JPH02308791A - 免疫グロブリンＦｃ領域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチド - Google Patents
免疫グロブリンＦｃ領域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドInfo
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- JPH02308791A JPH02308791A JP1131195A JP13119589A JPH02308791A JP H02308791 A JPH02308791 A JP H02308791A JP 1131195 A JP1131195 A JP 1131195A JP 13119589 A JP13119589 A JP 13119589A JP H02308791 A JPH02308791 A JP H02308791A
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は免疫グ９プリンのＦｃ領域に対する結合能力と
ルシフェラーゼ活性をもつ新規なポリペプチド、該ポリ
ペプチドの遺伝子、該ポリペプチド遺伝子を含む組換え
プラスミド、該組換えプラスミドで形質転換された形質
転換体、該形質転換体を用いた新規なポリペプチドの製
造法に関する。
ルシフェラーゼ活性をもつ新規なポリペプチド、該ポリ
ペプチドの遺伝子、該ポリペプチド遺伝子を含む組換え
プラスミド、該組換えプラスミドで形質転換された形質
転換体、該形質転換体を用いた新規なポリペプチドの製
造法に関する。
プロティンＡは細菌スタフィロコッカス・アウレウス（
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞
壁蛋白であって、なかでもＣｏｗａｎ １株（ＳＡＣ）
はその含有量が特に多いことが知られている。一方、こ
のプロティンＡはその遺伝子を大腸菌の発現ベクターに
組込み、該発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養す
ることにより大量に生産され市販されている。このプロ
ティンＡは免疫グロブリンのＦｃ領域と特異的に結合す
ることは一般に知られていることである。そして、プロ
ティンＡ遺伝子にβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を
つないでプロティンＡの活性とβ−ガラクトシダーゼの
活性を持った融合タンパクを得て、これを、抗原抗体反
応により抗原又は抗体の量を測定する酵素免疫測定法（
ＥＩＡ）において、酵素標識抗体の代りに標識第２抗体
として、使用することが示唆されている。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞
壁蛋白であって、なかでもＣｏｗａｎ １株（ＳＡＣ）
はその含有量が特に多いことが知られている。一方、こ
のプロティンＡはその遺伝子を大腸菌の発現ベクターに
組込み、該発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養す
ることにより大量に生産され市販されている。このプロ
ティンＡは免疫グロブリンのＦｃ領域と特異的に結合す
ることは一般に知られていることである。そして、プロ
ティンＡ遺伝子にβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を
つないでプロティンＡの活性とβ−ガラクトシダーゼの
活性を持った融合タンパクを得て、これを、抗原抗体反
応により抗原又は抗体の量を測定する酵素免疫測定法（
ＥＩＡ）において、酵素標識抗体の代りに標識第２抗体
として、使用することが示唆されている。
（Ｇｅｎｅ、 ２３３６９〜３７８ （１９８３））
、また、化学的方法によって作製されたプロティンＡ−
ペルオキシダーゼ複合体が、酵素標識抗体に代わる標識
第２抗体として市販されている。しかし、これらのプロ
ティンＡ−酵素融合タンパク又はプロティンへ−ベルオ
キシダーゼ複合体は感度が悪く、測定時間が長いという
欠点がある。
、また、化学的方法によって作製されたプロティンＡ−
ペルオキシダーゼ複合体が、酵素標識抗体に代わる標識
第２抗体として市販されている。しかし、これらのプロ
ティンＡ−酵素融合タンパク又はプロティンへ−ベルオ
キシダーゼ複合体は感度が悪く、測定時間が長いという
欠点がある。
本発明者らは、従来の標識第２抗体用の融合タンパクに
代えてより感度が高く、測定時間の短い標識第２抗体用
の融合タンパクを開発し、それを遺伝子工学的手法によ
り大量に製造することを目的として本発明を完成した。
代えてより感度が高く、測定時間の短い標識第２抗体用
の融合タンパクを開発し、それを遺伝子工学的手法によ
り大量に製造することを目的として本発明を完成した。
本発明の目的ゆ、免疫グロブリンのＦｃ３１域に対する
結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドを提
供することにある。
結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドを提
供することにある。
本発明の他の目的は、上記ポリペプチドをコードする遺
伝子、この遺伝子を含む組換えプラスミド、該プラスミ
ドで形質転換された形質転換体、並びに、該形質転換体
を培養して、上記ポリペプチドを製造する方法をそれぞ
れ提供することにある。
伝子、この遺伝子を含む組換えプラスミド、該プラスミ
ドで形質転換された形質転換体、並びに、該形質転換体
を培養して、上記ポリペプチドを製造する方法をそれぞ
れ提供することにある。
本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ頒域に
対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチ
ドにあり、このポリペプチドは、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒ
ｖｅｙｉのルシフェラーゼをプロティンＡ様物質につな
ぐことにより得られる融合タンパクである。この融合タ
ンパクは標識第２抗体として用いたとき従来のものに比
して感度が高く、酵素の反応時間が短いため測定時間が
短くてすむものである。
対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチ
ドにあり、このポリペプチドは、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒ
ｖｅｙｉのルシフェラーゼをプロティンＡ様物質につな
ぐことにより得られる融合タンパクである。この融合タ
ンパクは標識第２抗体として用いたとき従来のものに比
して感度が高く、酵素の反応時間が短いため測定時間が
短くてすむものである。
スタフィロコッカス アウレウス コーラ１フ１株（Ｓ
ｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａ
ｎ Ｉ ５ｔｒａｉｎ）１ 由来のプロテ
ィンＡは免疫グロブリンのＦｃ部分と結合し、第２抗体
として、また免疫グロブリンやＦｃフラグメントの精製
／除去のための免疫吸着剤として利用することができる
。
ｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａ
ｎ Ｉ ５ｔｒａｉｎ）１ 由来のプロテ
ィンＡは免疫グロブリンのＦｃ部分と結合し、第２抗体
として、また免疫グロブリンやＦｃフラグメントの精製
／除去のための免疫吸着剤として利用することができる
。
プロティンＡの構造は第１図の通りである。この構造の
特徴は免疫グロブリンのＦｃ部分と結合するり、Ａ、Ｂ
及びＣの４つの領域があり、それぞれのペプチド及びＤ
ＮＡ塩基配列にはホモロジーがある。
特徴は免疫グロブリンのＦｃ部分と結合するり、Ａ、Ｂ
及びＣの４つの領域があり、それぞれのペプチド及びＤ
ＮＡ塩基配列にはホモロジーがある。
一方、発光細菌のルシフェラーゼはαおよびβの２つの
サブユニットからなることが知られている。発光細菌の
一種であるビブリオ ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒ
ｖｅｙｉ）のルシフェラーゼは、サブユニットαとして
分子１ｔ４２．０００のタンパク質を、そして、サブユ
ニットβとして分子量３７，０００のタンパク質を有す
る。これらサブユニットαおよびβのタンパク質は、そ
れぞれ１ｕｘＡおよび１ｕｘＢと名付けられた遺伝子に
よりコードされている。１ｕｘＡ遺伝子および１ｕｘＢ
遺伝子は、染色体ＤＮＡにおいて、いくつかの遺伝子群
から成るルシフェラーゼオペロンの一部を構成している
。 Ｒ，Ｐ、Ｌｅｇｏｃｋｉら（Ｐｒｏｃ。
サブユニットからなることが知られている。発光細菌の
一種であるビブリオ ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒ
ｖｅｙｉ）のルシフェラーゼは、サブユニットαとして
分子１ｔ４２．０００のタンパク質を、そして、サブユ
ニットβとして分子量３７，０００のタンパク質を有す
る。これらサブユニットαおよびβのタンパク質は、そ
れぞれ１ｕｘＡおよび１ｕｘＢと名付けられた遺伝子に
よりコードされている。１ｕｘＡ遺伝子および１ｕｘＢ
遺伝子は、染色体ＤＮＡにおいて、いくつかの遺伝子群
から成るルシフェラーゼオペロンの一部を構成している
。 Ｒ，Ｐ、Ｌｅｇｏｃｋｉら（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ｖｏｌ、８３
．９０８０−９０８４ （１９８６））は、このビブリ
オ ハーベイのルシフェラーゼ遺伝子（１ｕｘＡおよび
１ｕｘＢ）を含む染色体ＤＮＡを大腸菌プラスミドｐＢ
Ｒ３２２に挿入して、組換え体プラスミドｐＦＩＴＯＯ
１を調製し、このプラスミドを大腸菌に導入して形質転
換させ、ルシフェラーゼを発現させる方法について記載
している。
．９０８０−９０８４ （１９８６））は、このビブリ
オ ハーベイのルシフェラーゼ遺伝子（１ｕｘＡおよび
１ｕｘＢ）を含む染色体ＤＮＡを大腸菌プラスミドｐＢ
Ｒ３２２に挿入して、組換え体プラスミドｐＦＩＴＯＯ
１を調製し、このプラスミドを大腸菌に導入して形質転
換させ、ルシフェラーゼを発現させる方法について記載
している。
本発明はプロティンＡの免疫グロブリンのＦｃ部分を結
合する領域の１つであるＢ ＲＭ域をＤＮＡ合成法によ
り合成しく第２図）、そのＣ末端に発光細菌の１種であ
るＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉのルシフェラーゼ遺伝
子の構造遺伝子をつなぎ融合したポリペプチド（ＭＷ
８７０００）の遺伝子を得、この遺伝子を用いて前記ポ
リペプチドを大腸菌に大量につくらせるものである。す
なわち、本発明のポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ
結合能力とルシフェラーゼ活性とを持つものであり、そ
して、このポリペプチドは標識第２抗体として用いたと
き従来のものに比して感度が高く、酵素の反応時間が短
いため測定時間が短くてすむ利点を有するものである。
合する領域の１つであるＢ ＲＭ域をＤＮＡ合成法によ
り合成しく第２図）、そのＣ末端に発光細菌の１種であ
るＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉのルシフェラーゼ遺伝
子の構造遺伝子をつなぎ融合したポリペプチド（ＭＷ
８７０００）の遺伝子を得、この遺伝子を用いて前記ポ
リペプチドを大腸菌に大量につくらせるものである。す
なわち、本発明のポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ
結合能力とルシフェラーゼ活性とを持つものであり、そ
して、このポリペプチドは標識第２抗体として用いたと
き従来のものに比して感度が高く、酵素の反応時間が短
いため測定時間が短くてすむ利点を有するものである。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、次式のＤ
