとする（こ
れらは、天然源から生ずる、工業的な規模における、有
機化合物を意味するものではない）。本発明の意義にお
いては、工業的な有機合成の生成物は、たとえば、次の
ものを包含する・ （１）　植物保護剤、特に殺虫剤、ならびに除草剤およ
び殺菌剤： （２）　医薬製剤； （３）　染料、特にアゾ染料およびアントラキノン染料
； （４）　有機中間物、特に重合のために用いられる単量
体類、たとえばニトリル類、およびゴムの製造のための
助剤、たとえばスルホン酸、および有機溶剤、たとえば
芳香族化合物類。
殺虫剤は、次のものを包含する： （Ａ）　　カルバミン酸エステル類： （Ｂ）　　カルボン酸エステル類（ビレトロイド類を包
含する）： （Ｃ）　　リン酸エステル類； （Ｄ）　　シクロアルカン類： （Ｅ）　　ハロゲノアルカン類。
カルバミン酸エステル類（Ａ）は次の一般式を有するも
のであり、 上式において Ｒ３ハアリール、複素環式基またはオキシム基を表わし
、 Ｒ４は水素または１〜４炭素原子を有するアルキルを表
わし、 Ｒ５はアルキル、アルキル基中に１〜６炭素原子を有す
るアルキルカルポニルヲ表ワし、これらは場合によって
はヒドロキシまたはメチルチオによって置換してあって
もよく、あるいは基−５−Ｚ　　を表わし、ここで Ｚは、場合によってはハロゲンによって置換しである１
〜４炭素原子を有する脂肪族（特にＣＣ１，３およびＣ
Ｆ３）を表わし、または場合によっては、好ましくはニ
トリル、ハロケン（特に塩素）、メチル、トリハロゲノ
メチル、トリフルオロメチルメルカプトまたはニトロに
よって置換しであるアリール基、特にフェニルを表わし
、あるいはメチルカルボニルまたは基Ｗ−３Ｏ２−Ｎ　
−を表わし、 ここで Ｗはアルキル、ハロゲノアルキル、アルキルアミノ、ジ
アルキルアミノまたは、場合によっては、好ましくはハ
ロゲン、トリハロゲノメチル、ニトリル、メチルまたは
ニトロによって置換しであるアリール基を表わす。
特に好適な式（１）のカルバミン酸エステルは、その中
で Ｒ３が、場合によっては何れもそれぞれ１〜５炭素原子
を有するアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキル
メルカプトまたはアルキルチオアルキレンによって置換
しであるフェニルあるいはナフチル、アルキル部または
アルケニル部当りに３までの炭素原子を有するジアルキ
ルアミノあるいはジアルケニルアミノ、ハロゲン（特に
塩素）、ジオキソラニルまたは基　−Ｎ＝ＣＨ−Ｎ（ｃ
　ｒ〜４−アルキル）２を表わし、あるいはＲ３が、そ
れぞれ場合によっては０１〜．−アルキル（特にメチル
）によって置換しである２、３−ジヒドロベンゾフラニ
ル、ベンゾジオキソリル、ベンゾチェニル、ピリミジニ
ルまたはピラゾリル、あるいはアルキル部当り１〜４炭
素原子を有するジアルキルアミノを表わし、あるいは Ｒ３が、次の一般式を有するオキシム基を表わし ここで Ｒ６およびＲ７は同一または異なるものであり且つ何れ
の場合も５までの炭素原子を有するアルキル、シクロア
ルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキ
ルメルカプト、アルコキシカルボニル、カルボニルアミ
ドまたはアルキルメルカプトアルキル、ニトリル、アリ
ール（特にフェニル）、または場合によっては置換しで
ある複素環式基を表わし、あるいは複素環式基によって
置換しであるアルキル基を表わし、あるいは共同して場
合によりＣ１〜、アルキル基によって置換しであるジオ
キソラニルまたはジチオラニル基を表わす、 ものである。
特に以下のカルバミン酸エステル類を挙げることができ
る＝２−メチルフェニル−１２−エチルフェニル−１２
−ｎ−プロピルフェニル−１２−メトキシフェニル−１
２−エトキシフェニル−１２−イソ−プロポキシフェニ
ル−１４−メチル−フェニル−１４−エチルフェニル−
１４−ｎ−プロピルフェニル−１４−メトキシフェニル
−１４−エトキシフェニル−１４−ｎ−プロポキシフェ
ニル−１３，４，５−１−リメチルフェニルー、１−ナ
フチル−１２，３−ジヒドロ−２，２−ｉジアルケニル
−ベンゾフラニル−，２−［１，３−ジオキソラン−２
−イル−フェニル］−および２．２−ジメチル−１，３
−ベンゾジオキソル−４−イル−Ｎ−メチル−カルバミ
ン酸エステルならび番こ相当するＮ−メチル−Ｎ−アセ
チル−１Ｎ−メチル−Ｎ−トリフルオロメチルチオ−１
Ｎ−メチル−Ｎ−ジクロロモノフルオロメチルチオ−お
よヒＮ−メチルーＮ−ジメチルアミノチオカル／（ミン
酸エステル。
カルボン酸エステル（Ｂ）は次の一般式を有するものを
包含し、 晩 Ｒ８−ＧＯ−０−ＣＨ−Ｒ”　　　　（Ｉ［）上式にお
いて Ｒ８は場合により置換してあってもよし１アルキル、ア
ラルキル、アリールまたはシクロアルキル基を表わし、 Ｒ９は水素、アルキル、ノーロゲノアルキル、アルケニ
ル、アルキニルまたはニトロを表わし且つ Ｒ”はアリールまたは複素環式基を表わし、あるいは　
Ｒ９と共同して、場合によって−は置換しであるシクロ
ベンテノン環を形成している。
特に好適な式（Ｉ＋）のカルボン酸エステルは、その中
で Ｒ８が、場合によっては置換しであるフェニルによって
場合により置換しである１〜６炭素原子を有するアルキ
ル、または、何れの場合も６までの炭素原子を有するア
ルキル、アルケニル、ハロゲノアルキルあるいはハロゲ
ノアルケニルによって場合により置換しであるシクロプ
ロピルを表わし、または場合によって置換しであるフェ
ニルを表わし、且つ／または Ｒ９が、水素、１〜６炭素原子を有するアルキル、１〜
４炭素原子および３までの／＼ロゲン原子を有するハロ
ゲノアルキル、ニトリルまたはエチニルを表わし、且つ
／まｌこ　（ま Ｒ１０が、０１〜４−アルキル、ハロゲン（特にフッ素
または塩素）によって場合により置換しであるフェニル
、場合によって置換しであるフェノキシまたは場合によ
って置換しであるベンジルを表わし、あるいはそれぞれ
ハロゲン（特に塩素）、４までの炭素原子を有するアル
キルまたはアルケニルあるいはベンジルによって場合に
より置換しであるフラニル、テトラヒドロフタリミドま
たはベンゾジオキソリルを表わし、あるいはまた、０１
〜４−アルキル、フルフリルまたはＣ３〜、−アルケニ
ルにより場合によって置換しであるシクロベンテノン環
ヲ表わす、 ものである。
特に以下のカルボン酸エステルを挙げることができる：
酢［１１（３，４−クロロフェニル）＝２．２．２−ト
リクロロエチルエステル、クリサンテン酸２．３．４．
５−テトラヒドロフタルイミド−メチルエステルおよび
２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロペニル）−シ
クロプロパン−カルボン酸（５−ベンジル−３−フリル
）−メチルエステル。
燐酸エステル（Ｃ）は、次の一般式を有するものを包含
し、 Ｘ′ 上式において 記号Ｘ′は相互に独立的に○またはＳを表わし、 Ｙ′はＯ，Ｓまたは−ＮＨ−を表わし、あるいは中心の
Ｐ原子と基Ｒ１３の間の直接の結合を表わし、 Ｒ１＋およびＲ１２は同一または異なるものであり且つ
アルキルまたはアリールを表わし且つ Ｒ”はアルキル、アリール、ヘテロ−アリール、アラル
キル、アルケニル、ジオキサニルまたはオキシム基を表
わし、あるいはそれが結合している基と同一の基を表わ
