JPH02308792A - ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法 - Google Patents
ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法Info
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- JPH02308792A JPH02308792A JP12796389A JP12796389A JPH02308792A JP H02308792 A JPH02308792 A JP H02308792A JP 12796389 A JP12796389 A JP 12796389A JP 12796389 A JP12796389 A JP 12796389A JP H02308792 A JPH02308792 A JP H02308792A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法に関す
る。
る。
従来、ゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａ
ｔａ ）及びヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ １ａｔ
ｅｒａｌｉｓ ）由来のルシフェラーゼは、不安定であ
るために精製に成功していないのが実情である〔蛋白質
核酸酵素、第３２巻、第１０号、第４４〜５９頁、特に
第４７頁（第１２３４〜１２４９頁、特に第１２３７頁
）（１９８７））。
ｔａ ）及びヘイケボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ １ａｔ
ｅｒａｌｉｓ ）由来のルシフェラーゼは、不安定であ
るために精製に成功していないのが実情である〔蛋白質
核酸酵素、第３２巻、第１０号、第４４〜５９頁、特に
第４７頁（第１２３４〜１２４９頁、特に第１２３７頁
）（１９８７））。
また、アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａ
ｌｉｓ ）由来のルシフェラーゼも極めて不安定であり
、該酵素の溶液形態での保存中に、酵素活性が急速に失
活するのが現状である。
ｌｉｓ ）由来のルシフェラーゼも極めて不安定であり
、該酵素の溶液形態での保存中に、酵素活性が急速に失
活するのが現状である。
本発明は、ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法を提供
することを目的とするものである。
することを目的とするものである。
そこで、本発明者等は、このような実情に鑑み鋭意検討
した結果、ホタル由来ルシフェラーゼを含む溶液に、エ
チレングリコールを添加すれば、該添加物を添加しない
場合に比較して著しく酵素活性が安定化されること等の
知見を得、本発明を完成した。
した結果、ホタル由来ルシフェラーゼを含む溶液に、エ
チレングリコールを添加すれば、該添加物を添加しない
場合に比較して著しく酵素活性が安定化されること等の
知見を得、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ホタル由来ルシフェラーゼを含む溶
液に、エチレングリコールを添加スルコとを特徴とする
ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法である。
液に、エチレングリコールを添加スルコとを特徴とする
ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明を適用しうるホタル由来ルシフエラーゼとしでは
、ホタル由来のものであれば、如何なるものでもよく、
例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル
等由来のルシフェラーゼが挙げられ、更に、遺伝子組み
換えにより得られる上記由来のルシフェラーゼも挙げら
れ、また、ホタル由来ルシフェラーゼは、粗酵素、精製
酵素等でも適用可能である。
、ホタル由来のものであれば、如何なるものでもよく、
例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル
等由来のルシフェラーゼが挙げられ、更に、遺伝子組み
換えにより得られる上記由来のルシフェラーゼも挙げら
れ、また、ホタル由来ルシフェラーゼは、粗酵素、精製
酵素等でも適用可能である。
上記ゲンジボタル及びヘイケボタル由来のルシフェラー
ゼの理化学的性質を以下に記載する。
ゼの理化学的性質を以下に記載する。
０ゲンジボタル由来のルシフェラーゼ
０作用：
下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である。
フェリンの酸化を触媒する酵素である。
本酵素
↓
ルシフェリン＋ＡＴＰ ＋ ０２
オキジルシフエリン ＋ＡＭＰ＋ ピロリン酸＋Ｃ○２
＋光 ■基質特異性： ＡＤＰ 、 ＣＴＰ 、 ＵＴＰ 及びＧＴＰ
には作用しない。
＋光 ■基質特異性： ＡＤＰ 、 ＣＴＰ 、 ＵＴＰ 及びＧＴＰ
には作用しない。
■至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：
至１ｐＨは、ルシフェリンを基質とし、２５ｍＭグリシ
ルグリシンのｐＨをｐＨ６，５〜１１．５迄変化させ、
温度３０°Ｃで反応させ、２０秒間発光量（７オトン数
）を測定した場合、第１図に示す如（ｐＨ８，０〜９．