ＮＡ配列で表わされるもの ＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡ ＴＧＴ
ＧＡにＴＡＡ６ Ａ’ｌ’ｌ’ｔｉＡＬ；Ｌ；ＱＣ：
１ＧＴＴＴＧＴＣＴＴＡ ＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＴ
ＣＧＡＴＣＡＴＧ ＡＣＴＣＡＡＡＴＡＧＡｆＬｉに
Ｌ、ｌ；ＴＴにＴ ＴＴＡＡＴＣ［；Ａｔ；に Ａ
ＡＣにＧＡＴＴＣＴ ＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴ
ＣＡＧＴＧＡ ＧＴＧＴＣＡＣＡＡＧ ＡＴＣＡＴＣ
ＡＡＴＧ ＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＩｔ、ＡＬｉＬ；Ａ
ＡｆＬｉＬｉ ＴＬ；ＡＴＴ（ｉＬ；Ａ６Ｇ ＾Ａ
ＣＡＡＡＡＡにＡ ＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＣＣＴ
ＴＧＴＴＡ ４八ＧＧＧＧＣＡＴＡ ＴＣＡＡＴＡ
ＣＣＡＴ ＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＴ 又は、次のＤＮＡ配列で表されるものである。
ＮＡ配列で表わされるもの ＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡ ＴＧＴ
ＧＡにＴＡＡ６ Ａ’ｌ’ｌ’ｔｉＡＬ；Ｌ；ＱＣ：
１ＧＴＴＴＧＴＣＴＴＡ ＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＴ
ＣＧＡＴＣＡＴＧ ＡＣＴＣＡＡＡＴＡＧＡｆＬｉに
Ｌ、ｌ；ＴＴにＴ ＴＴＡＡＴＣ［；Ａｔ；に Ａ
ＡＣにＧＡＴＴＣＴ ＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴ
ＣＡＧＴＧＡ ＧＴＧＴＣＡＣＡＡＧ ＡＴＣＡＴＣ
ＡＡＴＧ ＡＴＧＣＡＴＴＣＡＣＩｔ、ＡＬｉＬ；Ａ
ＡｆＬｉＬｉ ＴＬ；ＡＴＴ（ｉＬ；Ａ６Ｇ ＾Ａ
ＣＡＡＡＡＡにＡ ＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＣＣＴ
ＴＧＴＴＡ ４八ＧＧＧＧＣＡＴＡ ＴＣＡＡＴＡ
ＣＣＡＴ ＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＴ 又は、次のＤＮＡ配列で表されるものである。
［１ＴＴＴＧＴＡにＧＡ ＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴ ＣＧ
ＴＧＴＣＴＴＴＧ、 ＧＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＴＡ
ＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＴＴＡＡ ＴＧＧＡＣＴＧＴＴ
Ｇ ＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡ
ＧＣＧＴＴＣＴ ＴＣＴＧＡＴにＡＡＧ ＴＣＡＴ
ＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧＡ ＡＧＡＣＣＣＴＡ
ＴＴ ＡＡＣＡＣＴＴＧＡＣＧＡＴ本発明の組換えプラ
スミドは上記遺伝子を大腸菌のプラスミドに挿入したも
のである。そして大腸菌のプラスミドとしてはｐ［１Ｒ
７２０やｐＫＫ２３３−３などが用いられる。
ＴＧＴＣＴＴＴＧ、 ＧＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＴＡ
ＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＴＴＡＡ ＴＧＧＡＣＴＧＴＴ
Ｇ ＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡ
ＧＣＧＴＴＣＴ ＴＣＴＧＡＴにＡＡＧ ＴＣＡＴ
ＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧＡ ＡＧＡＣＣＣＴＡ
ＴＴ ＡＡＣＡＣＴＴＧＡＣＧＡＴ本発明の組換えプラ
スミドは上記遺伝子を大腸菌のプラスミドに挿入したも
のである。そして大腸菌のプラスミドとしてはｐ［１Ｒ
７２０やｐＫＫ２３３−３などが用いられる。
本発明の形質転換体は宿主細胞を前記組換えプラスミド
で形質転換されたものである。この宿主細胞としては大
腸菌が用いられる。
で形質転換されたものである。この宿主細胞としては大
腸菌が用いられる。
本発明の免疫グロブリンのＦｃｅＮ域に対する結合能力
とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドを製造する方
法は、次の工程、（ａ）プロティンＡの遺伝子Ｂ領域の
ＤＮＡを化学合成すること、Φ〕該領領域Ｄ−Ｎ Ａを
組み込むためのプラスミドベクターを構築すること、（
Ｃ）ルシフェラーゼ遺伝子を組み込むためのプラスミド
ベクターを構築すること、（ｄ）前記二つのプラスミド
を連結して組換えプラスミドを構築すること、（ｅ）該
組換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質転換すること
、（ｆ）得られた形Ｉ 質転換体を栄養媒
体中で培養して、免疫グロブリンのＦｃｒＪ域に対する
結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドを生
成させること、を包含する。前記工程（ｆ）の後にさら
に以下の工程、（□□□産生された該ポリペプチドを採
取すること、を包含する。前記ポリペプチドをコードす
る遺伝子が、ルシフェラーゼ活性をもち、かつＮ末端が
かけたポリペプチドをコードするものであることを特徴
とする。更に前記宿主細胞は細菌類、酵母および培養細
胞類であることを特徴とする。前記宿主細胞がＥ、ｃｏ
ｌｉであることを特徴とする。
とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドを製造する方
法は、次の工程、（ａ）プロティンＡの遺伝子Ｂ領域の
ＤＮＡを化学合成すること、Φ〕該領領域Ｄ−Ｎ Ａを
組み込むためのプラスミドベクターを構築すること、（
Ｃ）ルシフェラーゼ遺伝子を組み込むためのプラスミド
ベクターを構築すること、（ｄ）前記二つのプラスミド
を連結して組換えプラスミドを構築すること、（ｅ）該
組換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質転換すること
、（ｆ）得られた形Ｉ 質転換体を栄養媒
体中で培養して、免疫グロブリンのＦｃｒＪ域に対する
結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドを生
成させること、を包含する。前記工程（ｆ）の後にさら
に以下の工程、（□□□産生された該ポリペプチドを採
取すること、を包含する。前記ポリペプチドをコードす
る遺伝子が、ルシフェラーゼ活性をもち、かつＮ末端が
かけたポリペプチドをコードするものであることを特徴
とする。更に前記宿主細胞は細菌類、酵母および培養細
胞類であることを特徴とする。前記宿主細胞がＥ、ｃｏ
ｌｉであることを特徴とする。
以下に本発明を各工程に従い順に説明する。
免疫グロブリンのＦｃに結合する能力を有するプロティ
ンＡＯＢ ｍｌ域の遺伝子をＤＮＡシンセサイザーによ
り合成する。一方、大腸菌のベクターであるｐＤＲ７２
０を制限酵素により消化する。この消化したベクターと
上記合成遺伝子とを７４ＤＮＡＩＪガーゼにより結合し
て組換え体ＤＮＡを得る。この組換え体Ｄ Ｎ ＡｐＳ
ＰＡＰｃ−１を大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換して、目的
のＤＮＡ断片が挿入されている形質転換体を得た。
ンＡＯＢ ｍｌ域の遺伝子をＤＮＡシンセサイザーによ
り合成する。一方、大腸菌のベクターであるｐＤＲ７２
０を制限酵素により消化する。この消化したベクターと
上記合成遺伝子とを７４ＤＮＡＩＪガーゼにより結合し
て組換え体ＤＮＡを得る。この組換え体Ｄ Ｎ ＡｐＳ
ＰＡＰｃ−１を大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換して、目的
のＤＮＡ断片が挿入されている形質転換体を得た。
ビブリオ ））−ベイＡＴＣＣ１４１２６株をＬＢ培地
で培養し、培養物を遠心分離して菌体を得る。この菌体
を生理食塩水に懸濁してリゾチームを加えインキュベー
トする。この溶液に等量のフェノール溶液を加え抽出す
る。この抽出液にエタレールを加え染色体ＤＮＡを回収
分離する。この・染色体ＤＮＡを制限酵素影胆３＾で消
化する。一方、大腸菌プラスミドｐＵｃ１ＢをＢａｍ旧
で消化する。この両者の消化液を混合し、Ｔ４リガーゼ
を加えて反応させる。
で培養し、培養物を遠心分離して菌体を得る。この菌体
を生理食塩水に懸濁してリゾチームを加えインキュベー
トする。この溶液に等量のフェノール溶液を加え抽出す
る。この抽出液にエタレールを加え染色体ＤＮＡを回収
分離する。この・染色体ＤＮＡを制限酵素影胆３＾で消
化する。一方、大腸菌プラスミドｐＵｃ１ＢをＢａｍ旧
で消化する。この両者の消化液を混合し、Ｔ４リガーゼ
を加えて反応させる。
この反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に接触させて大腸菌の
形質転換体を得た。この大腸菌の形質転換体の中から発
光を示すものを分離して、ルシフェラーゼ活性を有する
コロニー株を得た。そして、この株に含まれるプラスミ
ドはｐＬＵχ１８０１と命名した。
形質転換体を得た。この大腸菌の形質転換体の中から発
光を示すものを分離して、ルシフェラーゼ活性を有する
コロニー株を得た。そして、この株に含まれるプラスミ
ドはｐＬＵχ１８０１と命名した。
このプラスミドρしＵＸ１８０１をサブクローニングし
てプラスミドρＬＵＸ１８０２． ｐＬＵＸ１８０３．
ｐＬＵＸ１８０４およびｐＬｔｌＸ１８０５を得た。
てプラスミドρＬＵＸ１８０２． ｐＬＵＸ１８０３．
ｐＬＵＸ１８０４およびｐＬｔｌＸ１８０５を得た。
そして、これらのプラスミドのうちｐＬＵＸ１８０２及
びｐＬＵＸ１８０３がルシフェラーゼ活性を示した。
びｐＬＵＸ１８０３がルシフェラーゼ活性を示した。
前記組換えプラスミドｐＬＵＸ１８０３ Ｄ Ｎ Ａ−
ｆ−緩衝液中、制限酵素Ｈｉｎｄ ｍで完全に消化する
。更にこのＤＮＡ溶液に制限酵素５ａｌＩを加え完全に
消化して、３．７ＫｂＯ名５ｉｒ−Ｈ４ｎｄｌＩ［断片
を得る。この断片に町■３１ヌクレアーゼを加え反応さ
せて、反応液をフェノールで抽出し、エタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収する。このＤＮＡを緩衝液に溶かし、
Ｂｉｎｄｌ［［リンカ−とＴ４リガーゼを加え、反応さ
せてＮ末端が欠失したルシフェラーゼ遺伝子を含む溶液
を得る。
ｆ−緩衝液中、制限酵素Ｈｉｎｄ ｍで完全に消化する
。更にこのＤＮＡ溶液に制限酵素５ａｌＩを加え完全に
消化して、３．７ＫｂＯ名５ｉｒ−Ｈ４ｎｄｌＩ［断片
を得る。この断片に町■３１ヌクレアーゼを加え反応さ
せて、反応液をフェノールで抽出し、エタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収する。このＤＮＡを緩衝液に溶かし、
Ｂｉｎｄｌ［［リンカ−とＴ４リガーゼを加え、反応さ
せてＮ末端が欠失したルシフェラーゼ遺伝子を含む溶液
を得る。
一方、前記プロティンＡ様遺伝子を含む組換えプラスミ
ドｐｓＰＡＦｃ−１を緩衝液に溶かし、Ｈｔｎｄ ＩＩ
Ｉを加え、完全消化し、常法によりＤＮＡを回収する。
ドｐｓＰＡＦｃ−１を緩衝液に溶かし、Ｈｔｎｄ ＩＩ
Ｉを加え、完全消化し、常法によりＤＮＡを回収する。
このＤＮＡを緩衝液に溶かし、この溶液に前記Ｎ末端が
欠失したルシフェラーゼ遺伝子を含む溶液及びＴ４リガ
ーゼを加えて反応させて、プロティンＡ様遺伝子とルシ
フェラーゼ遺伝子の両者が結合した融合蛋白遺伝子を含
む組換えプラスミドｐｔ、ｕχ５ＰＡＦｃ−１及びｐＬ