す。
特に好適な式（Ｉ［［）の燐酸エステルは、その中で Ｒ１１およびＲ１２が同一または異なるものであり且つ
０１〜４−アルキルまたはフェニルを表わし且つ Ｒ１３がハロゲン、ヒドロキシル、ニトリル、場合によ
っては置換したフェニル、カルボニルアミド、スルホニ
ルアルキル、スルホキシアルキル、カルボニルアルキル
、アルコキシ、アルキルメルカプトまたはアルコキシカ
ルボニルによって場合により置換しである１〜４炭素原
子を有するアルキルを表わし、あるいはハロゲン、場合
によってはハロゲン置換したフェニルまたはアルコキシ
カルボニルによって場合により置換しである４までの炭
素原子を有するアルケニルを表わし、あるいは次の一般
式のオキシム基を表わし、 ここで Ｒ６およびＲ７は前記の意義（特にシアノまたはフェニ
ル）を有し、または ＲＩ３はそれが結合している基と同一の基を表わし、あ
るいは Ｒ１３はメチル、ニトロ、ニトリＬ、ハロケンまたはメ
チルチオによって場合により置換しであるフェニルを表
わし、あるいはＲ１３は、０１〜．−アルキルまたはハ
ロゲンによって場合により置換しである、たとえばピリ
ジン、キノリン、キノキサリン、ピリミジン、ジアジノ
ンおよびベンゾ−１゜２．１−トリアジンのような、ヘ
テロ芳香族基を表わす。
特に以下の燐酸エステル類を挙げることができる：Ｏ，
Ｏ−ジメチルーおよびＯ２０−ジエチル−〇−（２，２
−ジクロロ−ならびに２．２−ジブロモ−ビニル）−燐
酸エステノ呟ｏ、０−ジエチル−〇−（４−ニトロ−フ
ェニル）−チオノ燐酸エステル（＝バラチオン）、○、
Ｏ−ジメチルー○−（３−メチル−４−メチルチオ）−
チオノ燐酸エステル、○、Ｏ−ジメチルーＣ）−（３−
メチル−４−二トロ）−チオノ燐酸エステル、〇−エチ
ルー５−ｎ−プロピルー○−（２，４−ジクロロフェニ
ル）−チオノ燐酸エステル、〇−エチルー５−ｎ−プロ
ピルー〇−（４−メチルチオ−フェニル）−チオノ燐酸
エステル、０．Ｏ−ジメチル−５−［４−オキソ−１，
２，３−ベンゾトリアジン−３−イル−メチル１−チオ
ノチオール燐酸エステル、０−メチル−〇−［２−イソ
−プロピル−６−メトキシ−ピリミジンー４−イル１−
チオノメタン燐酸エステル、０，０−ジエチル−Ｏ−［
２−イソ−プロピル−６−メチル−ピリミジン−４−イ
ル］−チオノ燐酸エステル、０．０−ジエチル−〇−［
３−クロロ−４−メチル−クマリン−７−イル］−チオ
ノ燐酸エステル、０．０−ジメチル−２，２，２−１−
リクロロー１−ヒドロキシ−エタン−燐酸エステルおよ
び○、○−ジメチルー８−（メチンカルバモイルエチル
）−チオノ燐酸エステル。
シクロアルカン類（Ｄ）は、次の一般式を有するものを
包含し、 上式においてＨａｌはハロゲンを表わす。
特に１，２，３，４，５．６−ヘキサクロロヘキサンを
挙げることができる。
ハロゲノアルカン類（Ｅ）は、次の一般式を有するもの
を包含し、 上式において Ｈａ　ｌ’　ハ塩素または臭素を表わし、Ｒ”は水素ま
たはヒドロキシルを表わし、Ｒｌ５およびＲ１６は同一
または異なるものであり且つハロゲン、アルキルまたは
アルコキシを表わし且つ ＲＩ７は水素またはハロゲンを表わす。
特に好適な式（Ｖ）のハロゲノアルカン類は、その中で Ｒ１４が水素またはヒドロキシルを表わし、ＲＩ６およ
びＲ１６が同一のハロゲン、またはそれぞれ１〜４炭素
原子を有するアルキルあるいはアルコキシを表わし、且
っ Ｒ１７がハロゲンを表わす、 ものを包含する。
特に下記のハロゲノカルカン類を挙げることができる：
ｌ、ｌ、１−）ジクロロ−２，２−ビス−（４−クロロ
−および４−メトキシフェニル）−エタン、１，１．１
−トリクロロ−２−ヒドロキシ−２，２−ビス−（４−
クロロフェニル）−エタンおよび１，１−ジクロロ−２
，２−ヒス−（４−エチルフェニル）−エタン。
分解せしめるべき染料は、次のものを包含する：アント
ラキノン染料、アゾ染料、メチン染料、フェノキサジン
染料およびトリフェニルメタン染料。
分解せしめるべき有機中間体生成物は、次のものを包含
する：たとえばアセトニトリルおよびインブチロニトリ
ルのような単純なニトリル類；α−位にアミン基を有す
るニトリル類、たとえばα−アミノプロピオニトリル、
α−アミノ−γ−メチルチオブチロニトリル、α−アミ
ノブチロニトリルおよびアミノ−アセトニトリル：α−
位に水酸基を有するニトリル類、たとえばラクトニトリ
ル、ヒドロキシアセトニトリルおよびα−ヒドロキシ−
γ−メチルチオイソブチロニトリル；β−位にアミノ基
を存するニトリル類、たとえば、アミノ−３−プロピオ
ニトリル；たとえばマロノニトリル、スクシノニトリル
およびアジポニトリルのようなジニトリル類；たとえば
アクリロニトリルおよびメタアクリロニトリルのような
α−不飽和ニトリル類；たとえばホモベラトロニトリル
オよびベンゾニトリルのようなσ−アリールニトリル類
；ならびにたとえはニコチノニトリルおよびインニコチ
ノニトリルのような複素環式ニトリル類。
有機中間体生成物は更に次のものを包含する：アセト（
イル）ガンマ酸、アセト（イル）−Ｈ−酸、アセト（イ
ル）〜Ｉ−酸、アセ］・（イル）−に−酸、アレン酸、
アルファーナフトエ酸、アルファーナフチル酸、アルフ
ァアミン、アルファーヒドロキシナフトエ酸、アルファ
ー酸、アミド−Ｅ−酸、アミノ−Ｃ−酸、アミノーシカ
ゴ酸（１４８）、アミノクロモイン酸、アミノ−ニブシ
ロン酸、アミノ−Ｆ−酸、アミノ−Ｇ−酸、アミノナフ
ト−ル、アミノ−Ｉ−酸、２，３−アミノナフトール、
アミノナフトール（酸）Ｒ１アミノ−Ｒ−酸、アミノ−
Ｒ，Ｒ−酸、アミノーシエーファーのエーテル（酸）　
、アミノーシエーフア−の酸、アンドレセンの酸、アー
ムストロングの酸、エチル−ベーターナフトアミン、エ
チルクロモトロピン酸、アズリン塩基、アズリン酸、Ｂ
−酸、バデイツシエ酸、バイエル酸、ベンゼンスルホ−
ガンマ−酸エステル、ベンゼンスルホ−Ｒ−Ｒ−酸、ベ
ンゾイル−Ｈ−酸、ベンゾイル−■−酸、ベンゾイル−
に−酸、ベーターナフトエ酸、ベーター酸、ベーニゲル
酸、フレンネル酸、Ｃ−酸、カセラ酸、シカゴ酸Ｓ８１
クロモトロブ酸（４ＧおよびＣ）、■、６−および１．
７−クレープ酸、コロンビア酸、クロモイン酸、Ｄ−酸
、ダール酸、デルタ−酸、ジアミノゲン酸、ジメチル−
ガンマ−酸、ダイナ−酸、シノール、ジヒドロキシーシ
カゴ酸、ジヒドロキシ−Ｆ−酸、ジヒドロキシ−Ｇ〜酸
、ジヒドロキシ−■−酸、ドレン−１［、Ｅ−ＩＬ　エ
イコノジエン、ニブシロン酸、Ｆ−酸、フラビアン酸、
フロイント酸１３６．７０インド酸１３７、Ｇ−酸、ガ
ンマ−酸、ガイギー酸、Ｈ−酸、Ｈ−酸エステル、Ｈ−
酸スルファミド、■−酸、■−酸尿素、■−ジ酸、イミ
ダゾール−Ｉ−酸、イソ−コロンビア酸、イソーＩ−酸
、イソノイ酸、Ｋ−酸、コツホ酸、Ｌ−酸、ラウレント
酸、Ｍ−酸、メラニン酸、メタゾリン酸、メチルアミノ
−Ｆ−酸、メチル−ベーターナフトアミン、メチルパラ
ゾール−■−酸、マイヤーランドショツ７酸、ムシジン
、ナフタレンジオン酸Ｆ１ナフタレン塩、ナツトアミン
ジオン酸１４７、ナフトアミンジオン酸１５７、ナフト
アミン酸１３、ナフトアミントリオン酸１，２４７およ
びｌ。
２４８、ナフトアミントリオン酸２，１５７、ナンドア
ミントリオン酸に、ｏ−ナフチオン酸、ナフチオン酸、
ナフトールジスルホン酸ｃ１ナフトールジスルホン酸Ｆ