５であり、また安定ｐＨ範囲ハ、ルシフェリンを含有す
る緩衝液（ｐＨ４，６〜８．０ ： ２５ ｍＭ リ
ン酸緩衝液、ｐＨ８，０〜１１．５ ： ２５ ｍＭ
グリシン−塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を
それぞれ使用。なお、それぞれの緩衝液には１０％飽和
となる如く硫酸アンモニウムを添加したものである）に
酵素を添加し、温度０°Ｃで４時間作用させた場合、第
２図に示す如く、ｐＨ６，５〜９．０である。
ルグリシンのｐＨをｐＨ６，５〜１１．５迄変化させ、
温度３０°Ｃで反応させ、２０秒間発光量（７オトン数
）を測定した場合、第１図に示す如（ｐＨ８，０〜９．
５であり、また安定ｐＨ範囲ハ、ルシフェリンを含有す
る緩衝液（ｐＨ４，６〜８．０ ： ２５ ｍＭ リ
ン酸緩衝液、ｐＨ８，０〜１１．５ ： ２５ ｍＭ
グリシン−塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を
それぞれ使用。なお、それぞれの緩衝液には１０％飽和
となる如く硫酸アンモニウムを添加したものである）に
酵素を添加し、温度０°Ｃで４時間作用させた場合、第
２図に示す如く、ｐＨ６，５〜９．０である。
なお、第２図において、・−・及びΔ−Δは、夫々２５
ｍＭ ’）ン酸緩衝液、及び２５ ｍＭグリシン・塩
化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合
の活性を示す。
ｍＭ ’）ン酸緩衝液、及び２５ ｍＭグリシン・塩
化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合
の活性を示す。
■力価の測定法
２５ ｍＭ グリシルグリシン（ｐＨ７，８） ８
ｄ。
ｄ。
ｔｔｍマグネシウム溶液（２５ｍＭグリシルグリシン（
ｐＨ７，８）に硫酸マグネシウムなＯ，１Ｍ となる如
く添加した溶液）０．５ｍｅ及びルシフェリン溶液（２
５ｍＭ グリシルグリシン（ｐＨ７，８）にルシフェリ
ンを１ ｍＭ となる如く添加した溶液］０．８ｇｔを
混合してルシフェリン混合液を調製する。
ｐＨ７，８）に硫酸マグネシウムなＯ，１Ｍ となる如
く添加した溶液）０．５ｍｅ及びルシフェリン溶液（２
５ｍＭ グリシルグリシン（ｐＨ７，８）にルシフェリ
ンを１ ｍＭ となる如く添加した溶液］０．８ｇｔを
混合してルシフェリン混合液を調製する。
このようにして得たルシフェリン混合液４００μｌ及び
測定するルシフェラーゼ１０μｊを混合したものに、Ａ
ＴＰ 溶液［２５ｍＭグリシルグリシ７ （１）Ｈ７
，８）にＡＴＰ を１０ｍＭとなる如く添加したもの
］８０μＥを注入すると同時に、ルミ／メーター（アロ
カ社製、ルミネッセンスリーダＢＬＲ−２０１）により
発生するフォトン数を２０秒間積算して求める。
測定するルシフェラーゼ１０μｊを混合したものに、Ａ
ＴＰ 溶液［２５ｍＭグリシルグリシ７ （１）Ｈ７
，８）にＡＴＰ を１０ｍＭとなる如く添加したもの
］８０μＥを注入すると同時に、ルミ／メーター（アロ
カ社製、ルミネッセンスリーダＢＬＲ−２０１）により
発生するフォトン数を２０秒間積算して求める。
■作用適温の範囲
ｐＨ７，８のもとに、各温度で反応させ２０秒間発光ｆ
ｆｉ：（フォトン数）を測定した場合、０〜５０℃の範
囲内にある。
ｆｉ：（フォトン数）を測定した場合、０〜５０℃の範
囲内にある。
■ｐＨ１温度等による失活の条件
（イ） ｐＨによる失活の条件
ｐＨ５，０以下及びｐＨ１１，０以上で４時間後完全に
失活する。
失活する。
（ロ）温度による失活の条件
ｐＨ７，８において、温度５０°Ｃ１１５分間の熱処理
により完全に失活する。
により完全に失活する。
０ヘイケボタル由来ルシフ工ラーゼ
■作用：
下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
フェリンの酸化を触媒する酵素である。
フェリンの酸化を触媒する酵素である。
本酵素
↓
ルシフェリン＋ＡＴＰ ＋０２
オキジルシフエリン ＋ＡＭＰ＋ ビロリン酸＋ＣＯ□
十光 ■基質特異性： ＡＤＰ 、 Ｃ１ア 、ＵＴＰ 及びＧＴＰ には
作用しない＠ ■至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とし、２５ｍＭグリシ
ルグリシンのｐＥ（をｐＥ（６，５〜１１．５迄変化さ
せ、温度３０″Ｃで反応させ、２０秒間発光ｆｆ１（フ
ォトン数）を測定した場合、第３図に示す如＜ ｐＨ
７，５〜９．５であり、また安定ｐＨ範囲ハ、ルシフェ
リンを含有する緩衝ＷｉＡｐＨ４，６〜８．０ ：
２５ ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ８，０〜１１．５ ：
２５ ｍＭグリシン・塩化ナトリウム−水酸化すｔ
ｌｌラムｉ１１液をそれぞｈ使用。なお、それぞれの緩
衝液には１０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加
したものである）に酵素を添加し、温度０℃で４時間作
用させた場合、第４図に示す如く、ｐＨ６，０〜１０．
５である。なお、第４図において、・−・及びΔ−Δは
、夫々２５ ｍＭ リン酸緩衝液、及び２５ ｍＭグリ
シン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用
した場合の活性を示す。
十光 ■基質特異性： ＡＤＰ 、 Ｃ１ア 、ＵＴＰ 及びＧＴＰ には
作用しない＠ ■至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは、ルシフェリンを基質とし、２５ｍＭグリシ
