JPH02299595A - 体細胞不定胚によるブラシノステロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物の組織片を培養し、体細胞不定胚（以下
、不定胚という）を誘導し、得られた不定胚よりプラシ
ノステロイドを分離、採取することによりプラシノステ
ロイドを生産する方法である。本発明によるプラシノス
テロイドは植物の生長調節物質として農業上、作物生産
に有用である。

［従来の技術］ 近年、ブラシノライドは、農業への利用のため、生産方
法、利用方法等の研究が精力的に進められている。その
実用化のため安価な合成法が検討されているが、立体異
性体を持つ複雑な化学構造を持つことから安価に供給す
ることが比較的困難な状況にあった。このことから、微
生物による生産等の試みもなされている。

ブラシノライドは高等植物には普遍的に存在し、特に多
く含まれるのは、花粉、未熟種子等の生殖生長期の組織
であるが、微量しか含まれていない。そこで、植物細胞
による生産についても最近研究が進められ、ニチニチソ
ウのクラウンゴール細胞やセイタカアワダチソウカルス
がプラシノステロイドを生産すると報告され、植物培養
細胞によるブラシノライド生産の可能性が示唆されてい
る。

［発明が解決しようとする課題］ このブラシノライドを植物細胞培養法により生産できれ
ば、合成法と比較して、危険な試薬類を使用することも
な（、また、異性体を副成することもなく、安全な天然
物を安全に生産することが可能となる。本発明者らは、
植物体の組織片の組織培養に関する永年の研究を通して
、プラシノステロイドは、植物組織より脱分化したカル
スにおいては、その生産量は極めて微量に過ぎないこと
を知った。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、ブラシノライドが植物組織のなかで、特
に多く含まれるのは、花粉、未熟種子等の生殖生長期の
組織であることに着目し、手掛かりを不定胚に求め、植
物細胞由来の不定胚を用いてブラシノライドを、化学合
成において使用される高価な試薬も、危険な試薬を用い
ることもなく、安全に生産しようと鋭意研究した結果、
不定胚が比較的多量のプラシノステロイドを生産してい
ることをはじめて見出し発明を完成したものである。

即ち、ブラシノライドを含有していることが知られてい
るマメ科作物（ダイス、インゲン、フジマメ等）、アブ
ラナ科作物（ナタネ、アブラナ、ハクサイ等）およびセ
リ科作物ニンジンについて、不定胚の誘導に関する研究
を行い、形成された不定胚がプラシノステロイドを生産
することを見出したものである。

本発明は、マメ科作物、アブラナ科作物もしくはセリ科
作物の種子または植物組織片から、不定胚を誘導し、得
られた不定胚よりプラシノステロイドを分離、採取する
ことを特徴とするプラシノステロイドの生産方法である
。

更に、本発明は詳しくは、マメ科、アブラナ科作物もし
くはセリ科作物の未熟もしくは完熟種子または植物組織
片を、２．４−Ｄを含む培地で培養し、次いで、オーキ
シンを含まない液体培地に移植し、不定胚を誘導し、発
達させ、得られた不定胚よりプラシノステロイドを分離
、採取することを特徴とするプラシノステロイドの生産
方法である。

なお、本発明のプラシノステロイドとは、ブラシノライ
ド、カスタステロン等のブラシノライド様活性を示すも
のをいう。

本発明の実施に当たっては、未熟種子、完熟種子あるい
は芽生え等の植物組織片を用意し、それらの組織片を常
法に従って滅菌した後、適当な大きさに組織片を切断し
て、外植体として用いる切片を作製する。未熟種子や完
熟種子の場合には、種皮を除去した後、種子の子葉を切
断し切片を作る。この切片を培地に植え付け、カルスを
形成させる。培地としては、オーキシンとして、ＩＡＡ
、ＮＡＡまたは２．４−Ｄ、好ましくは２．４−Ｄを添
加したＭＳ培地あるいはホワイトの培地を用いることが
できる。培養温度は２３−２７℃が好ましく、１２〜１
６時間日長、１０口０〜２０００１ｕｘで培養できる。

この形成したカルスをオーキシンを含まないＭＳ液体培
地に移植し、培養して、不定胚を誘導する。培養は、８
０〜１２Ｏｒｐｍ　、　２３−２７度、１０００−２０
００１ｕｘの条件で培養できる。ここに得られた不定胚
をプラシノステロイドの植物体がらの分離の常法により
処理する。即ち、不定胚を破砕し、エタノール、酢酸エ
チルまたはメタノール次いでクロロホルム、ベンゼンの
ような有機溶媒を用いて抽出、分離して、採取すれば、
プラシノステロイドを得ることができる。