１ナフトールジスルホン酸Ｓ１ナフトールイエロー、ナ
フトール−■−酸、ナフトール酸１３、ナフトール酸Ｆ
Ｆ、ナフトール酸Ｐ１ナフトール酸Ｓ１ナフトールスル
ホン酸２１ナフトールトリ（スルホン）酸ＲＲ，ナフト
ールトリ（スルホン）酸Ｔ１ナフチルアミンジスルホン
酸■、ナフチルアミンジスルホン酸ｓ１ナフヂレン酸１
２５、不カールＢＸ、ノイ酸、ネビルおよびウィンザー
酸、ニトロチン酸、ニトロジアゾアミトール酸、ニトロ
ジアゾーベーニガー酸、ニトロソ〜Ｒ−酸、０−ナフチ
オン酸、５−ヒドロキシ−Ｃ−酸、ヒドロキシーシカゴ
酸、ヒドロキシーコツホ酸、ヒドロキシ−し−酸、ヒド
ロキシナフトエ酸２１１８−ヒドロキシナフチル酸、ヒ
ドロキシ−Ｒ−酸、ヒドロキシートピアス酸、バラデュ
ロール、バラゾール−Ｉ−酸、パトロール−Ｉ−酸、ぺ
り酸、フェニル−ガンマ−酸、フルプル酸、プルブロー
ル、プロプロール酸、Ｒ−Ｍ、２Ｒ−酸、Ｒ，Ｇ、−酸
、ローデュリン酸、ＲＭ酸、レッド酸■、ＲＲ−酸、Ｓ
Ｓ−酸、酸■、ルドルフおよびグエルケの酸、シエーフ
ァー酸、シエーフア−に一酸、シャイブ塩、シーコツホ
酸、スルファミジン酸、スルホエチル−ガンマ−酸、ス
ルホ−ガンマ−酸、スルホ−Ｉ−酸、スルホナフチル酸
６、スルホナフチル酸８、ブラック酸、Ｔ−酸、テトラ
酸、トビアス酸、トリヒドロキシ−Ｒ−酸、トリー塩、
バイオレット酸（Ｎ）およびＷ酸、更にはフェノール、
ニトロフェノール、クロロフェノール類、クロロニトロ
フェノール類、ベンゼン、クロロベンゼン類ならびにア
ニリン類。
ある種の有機合成生成物を分解する性質を有する微生物
の新規または公知の混合培養物は、何れも、新規製剤の
製造のための本発明による方法における出発材料として
使用することができる。
新規な混合培養物は、土壌、精製工場における活性汚泥
、または非滅菌条件下に分解せしめるべき生成物と連続
的に接触する表面水または表面（たとえば製造工場の壁
および床）から試料を採取し、且つ通常の条件下に、分
解せしめるべき生成物と共に培養するという方法によっ
て、取得する。培養は、分解せしめるべき生成物を開裂
させることができる活性な混合培養物を取得するまで、
何回も繰返す。しかしながら、分解せしめるべき生成物
を基質中に使用して、培養を連続的に行なうことも可能
である。
このような混合培養物は、原虫類、藻類、青緑藻類、酵
母類、菌類、細菌およびこれらの何らかの混合物から成
るものとすることができる。菌類および／または細菌の
混合培養物が特に好適である。
菌類は次のものを包含する：変形菌類、アクラシアレス
（Ａｃｒａｓｉａｌｅｓ）　、藻菌類、舞子菌類および
酵母類、担子菌類ならびに不完全菌類。
細菌は次のものを包含する：たとえばロードスピリラ科
（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）　、りａマチ
ア科（Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ）およびクロロビア
科（Ｃｈｌｏｒｏ−ｂｉａｃｅａｅ）のような、局光性
細菌：たとえば粘液球菌科（Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａ
ｅ）　、アルカンジウム科（Ａｒｃｈａｎｇｉａｃｅａ
ｅ）　、ポリアンジウム科（Ｃｙｓｔｏ−ｂａｃｔｅｒ
ｉａｃｅａｅ）、ポリアングラ科（ＰＯｌｙａＨｇｒａ
ｃｅａｅ）、シストファガ科（Ｃｙｓｔｏｐｈａｇａｃ
ｅａｅ）　、ベンジャト科（Ｂｅｇｇｉａｔｏａｃｅａ
ｅ）　、シモシエラ科（Ｓｉｍｏｎｓｉｅ−１ｌａＣｅ
ａｅ）、ロイコトリキア科（Ｌ６ｕＣ０１４−ｉｃｈａ
ｃｅａｅ）のようなりリービング（ｃｒｅｅｐｉｎｇ）
細菌；たとえばスフエロチラス属（Ｓｐｈａｅｒｏｔｉ
ｌｕｓ）、レプトスリツクス属（Ｌｅｐｔｏｔｈｒ　ｉ
ｘ）および分岐菌属（Ｓｔｒｅｐ−ｔｏｔｈｒｉｘ）の
ような有角細菌；たとえばハイフオミクロビウム属（Ｈ
ｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）　、ハイ７オモナス属（
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ）　、ペドミクロヒウム属（Ｐｅ
ｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）　、コーロバクター属（Ｃａ
ｕｌｏｂａ−ｃｔｅｒ）　、ガリオネラ属（Ｇａ　１１
１ｏｎｅ　Ｉ　Ｉａ）およびネヴスキア属（Ｎｅｖｓｋ
ｉａ）のような発芽および有柄細菌；たとえばスペリラ
科（５ｐｅｒ　ｉ　ｌ　１ａｃｅａｅ）のような螺旋形
細菌；更にはニアクロマチウム科（Ａｃｈｒｏｍａｔｉ
ａｃｅａｅ）　、プソイドモナス科（Ｐｓｅｕ−ｄｏｍ
ｏｎａｄａｃｅａｅ）　、窒素菌科（Ａｚｏｔｏｂａｃ
ｔｅｒａｃｅａｅ）、根生菌科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅ
ａｅ）　、メチロモナス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄ
ａｃｅａｅ）　、フラボバクテリウム科（Ｈａｌｏｂａ
ｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　、アルカリ菌属（Ａｌｋａｌ
ｉ−ｇｅｎｅｓ）　、酢酸菌属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ）　、腸内菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅ
ａｅ）　、ビブリオナス属（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ
）　、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、有色バ
クテリウム属（Ｃｈｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　、フ
ラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
　、血好菌属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）　、アクチノ
バチルス属（Ａｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、連
鎖桿菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）　、デサル
７オヒブリオ属（Ｄｅｓｕｌｐｈｏｖｉｂｒｉｏ）　、
セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）　、ナイセ
リア科（Ｎｅｉ−ｓｅｒｉａｃｅａｅ）　、アシ不Ｉ゛
バクター属（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃ−ｔｅｒ）、ニトロ
バクテリア科（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、
硫黄菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）　、硫黄菌属（Ｔ