ＵＸＳＰＡＦｃ−２を得た。この組換えプラスミドにつ
いて塩基配列を決定したところ、第７図及び第８図の通
りである。
欠失したルシフェラーゼ遺伝子を含む溶液及びＴ４リガ
ーゼを加えて反応させて、プロティンＡ様遺伝子とルシ
フェラーゼ遺伝子の両者が結合した融合蛋白遺伝子を含
む組換えプラスミドｐｔ、ｕχ５ＰＡＦｃ−１及びｐＬ
ＵＸＳＰＡＦｃ−２を得た。この組換えプラスミドにつ
いて塩基配列を決定したところ、第７図及び第８図の通
りである。
この結果からｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−１及びｐＬＵＸｓＰ
ＡＦｃ−２はいずれもプロティンＡ様遺伝子とルシフエ
ラー・ゼが融合した融合タンパクをコードした遺伝子を
含んでいることが確認された。
ＡＦｃ−２はいずれもプロティンＡ様遺伝子とルシフエ
ラー・ゼが融合した融合タンパクをコードした遺伝子を
含んでいることが確認された。
進ｊづ一乙ペクＡ襲ｌ裂
前記組換えプラスミドｐＬＵＸＳＰＡＦｃ−１及びｐＬ
ｔｌＸｓＰＡＦｃ−２で常法に従いそれぞれ大腸菌１１
８ＩＯＩを形質転換して形質転換体を得る。そして、形
質転換体微生物を常法により培養して、免疫グロブリン
Ｐｃ領域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつ
ポリペプチドから成る融合タンパクを得た。この菌体が
産生じた融合タンパクの免疫グロブリンのＰｃ結合能力
を調べた結果第１０図に示す通りであり、いずれもその
結合能力を示した。
ｔｌＸｓＰＡＦｃ−２で常法に従いそれぞれ大腸菌１１
８ＩＯＩを形質転換して形質転換体を得る。そして、形
質転換体微生物を常法により培養して、免疫グロブリン
Ｐｃ領域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつ
ポリペプチドから成る融合タンパクを得た。この菌体が
産生じた融合タンパクの免疫グロブリンのＰｃ結合能力
を調べた結果第１０図に示す通りであり、いずれもその
結合能力を示した。
今回の方法により得られた免疫グロブリンのＦｃ領域に
対する結合能力とルシフェラーゼ活性を持った融合タン
パクは標識第２抗体として使用することができる。現在
、標識第２抗体として市販されているペルオキシダーゼ
プロティンＡに比べて、酵素反応の時間が短かくてすむ
。またペルオキシダーゼプロティンＡはプロティンＡに
化学結合によってペルオキシダーゼを結合させており、
製造がむずかしい。今回のルシフェラーゼプロティンＡ
は、遺伝子レベルでつなぎ融合タンパクの型で生産する
ので、製造が簡単である。
対する結合能力とルシフェラーゼ活性を持った融合タン
パクは標識第２抗体として使用することができる。現在
、標識第２抗体として市販されているペルオキシダーゼ
プロティンＡに比べて、酵素反応の時間が短かくてすむ
。またペルオキシダーゼプロティンＡはプロティンＡに
化学結合によってペルオキシダーゼを結合させており、
製造がむずかしい。今回のルシフェラーゼプロティンＡ
は、遺伝子レベルでつなぎ融合タンパクの型で生産する
ので、製造が簡単である。
以下に本発明を実施例により説明する。但し、本発明は
これらの実施例により限定されるものでない。
これらの実施例により限定されるものでない。
実施例１
（１）プロティン人様遺伝子を含む組換えプラスミドお
よび形質転換微生物の調製 免疫グロブリンのＦｃに結合する能力を有するプロティ
ンＡのＢ Ｍ域（以下Ｆｃ結合ペプチドと称する）の遺
伝子を日本ゼオン社のＤＮＡシンセサイザージエネット
により得た（第２図）。大腸菌のｔｒｐプロモーターを
有する発現ベクターであるｐＤＲ７２０Ｄ Ｎ Ａ （
Ｐｈａ、ｒｍａｃｉａ社より購入製品Ｎ［Ｌ２７−４９
３０−０１） １１００ｎに１７１０量の１０ＸＢ１０
ＸＢａバッフｙ−（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）、 ７０ｎ＋Ｍ ＭｇＣ１ｚ、ＬＭ ＮａＣ
ｌ、 ２０ｍＭ２メルカプトエタノール、０．１％ウシ
血血清アルブミン色制限酵素ＢａｍＨＩ ２単位を加え
て３７°Ｃで完全消化した。
よび形質転換微生物の調製 免疫グロブリンのＦｃに結合する能力を有するプロティ
ンＡのＢ Ｍ域（以下Ｆｃ結合ペプチドと称する）の遺
伝子を日本ゼオン社のＤＮＡシンセサイザージエネット
により得た（第２図）。大腸菌のｔｒｐプロモーターを
有する発現ベクターであるｐＤＲ７２０Ｄ Ｎ Ａ （
Ｐｈａ、ｒｍａｃｉａ社より購入製品Ｎ［Ｌ２７−４９
３０−０１） １１００ｎに１７１０量の１０ＸＢ１０
ＸＢａバッフｙ−（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）、 ７０ｎ＋Ｍ ＭｇＣ１ｚ、ＬＭ ＮａＣ
ｌ、 ２０ｍＭ２メルカプトエタノール、０．１％ウシ
血血清アルブミン色制限酵素ＢａｍＨＩ ２単位を加え
て３７°Ｃで完全消化した。
このように消化されたベクターと上記Ｆｃ結合ペプチド
をコードするＤＮＡ消化物ｇとを混ぜ、１／１０量の１
０ＸＴ４リガーゼバツフｙ −（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ｔ−ＩＣＩ （ｐＨ７，６）、 ６６ｍＭ Ｍｇｃｈ
、 １００ｍＭジチオスレイトール、 １ｍＭ ＡＴＰ
）とＴ４ ＤＮＡリガーゼ１０単位を加えて、１０℃
、−晩で結合反応を行った。この結合したＤＮＡを大腸
１１１Ｂ１０１ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（宝酒
造社より購入）に形質転換し、５０ｄｇ／Ｉｄのアンピ
シリンを含むＬＢ寒天培地（バクトドリブトンｉｇ、
酵母エキス０．５ｇ、 ＮａＣｌ ０．５ｇ、寒天１
゜５％）１０枚にぬりつけ３７°Ｃで一晩放置した。そ
の結果アンピシリン耐性の約１００００個の形質転換コ
ロニーが得られた。得られたコロニーをアルカリ法によ
りプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素坦υ旧で処理し
、アガロース電気泳動により目的のＤＮＡ断片が挿入さ
れていることを確認した（この組換えプラスミドをｐＳ
ＰＡＦｃ−１と命名する）（第３図）。
をコードするＤＮＡ消化物ｇとを混ぜ、１／１０量の１
０ＸＴ４リガーゼバツフｙ −（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ｔ−ＩＣＩ （ｐＨ７，６）、 ６６ｍＭ Ｍｇｃｈ
、 １００ｍＭジチオスレイトール、 １ｍＭ ＡＴＰ
）とＴ４ ＤＮＡリガーゼ１０単位を加えて、１０℃
、−晩で結合反応を行った。この結合したＤＮＡを大腸
１１１Ｂ１０１ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（宝酒
造社より購入）に形質転換し、５０ｄｇ／Ｉｄのアンピ
シリンを含むＬＢ寒天培地（バクトドリブトンｉｇ、
酵母エキス０．５ｇ、 ＮａＣｌ ０．５ｇ、寒天１
゜５％）１０枚にぬりつけ３７°Ｃで一晩放置した。そ
の結果アンピシリン耐性の約１００００個の形質転換コ
ロニーが得られた。得られたコロニーをアルカリ法によ
りプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素坦υ旧で処理し
、アガロース電気泳動により目的のＤＮＡ断片が挿入さ
れていることを確認した（この組換えプラスミドをｐＳ
ＰＡＦｃ−１と命名する）（第３図）。
（２）ルシフェラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド
および形質転換微生物の調製 本実施例で使用した発光細菌ビブリオ ハーベイは、ア
メリカンタイプカルチャーコレクションから購入したＡ
ＴＣＣ１４１２６株である。大腸菌ＪＭ１０９株および
プラスミドｐＵｃ１８（宝酒造社製品Ｎα３２１８）は
宝酒造社から購入した。
および形質転換微生物の調製 本実施例で使用した発光細菌ビブリオ ハーベイは、ア
メリカンタイプカルチャーコレクションから購入したＡ
ＴＣＣ１４１２６株である。大腸菌ＪＭ１０９株および
プラスミドｐＵｃ１８（宝酒造社製品Ｎα３２１８）は
宝酒造社から購入した。
ビブリオハーベイＡＴＣＣ１４１２６株を、２％ＮａＣ
１を含有するＬＢ培地（バクトドリブトンＩｇ、 酵
母エスキ０．５ ｇ、 ＮａＣ１２ｇ／Ｌ００１ｎｉ）
１００ｄで２８°Ｃにて８時間培養した後、８．００Ｏ
ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。得られた菌体沈澱
物をＥＤＴＡを含有する生理食塩水（ＮａＣ１Ｏ，８８
ｇ、 ＥＤＴＡ−Ｎａｇ １．８６ｇ／１００ａ＋ｆ。
１を含有するＬＢ培地（バクトドリブトンＩｇ、 酵
母エスキ０．５ ｇ、 ＮａＣ１２ｇ／Ｌ００１ｎｉ）
１００ｄで２８°Ｃにて８時間培養した後、８．００Ｏ
ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。得られた菌体沈澱
物をＥＤＴＡを含有する生理食塩水（ＮａＣ１Ｏ，８８
ｇ、 ＥＤＴＡ−Ｎａｇ １．８６ｇ／１００ａ＋ｆ。
ｐＨ８，０）１０ｄに懸濁して洗浄し、８．００Ｏｒｐ
ｍで１０分間遠心分離を行った０次いで、沈澱物を上記
のＥＤＴＡを含有する生理食塩水５ｄに懸濁し、リゾチ
ームを最終濃度が２■／ｄとなるように添加し、３７°
Ｃで２０分間振盪しながらインキュベーションを行った
。さらに、この溶液に１０％ＳＤＳを０．６成添加し、
６０℃で１０分間インキュベートした。その後、等量の
フェノール溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミ
ルアルコール：Ｈ２Ｏ・２５：２４：１：５０）を添加
して穏やかに撹拌し、次いで遠心分離を行ってその上清
（ＤＮＡを含有する水層）を得た。この上清について、
上記のフェノール溶液による抽出操作をさらに２回繰り
返した。
ｍで１０分間遠心分離を行った０次いで、沈澱物を上記
のＥＤＴＡを含有する生理食塩水５ｄに懸濁し、リゾチ
ームを最終濃度が２■／ｄとなるように添加し、３７°
Ｃで２０分間振盪しながらインキュベーションを行った
。さらに、この溶液に１０％ＳＤＳを０．６成添加し、
６０℃で１０分間インキュベートした。その後、等量の
フェノール溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミ
ルアルコール：Ｈ２Ｏ・２５：２４：１：５０）を添加
して穏やかに撹拌し、次いで遠心分離を行ってその上清
（ＤＮＡを含有する水層）を得た。この上清について、
上記のフェノール溶液による抽出操作をさらに２回繰り
返した。
得られた上清に２倍量のエタノールを添加し、浮遊して
いる染色体ＤＮＡをガラス棒を用いて巻きとり、回収し
た。この染色体ＤＮＡが巻きついているガラス棒を７０
％エタノール、８０％エタノール、９０％エタノール、
１００％エタノールに順次浸漬し、ＤＮＡの脱水を行っ
た。これをさらに室温で乾燥させた後、ｌｄのＴＥＩＯ
−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｌ（ｐＨ８，０）、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ４ａｚ）に溶解させた。
いる染色体ＤＮＡをガラス棒を用いて巻きとり、回収し
た。この染色体ＤＮＡが巻きついているガラス棒を７０
％エタノール、８０％エタノール、９０％エタノール、
１００％エタノールに順次浸漬し、ＤＮＡの脱水を行っ
た。これをさらに室温で乾燥させた後、ｌｄのＴＥＩＯ
−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｌ（ｐＨ８，０）、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ４ａｚ）に溶解させた。
このようにして得られたビブリオ ハーベイの染色体Ｄ
ＮＡを２μｇ含有する溶液（ＤＮＡ量は０Ｄ２６０ｎｒ
ａにおける吸光度より求めた）に、１／ＩＯ量の１０
Ｘ ５ａｕ３Ａ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣＩｘ、ＩＭ Ｎａ