上記のように、プラシノステロイドを生産する不定胚の
取得は、誘導期と発達期の２段階のフェーズに分けて行
うことにより容易に達成される。

不定胚の誘導期のカルス形成培地としては、ＭＳあるい
はホワイト培地が良好であるが、これに限られるもので
はない。炭素源としては、望ましくは１％のショ糖を使
用するのがよいが、使用しなくてもよい。使用するオー
キシンとしては、ＩＡＡ、ＮＡＡもしくは２．４−Ｄま
たはそれらの塩類等色々あるが、２．４−Ｄが好ましい
。

使用されるオーキシンの濃度は、不定胚の誘導に適した
濃度であればよく通常１Ｏ−６〜１０−’Ｍである。使
用されるオーキシンとして好ましい２．４−Ｄは０．１
〜２．５ｍｇ／ｌ好ましくは１．０〜２．０ｍｇ／ｌで
ある。

不定胚の発達期においては、形成したカルスな還元型窒
素を含む高塩濃度のＭＳ培地に移植すると、不定胚が誘
導され、高濃度硝酸イオンの存在および硝酸イオンとア
ンモニウムイオンのような還元型窒素が共存すると不定
胚の誘導が促進される。

誘導期には還元型窒素の影響は小さいが、発達期には還
元型窒素の効果が認められ、硝酸イオンとアンモニウム
イオンのような還元型窒素が共存するような培地であれ
ば、ＭＳ培地に限られるものではない。

不定胚の発達期には、オーキシンの存在は好ましいもで
はないので、オーキシンフリーの液体培地を用いるが、
オーキシン以外の植物ホルモンとして、ジベレリン、サ
イトカイニンおよびアブシジン酸を微量添加し、不定胚
の誘導を促進することは可能である。

培養は、植物体により異なるが、通常の植物組織培養の
条件で行うことができる６ 不定胚誘導のための外植体の採取部位としては、未熟種
子や完熟種子の子葉の外、芽生えの胚軸、葉、頂芽およ
び根からカルスを形成させ、形成したカルスをオーキシ
ンフリーの液体培地に移植、培養して、不定胚を誘導す
ることができる。頂芽のような若い組織片を外植体とし
て用いる時、特に不定胚の形成がよい。

次に、カルス形成と不定胚誘導について詳しく説明する
。

■カルス形成 不定胚誘導のため、ダイス（品種：アムソイ）またはフ
ジマメの完熟種子を７０％アルコールに２分間浸し、次
いで３％次亜塩素酸ナトリウム液に１０分間入れて撹拌
して滅菌した。種子を滅菌水でよく洗浄した後、水分を
よく拭き取ってから種皮を除去し、外植体として種子中
の子葉を５Ｘ５ｍｍ角の切片に切断し、２．４−Ｄ　　
２ｍｇ／ｌを含むムラシゲ・スクーグＭｕｒａｓｈｉｇ
ｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　（Ｍ　Ｓ　）およびホワイトｗｈ
ｉｔｅ（Ｗ）寒天培地上に植え付け、２５°Ｃ，１６時
間日長、２０００１ｕｘで培養し、カルスを形成させた
。

■不定胚誘導 次いで、形成したカルスな２．４−Ｄを含まないＭＳお
よびＷ液体培地に移植しく移植量８０〜１００１００ｍ
ｇ７ｌ００　、往復振どう培養機、１１５ｒｐｍ、２３
〜２７℃、　５００〜１０００１ｕｘで培養した。

プラシノステロイド生産のための不定胚の誘導は、この
ような２段階のフェーズに分けて行うことができる。

プラシノステロイド生産のための不定胚誘導と形成のた
めの好ましい条件として、種々検討した結果、ダイスで
は、２．４−Ｄを含む培地で７〜ｌＯ日培養してカルス
を形成させ、その後、オーキシンフリーの培地に移植し
、７〜ｌＯ日間培養する。ハクサイにおいては、７〜ｌ
Ｏ日後のカルスを移植し、１４〜２１日間培養する。ニ
ンジンにおいては不定胚分化開始直前まで培養したカル
スな液体培地に移植し、２１〜２８日間培養すると不定
胚の生育量および活性はピークに達する。

このようにして得た不定胚により、生産されたプラシノ
ステロイドは容易な操作で、抽出、分離、精製すること
ができる。

［実施例］ 以下に実施例にて結果を示すが、これらは例であって、
本発明の範囲を制限するものではないことはいうまでも
ない。

実施例Ａ、カルスの移植時期の検討 ダイス（品種：アムソイ）とフジマメの完熟種子を常法
により種子消毒し、種皮を除去して種子の子葉の部分を
５Ｘ５ｍｍ角の切片に切り、ＭＳ培地（＋２．４−Ｄ　
　２ｍｇ／ｌ）の固体培地に置床した。３．７．１４．
２１．と２８日後にオーキシンフリーのＭＳ培地に移植
し、不定胚の誘導を観察したところ、表１の結果を得た
。