ｂ　１ｏｂａｃ　ｔｅ−ｒｉｕｍ）　、シデロカプサ科
（５ｉｄｅｒｏｃａｐｓａｃｅａｅ）、メタノバクテリ
ア科（ＭｅｔｈａｎｏｂａｃＬｅｒｉａｃｅａｅ）、好
菌科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）　、連鎖球菌族
（５ｔｒｅ−ｐｔｏｃｏｃｃａｓｅａｅ）　、ペプトコ
ツカス科（Ｐｅｐｔｏｃｏ−ＣＣａＣｅａｅ）、バチル
ス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）　、乳酸桿菌科（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）　、コリネバクテリウ
ム属（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕＩｎ）　、アルト
ロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）　、セルロ
モナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏ−ｎａｓ）　、クルチア
亜属（Ｋｕｒｔｈｉａ）　、プロピオンバクテリウム科
（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　、放
線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、ミコバク
テリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　、
アクチップラナス科（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅａｅ
）およびノカルジア科（Ｎｏｃａ−ｒｄｌａＣｅａｅ）
　。
分解の遂行のための最適培養条件を、次いでこのように
して取得した活性混合培養物に対して、決定する。
そのためには、次の要因に合致することが必要である： ■、温度 ２、ｐＨ値 ３、酸素の分圧 ４．窒素、燐、硫黄、カルシウム、鉄、重金属などの供
給を調節するための、無機塩類の含量。
５、量および連続的または不連続的の両点に関しての、
分解せしめるべき生成物の添加量。
６、培養時間 ７、撹拌速度 ８、特に難溶性の生成物の場合において、分解せしめる
べき生成物に対する配合助剤。
次いで最適培養条件を確立するために、これらの要因を
、独立的にまたは組合せとして、変化させ、且つ分解せ
しめるべき生成物の分解の間の活性を、連続的に監視す
る。それによって個々の要因に対して決定した培養条件
は、下記の範囲である： ■、温度１０〜７０°Ｃ ２、ｐＨ値１〜１０ ３、酸素濃度０−４８　＋ｎＢ／　ｊ２４、燐酸含量ｐ
ｏ、（３−’０−００〜Ｌｏｇ／Ｒ。
窒素含有塩ＣＮＨ，Ｃ１として）０〜５０ｇ／ｌ。
マグネシウム（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４として）０．０１〜２
ｇ／ｌ、鉄（塩として）０．０１〜０．１ｇ／Ｊ２１力
ルンウム（Ｃａ　Ｃｊ２２として）　０．００−０．１
　ｇ／ｌおよび、たとえば、なかでもＣＨ，Ｃｏ、Ｍｎ
’％ＺｎおよびＢａのような微量元素。
５、分解せしめるべき生成物を、生長限界濃度または過
剰の何れかで、加える。生長限界濃度の場合には、生長
に対応するようにした流速で、連続的に加えることもで
きる。
６、培養時間は５時間乃至１４日とする。
７．１分間当り０〜１５００回転の実験室規模の撹拌速
度。
８、使用する乳化剤および分散剤は、たとえば、非イオ
ン、陰イオン乳化剤、たとえばポリオキシエチレン脂肪
酸エステル類、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエー
テル類、たとえはアルキルアリールポリグリコールエー
テル類、スルホン酸アルキル類、硫酸アルキル類、スル
ホン酸アリール類およびアルブミン加水分解生成物、た
とえばリグニン−亜硫酸パルプ廃液ならびにメチルセル
口一スである。
これらの基準の組合わせによって、混合培養物は、非滅
菌条件下に活性の低下か生ずることなく働らかせること
かできる程度まで、安定化される。
次いで活性混合培養物を、決定した最適条件下に、安定
化した活性化混合培養へと、少なくとも２代、一般には
２〜５０代の継代接種で、転化させる。
この過程において、比較的小さな規模（小バンチ容量）
で、有機合成生成物の分解を生じさせる性質のそれ以上
の増大が、それ以上の接種によってもはや生じなくなる
混合培養物を取得するために必要な代の回数の接種を行
なう。
安定化した活性化混合培養物を貯蔵安定性ならしめる。
これは、培養物を凍結するか、またはそれを注意深く乾
燥することによって、たとえは凍結乾燥、有機溶剤によ
る水の除去、または噴霧乾燥によって、あるいは、たと
えばくえん酸、安息香酸、ギ酸、サリチル酸、糖または
塩化すトリウムのような防腐性薬品の添加により培養物
を安定性ならしめることによって、行なうことができる
。
なかんずく、大きな工業的規模において培養物を貯蔵安
定性ならしめるための好適方法は、培養液から微生物組
成物を分離し且つそれを凍結乾燥によって、または有機
溶剤によって、水を除去することにより乾燥する方法で
ある。
上記のようにして安定化した活性化混合培養物を貯蔵安
定性ならしめるための方法を、生活力が失なわれないよ
うに選ぶならは、製剤は、その後のバッチ、たとえば大
規模の工業的バッチのための接種物として、保存し且つ
使用することができるようになる。生活力の低下なしに
培養物を貯蔵安定性ならしめるためのかかる方法は、た
とえば、培養液を凍結乾燥し、且つそれを、たとえばグ
リセリンまたはジメチルスルホキシドのような防腐性物
質を添加しまたは添加せずに、０°Ｃ以下の温度で貯蔵
し、凍結乾燥し、または液体窒素中で保存する。かくし
て得られる安定化した活性化混合培養物の保存物は、大
規模の工業的バッチに対する接種物として、任意の時期
に使用することができる。
このような大規模の工業的バッチは、上記のようにして
得た安定化した活性化混合培養物を直接にまたはその保
存物の形態で、接種物として使用して、前記の最適条件
下に常法によりバッチ的に処理する。
大きな工業的規模における安定化した活性化混合培養物
の培養の場合には、分解せしめるべき生成物を、その性
質に依存して、直接に、または全バッチ中での生成物の
良好な均一混合を許す配合物の形態の何れかにおいて、
あるいは適当な乳化剤または分散剤と共に、使用するこ
とが有利である。
純培養物は、常法に従がい、前記のようにして得た安定
化した活性混合培養物から、それらの開裂活性に従かう
選択によって、取得することができる（ミクロビオロジ
ー、第３ａ巻、３０５〜３６１頁、第３ｂ巻１−３２９
頁、第４巻、ｌ〜４６０頁中の方法参照）。たとえば菌
株プソイドモナスｓｐｅｃ　ｐｋ６　（ＤＳＭＩ　ｌ　
９２　：微工研菌寄第４６６３号）、プソイドモナスｓ
ｐｅｃ　５　（ＤＳＭ１１９３：微工研菌寄第４６６４
号）、プソイドモナスｓｐｅｃ　６　（ＤＳＭＩ　ｌ　
９４　：微工研菌寄第４６７９号）、プソイドモナスｓ
ｐｅｃ　１１　（Ｄ　５Ｍ１１９５：微工研菌寄第４６
６５号）、プソイドモナスｓｐｅｃ　ｌ　２　（ＤＳＭ