Ｃ１）および制限酵素５ａｕ３Ａを２単位添加し、３７
°Ｃで１５分間部分消化した。この溶液のうちＤ Ｎ
Ａ ２００ｎｇに相当する量（上記ＤＮＡ消化物の１／
１０１３に相当する量）と、制限酵素で完全消化した大
腸菌プラスミドＤＮＡとを混合した。この「制限酵素で
完全消化した大腸菌プラスミドＤＮＡＪとは、大腸菌の
多コピープラスミドｐＵＣ１８のＤ Ｎ Ａ １１００
ｎに、１／１０１の１０ Ｘ Ｂａｍ旧緩衝液（１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ８，０）、７０ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ、 Ｉ Ｍ ＮａＣｌ。
ＮＡを２μｇ含有する溶液（ＤＮＡ量は０Ｄ２６０ｎｒ
ａにおける吸光度より求めた）に、１／ＩＯ量の１０
Ｘ ５ａｕ３Ａ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣＩｘ、ＩＭ Ｎａ
Ｃ１）および制限酵素５ａｕ３Ａを２単位添加し、３７
°Ｃで１５分間部分消化した。この溶液のうちＤ Ｎ
Ａ ２００ｎｇに相当する量（上記ＤＮＡ消化物の１／
１０１３に相当する量）と、制限酵素で完全消化した大
腸菌プラスミドＤＮＡとを混合した。この「制限酵素で
完全消化した大腸菌プラスミドＤＮＡＪとは、大腸菌の
多コピープラスミドｐＵＣ１８のＤ Ｎ Ａ １１００
ｎに、１／１０１の１０ Ｘ Ｂａｍ旧緩衝液（１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ８，０）、７０ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ、 Ｉ Ｍ ＮａＣｌ。
２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、および０．１％
ウシ血清アルブミン〕、および２単位の制限酵素Ｂａｍ
１ｌｒを添加して、３７℃で２時間インキュベーション
して完全に消化したものである。この混合液に、１７１
０量の１０ＸＴ４リガーゼ緩衝液（６６０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、 ６６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１
００ｍＭジチオスレイトール、および１ ｍＭ ＡＴＰ
） 、および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、
１０°Ｃで一晩反応を行って連結させた（第４図参照）
。大腸菌ＪＭ １０９株のコンピテントセルを調製し、
これに上記連結混合物を接触させて、該大腸菌の形質転
換を行った。この菌体を、５０ｄｇ／ｄのアンピシリン
と１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ寒天培地（１００ｄあ
たりバクトドリブトンＩｇ、 酵母エキス０．５ｇ、
ＮａＣ１０，５ｇ８および寒天１．５％を含む＞ ｉ
ｏ枚に塗り、３７°Ｃで一晩平板培養してスクリーニン
グを行った。この培養で得られた１０．０００個のアン
ピシリン耐性の形質転換コロニーに、ｎ−デカナール（
半井化学薬品社）を噴霧器を用いて霧状に添加し、発光
を示した（ルシフェラーゼ活性を有する）コロニーを１
株得た。このコロニーを形成する菌株に含有されるルシ
フェラーゼ活性を有する組換え体プラスミドをｐＬＵＸ
１８０１と命名し、該大腸菌コロニーを大量培養した後
にアルカリ処理を行うことにより、該プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０１を単離・精製した。この精製されたプラスミ
ドｐＬＵＸ１８０１ニ制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＋影
吐１． ＰｓｔＩ、およびシ遼Ｒ１を種々の組み合わせ
で作用させて消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳
動することにより、以下のＤＮＡ断片を得た：（１）４
．０ｋｂｐ（７）Ｈｉｎｄ ｍ Ｄ Ｎ Ａ断片、（２
）３．７ｋｂｐ（７）ＳａｌＩ −則ｎｄｌＩ［ＤＮＡ
断片、（３）３．ＯｋｂｐＯ則ｎｄＩ［Ｉ−匡［）ＮＡ
断片、および（４） １ 、５ ｋ ｂ ｐのＨｔｎｄ
ｍ −ＥｃｏＲＩ Ｄ ＮＡ断片。（１） 〜（４）
それぞれのＤＮＡ断片２０ｎｇと、１０ｎｇのｐＵｃ１
８ ＤＮＡを（１） 〜（４）と同じ制限酵素の組み合
わせで消化したＤＮＡとを、１０単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合させ、プラスミドｐＬＵＸ１８０１よ
りサブクローニングし、プラスミドｐＬＵＸ１８０２゜
ｐＬＵＸ１８０３． ｐＬＵＸ１８０４、およびｐＬＵ
Ｘ１８０５を調製した（第５図）、つまり、上記４種の
組換え体プラスミドは、それぞれ、以下のようなビブリ
オ ハーベイ由来（７）ＤＮＡ断片を有する： ｐＬＵ
Ｘ１８０２ ： ４．０ｋｂｐの！ｆｉｎｄ ｍ Ｄ
Ｎ Ａ断片、ｐＬＵＸ１８０３ ： ３．７ｋｂｐの力
吐■−Ｈ１ｎｄＩ［［ＤＮＡ断片、ｐＬＵＸ１８０４
： ３．０ｋｂｐのＨｉｎｄＩ［−力＋ｔｌＤＮＡ断片
、およびｐＬＵＸ１８０５：１．５ｋｂｐのＨｉｎｄｍ
−ｔ！ｃｏＲＩ Ｄ Ｎ Ａ断片。これらそれぞれの
組換え体プラスミドで大腸菌ＪＭ １０９株を上記と同
様の方法により形質転換した。この形質転換体をＬＢ寒
天培地で培養し、上記ｎ−デカナールを用いる方法によ
りルシフェラーゼ活性を調べた。その結果、組換え体プ
ラスミドｐＬＵＸ１８０２およびｐＬ［ＪＸ１８０３を
含有する菌体にルシフェラーゼ活性が検出された。
ウシ血清アルブミン〕、および２単位の制限酵素Ｂａｍ
１ｌｒを添加して、３７℃で２時間インキュベーション
して完全に消化したものである。この混合液に、１７１
０量の１０ＸＴ４リガーゼ緩衝液（６６０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、 ６６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１
００ｍＭジチオスレイトール、および１ ｍＭ ＡＴＰ
） 、および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、
１０°Ｃで一晩反応を行って連結させた（第４図参照）
。大腸菌ＪＭ １０９株のコンピテントセルを調製し、
これに上記連結混合物を接触させて、該大腸菌の形質転
換を行った。この菌体を、５０ｄｇ／ｄのアンピシリン
と１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ寒天培地（１００ｄあ
たりバクトドリブトンＩｇ、 酵母エキス０．５ｇ、
ＮａＣ１０，５ｇ８および寒天１．５％を含む＞ ｉ
ｏ枚に塗り、３７°Ｃで一晩平板培養してスクリーニン
グを行った。この培養で得られた１０．０００個のアン
ピシリン耐性の形質転換コロニーに、ｎ−デカナール（
半井化学薬品社）を噴霧器を用いて霧状に添加し、発光
を示した（ルシフェラーゼ活性を有する）コロニーを１
株得た。このコロニーを形成する菌株に含有されるルシ
フェラーゼ活性を有する組換え体プラスミドをｐＬＵＸ
１８０１と命名し、該大腸菌コロニーを大量培養した後
にアルカリ処理を行うことにより、該プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０１を単離・精製した。この精製されたプラスミ
ドｐＬＵＸ１８０１ニ制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＋影
吐１． ＰｓｔＩ、およびシ遼Ｒ１を種々の組み合わせ
で作用させて消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳
動することにより、以下のＤＮＡ断片を得た：（１）４
．０ｋｂｐ（７）Ｈｉｎｄ ｍ Ｄ Ｎ Ａ断片、（２
）３．７ｋｂｐ（７）ＳａｌＩ −則ｎｄｌＩ［ＤＮＡ
断片、（３）３．ＯｋｂｐＯ則ｎｄＩ［Ｉ−匡［）ＮＡ
断片、および（４） １ 、５ ｋ ｂ ｐのＨｔｎｄ
ｍ −ＥｃｏＲＩ Ｄ ＮＡ断片。（１） 〜（４）
それぞれのＤＮＡ断片２０ｎｇと、１０ｎｇのｐＵｃ１
８ ＤＮＡを（１） 〜（４）と同じ制限酵素の組み合
わせで消化したＤＮＡとを、１０単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合させ、プラスミドｐＬＵＸ１８０１よ
りサブクローニングし、プラスミドｐＬＵＸ１８０２゜
ｐＬＵＸ１８０３． ｐＬＵＸ１８０４、およびｐＬＵ
Ｘ１８０５を調製した（第５図）、つまり、上記４種の
組換え体プラスミドは、それぞれ、以下のようなビブリ
オ ハーベイ由来（７）ＤＮＡ断片を有する： ｐＬＵ
Ｘ１８０２ ： ４．０ｋｂｐの！ｆｉｎｄ ｍ Ｄ
Ｎ Ａ断片、ｐＬＵＸ１８０３ ： ３．７ｋｂｐの力
吐■−Ｈ１ｎｄＩ［［ＤＮＡ断片、ｐＬＵＸ１８０４
： ３．０ｋｂｐのＨｉｎｄＩ［−力＋ｔｌＤＮＡ断片
、およびｐＬＵＸ１８０５：１．５ｋｂｐのＨｉｎｄｍ
−ｔ！ｃｏＲＩ Ｄ Ｎ Ａ断片。これらそれぞれの
組換え体プラスミドで大腸菌ＪＭ １０９株を上記と同
様の方法により形質転換した。この形質転換体をＬＢ寒
天培地で培養し、上記ｎ−デカナールを用いる方法によ
りルシフェラーゼ活性を調べた。その結果、組換え体プ
ラスミドｐＬＵＸ１８０２およびｐＬ［ＪＸ１８０３を
含有する菌体にルシフェラーゼ活性が検出された。
ルシフェラーゼ活性を発現し得る上記プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０２およびｐＬＵＸ１８０３（７）、上記ｐＬＵ
Ｘ１８０１からの調製の詳細は次のとおりである。車ず
、ｐＬＵＸ１８０１のＤＮＡ１０μｇに、１／１０１の
１０×坦ｎｄＩ［［緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣｈ、
６００ｍＭＮａＣ１）および制限酵素１１ｉｎｄｌＩ［
を２０単位添加して３７°Ｃで２時間完全に消化し、４
．０ｋｂｐの狽ｎｄｌｌｌＤＮＡ断片を含む反応混合溶
液を得る。このＨｉｎｄｌＩＩＤＮＡ断片を含む溶液に
１７１０量の１１５０ｍＭ ＮａＣ１および制限酵素５
ａｉｌを２０単位添加し、３７°Ｃで２時間完全に消化
したものを、０．８％アガロースゲルで電気泳動するこ
とによって３．７ｋｂｐの則ｎｄｌｌＩ−里Ｎ）ＮＡ断
片３μｇを単離・精製する。この３．７ｋｂｐの１１ｉ
ｎｄ ＩＩＩ −５ａｌＩ Ｄ Ｎ Ａ断片２０ｎｇと
、ｐυＣ１８ＤＮＡＩＯｎｇを制限酵素５ａｌＩ２単位
およびＨｉｎｄｌｌ１２単位で消化したＤＮＡとをＴ４
ＤＮＡリガーゼ１０単位を用いて結合し、組換え体プ
ラスミドｐＬＵＸ１８０３を得る。
Ｘ１８０２およびｐＬＵＸ１８０３（７）、上記ｐＬＵ
Ｘ１８０１からの調製の詳細は次のとおりである。車ず
、ｐＬＵＸ１８０１のＤＮＡ１０μｇに、１／１０１の
１０×坦ｎｄＩ［［緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣｈ、
６００ｍＭＮａＣ１）および制限酵素１１ｉｎｄｌＩ［
を２０単位添加して３７°Ｃで２時間完全に消化し、４
．０ｋｂｐの狽ｎｄｌｌｌＤＮＡ断片を含む反応混合溶
液を得る。このＨｉｎｄｌＩＩＤＮＡ断片を含む溶液に
１７１０量の１１５０ｍＭ ＮａＣ１および制限酵素５
ａｉｌを２０単位添加し、３７°Ｃで２時間完全に消化
したものを、０．８％アガロースゲルで電気泳動するこ
とによって３．７ｋｂｐの則ｎｄｌｌＩ−里Ｎ）ＮＡ断
片３μｇを単離・精製する。この３．７ｋｂｐの１１ｉ
ｎｄ ＩＩＩ −５ａｌＩ Ｄ Ｎ Ａ断片２０ｎｇと
、ｐυＣ１８ＤＮＡＩＯｎｇを制限酵素５ａｌＩ２単位
およびＨｉｎｄｌｌ１２単位で消化したＤＮＡとをＴ４
ＤＮＡリガーゼ１０単位を用いて結合し、組換え体プ
ラスミドｐＬＵＸ１８０３を得る。
組換え体プラスミドｐＬｔｌＸ１８０２は、同様にして
、ｐＬＵＸ１８０１のＤＮＡを制限酵素氾ｎｄｌｌＩで
消化して得られた、４．０ｋｂｐの但ｎｄｌＤＮＡ断片
と、ｐＵｃ１８ ＤＮＡ （あらかじめＨｉｎｄＩ［Ｉ