表１　ダイスとフジマメ完熟種子子葉からの不定胚誘導
に及ぼすカルスの移植時期 移植時期（日）　　　３　　　　　７　　　　１４　　
　　２１　　　　２８アムソイ　　　　−　　　　＋＋
＋　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋フジマメ　　　
　＋　　　　　＋＋　　　　＋　　　　　＋　　　　　
−一：なし　　＋＝５以下　＋＋：５〜１０　　　　＋
＋＋：１０〜２０（注二数字はコルベン当りの不定胚数
を意味する。） アムソイ、フジマメ共にカルスの移植時期が７日目の時
、最も多くの不定胚が誘導された。

従って、カルス形成後の早い時期に移植することが望ま
しい。

実施例Ｂ　同調性の良い不定胚の作出 外植部位として播種後、３０〜６０日目のニンジンの芯
葉より、１〜２枚目の葉柄を用い、７０％アルコールと
１％アンチホルミンで滅菌後、１〜２ｍｍに切断し、２
．　４−Ｄ　（０，１〜１．０ｍｇ／ｌ）を添加したＭ
Ｓ培地上に置床し、カルスを誘導した。形成したカルス
を同培地で維持、増殖させ、不定胚の誘導を行う。

２．４−Ｄで誘導したカルスを一旦オーキシンフリーの
ＭＳ寒天培地に移植し、細胞の増殖とともに不定胚分化
開始直前まで培養した。このカルスをオーキシンフリー
のＭＳ液体培地に移植しマグネチックスクーラーで撹拌
し、大きな細胞塊を小細胞塊にホモジナイズ化し、細胞
懸濁液を孔径９０ｍμのナイロンメツシュで濾す。瀘し
た細胞懸濁液を培養用の３角フラスコに分注して振どう
培養を行い、不定胚の誘導を行う。その結果、ホルモン
無添加のＭＳ寒天培地に移植して、３週間経過したカル
スを培養してｌＯ０日目細胞懸濁液を顕微鏡で観察した
ところ、大きさの揃った球状胚が多数認められた。

さらに培養を続けると魚雷型の不定胚が肉眼でも認めら
れ、子葉、胚軸および根が十分発達した胚が多数得られ
る。

実施例Ｃ培養日数と生育量およびラミナジョイント活性
との関係 固体培地（ＭＳ＋２．４−、Ｄ　　２ｍｇ／ｌ＋シヨ糖
　１％）上で増殖、形成した７日後のカルスをビンセッ
トで細かく砕き、８０ｍ１のオーキシンフリーのＭＳ液
体培地を入れた５００ｍ１の３角フラスコに移植（移植
量　ダイ１６００ｍｇ前後、ハクサイ　２００ｍｇ前後
）し、所定の日数培養後、フラスコ３本分を濾過して、
得られた不定胚を各々新鮮重当たり１０ｇをガラスホモ
ジナイザーですりつぶして、常法によりエタノール、酢
酸エチルで抽出、分離した後、酢酸エチルを留去した。

残渣をペトリ皿に移し、風乾後、１０ｍ１の蒸留水を加
え供試薬液を調製し、ラミナジョイント活性を調べた結
果、表２の結果を得た。

表２　ダイスカルス移植後の培養日数、生育量とラミナ
ジョイント活性との関係 ダイスは、移植後４日目ではまだ不定胚の誘導は初期の
段階で、肉眼的に不定胚ができているのか判断すること
が難しいが、７日目では頂端部と基端部とに分かれた形
の整った不定胚が多く見られ、不定胚の形成量もピーク
に達する。

形成されたダイスカルスをオーキシンフリーのＭＳ培地
に移し、培養日数、４．７．１０゜１４、２１および２
８日後の不定胚のラミナジョイント活性は、培養７日〜
１０日後の不定胚が相対的に高い活性を示す。

表３　ハクサイカルス移植後の培養日数、生育量とラミ
ナジョイント活性との関係 ハクサイにおいては、ダイスに比べ不定胚の取得量が高
く、不定胚は７日、１０日と増加し、１４日目にピーク
に達する。

ハクサイの培養日数とラミナジョイント活性との関係は
、１４〜２１日目にかけてピークを示す。

表４　ニンジンカルス移植後の培養日数とラミナジョイ
ント活性との関係 ニンジンにおける培養日数とラミナジョイント活性との
関係は、２１日目にピークになり、２８日目においても
がなり高い値を保持する。

これらの不定胚の取得量とラミナジョイント活性の結果
またはラミナジョイント活性の結果から、ダイスにおい
ては移植後７〜１ｏ日目の不定胚を、ハクサイにおいて
は１４〜２１日目の不定胚を、ニンジンにおいては２１
〜２８日目の不定胚を培養することにより、ブラシノラ
イドを生産することができることを見出したものである
。