Ｉ　１９６　：微工研菌寄第４６６６号）、プソイドモ
ナスｓｐｅｃ　１４（ＤＳＭ１１９７：微工研菌寄第４
６６７号）、プソイドモナスｓｐｅｃ　ｐｋ　９　（Ｄ
ＳＭＩ　１９８　：微工研菌寄第４６６８号）、プソイ
ドモナス５ｐｅＣｐｋ　１０　（ＤＳＭ１１９９：微工
研菌寄第４６６９号）は、このようにして単離された。
かくして取得する純培養物は、通常の栄養培地中で培養
することができる。分解せしめるべき生成物は、その際
基質中に存在せしめることができ、または誘導質として
低濃度で基質に加えることができ、あるいは特別の場合
にそれを完全に省略することができる。
かくして生ずる純培養物から、生活力を持続しながら、
貯蔵によりその後のバッチのだめの接種−３５＝ 物を取得すること、または培養液から微生物組成物を分
離し且つ前記５における本発明による製剤を取得するた
めにそれを注意深く乾燥すること、の何れも可能である
。その際、乾燥は、安定化した活性化混合培養物からの
本発明による製剤の取得に対して先に記したようにして
、行なうことができる。
純培養物は、前記のように大きな工業的規模において、
バッチ的に培養することもできる。
以下の記述において、例として殺虫活性化合物、好まし
くは燐含有活性化合物、特にパラチオンを分解するため
の製剤を用いて、本発明を例証する。
燐含有活性化合物、特にパラチオンの分解のための混合
培養物は公知である（ムネツケら、アブライドミクロビ
オロジー、１９７４、Ｉ盈、２１２〜２１７頁参照）。
安定化した活性化混合培養物は、それから、本発明の方
法によって取得することができる。この方法は、下記の
条件下に、少なくとも２代の継代接種において行なわれ
る： ３６一 温度範囲は２０〜３５°Ｃ１好ましくは２４〜３０℃、
特に２５〜２８°Ｃである。
ｐＨ範囲は、６．５〜９．０、好ましくは７．５〜７．
９、特に７，５〜７．６である。
分解せしめるべき燐含有活性化合物は、活性化合物の濃
度が約１０ｐｐｍ以上に上らず且つ開裂生成物ｐ−ニト
ロフェノールの濃度が３０ｐｐｍ以上に上らないような
具合に、生長に相当するように調節した不連続的流速で
、炭素およびエネルギーの単−源として、培養物に供給
する。これらの基準の組合わせによって、混合培養物を
、活性化合物の分解活性を変化させることなく非滅菌条
件下に働らかせることができるように、安定化させる。
このようにして取得する混合培養物は、新しい発酵のた
めの接種物として使用することができ、且つ一１８°Ｃ
において長期間にわたり、生活力を失なうことなく保存
することができる。これらの基準によって取得しうる活
性収率は、パラチオンに対して、従来の技術により公知
の相当する培養物のそれよりも１０〜２０倍も大である
。かくして得た混合培養物から、適当な乾燥方法、たと
えば凍結乾燥、によって製剤を単離するときは、その活
性は、蛋白質１ｍｇ当りとして、従来の文献記載のもの
の１０倍も大である。驚くべきことに、この種の製剤は
、担体に結合せしめることなしに、室温においてすら、
やはり長期にわたって保存することができる。
燐含有活性化合物、特にパラチオン、を分解する純培養
物を、かかる混合培養物から単離することができる。
驚くべきことに、このような純培養物は、通常の複合栄
養培地、たとえば酵母抽出物中で、生長基質としての付
加的な燐含有化合物、および燐含有活性化合物を開裂す
る活性化剤なしで、培養することができる。燐含有活性
化合物の分解を生じさせるそれらの活性は、驚くべきほ
ど持続する。
これらの純培養物から、生物質の注意深い乾燥、たとえ
ば凍結乾燥、によって、工業的な目的に対して適する高
度に活性な撒布剤を、同様に取得することができる。従
来用いられている酵素溶液と異なって、この粉末は、室
温においてすら、数年間は安定である。この製剤の水性
懸濁液を、有機溶剤または洗浄剤を用いて処理すること
によって、完全に水溶性の酵素製剤を取得することがで
きる。
有機溶剤または洗浄剤によって処理する湿った細胞を、
直接に、可溶性酵素製剤の製造のための出発材料として
、使用することもできる。
詳細には、パラチオン分解製剤を取得すべき場合は、前
記の公知混合培養物から出発して、次のような手順に従
かう（前記参照）。
■、無機窒素含有塩、たとえば（ＮＨ＜）ｚｓＯａ、お
よび通常の栄養塩を含有する培地を、公知の混合培養物
の活性化のために使用する。これらの物質の濃度は広い
限界内で変えることができる。下記の範囲の濃度が好適
である＋０．０５〜０．２ｇ／ｌのＭｇ５Ｏ１，０，Ｏ
１〜０．０５ｇ／βのＣａ　Ｃ４２２，０，１−１，０
ｇ／Ｉｔの（Ｎ　Ｈ＋）ｚ　Ｓ　Ｏ４，０，００１〜０
．０１ｇ／４２の鉄塩、０．５〜５．０ｇ／ｌのに２Ｈ
ＰＯ４および０．１〜１．Ｏｇ／ｊ２のＫＨ２Ｐｏ４゜
ｐＨ値を、緩衝液によって、６．５〜−３９＝ ９．０、特に燐酸塩緩衝液によって７．５〜７．９に調
節する。ｐＨ値は、ＮａＯＨの添加によって、７．６に
一定に保つことが特に好都合である。このような溶液を
、保存物からの細胞によって接種する。接種物の量は、
広い範囲内で変えることができる。培養液１０１当りに
０．１〜５．０ｇ、特に０．５〜１．Ｏｇの乾燥細胞物
質が最適量である。
これらの培養物を２０〜３７°Ｃ１好ましくは２４〜３
０°Ｃにおいて培養するが、２５〜２８°Ｃが特に好適
な温度範囲である。
混合培養物を生長させるために、ポンプを用いてパラチ
オンを、ニトロフェノール（パラチオンの開裂生成物）
が全く、または痕跡しか、醗酵の間に存在することがで
きないような具合に、連続的に計り入れる。１時間当り
に計り入れる量は、培養物の生長に依存し且つ生体物質
の濃度の増大に従って、連続的に増大させる。たとえば
、１０βの培養物に対して最初に１時間当り０．１−の
パラチオンを、且つ最後に１時間当り０．７５ｍｊ２の
パラチオンを供給し、その間、醗酵槽中のパラチオン濃
度が常にｌｏｐｐｍ以下にとどまるようにする。醗酵時
間は５〜７日間、好ましくは６日間とする。培養基１１
当り約１ｇの乾燥重量という細胞密度が、５０＋ｎｌの
純パラチオンの消費によって、達成される。
低い混合速度においてのみ醗酵を遂行することができる
醗酵バッチの場合においては、炭素源としてパラチオン
配合物を用いることが望ましく、それによって醗酵槽内
の良孝な分散が達成される。
た七えば、有機溶剤および乳化剤を含有する配合物を使
用することか可能である。適当な配合物は、たとえば、
３部のインプロパツール、１部のパラチオンおよび０．
０１部のアルキルアリールポリグリコールエーテルから
成るものである。
このように取得した培養液の、燐酸エステルに対する、
開裂活性は、はぼ同一の醗酵時間とパラチオン使用量に
おいて、純パラチオンを用いて生長させる培養物の場合
におけるよりも、５０〜１００％高い。
通常の複合培地、たとえは、酵母抽出物、酵素自己溶解
物または肉エキス培地、は、純培養物から活性細胞培養
物を製造するために用いて最良である。加うるに、たと
えば有機酸類、アミノ酸類、カルボン酸類、たとえばコ
ハク酸、且つまたニトロフェノールのような、その他の
炭素源を加えることもまた、可能である。純培養物を用
いる場合には、醗酵時間は、混合培養物および炭素の有
機源としてのパラチオンを用いる醗酵と比較して、かな
り短かくなり、活性収率は同一またはかなり増大する。
しかしながら、燐酸エステルを開裂する細胞製剤を製造