で消化）とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合するこ
とにより調製される。
、ｐＬＵＸ１８０１のＤＮＡを制限酵素氾ｎｄｌｌＩで
消化して得られた、４．０ｋｂｐの但ｎｄｌＤＮＡ断片
と、ｐＵｃ１８ ＤＮＡ （あらかじめＨｉｎｄＩ［Ｉ
で消化）とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合するこ
とにより調製される。
（３）免疫グロブリンのＦｃ結合能力とルシフェラーゼ
活性をもつ融合タンパクの作成 組換えプラスミドｐＬＵＸ１８０３ Ｄ Ｎ Ａ １０
μｇに１７１０量の１ＯＸＨｉｎｄＩ［［バッフｙ −
（１００ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐＨ７，５）、
７０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ、 ６００ｍＭ ＮａＣ１）と
制限酵素ＨｔｎｄＩ１１２０単位を加え、３７°Ｃで２
時間完全消化した。その後、このＤＮＡ溶液に１／１０
１の１１５０ｍＭ ＮａＣ１と制限酵素５ａｌ１２０単
位を加えて、３７°Ｃで２時間完全消化したものを０．
８％アガロースゲルで電気泳動することによって３．７
ｋｂｐの５ａｌＩ ＨｉｎｄＩＩ［断片３μｇを精製
した。
活性をもつ融合タンパクの作成 組換えプラスミドｐＬＵＸ１８０３ Ｄ Ｎ Ａ １０
μｇに１７１０量の１ＯＸＨｉｎｄＩ［［バッフｙ −
（１００ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐＨ７，５）、
７０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ、 ６００ｍＭ ＮａＣ１）と
制限酵素ＨｔｎｄＩ１１２０単位を加え、３７°Ｃで２
時間完全消化した。その後、このＤＮＡ溶液に１／１０
１の１１５０ｍＭ ＮａＣ１と制限酵素５ａｌ１２０単
位を加えて、３７°Ｃで２時間完全消化したものを０．
８％アガロースゲルで電気泳動することによって３．７
ｋｂｐの５ａｌＩ ＨｉｎｄＩＩ［断片３μｇを精製
した。
この精製した３、７ｋｂｐの５ａｌｌ−形ｎｄｌｕ断片
３μｇに１７３量の３ ｘＢａ１３１バッフｙ （
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、３００ｍ
Ｍ ＮａＣ１，１５ｍＭ ＣａＣＩｚ、 １５ｍＭ Ｍ
ｇＣＩｚ。
３μｇに１７３量の３ ｘＢａ１３１バッフｙ （
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、３００ｍ
Ｍ ＮａＣ１，１５ｍＭ ＣａＣＩｚ、 １５ｍＭ Ｍ
ｇＣＩｚ。
３ ｍＭ ＥＤＴＡ ・２Ｎａ、）とＢａ１３１ヌクレ
アーゼ１．３５単位を加え３０℃で１分１０秒反応させ
た。その後、等量のフェノールを加えて、ゆっくり撹拌
し、遠心（１００００ｒｐｍ、 ５分、４°ｃ＞ し
て、上清をとった。その後、上清に対して１７１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）と２倍量のエタノー
ルを加えてエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。得
られたＤＮＡａ：ｉｉを７０％エタノールで洗浄し、乾
燥させる。このＤＮＡを２０μ２のＴｆ！１０−１ （
ｌｈＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、 １ｍＭＥ
ＤＴＡ・２Ｎａ）にとかす。このＤＮＡ溶液に５００ｐ
ａａｏ １のｔ−１ｉｎｄｌｌＩリンカ−（Ｃ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ） と１７１０量の１０ＸＴ４
リガーゼ／”（ｙ ７ ｙ−とＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ
１０単位を加えて、１０’Ｃ１−晩で結合反応を行った
。この結合したＤＮＡに１７１０量の１０ＸＨｉｎｄｌ
ｌ［バッファーと制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［２単位を加え
３７℃で完全消化し、６５°Ｃ５分間の熱処理によって
制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［を失活させた。このようにして
得られた溶液のことをｒ Ｂａ１３１ヌクレアーゼ処理
ＤＮＡ溶液」と呼ぶことにする。この溶液中には種々の
Ｎ末端が欠失したルシフェラーゼ遺伝子が含まれている
。
アーゼ１．３５単位を加え３０℃で１分１０秒反応させ
た。その後、等量のフェノールを加えて、ゆっくり撹拌
し、遠心（１００００ｒｐｍ、 ５分、４°ｃ＞ し
て、上清をとった。その後、上清に対して１７１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）と２倍量のエタノー
ルを加えてエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。得
られたＤＮＡａ：ｉｉを７０％エタノールで洗浄し、乾
燥させる。このＤＮＡを２０μ２のＴｆ！１０−１ （
ｌｈＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、 １ｍＭＥ
ＤＴＡ・２Ｎａ）にとかす。このＤＮＡ溶液に５００ｐ
ａａｏ １のｔ−１ｉｎｄｌｌＩリンカ−（Ｃ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ） と１７１０量の１０ＸＴ４
リガーゼ／”（ｙ ７ ｙ−とＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ
１０単位を加えて、１０’Ｃ１−晩で結合反応を行った
。この結合したＤＮＡに１７１０量の１０ＸＨｉｎｄｌ
ｌ［バッファーと制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［２単位を加え
３７℃で完全消化し、６５°Ｃ５分間の熱処理によって
制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［を失活させた。このようにして
得られた溶液のことをｒ Ｂａ１３１ヌクレアーゼ処理
ＤＮＡ溶液」と呼ぶことにする。この溶液中には種々の
Ｎ末端が欠失したルシフェラーゼ遺伝子が含まれている
。
次に、組換えプラスミドｐＳＰＡＦｃ−Ｉ Ｄ Ｎ Ａ
１１００ｎに１／１０量の１０×もｎｄＩＩ［バッフ
ァーと制限酵素Ｈｉｎｄ■２単位を加えて３７°Ｃで完
全消化した。このＤＮＡ溶液に等量のフェノールを加え
て、ゆっくり攪拌し、遠心（１００００ｒｐｍ＋、
５分、４°Ｃ）して、上清をとった。その後、上清に対
して１７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）と
２倍量のエタノールを加えて、エタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを２０μ２のＴＥＩ
Ｏ−１にとかす。
１１００ｎに１／１０量の１０×もｎｄＩＩ［バッフ
ァーと制限酵素Ｈｉｎｄ■２単位を加えて３７°Ｃで完
全消化した。このＤＮＡ溶液に等量のフェノールを加え
て、ゆっくり攪拌し、遠心（１００００ｒｐｍ＋、
５分、４°Ｃ）して、上清をとった。その後、上清に対
して１７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）と
２倍量のエタノールを加えて、エタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを２０μ２のＴＥＩ
Ｏ−１にとかす。
このＤＮＡ溶液に１７１０量のＩＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃ
Ｉ （ｐ Ｈ８，０）とアルカリホスファターゼ２単位
を加えて３７°Ｃで２時間処理した。このＤＮＡ溶液を
フェノール抽出後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。回収されたＤＮＡを２０μ２のＴＥＩＯ−１にとか
す。
Ｉ （ｐ Ｈ８，０）とアルカリホスファターゼ２単位
を加えて３７°Ｃで２時間処理した。このＤＮＡ溶液を
フェノール抽出後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。回収されたＤＮＡを２０μ２のＴＥＩＯ−１にとか
す。
このＤＮＡ溶液（この溶液のうち、ＤＮＡ１００ｎＨに
相当する量を使用する）に、前記のようにして得られた
ｒＢａ１３１ヌクレアーゼ処理ＤＮＡ溶液（この溶液の
うち、ＤＮＡ １１００ｎに相当する量を使用する）」
と１７１０量のｌ０ＸＴ４ リガーゼバッファーとＴ４
ＤＮＡリガーゼ１０単位を加えて、１０°Ｃ５−晩で結
合反応を行った。この結合したＤＮＡを大腸菌）！ＢＩ
ＯＩ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換し、５
０μｓ／ａｄ！のアンピシリンと４０μｇ／１ｔｔｆｌ
のインドール酢酸（ＩＡＡ）を含むＬＢ寒天培地１０枚
にぬりつけ３７°Ｃで一晩放置した。増殖したアンピシ
リン耐性の１０００個の形質転換コロニーにｎ−デカナ
ールを噴霧器で霧状にかけて、光を発する （ルシフェ
ラーゼ活性を有する）コロニーを２２株得た（それぞれ
のコロニーに含まれる組換えプラスミドをｐＬＬＩＸＳ
ＰＡＦＣ−１〜２２と命名した）。
相当する量を使用する）に、前記のようにして得られた
ｒＢａ１３１ヌクレアーゼ処理ＤＮＡ溶液（この溶液の
うち、ＤＮＡ １１００ｎに相当する量を使用する）」
と１７１０量のｌ０ＸＴ４ リガーゼバッファーとＴ４
ＤＮＡリガーゼ１０単位を加えて、１０°Ｃ５−晩で結
合反応を行った。この結合したＤＮＡを大腸菌）！ＢＩ
ＯＩ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換し、５
０μｓ／ａｄ！のアンピシリンと４０μｇ／１ｔｔｆｌ
のインドール酢酸（ＩＡＡ）を含むＬＢ寒天培地１０枚
にぬりつけ３７°Ｃで一晩放置した。増殖したアンピシ
リン耐性の１０００個の形質転換コロニーにｎ−デカナ
ールを噴霧器で霧状にかけて、光を発する （ルシフェ
ラーゼ活性を有する）コロニーを２２株得た（それぞれ
のコロニーに含まれる組換えプラスミドをｐＬＬＩＸＳ
ＰＡＦＣ−１〜２２と命名した）。
以上を第６図に示した。各コロニーを５０μｇ／ｍｉの
アンピシリンを含むＬＢ液体培地で増殖させた後、得ら
れた菌体からアルカリ法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素１１ｉｎｄｌ１１． Ｐ！匹！で処理し、
アガロース電気泳動により目的のＤＮＡ断片が挿入され
ていることをチェックした。これらの中からプロティン
Ａとルシフェラーゼがタンパクレベルで融合していると
思われる組換えプラスミドｐＬＩＪＸｓＰＡＦｃ−１，
ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−２（７） Ｄ Ｎ Ａ塩基配列の
決定を行った。ＤＮＡ塩基配列の決定はサンガー法に従
って行った。その結果得られた配列を第７図と第８図に
示した。ＤＮＡ塩基配列の決定の結果ｐＬＵＸＳＰＡＦ
ｃ−１とｐＬＩＩＸｓＰＡＦｃ−２はプロティアＡとル
シフェラーゼが融合した一つのタンパクをコードしてい
ることがわかった。第７図において、４角で囲んだ塩基
１６〜１２７５は、プロティンＡとルシフェラーゼのα
サブユニットとの融合タンパクをコードする塩基配列で
あり、塩基１３０２〜２２７６はルシフェラーゼのβサ
ブユニットをコードする塩基配列である。
アンピシリンを含むＬＢ液体培地で増殖させた後、得ら
れた菌体からアルカリ法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素１１ｉｎｄｌ１１． Ｐ！匹！で処理し、
アガロース電気泳動により目的のＤＮＡ断片が挿入され
ていることをチェックした。これらの中からプロティン