試験例 不定胚の大量培養を、上記の、カルス誘導、移植量、移
植時期、培養液量、培養日数と生育量等の条件について
検討し、ダイス、ハクサイおよびニンジンの各々につい
て、　５００ｍ１の３角フラスコ５０本中で培養し、新
鮮型として、ダイス（アムソイ）　２２．３ｇ、ハクサ
イ５４．６　ｇおよびニンジン３２．５　ｇの不定胚を
得た。それぞれ得た不定胚を常法により、ガラスホモゲ
ナイザーで磨り潰し、エタノール、酢酸エチルで抽出、
分離し、それぞれの抽出物をＴＬＣシリカゲルプレート
６０Ｆ　２６４にスポットし、酢酸エチル：エタノール
（２２＋３）で展開した。シリカゲルを、Ｒｆ値で１０
等分し、それぞれの画分についてアセトンで抽出し、ア
セトンを留去し残渣が得られた。下記活性テストの活性
が発現するように希釈した供試液を調製し、ブラシノラ
イドが特異的に反応するラミナジョイントテスト、イネ
幼苗生長試験およびコムギ葉身展開試験に供試した。そ
の結果、いずれの不定胚抽出物も上記の３つの生物試験
に、下記の表に示すようにブラシノライド様活性を示し
、しかも、それぞれがＲｆ値０．２〜０．３の画分にお
いて強い活性を示し、標品であるブラシノライドのＲｆ
値と一致し、本活性物質がブラシノライドであることを
確認した。

各不定胚抽出物に含有されるブラシノライドの量は、ラ
ミナジョイントテストにおける検量線より求めると、新
鮮重当たり、ダイス１８８μｇ／Ｋｇ、ハクサイ　１０
０μｇ／Ｋｇ、ｌ；よびニンジン２０７μｇ／Ｋｇであ
った。

また、同様の実験より得た不定胚を、常法により処理し
て得た抽出物をメルク社薄層シリカゲルプレート６０Ｆ
　２５４を用い移動相として、酢酸エチル：エタノール
（２２：３）で展開し、バニリン硫酸を噴霧して検出し
た結果、Ｒｆ値と一致する。

表５　各不定胚の抽出物と標品のブラシノライドのＲｆ
値 ダイス　　　ハクサイ　　ニンジン　　ブラシノライド
Ｒｆ０．２８０．２６　　０．２８　　　０．２６展開
溶媒、酢酸エチル：エタノール（２２：３）この結果、
各抽出物に含まれる活性物質がブラシノライドであると
同定できる。

これらの不定胚がブラシノライドを生産するという知見
は、これまで報告されたことはなく、全く新しい知見で
ある。

ブラシノライドが特異的に反応するラミナジョイントテ
スト、イネ幼苗生長試験およびコムギ葉身展開試験の結
果について以下に説明する。

ｆａ）ラミナジョイント イネ種子を３０　’Ｃで水に漬けて発芽させ、バットに
播種する。３０℃、暗黒化７日間栽培した後、ラミナジ
ョイントを切り取る。イネ切片を蒸留水に浮かべ暗黒化
に２４時間置く、この切片の中から約３０度屈曲した切
片を選び試料液に浮かべ、４８時間後、角度を測定する
。

被験物質の屈曲度 屈曲率（％ｌ　＝　　　　　　　　　　ｘ　１ｏ。

対照物質の屈曲度 （ｂｌ　イネ幼苗生長試験 ブラシノライドがイネ幼苗の根を捻転することを利用し
た検定法で、芽出ししたイネの種子を試料液に浮かべ、
根の捻転度合を観察する。

（ｃ）コムギ葉身展開試験 コムギの種子を２４時間湿った綿の上で発芽させ、その
後、バーミキュライトを入れたバットに播種し、２６°
Ｃ２暗黒下６日間栽培した後、先端から１．５〜３ｃｍ
の部分を１．５ｃｍの長さに切取り、試料液に浮かべ、
２４時間後の葉身の幅を測定する。

表６　ダイス、ハクサイおよびニンジン不定胚の以上の
ように、本発明においては、不定胚を誘導し、それらの
不定胚より、有機溶媒により、ブラシノライドを分離、
採取することができる。

Ｃ発明の効果〕 本発明の方法は、化学合成法と異なり、種々の異性体を
副成することもなく、人工的に管理できる条件の下で、
不定胚により天然のプラシノステロイドを生産する方法
を提供する。従って、本発明は、安全な方法で安全な物
質を生産し、容易に分離でき、しかも素材が植物である
ことから、状況によっては、特別の処理をせず、抽出物
あるいは粗精製物を使用することを可能にした。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. マメ科作物、アブラナ科作物もしくはセリ科作物の種子
   または植物組織片から体細胞不定胚を誘導し、得られた
   不定胚よりプラシノステロイドを分離、採取することを
   特徴とするプラシノステロイドの生産方法。