するための純培養物の使用は、滅菌操作条件を必要とす
る。
醗酵の終点は、燐酸エステルに対する培養物の開裂活性
が増大する速度によって、与えられる。
培養は、活性のそれ以上の顕著な増大を認めることがで
きなくなったときに、中止する。
燐酸エステルを開裂する製剤を製造するためには、微生
物組成物を、遠心分離によって単離する。
それを、たとえば出発容量の１／ｌＯ〜１／２０の蒸留
水中に取り且つ撹拌によって均一に分散させる。懸濁液
を再び遠心分離し、上澄液を廃棄したのち、沈降物を再
び、たとえば出発容量の１１５０〜ｌ／１００の蒸留水
中に取る。この懸濁液を凍結したのち、凍結乾燥する。
生ずる乾燥生成物は水に不溶性であるが、容易に水中に
懸濁させることができる。これは、燐酸エステルに対す
る全開裂活性を含有している。
より簡単ではあるが、しかし活性の多少の損失を伴なう
乾燥方法は、たとえば、容量で１０部（押固めた細胞容
積に対して）の有機溶剤、特にアセトンまたはエタノー
ルによる２回の抽出によって、蒸留したＨ２Ｏを用いて
単離した微生物沈降物から、水を除去する方法である。
脱水した微生物沈降物を、次いで２０ｍｍＨｇの圧力下
の真空乾燥基中で、２０〜３０°Ｃにおいて乾燥する。
新鮮な、または凍結し且つ解凍した微生物細胞の、水ま
たは緩衝液（たとえばＯ，１ＭＸｐＨ６〜９）中におけ
る懸濁液は、乾燥した、しかし水溶性の酵素製剤の製造
のだめの出発材料として使用して、最良である。しかし
ながら、凍結乾燥した微生物細胞の適当な懸濁液もまた
、使用することができる。微生物細胞懸濁液を１〜５％
の、たとえば、デオキシコール酸ＮａまたはトリトンＸ
１００のような、界面活性物質を用いて、あるいは２〜
１０容量％のブタノールを用いて、２５〜２７°Ｃにお
いて０．５〜８時間培養し、次いでバンチを遠心分離し
たのち、上澄液を、直接に（ブタノールが可溶化剤であ
る場合）、または蒸留水に対して予め透析したのちに（
界面活性物質を用いる場合）、凍結乾燥する。かくして
取得する試験製剤は、初期活性の約５０％を含有し、そ
れらの比活性は、使用する出発材料のそれの２〜３倍も
高く、且つそれらは、水または緩衝液中に溶解して透明
な溶液を与える。
以下の実施例は、本発明の全般的適用性の限定を意味す
るものではなく、本発明を例証するためのものである。
試薬は、パラチオン分解微生物を用いて行なう。
実施例１ パラチオン分解活性を測定するための試験０．１Ｍの燐
酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，２、アリロキシポリグリコ
ールエーテルの水中における濃度ｌＯ％の溶液およびパ
ラチオンのエタノール中における濃度１％の溶液を必要
とする。基質溶液を調製するために、０．３ｍβの乳化
剤水溶液を５０ｍβの緩衝剤溶液中に撹拌しながら加え
、次いで２　＋ａｌｌのパラチオンエタノール溶液を徐
々に加える。
試験のために、２．４＋ｎｌの上記基質溶液を、２５°
Ｃに温度調節したセル中に導入する。同じ基質溶液を、
空試験としても使用する。温度を調節したのちに、１０
０μｌの緩衝剤溶液を空試験セル中に導入し、且つ１０
０μβの酵素溶液、懸濁液または培養液を、後者はトル
エンによる予備処理後に（下記参照）、測定セル中に導
入して、４１Ｑｎｍにおける吸光の変化を記録して、生
成するパラ−ニトロフェノールすなわち開裂したバラチ
オンのμモル数に変換する。
■酵素単位（Ｕ）は、上記の試験条件下に、１分間当り
に１μモルのパラチオンの開裂、あるいは１分間当りに
１μモルのパラ−パラチオンの遊離、として定義する。
培養溶液中の新鮮な細胞または新鮮な細胞懸濁液を試験
するためには、これらを先ず分解しなけれはならない。
そのために、０．２％の１〜ルエンを、試験すべき試料
に加え且つ混合物を３０°Ｃにおいて３０分間撹拌しな
がら培養する。このように予備処理したｌＯ〜１００μ
Ｂの試料を試験する。凍結乾燥した細胞または凍結した
のち解凍した細胞の場合においては、トルエン処理は不
必要であり且つ試験すべき試料の活性に何らの変化も与
えない。
以下の実施例においては、上記のようにして測定した活
性をＵ単位で示す。
実施例２ 燐酸エステルを開裂する、従来から公知の混合培養物か
らの、活性化した、安定化混合培養物の製造 活性化した、安定化混合培養物を製造するために、先ず
以下の原液を調製した： 原液１：１Ｍの燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，６、原液
２：ｌＯ，Ｏｇの硫酸アンモニウム、０．６ｇの塩化カ
ルシウム、４．０ｇの硫酸マンガンおよび１０１００Ｏ
の水、 原液３：３．Ｏｇの硫酸鉄（Ｉ［）および１０１００Ｏ
の水、 原液４：微量元素の常用の溶液。
ｌＯｌの水中に、１００−の原液１．２０〇−の原液２
および１０ｍ１の原液３と４を含有する無機塩培養基を
、培養物の生長のために使用した。
ムネツケらによりアプライドミクロビオロジー１９７４
．２８．２１２〜２１７頁中に記されているパラチオン
開裂混合培養物を、出発培養物として使用した。
すなわち、出発培養物としてプソイドモナスｓｐｅｃ　
６　（ＤＳＭＩ　１９４　；ＦＥＲＭ−Ｐ−４６７９）
及びプソイドモナスｓｐｅｃ　５　（Ｄ　ＳＭ　Ｉ　Ｉ
９３　、ＦＥＲＭ−Ｐ−４６６４）を使用した。
この培養物を、９１の無機塩培地を含有するｌＯｌの醗
酵槽中で、生長させた。ムネツケらによって記されてい
るようにして生長させた活性混合−４７＝ 培養物のＩｇの生体物質（乾燥重量に対し）によって、
それを接種した。醗酵槽培養物に、２５〜２８°Ｃにお
いて、１分間光りにＩＯＡの空気を撹拌（１２００回転
／分）しながら通気した。滴定器を使用し、２．５Ｎ　
　ＮａＯＨを用いて、ｐＨ値を７．５〜７．６に調節し
た。生長基質としてパラチオンを使用した：それを、醗
酵バッチ中に、醗酵槽中のパラチオン濃度が生長を限定
するような具合に、連続的に加えた。実際のパラチオン
濃度が１０ｐｐｍ以下であり且つニトロフェノールを全
く検出し得ない場合に、このような条件が存在した。
培養を、後続する生長過程に対する接種物として先行す
る生長過程のＩＰを使用して、４代の連続継代接種で、
行なった。培養期間は３〜６日であった。醗酵槽バッチ
中に、活性の僅かな増大しか認められなくなったとき、
または活性の増大が全く認められなくなったときに、培
養を中止して、次の代の培養を開始させた。
４代の継代接種にわたる混合培養物の活性の増大を、第
１表に示す。
募土遣 像！ｊ　培養期間（日）醗酵終了時の活性（Ｕ／β）１
　　　　３　　　　　　　　３１．５４　　　　６　　
　　　　１．１４０ 混合培養物を５伏目の培養において生長させても、それ
以上は活性が増大しなかった。これは第２表に見ること
ができるが、第２表中には活性の増大に加えて、パラチ
オンの添加量、醗酵中に消費されたパラチオンの量およ
び生体物質の増大が、醗酵時間の関数として、示されて
いる。醗酵時間は１２３時間とした。１！当り４．４ｍ
βのパラチオンの全消費量において、培養基１２当りに
１゜３４０Ｕのパラチオン開裂活性を有する、培養基１
１当り４８０ｍｇの乾燥重量という細胞密度が達成され
た：これは、乾燥細胞１ｇ当り２，８００Ｕの活性に相
当する。
策２８　：時間の関数としてのパラチオン醗酵醗酵時間