Ａとルシフェラーゼがタンパクレベルで融合していると
思われる組換えプラスミドｐＬＩＪＸｓＰＡＦｃ−１，
ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−２（７） Ｄ Ｎ Ａ塩基配列の
決定を行った。ＤＮＡ塩基配列の決定はサンガー法に従
って行った。その結果得られた配列を第７図と第８図に
示した。ＤＮＡ塩基配列の決定の結果ｐＬＵＸＳＰＡＦ
ｃ−１とｐＬＩＩＸｓＰＡＦｃ−２はプロティアＡとル
シフェラーゼが融合した一つのタンパクをコードしてい
ることがわかった。第７図において、４角で囲んだ塩基
１６〜１２７５は、プロティンＡとルシフェラーゼのα
サブユニットとの融合タンパクをコードする塩基配列で
あり、塩基１３０２〜２２７６はルシフェラーゼのβサ
ブユニットをコードする塩基配列である。
第８図において、４角で囲んだ塩基１６〜１２６６は、
プロティンＡとルシフェラーゼのαサブユニットとの融
合タンパクをコードする塩基配列であり、塩基１２９２
〜２２６７はルシフェラーゼのβサブユニットをコード
する塩基配列である。
プロティンＡとルシフェラーゼのαサブユニットとの融
合タンパクをコードする塩基配列であり、塩基１２９２
〜２２６７はルシフェラーゼのβサブユニットをコード
する塩基配列である。
またそれぞれｐＬＵＸＳＰＡＦｃ−１とｐＬＬＩＸｓＰ
ＡＦｃ−２を含む大腸菌１１８ＩＯＩを５０μｇ７ｍｌ
アンピシリンを含存する１、 ５ ＩｌｌのＬＢ培地で
培養し、細胞数が５Ｘ１０”個／ ｍｌに達したときに
インドール酢酸（ＩＡＡ）を４０μｓ／ｄになるように
添加した。ρＬＵＸＳＰＡＦｃ−１およびｐＬＵＸＳＰ
ＡＦｃ−２は、ｐＤＲ７２０由来のトリプトファンプロ
モーター（Ｐ ｔｒｐ）を有するので、ＩＡＡの添加に
より融合蛋白の誘導が可能である。さらに２時間培養を
継続することによりこの形質転換体に融合蛋白を生産さ
せた。この培養物を８００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し
、得られた沈澱物を５００μｌのＴＥ１０−１緩衝液（
ｐＨ８，０）に懸濁させた。この懸濁液から２０μ２を
採取し、８０００ｒｐＩ１１で５分間遠心分離した。得
られた沈澱物を５μ２の滅菌水に懸濁し、５μ２の２×
試料緩衝液（０，１３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６゜
８）、４％ＳＯＳ、 ２０％グリセロール、１０％メル
カプトエタノール、および０．００２％ブロムフェノー
ルブルー〕を添加し、９０°Ｃで３分間熱処理して大腸
菌を熱変性させ、菌体内タンパクの５Ｏ５−ＰＡＧＥを
行った。泳動後のゲルを染色し、デンシトメーターにて
分析したところ分子量４９０００と３７０００の過剰生
産があった（分子量４９０００はプロティンＡ＋ルシフ
ェラーゼαサブユニット、分子３１３７０００はルシフ
ェラーゼβサブユニットに相当すると考えられる）。５
Ｏ５−ＰＡＧＩＥの結果は第９図に示した。
ＡＦｃ−２を含む大腸菌１１８ＩＯＩを５０μｇ７ｍｌ
アンピシリンを含存する１、 ５ ＩｌｌのＬＢ培地で
培養し、細胞数が５Ｘ１０”個／ ｍｌに達したときに
インドール酢酸（ＩＡＡ）を４０μｓ／ｄになるように
添加した。ρＬＵＸＳＰＡＦｃ−１およびｐＬＵＸＳＰ
ＡＦｃ−２は、ｐＤＲ７２０由来のトリプトファンプロ
モーター（Ｐ ｔｒｐ）を有するので、ＩＡＡの添加に
より融合蛋白の誘導が可能である。さらに２時間培養を
継続することによりこの形質転換体に融合蛋白を生産さ
せた。この培養物を８００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し
、得られた沈澱物を５００μｌのＴＥ１０−１緩衝液（
ｐＨ８，０）に懸濁させた。この懸濁液から２０μ２を
採取し、８０００ｒｐＩ１１で５分間遠心分離した。得
られた沈澱物を５μ２の滅菌水に懸濁し、５μ２の２×
試料緩衝液（０，１３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６゜
８）、４％ＳＯＳ、 ２０％グリセロール、１０％メル
カプトエタノール、および０．００２％ブロムフェノー
ルブルー〕を添加し、９０°Ｃで３分間熱処理して大腸
菌を熱変性させ、菌体内タンパクの５Ｏ５−ＰＡＧＥを
行った。泳動後のゲルを染色し、デンシトメーターにて
分析したところ分子量４９０００と３７０００の過剰生
産があった（分子量４９０００はプロティンＡ＋ルシフ
ェラーゼαサブユニット、分子３１３７０００はルシフ
ェラーゼβサブユニットに相当すると考えられる）。５
Ｏ５−ＰＡＧＩＥの結果は第９図に示した。
次に、菌体内タンパクの免疫グロブリンのＦｃ結合活性
を以下の方法で調べた。それぞれｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−
１とｐＬＵＸｓＰＡＰｃ−２を含む大腸菌ＨＢ １０１
を使用し、前記と同様にして、融合蛋白生産、得られた
培養物の遠心分離、得られた沈澱物のＴＥＩＯ−１緩衝
液への懸濁および懸濁液の１部を取り、遠心分離を行っ
た。また、前記（２）項で得られたルシフェラーゼ遺伝
子を含む組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０３をＪＭ１
０９に形質転換したものおよびＨＢ １０１についても
全く同様の操作を行った。
を以下の方法で調べた。それぞれｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−
１とｐＬＵＸｓＰＡＰｃ−２を含む大腸菌ＨＢ １０１
を使用し、前記と同様にして、融合蛋白生産、得られた
培養物の遠心分離、得られた沈澱物のＴＥＩＯ−１緩衝
液への懸濁および懸濁液の１部を取り、遠心分離を行っ
た。また、前記（２）項で得られたルシフェラーゼ遺伝
子を含む組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０３をＪＭ１
０９に形質転換したものおよびＨＢ １０１についても
全く同様の操作を行った。
遠心分離によって得られた沈澱物を１００μ！（希釈倍
率×１と表わす）および１０００１！ｆ（希釈倍率×１
０と表わす）の８Ｍウレアに懸濁した。この懸濁液を試
料として、酵素免疫測定法によって、免疫グロブリンの
Ｆｃへの結合性を調べた。酵素免疫測定は、ＢＩＯ−Ｄ
ＯＴ（ｉｍｍｕｎ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ： Ｂｉ
ｏ−ＲＡＤ社）の装置を使用し、その使用説明書に従っ
て行った。
率×１と表わす）および１０００１！ｆ（希釈倍率×１
０と表わす）の８Ｍウレアに懸濁した。この懸濁液を試
料として、酵素免疫測定法によって、免疫グロブリンの
Ｆｃへの結合性を調べた。酵素免疫測定は、ＢＩＯ−Ｄ
ＯＴ（ｉｍｍｕｎ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ： Ｂｉ
ｏ−ＲＡＤ社）の装置を使用し、その使用説明書に従っ
て行った。
試料液を８１０−ＤＯＴ装置にセットされたニトロセル
ロース（ＮＣ）フィルターに吸着させた。次にパーオキ
シダーゼ標識抗ヒトＴｇＧ抗体を、上記の吸着物に接触
させた後洗浄する０次に、装置からニトロセルロースフ
ィルターをはずし、発色液〔Ａ液：３０％１１ｚＯｚ
１２μＩｔ ＋ＴＢＳ（２０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
ロース（ＮＣ）フィルターに吸着させた。次にパーオキ
シダーゼ標識抗ヒトＴｇＧ抗体を、上記の吸着物に接触
させた後洗浄する０次に、装置からニトロセルロースフ
ィルターをはずし、発色液〔Ａ液：３０％１１ｚＯｚ
１２μＩｔ ＋ＴＢＳ（２０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
ｐＨ７，５，５００＋＋＋Ｍ ＮａＣ１） ２０ｄ、Ｂ
液：４−クロロ−１−ナフトール１２１１Ｉｇ＋メタノ
ール４ｍ、、Ａ液とＢ液を混合。〕に浸漬する。試料液
中に免疫グロブリンのＦｃへ結合するものが存在すれば
、黄色に発色する。
液：４−クロロ−１−ナフトール１２１１Ｉｇ＋メタノ
ール４ｍ、、Ａ液とＢ液を混合。〕に浸漬する。試料液
中に免疫グロブリンのＦｃへ結合するものが存在すれば
、黄色に発色する。
この結果を第１０図に示した。第１０図により、融合蛋
白は免疫グロブリンのＦｃに結合する能力があることが
わかった。
白は免疫グロブリンのＦｃに結合する能力があることが
わかった。
実施例２
融合蛋白の大量調製
実施例１の（３）で得られた組換え体プラスミドｐＬｔ
ｌＸｓＰＡＦｃ−１を含有する大腸菌８８１０１株（形
質転換体）を、５０Ｍｇ／ｕｔｉアンピシリンを含有す
る１ １．のＬＢ培地で大量培養した。この培養細胞が
５Ｘ１０”個／ ｍｌに達したときにＩＡＡを４０Ｍｇ
ｏａｌになるように添加して上記の融合タンパクを誘導
し、さらに２時間培養を継続した。この培養物を８００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈澱物を８１
ｄの緩衝液Ａ （５０μＩｔＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，０）、 ５ｍＭ ＢＤＴＡ−Ｎａ
ｚ。
ｌＸｓＰＡＦｃ−１を含有する大腸菌８８１０１株（形
質転換体）を、５０Ｍｇ／ｕｔｉアンピシリンを含有す
る１ １．のＬＢ培地で大量培養した。この培養細胞が
５Ｘ１０”個／ ｍｌに達したときにＩＡＡを４０Ｍｇ
ｏａｌになるように添加して上記の融合タンパクを誘導
し、さらに２時間培養を継続した。この培養物を８００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈澱物を８１
ｄの緩衝液Ａ （５０μＩｔＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，０）、 ５ｍＭ ＢＤＴＡ−Ｎａ
ｚ。
１０ｍＭ ＭｇＣｈ、 ０．１ｍＭジチオスレイトール
、１０％グリセロール、２１１１Ｍフッ化フェニルメチ
ルスルホニル、 ６０１１Ｍ ＮＨ４Ｃ１）に懸濁し、
超音波処理を行った。
、１０％グリセロール、２１１１Ｍフッ化フェニルメチ
ルスルホニル、 ６０１１Ｍ ＮＨ４Ｃ１）に懸濁し、
超音波処理を行った。
これを１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、得ら
れた上清を７０％飽和硫安で分画した。得られた沈澱物
を２ｄの緩衝液Ｂ Ｃ１０ｔｔｒＭＮａｔ１１ＰＯａ−
Ｎａ１１ｚＰＣ１０ｔｔｒ、８＞。
れた上清を７０％飽和硫安で分画した。得られた沈澱物
を２ｄの緩衝液Ｂ Ｃ１０ｔｔｒＭＮａｔ１１ＰＯａ−
Ｎａ１１ｚＰＣ１０ｔｔｒ、８＞。
１００μｈフツ化フエニルメチルスルホニル、 １００
μＭ ＢＤＴＡ・Ｎａｚ）に溶かし、１０．００Ｏｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を緩衝液Ｂで平
衡化した内径１．６ＣＩ１１．高さ９０ｃｍのセファク
リル５２００カラム（ファルマシアＬＫＢ製）に添加し
、緩衝液Ｂを溶離液として３０ｄ／ｈでゲルクロマトグ
ラフィーを行った。ルシフェラーゼ活性のある分子量８
６，０００の分画をタンパク質の５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＯＳ −ＰＡＧＥ）を行い、泳
動後のゲルをコマジ−ブリリアントブルー染色すると、
分子量４９、０００及び３７，０００にバンドが認めら
れた。この２つのバンドは、それぞれ免疫グロブリンの
Ｆｃ結合ペプチドとビブリオ ハーベイのルシフェラー
ゼのサブユニットαとの融合ペプチド及びルシフェラー
ゼのβサブユニットに相当し、その純度をデシントメ−
ターにて分析すると９０％以上であることが確認された
。更に、ゲルクロマトグラフィーを行って得た分子１８
６．０００の分画を、１２の緩衝液Ａで４℃−晩透析し
た。この透析試料を緩衝液Ａで平衡化した内径１．６１
、高さ１７ｃｍのＱセファロース （ファルマシアＩＪ
Ｂ製）に添加し、流速３０ｙ１／ｈでＮａＣ１を含む緩
衝液Ａの２０ｍＭ〜Ｉ Ｍ ＮａＣ１直線濃度勾配によ