　活性　乾燥重量　連続添加量　パラチオン（時間）　
　（Ｕ＃り　　（ｇ／ｊ２）　　　（ｍβ／時）　消費
量（ｍβ）０　　　１１９　　０．０４５ ２５　　　　　　　　　　　　０．１５　　　３．８０
５６．５　　　　　　　　　　　０．２０　　　１０．
００７１．５　　３７５　　０．２９　　　０．３７５
　　１５．９０９５．５　　８２０　　　　　　　０．
５００　　２７．９０１１９．５　１，３４０　　０．
４８　　　０．５００　　３９．９０１２３　　　　　
　回　　収　　　　　　　０．７５０　　　４２．５０
このようにして取得した活性化した、安定化混合培養物
を、遠心分離によって、最初の容量の１／１０に濃縮し
て、−１８°Ｃにおいて保存した。
それを、その後の醗酵バッチに対する出発培養物として
使用した。
凍結乾燥された後の乾燥酵素調製物の貯蔵安定性は下記
の通りであった。
表中 方法工：超音波処理、アセトン洗浄後乾燥方法■：アセ
トン洗浄後乾燥 方法■：液体窒素中凍結後乾燥 実施例３ パラチオン配合物を使用する活性細胞材料の製培養条件
は、大部分は実施例２に記したものと一致する。しかし
純バラチオンの代りに、次の組成のパラチオン配合物を
使用した：１５０＋Ｊのインプロパツール、５０−のパ
ラチオンおよび０゜５−のアルキルアリールポリグリコ
ールエーテル。
８．５１の培地を、実施例２に記した８０−の保存混合
培養物で接種し且つ培養を１２３時間行なった。パラチ
オン配合物は連続的に導入した。
醗酵は非滅菌条件下に行なった。
記載の時期に取得した培養液の活性、パラチオンの消費
量およびその他の醗酵データを、第３表に示す。
＝５２− 培養基ＩＡ当り４　、２　＋ｎβの純パラチオンの全消
費において、乾燥細胞１ｇ当り２，３００Ｕの比活性が
、パラチオン配合物を用いて、達成された。
実施例４ 基質として純パラチオンを使用する、２０００１規模に
おいての、活性化混合培養物の製造１０００ｇの（ＮＨ
４）２Ｓ　０４　Ｓ　３０　ｇのＣａＣｊ！ｚ、２００
ｇのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ＋　、３．１００　ｇのに２ＨＰＯ
，，６００ｇのＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏｌ　、６　ｇのＦｅＣｌ
２および２，０００ｍβの微量元素の溶液を、２０００
Ａの脱イオン水に加えた。
２０００ｊ２の醗酵バッチを、実施例２に記した保存培
養物から出発して、実施例２に記した培養条件下に、Ｉ
Ｌ　２０１および２００βにわたる継代接種において取
得した、２００１の予備培養物を用いて接種した。この
醗酵バッチを、２４０回転／分で１３８時間撹拌し、次
いで３５０回転／分で醗酵が終了するまで撹拌し、且つ
１分間当り２．０００ｊ２の空気を通気した。温度は２
７〜２８°Ｃとした。ｐＨ値は２．５ＮＮａＯＨによッ
テ、７．５〜７．７で一定に保った。パラチオンを表中
に示す添加速度で連続的に加えた。醗酵の経過は、同様
に第４表から知ることができる。
寒４９：２０００１規模におけるパラチオン醗酵と時間
の関係 ７２　　１０３　０．１７　　　３０　　　２，０８０
１２０　　３３４　　　　　　　４０、　　４，０００
１４８　　３８４　　　　　　　６０　　　５．６８０
１６８　　５００　０．５３７　　　１００　　　７．
６８０培地Ｉｎ当りに３．８ｍｋのパラチオンの消費に
おいて、乾燥細胞１ｇ当り９４０Ｕの比活性が達成され
た。
実施例５： 醗酵槽における低速混合（２００回転／分）でインプロ
パツール配合物を使用する、活性細胞材料の製造 ＝１８°Ｃにおいて７日間貯蔵した、実施例２からのｌ
ｏｍβの濃活性化混合培養物によって、７１の醗酵槽中
の５君の栄養溶液に接種して、このバッチを２００回転
／分で撹拌し且つ６１／分の空気で通気した。培養温度
は２７°Ｃとし、ｐＨ値は７゜６とした。インプロパツ
ール中のパラチオンの配合物（組成は実施例３参照）０
．５＋ｏβを、最初に不連続的に加えて、バッチを１５
時間培養した。
然るのち、パラチオン配合物を連続的に第５表に示す速
度で加えた。活性の増大および生体物質の乾燥重量を、
同様に第５表に示す。
笈５ｍ　、低速混合におけるパラチオン醗酵と時間の関
係 １５．０　　　　　　　　　　　　　０．５　　０．１
３（Ｌ５　３４３　　　　　　０．７　２１．０　　５
．２４８．０　５８０　　０．４５　　１．１５　４１
．１　　１０．３５７．５　　　　　　　　　１，３　
５４，０　　１３．５７２．０　８６０　　０．９８　
　１，５　７５．８　　１９．０培地ＩＬ当りに３．８
ｍβの純パラチオンの消費において、乾燥細胞１ｇ当り
に８８０Ｕの比活性が達成された。
実施例６： 純培養物からの活性細胞材料の製造 １ｇのＮａＨＣＯ３，８ｇの酵母自己溶解物、３ｇの肉
加水分解物（ダニメツクス）および１０１００ＯのＨ，
Ｏの組成を有する複合培地９１を、燐酸エステルを開裂
する、プソイドモナス単離プソイドモナス種（ＤＳＭゲ
ッチンゲン、１１９３号）の、複合培地中で３日間生長
させた、予備培養物５００　ｍｊ２で接種し、そのバッ
チを、２８°Ｃにおいて、１０００回転／分で撹拌し、
且つ９２／分で通気した。ｐＨ値は７．６とした。醗酵
時間は２１時間であった。この時間の後に、醗酵バッチ
のパラチオン開裂活性は、培地ｌβ当り５，２００Ｕで
あった。細胞の比活性は、乾燥重量１ｇ当り１，６２０
Ｕであった。
実施例７： １１９３．１１９５．１１９６．１１９７および１１９
４の番号下にドイツ微生物収集（Ｄｅｕ−ｔｓｃｈｅｎ
　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ
）中に保存されたプソイドモナス菌株を、栄養溶液（デ
ィフコ）中で、振とう培養物として生長させ、最高の活
性に達したのちに、パラチオン氷解酵素活性を測定しｌ
こ。
氷解酵素活性を、細胞蛋白質１　ｍｇ当りのＵ単位３Ｉ
ゝで、第６表中に要約する。
策立茎 １１９３　　　　　　　０．４２ １１９５　　　　　　　０・８３ １１９６　　　　　　　１．２１ １１９７　　　　　　　２．０４ １１９４　　　　　　　０．２ （１）細胞を超音波によって分解させた；超音波熱塊後
に、実施例１に記したようにして試験を行なった。
実施例８： ＤＳＭ１１９２、ＤＳＭｌ１９８およびＤＳＭ１１９９
の番号下にドイツ微生物収集中に保存されたプソイドモ
ナス菌株を、実施例６に記した複合培地中で、３０°Ｃ
において２日間撹拌下に培養した。これらの菌株の培地
１λ当りのパラチオン開裂活性を、第７表に示す。
寒↑清 菌株番号（ＤＳＭ）　　　　　活性、Ｕ／１１１９２　
　　　　　　　１．２４０ 実施例９ 実施例２に記すようにして培養した、８９０Ｕ／ｌの活
性を有する５Ｉ！、の活性化混合培養物を、メツサーズ
へツチツヒからの冷却遠心分離機中で、４°Ｃにおいて
４０００回転／回転速度で、３０分間遠心分離した。不
活性な上澄液を流し出し、沈降物に５００＋＋＋Ｊｉ！
の蒸留水を加えたのち、混合物を磁気撹拌機により１０
分間撹拌した。均一な細胞懸濁液（５５０ｍＡ、７．］
００ｔｒ／／２）を、再び上記のようにして遠心分離し
、不活性な上澄液を捨て、今度は１００　ｍ、ｉ！の蒸
留水を沈降物に加えたのち、上記と同様に撹拌した。生
成する１　３０　ｔｔｄｌの細胞懸濁液（２７，３００