り分画し、分画したものを後述の「ルシフェラーゼの活
性測定法」によって活性を測定し、ルシフェラーゼ活性
のある０、３Ｍ〜０．３５ＭＮａＣ１を含む緩衝液分画
をタンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、泳動後のゲルをコマジ−ブリリアントブルー
染色すると、分子１Ｆ４９．０００と３７．０００にバ
ンドが認められ、その純度をデンシトメーターにて分析
すると９５％以上であることが確認された。この溶液中
のタンパク質の量を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標
準物質としてローリ−法により測定したところ、３０■
のタンパク質が含有されていることがわかった。
μＭ ＢＤＴＡ・Ｎａｚ）に溶かし、１０．００Ｏｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を緩衝液Ｂで平
衡化した内径１．６ＣＩ１１．高さ９０ｃｍのセファク
リル５２００カラム（ファルマシアＬＫＢ製）に添加し
、緩衝液Ｂを溶離液として３０ｄ／ｈでゲルクロマトグ
ラフィーを行った。ルシフェラーゼ活性のある分子量８
６，０００の分画をタンパク質の５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＯＳ −ＰＡＧＥ）を行い、泳
動後のゲルをコマジ−ブリリアントブルー染色すると、
分子量４９、０００及び３７，０００にバンドが認めら
れた。この２つのバンドは、それぞれ免疫グロブリンの
Ｆｃ結合ペプチドとビブリオ ハーベイのルシフェラー
ゼのサブユニットαとの融合ペプチド及びルシフェラー
ゼのβサブユニットに相当し、その純度をデシントメ−
ターにて分析すると９０％以上であることが確認された
。更に、ゲルクロマトグラフィーを行って得た分子１８
６．０００の分画を、１２の緩衝液Ａで４℃−晩透析し
た。この透析試料を緩衝液Ａで平衡化した内径１．６１
、高さ１７ｃｍのＱセファロース （ファルマシアＩＪ
Ｂ製）に添加し、流速３０ｙ１／ｈでＮａＣ１を含む緩
衝液Ａの２０ｍＭ〜Ｉ Ｍ ＮａＣ１直線濃度勾配によ
り分画し、分画したものを後述の「ルシフェラーゼの活
性測定法」によって活性を測定し、ルシフェラーゼ活性
のある０、３Ｍ〜０．３５ＭＮａＣ１を含む緩衝液分画
をタンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、泳動後のゲルをコマジ−ブリリアントブルー
染色すると、分子１Ｆ４９．０００と３７．０００にバ
ンドが認められ、その純度をデンシトメーターにて分析
すると９５％以上であることが確認された。この溶液中
のタンパク質の量を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標
準物質としてローリ−法により測定したところ、３０■
のタンパク質が含有されていることがわかった。
「ルシフェラーゼ活性の測定法」
ルシフェラーゼ活性の測定はＮＡＤ（Ｐ）ｌｌ測定キッ
ト （ベーリンガーマンハイム山之内社）、ＮＡＤＨ（
ヘーリンガーマンハイム山之内社）およびＮＡＤＨオキ
シダーゼを用いて行った。
ト （ベーリンガーマンハイム山之内社）、ＮＡＤＨ（
ヘーリンガーマンハイム山之内社）およびＮＡＤＨオキ
シダーゼを用いて行った。
ＮＡＤ（Ｐ）ｌｌ測定キットについているボトル１に２
．０ｄの脱イオン水を入れる（ＦＭＮ最終濃度６２．５
μｍｏｌ／ｌ１）（溶液１）０次に最終濃度がそれぞれ
３１．２５ｍＭ、０．１２５ ｍＭになるようにリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨの溶液に５ Ｘ １０′ｍｏｌ／
ｌのＮＡＤＨ溶液を５０ｕｌ加えた。この溶液を２０
０μ２ずつ小試験管に分注し、それぞれに１０単位のＮ
ＡＤ）ｌオキシダーゼを加え、これに１０μ２〜２０μ
２のルシフェラーゼ活性測定用サンプルを入れ、次いで
５μ２のｎ−デカナールを加え、１分径ベックマン液体
シンチレーションカウンターＬＳ３８０１でフォトンの
量を測定する。
．０ｄの脱イオン水を入れる（ＦＭＮ最終濃度６２．５
μｍｏｌ／ｌ１）（溶液１）０次に最終濃度がそれぞれ
３１．２５ｍＭ、０．１２５ ｍＭになるようにリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨの溶液に５ Ｘ １０′ｍｏｌ／
ｌのＮＡＤＨ溶液を５０ｕｌ加えた。この溶液を２０
０μ２ずつ小試験管に分注し、それぞれに１０単位のＮ
ＡＤ）ｌオキシダーゼを加え、これに１０μ２〜２０μ
２のルシフェラーゼ活性測定用サンプルを入れ、次いで
５μ２のｎ−デカナールを加え、１分径ベックマン液体
シンチレーションカウンターＬＳ３８０１でフォトンの
量を測定する。
実施例３
実施例２において、Ｉ）ＬＵＸＳＰＡＦｃ−１を含有す
る大腸菌ＨＢ １０１株（形質転換体）の代りに、実施
例１の（３）で得られた組換え体プラスミドｐＬＩＪＸ
ｓＰＡＦｃ−２を含有する大腸菌ＨＢ １０１株（形質
転換体）を使用したこと以外は、実施例２と同様にして
融合蛋白の大ＩＩＩ製を行ったところ、実施例２とほぼ
同様の結果が得られた。
る大腸菌ＨＢ １０１株（形質転換体）の代りに、実施
例１の（３）で得られた組換え体プラスミドｐＬＩＪＸ
ｓＰＡＦｃ−２を含有する大腸菌ＨＢ １０１株（形質
転換体）を使用したこと以外は、実施例２と同様にして
融合蛋白の大ＩＩＩ製を行ったところ、実施例２とほぼ
同様の結果が得られた。
実施例４
融合タンパクを用いてのアルファフェトプロティンの定
量 ＢＩＯ−ＤＯＴ（ｉｍｍｕｎ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ
）装置（第１１図）を使って行った。ニトロセルロース
（ＮＣ）フィルター（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社、９Ｘ１４ｃｍ
）をＴＢＳ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｃ１（ｐＨ７，
５）、５００ｍＭ ＮａＣ１）中に約５分間浸す。その
後、ろ紙上で軽く水を切り、第１１図の様に着装した。
量 ＢＩＯ−ＤＯＴ（ｉｍｍｕｎ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ
）装置（第１１図）を使って行った。ニトロセルロース
（ＮＣ）フィルター（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社、９Ｘ１４ｃｍ
）をＴＢＳ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｃ１（ｐＨ７，
５）、５００ｍＭ ＮａＣ１）中に約５分間浸す。その
後、ろ紙上で軽く水を切り、第１１図の様に着装した。
１ウエルあたり５００μ２のＴＢＳで・２回洗浄し、５
分間吸引乾燥後常圧に戻した。その後、１０−’。
分間吸引乾燥後常圧に戻した。その後、１０−’。
７ Ｘｌ０−−１０−＠、 ６．８Ｘ１０−’およびＩ
Ｑ−’ｍｏｌ／ｊ！濃度のアルファフェトプロティンを
１ウエルあたり２０μｌずつドツトした。５分後、コ・
ツクを開は自然ろ過し、２ｈｒ後、吸引濾過し、常圧に
戻した。
Ｑ−’ｍｏｌ／ｊ！濃度のアルファフェトプロティンを
１ウエルあたり２０μｌずつドツトした。５分後、コ・
ツクを開は自然ろ過し、２ｈｒ後、吸引濾過し、常圧に
戻した。
その後、ＴＴＢＳ （０，５％ドライド：／Ｘ１００を
含むＴＢＳ） ニＢＳＡを３％濃度にとかしたものをｌ
ウェルあたり１００ μ２ドツトし、ブロッキングした
。５分後、コックを開は自然ろ過し、ｌウェルあたり５
００μｌのＴＴＢＳで４〜５回洗浄し、５分間吸引乾燥
し、常圧に戻した。１ウエルあたり１００ＩＩＪｌ！の
第１抗体〔抗アルファフェトプロティンモノクローナル
抗体（東洋醸造社より購入）を１μｇ／ｄ：ａ度に、１
％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳにとかしたもの〕をドツトし、コ
ックを開は自然濾過した。室温で２時間後、吸引濾過し
た。１ウエルあたり５００μ２のＴＴＢＳで４〜５回洗
浄し、５分間吸引乾燥し、常圧に戻した。
含むＴＢＳ） ニＢＳＡを３％濃度にとかしたものをｌ
ウェルあたり１００ μ２ドツトし、ブロッキングした
。５分後、コックを開は自然ろ過し、ｌウェルあたり５
００μｌのＴＴＢＳで４〜５回洗浄し、５分間吸引乾燥
し、常圧に戻した。１ウエルあたり１００ＩＩＪｌ！の
第１抗体〔抗アルファフェトプロティンモノクローナル
抗体（東洋醸造社より購入）を１μｇ／ｄ：ａ度に、１
％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳにとかしたもの〕をドツトし、コ
ックを開は自然濾過した。室温で２時間後、吸引濾過し
た。１ウエルあたり５００μ２のＴＴＢＳで４〜５回洗
浄し、５分間吸引乾燥し、常圧に戻した。
エラーゼ活性をもつもの）を１ａｇ／ｍｌ濃度に、１％
ＢＳＡ含有ＴＴＢＳにとかしたもの〕をドツトし、コッ
クを開は自然濾過した。１時間後、吸引濾過した。１ウ
エルあたり５００１ＪｆのＴＴＢＳで４〜５回洗浄し、
その後１ウエルあたり５００．１のＴＢＳで２〜３回洗
浄後、５分間、吸引乾燥した。ニトロセルロースフィル
ターを装置よりはずし、ウェルにそってフィルターを切
り、発光カウンターＢｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５００（
Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）の測定チューブに、切りとったフ
ィルターを入れた。その後、２００ｕＡの反応混合液（
２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）、１０
０１！Ｍジチオスレイトール、２，５！Ｍ ＦＭＮＨ，
，４０ｍｇ／ｊ！）ライドンＸ−１００，２０ｕ ｍｏ
ｌ／ ｉミリステイクアルデヒド］を加えて、１背後Ｂ
ｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５００で測定した。（結果を第
１２図に示した。）
ＢＳＡ含有ＴＴＢＳにとかしたもの〕をドツトし、コッ
クを開は自然濾過した。１時間後、吸引濾過した。１ウ
エルあたり５００１ＪｆのＴＴＢＳで４〜５回洗浄し、
その後１ウエルあたり５００．１のＴＢＳで２〜３回洗
浄後、５分間、吸引乾燥した。ニトロセルロースフィル
ターを装置よりはずし、ウェルにそってフィルターを切
り、発光カウンターＢｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５００（
Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）の測定チューブに、切りとったフ
ィルターを入れた。その後、２００ｕＡの反応混合液（
２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）、１０
０１！Ｍジチオスレイトール、２，５！Ｍ ＦＭＮＨ，
，４０ｍｇ／ｊ！）ライドンＸ−１００，２０ｕ ｍｏ
ｌ／ ｉミリステイクアルデヒド］を加えて、１背後Ｂ
ｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５００で測定した。（結果を第
１２図に示した。）
第１図はプロティンへの構造を示す図、第２図はプロテ
ィンＡ様遺伝子配列、第３図はｐｓＰＡＦｃ−１の構築
図、第４図はｐＬＵＸ１８０１の構築図、第５図はｐＬ
ＩＪＸ１８０１．１８０２．１８０３．１８０４及び１
８０５のＤＮＡ断片を示す図、第６図はｐＬＵＸｓＩ’
ＡＦｃ−１，ｐＬＩＪＸｓＰＡＦｃ−２の構築図、第７
図はｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−１のＤＮＡ塩基配列、第８図
はｐＬＬＩＸｓＰＡＦｃ−２のＤＮＡ塩基配列、第９図
はＨＢＩＯＩ （ｐＬＬＩＸｓＰＡＦｃ−１）、ＩＩＢ
ＩＯＩ （ｐＬＵＸｓＰＡＰｃ−２）の８０５−ＰＡＧ
Ｅ、第１０図は菌体生成蛋白の免疫グロブリンのＰｃ結