Ｕ／ｌ）を−１８°Ｃで冷凍したのち、凍結乾燥した。
収量ニア５０Ｕ／ｇの活性を有する製剤３．３ｇ。
実施例１０ 実施例４に従がい２バツチ中で製造した４０００２の培
養液の細胞スラリーを、メツサーズウエストンアリアか
らの分解機中で濃縮しく２００〜３００１、不活性な透
明流出液を捨てた。細胞体をバスケット遠心分離機中で
、２，５００回転／分で、スラリーから沈降させた。沈
降物を３００βの蒸留水中に取り且つ撹拌によって懸濁
させた。それを再びバスケット遠心分離機中で沈降させ
、洗浄した細胞沈降物を３０〜４０λの蒸留水中に取り
、懸濁させたのち、その懸濁液を一４０°Ｃで凍結させ
、次いで凍結乾燥した。収量＝７０００／ｇの活性を有
する製剤９８１ｇ。
実施例１１ 一６〇一 実施例２に記すようにして製造し、洗浄し、次いで凍結
して−１８°０において１月貯蔵した１００ｍβの細胞
懸濁液を解凍して、ｔｏｏ（ｔｏ回転／分で、２０分間
、４°Ｃにおいて遠心分離した。上澄液（２０００／β
）を廃棄した。細胞沈降物を１００−の水中に再懸濁し
、その懸濁液を分割した（６，８３０Ｕ／β）。半分を
直接に凍結乾燥した。収量：１７５Ｕ／ｇの活性を有す
る製剤１．２５ｇ。
他の半分を再び１０，０００回転／分で遠心分離し、細
菌沈降物を、５０ａ＋βの分析縁アセトンを用いて、４
°Ｃにおいて２回抽出した。アセトン抽出物を廃棄し、
残渣を真空乾燥型中で室温において乾燥した。収量：１
５０Ｕ／ｇの活性を有する製剤０．９ｇ。
実施例１２ 実施例２に従って製造した、１２５　Ｕ／ｌの活性を有
する培養液１２ｊ２を、４０００回転／回転速０分間遠
心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を５０Ｏｎ＋４２の
水中に取って懸濁させた（３．０００Ｕ／ｌ　）。それ
を再び遠心分離し、上澄液を廃棄し、沈降物を水中に再
懸濁させて１２０＋ｎβとした。
この溶液を、実施例６および７における可溶化実験に対
する出発溶液として使用した。
実施例１３ ３０ｍＪ２の０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ８、２
、を、実施例４からの懸濁液（試験懸濁液４．８゜ＯＵ
／ｌ、１０，０００ｇの上澄液：Ｕ＃！＝０）３０ｍｆ
ｌに加えた。次いで３ｇのデオキシコール酸ナトリウム
を加え、そのバッチを振とう水浴中で３０°Ｃにおいて
３０分間培養した。次いでこのバッチを１０．０００ｇ
で４０°Ｃにおいて３０分間遠心分離した。上澄液は１
９，９３０Ｕ／βの活性を有していた。上澄液を透析管
中に導入して、４°Ｃにおいて蒸留水に対して透析した
。それによって最初に粘稠であった溶液は透明になった
。残留する物質を１９，０００回転回転−遠心分離し、
透明上澄液を凍結乾燥した。収量：３２０Ｕ／ｇの活性
を有する水溶性の酵素１−４ｇ。
実施例１４ ３０ｍＮのＯ，１Ｍ燐酸カリウム、ｐＨ８、２、を、３
０ｍ１の実施例４からの懸濁液（試験懸濁液４゜８００
Ｕ／β、１００００ｇの上澄液Ｕ／β−〇）に加えた。
次いで６ｍｊ２のｎ−ブタノールを加え、そのバッチを
、振とう水浴中で、３０°Ｃにおいて３０分間振とうし
た。このバッチを、１０，０００ｇ下に３０分間遠心分
離した。その上澄液は１３．７００Ｕ／ｌの活性を有し
ていた。
２５ｍＡの上澄液を直接に凍結乾燥した。収量：８９０
Ｕ／ｇの活性を有する水溶性の製剤３００ｇ０ ２５ｍＡの上澄液を最初に蒸留水に対して透析し、次い
で凍結乾燥した。収量＋１，７６０Ｕ／ｇの活性を有す
る製剤１２０　ｍｇ。
実施例１５ 実施例２に記すようにして取得した、１２０Ｕ／βの活
性を有する培養液１６Ａを、４０００回転／回転速心分
離し、上澄液を廃棄し、沈降物を５００ｍｐの水中に取
り、再懸濁させた。懸濁液を再び遠心分離し、沈降物を
１００ｍｋの蒸留水中に取った。１００　ｍｌの０．１
Ｍグリシン／　Ｎ　ａ　ＯＨ緩衝液、ｐＨ８、５、を、
この細胞懸濁液に加えたのち、バッチを、ウルトラッラ
ックスボモジナイザーによって、短時間均質化した（試
験懸濁液９５６Ｕ／ｊ２，１０，０００ｇ上澄液５５０
Ｕ／ｌ。
次いで１５ｍ１（−７，５容量％）のブタノールをバッ
チに加え、そのバッチを、撹拌しながら、３７°Ｃにお
いて１時間培養した。次いで４°Ｃに冷却したのち、１
９，０００回転回転−３０分間遠心分離した。上澄液は
９，１５０Ｕ／ぷり活性を有していた。沈降物を１００
＋ｎβの水中に取り、懸濁液を再び遠心分離した。この
第二の上澄液（２゜８８０Ｕ／ｌを第一）も（７）　（
２８０ｔｒＪ、　　７６５０Ｕ／ｊｌりと混合した。１
９０　ｍｌのこの溶液を直接凍結乾燥した。収量：１，
０９０Ｕ／ｇの活性を有する可溶性製剤１，４ｇ。９０
ｍＡのこの溶液を、先ず水に対して透析したのち、凍結
乾燥した。
収量：Ｉ、３７０Ｕ／ｇの活性を有する可溶性製剤０．
５ｇ。
実施例１６ ６４一 実施例６における醗酵バッチからの６βの醗酵液を、４
，０００回転回転−おいて、４０°Ｃで３０分間遠心分
離した。沈降物を５００　＋ｎｌの水中に再懸濁させ、
その懸濁液を再び上と同様に遠心分離した。上澄液を廃
棄し、このようにして洗浄した沈降物を１００＋ｎλの
水中に懸濁させ、その懸濁液を凍結し且つ凍結乾燥した
。
実施例１７ 容器中のパラチオンの分解 空にしたのちに残留汚染物として４０〜６０ｇのパラチ
オンを含有している、パラチオン貯蔵用の１２０２の容
器中に３０１の水を導入した：内容物を十分の混合し且
つｐＨ値を８．３に調節した。
実施例１０に従って取得した製剤４００＋ｎｇを使用し
て、パラチオンの分解を開始させた。１分間当り９０〜
１２０　＋ｎｇの転化速度で、パラチオンの分解が１０
時間の中に終了した。
実施例１８ 湿った砂中のパラチオンの酵素による分解２００−の蒸
留水およびＩｇの分析縁Ｎ　ａ　ＨＣＯ３を、５００ｇ
の砂（１４０°Ｃにおける乾燥において０．７６％の減
少）に加えた。４２５．５ｍｇの濃度４７％のバラチオ
ン配合物を加え、各成分を混合し且つ２０ｍｇの実施例
１Ｏに従って製造した製剤を添加した。２．５時間の混
合時間後に、混合物をアルカリ性とし、濾過したのち、
直ちに濾液中のｐ−ニトロフェノールを光度測定的に定
量した。内容物：４９０ｇ／ｌのｐ−ニトロフェノール
、すなわち、分解は理論の１００％であつＩこ。
特許出願人　ジエネンカー・インコーホレーテッド

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 プソイドモナスｓｐｅｃｐｋ６（ＤＳＭ１１９２：微工
    研菌寄第４６６３号）、 プソイドモナスｓｐｅｃ５（ＤＳＭ１１９３：微工研菌
    寄第４６６４号）、 プソイドモナスｓｐｅｃ６（ＤＳＭ１１９４：微工研菌
    寄第４６７９号）、 プソイドモナスｓｐｅｃ１１（ＤＳＭ１１９５：微工研
    菌寄第４６６５号）、 プソイドモナスｓｐｅｃ１２（ＤＳＭ１１９６：微工研
    菌寄第４６６６号）、 プソイドモナスｓｐｅｃ１４（ＤＳＭ１１９７：微工研
    菌寄第４６６７号）、 プソイドモナスｓｐｅｃｐｋ９（ＤＳＭ１１９８：微工
    研菌寄第４６６８号）および プソイドモナスｓｐｅｃｐｋ１０（ＤＳＭ１１９９：微
    工研菌寄第４６６９号）。
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