合能力を示す図、第１１図はＢＩＯ−ＤＯＴ（ｉｍｍｕ
ｎ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ）装置を示す図、第１２図
はアルファフェトプロティンの測定結果を示す図である
。 第２図 ゛プロティン、１！遺遺伝子列 しｙｓＬｅｕＣ：ｙｓＭｅ を本車傘本事＊第３図 ｐｓＰＡＦｃ−１の構築 第４図 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ連結 ↓ 因二Ｈ１／瀾蕉 第 ７ 図（その１） ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−１のＤＮＡ塩基配列第７図（その
２） 第７図（その３） 第７図（その４） ＡＬＩＩｕｌＡＩＩｌ １ｌＡＡｌ＋’ｌ”１ＬｉＡ
Ａ ｌｊＡにしし■＾Ｔ−ｆ＾ ＡＣＡにＴＴＧＡに
ＧＴ 第 ８ 図（その１） ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−２のＤＮＡ塩基配列第８図（その
２） 第８図（その３） 第８図（その４） ＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧ ＣＴＡＡＣＴＡＡＴＡ Ｇ
ＡＧＧＣＡＴＴτＡ ＴＡ丁ＧＧＡＣＧＴＡＧ丁ＣＡ
ＴＴＧＣＡＧ ＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣ
ＡＴＣＴＣＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡ
ＣＧＡＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＣＴ
ＡＴＴ丁ＴＴＡＡＧＴＴＧＡ ＡＧＡＣＣＣＴＡＴＴ
ＡＡＣＡＣ丁ＴＧＡＣＧＡＴ第９図 １、分子量マーカー ２、 ＨＢＩＱＩ ３、 ＪＭ１０９（ｐ ＬＵＸ１８０３）４、ＨＢＩ
ＯＩ（ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−Ｄ５、ＨＢＩＯＩ（ｐＬＵ
ＸＳＰＡＦｃ−２）ＨＢＩＯＩ（ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−
１）。 ＨＢＩＯＩ（ｐＬＵＸＳＰＡＦｃ−りの５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ第１０図 免疫グロブリンのＦｃ結合能力の測定 、ｚ ＋ ＋＋、発色しなかったちの ・黄色に発色したちの ４ ： Ｈ８１０１（ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ −２）第１
１図 ２：サンプルテンプレート ８：吸引コック
ィンＡ様遺伝子配列、第３図はｐｓＰＡＦｃ−１の構築
図、第４図はｐＬＵＸ１８０１の構築図、第５図はｐＬ
ＩＪＸ１８０１．１８０２．１８０３．１８０４及び１
８０５のＤＮＡ断片を示す図、第６図はｐＬＵＸｓＩ’
ＡＦｃ−１，ｐＬＩＪＸｓＰＡＦｃ−２の構築図、第７
図はｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−１のＤＮＡ塩基配列、第８図
はｐＬＬＩＸｓＰＡＦｃ−２のＤＮＡ塩基配列、第９図
はＨＢＩＯＩ （ｐＬＬＩＸｓＰＡＦｃ−１）、ＩＩＢ
ＩＯＩ （ｐＬＵＸｓＰＡＰｃ−２）の８０５−ＰＡＧ
Ｅ、第１０図は菌体生成蛋白の免疫グロブリンのＰｃ結
合能力を示す図、第１１図はＢＩＯ−ＤＯＴ（ｉｍｍｕ
ｎ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ）装置を示す図、第１２図
はアルファフェトプロティンの測定結果を示す図である
。 第２図 ゛プロティン、１！遺遺伝子列 しｙｓＬｅｕＣ：ｙｓＭｅ を本車傘本事＊第３図 ｐｓＰＡＦｃ−１の構築 第４図 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ連結 ↓ 因二Ｈ１／瀾蕉 第 ７ 図（その１） ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−１のＤＮＡ塩基配列第７図（その
２） 第７図（その３） 第７図（その４） ＡＬＩＩｕｌＡＩＩｌ １ｌＡＡｌ＋’ｌ”１ＬｉＡ
Ａ ｌｊＡにしし■＾Ｔ−ｆ＾ ＡＣＡにＴＴＧＡに
ＧＴ 第 ８ 図（その１） ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−２のＤＮＡ塩基配列第８図（その
２） 第８図（その３） 第８図（その４） ＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧ ＣＴＡＡＣＴＡＡＴＡ Ｇ
ＡＧＧＣＡＴＴτＡ ＴＡ丁ＧＧＡＣＧＴＡＧ丁ＣＡ
ＴＴＧＣＡＧ ＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣ
ＡＴＣＴＣＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡ
ＣＧＡＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＣＴ
ＡＴＴ丁ＴＴＡＡＧＴＴＧＡ ＡＧＡＣＣＣＴＡＴＴ
ＡＡＣＡＣ丁ＴＧＡＣＧＡＴ第９図 １、分子量マーカー ２、 ＨＢＩＱＩ ３、 ＪＭ１０９（ｐ ＬＵＸ１８０３）４、ＨＢＩ
ＯＩ（ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−Ｄ５、ＨＢＩＯＩ（ｐＬＵ
ＸＳＰＡＦｃ−２）ＨＢＩＯＩ（ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ−
１）。 ＨＢＩＯＩ（ｐＬＵＸＳＰＡＦｃ−りの５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ第１０図 免疫グロブリンのＦｃ結合能力の測定 、ｚ ＋ ＋＋、発色しなかったちの ・黄色に発色したちの ４ ： Ｈ８１０１（ｐＬＵＸｓＰＡＦｃ −２）第１
１図 ２：サンプルテンプレート ８：吸引コック
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合能力とルシ
フェラーゼ活性をもつポリペプチド。 ２、次式のＤＮＡ配列を有する請求項１記載のポリペプ
チドをコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ３、次式のＤＮＡ配列を有する請求項１記載のポリペプ
チドをコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ４、ルシフェラーゼ活性をもちかつＮ末端がかけたポリ
ペプチドをコードする遺伝子。 ５、請求項２又は３記載の遺伝子を含むＤＮＡ配列を大
腸菌のプラスミドへ組み込んだ組換えプラスミド。 ６、宿主細胞を請求項５記載の組換えプラスミドで形質
転換した形質転換体。 ７、請求項５記載の組換えプラスミドを含む形質転換体
を培地中で培養し、培養物から免疫グロブリンのＦｃ領
域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペ
プチドを採取することを特徴とする前記ポリペプチドの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1131195A JPH02308791A (ja) | 1989-05-24 | 1989-05-24 | 免疫グロブリンＦｃ領域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1131195A JPH02308791A (ja) | 1989-05-24 | 1989-05-24 | 免疫グロブリンＦｃ領域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02308791A true JPH02308791A (ja) | 1990-12-21 |
Family
ID=15052249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1131195A Pending JPH02308791A (ja) | 1989-05-24 | 1989-05-24 | 免疫グロブリンＦｃ領域に対する結合能力とルシフェラーゼ活性をもつポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02308791A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995009240A1 (en) * | 1993-09-27 | 1995-04-06 | University Of Massachusetts Medical Center | Receptor-activated reporter systems |
| US5989893A (en) * | 1993-09-27 | 1999-11-23 | University Of Massachusetts Medical Center | Receptor-activated reporter systems |
| WO2001004310A1 (en) * | 1999-07-13 | 2001-01-18 | Heska Corporation | Fc EPSILON RECEPTOR-LUMINESCENCE INDUCING PROTEIN CHIMERIC NUCLEIC ACID MOLECULES, FUSION PROTEINS AND USES THEREOF |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59113890A (ja) * | 1982-10-27 | 1984-06-30 | レプリゲン・コ−ポレ−シヨン | プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物 |
| JPS60501178A (ja) * | 1983-04-23 | 1985-07-25 | バツテレ−インステイツウト | 抗原抗体検出剤 |
-
1989
- 1989-05-24 JP JP1131195A patent/JPH02308791A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59113890A (ja) * | 1982-10-27 | 1984-06-30 | レプリゲン・コ−ポレ−シヨン | プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物 |
| JPS60501178A (ja) * | 1983-04-23 | 1985-07-25 | バツテレ−インステイツウト | 抗原抗体検出剤 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995009240A1 (en) * | 1993-09-27 | 1995-04-06 | University Of Massachusetts Medical Center | Receptor-activated reporter systems |
| US5989893A (en) * | 1993-09-27 | 1999-11-23 | University Of Massachusetts Medical Center | Receptor-activated reporter systems |
| WO2001004310A1 (en) * | 1999-07-13 | 2001-01-18 | Heska Corporation | Fc EPSILON RECEPTOR-LUMINESCENCE INDUCING PROTEIN CHIMERIC NUCLEIC ACID MOLECULES, FUSION PROTEINS AND USES THEREOF |
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