ルグリシンのｐＥ（をｐＥ（６，５〜１１．５迄変化さ
せ、温度３０″Ｃで反応させ、２０秒間発光ｆｆ１（フ
ォトン数）を測定した場合、第３図に示す如＜ ｐＨ
７，５〜９．５であり、また安定ｐＨ範囲ハ、ルシフェ
リンを含有する緩衝ＷｉＡｐＨ４，６〜８．０ ：
２５ ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ８，０〜１１．５ ：
２５ ｍＭグリシン・塩化ナトリウム−水酸化すｔ
ｌｌラムｉ１１液をそれぞｈ使用。なお、それぞれの緩
衝液には１０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加
したものである）に酵素を添加し、温度０℃で４時間作
用させた場合、第４図に示す如く、ｐＨ６，０〜１０．
５である。なお、第４図において、・−・及びΔ−Δは
、夫々２５ ｍＭ リン酸緩衝液、及び２５ ｍＭグリ
シン・塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用
した場合の活性を示す。
■力価の測定法
２５ ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ７，８） ８ ｍ
ｌ、硫酸マグネシウム溶液［２５ｍＭグリシルグリシン
（ｐＨ７，８）に硫酸マグネシウムをＯ，１Ｍ となる
如く添加した溶液］０．５肩／及びルシフェリン溶液（
２５ｍＭ グリシルグリシン（ｐＨ７，８）にルシフェ
リンを１ ｍＭ となる如く添加した溶液）０．８ｍ／
を混合してルシフェリン混合液を調製する。
ｌ、硫酸マグネシウム溶液［２５ｍＭグリシルグリシン
（ｐＨ７，８）に硫酸マグネシウムをＯ，１Ｍ となる
如く添加した溶液］０．５肩／及びルシフェリン溶液（
２５ｍＭ グリシルグリシン（ｐＨ７，８）にルシフェ
リンを１ ｍＭ となる如く添加した溶液）０．８ｍ／
を混合してルシフェリン混合液を調製する。
このようにして得たルシフェリン混合液４００μｊ及び
測定するルシフェラーゼ１０μＥを混合したものに、Ａ
ＴＰ 溶液（２５ｍＭグリシルグリシｖ （ｐＨ７，８
）にＡＴＰ を１０ ｍＭとなる如く添加したもの〕
８０μ！を注入すると同時に、ルミノメータ−（アーカ
社製、ルミネッセンスリーダＢＬＲ−２０１）により発
生するフォトン数を２０秒間積算して求める。
測定するルシフェラーゼ１０μＥを混合したものに、Ａ
ＴＰ 溶液（２５ｍＭグリシルグリシｖ （ｐＨ７，８
）にＡＴＰ を１０ ｍＭとなる如く添加したもの〕
８０μ！を注入すると同時に、ルミノメータ−（アーカ
社製、ルミネッセンスリーダＢＬＲ−２０１）により発
生するフォトン数を２０秒間積算して求める。
■作用適温の範囲
ｐＨ７，８のもとに、各温度で反応させ２０秒間発光量
（フォトン数）を測定した場合、０〜５０°Ｃの範囲内
にある。
（フォトン数）を測定した場合、０〜５０°Ｃの範囲内
にある。
■ｐＨ，Ｕ度等による失活の条件
（イ） ｐＨによる失活の条件
ｐＨ５，０以下及びｐＨ１２，０以上で４時間後完全に
失活する。
失活する。
（ロ）温度による失活の条件
ｐＨ７，８において、温度５５℃、１５分間の熱処理に
より完全に失活する。
より完全に失活する。
■耐熱性：
精製したヘイケボタル由来ルシフェラーゼ１００キロカ
ウント（Ｋｃｏｕｎｔ ）含有する酵素液１００μｇ〔
１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコール、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃ１及び０．２％（Ｗ ／ Ｖ ） ７ ルプミンを含
有する６０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ）を
、温度４０°Ｃで１５．３０及び６０分間保持して残存
する酵素活性を測定した結果を、第１表に示した。
ウント（Ｋｃｏｕｎｔ ）含有する酵素液１００μｇ〔
１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコール、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃ１及び０．２％（Ｗ ／ Ｖ ） ７ ルプミンを含
有する６０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ）を
、温度４０°Ｃで１５．３０及び６０分間保持して残存
する酵素活性を測定した結果を、第１表に示した。
なお、ゲンジボタル及びアメリカホタル由来のルシフェ
ラーゼについても上記と同様にして残存酵素活性を測定
した結果を合わせて第１表に示した。
ラーゼについても上記と同様にして残存酵素活性を測定
した結果を合わせて第１表に示した。
第 １ 表
上表より明らかな如く、ヘイケボタル由来ルシフェラー
ゼは、ゲンジボタル及びアメリカホタル由来ルシフェラ
ーゼに比し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼである
ことが判る。
ゼは、ゲンジボタル及びアメリカホタル由来ルシフェラ
ーゼに比し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼである
ことが判る。
次に、ホタル由来ルシフェラーゼを製造するための具体
的手段を以下に述べる。
的手段を以下に述べる。
本酵素を製造する方法としては、如何なる方法でも良く
、例えば、以下の方法が挙げられる。
、例えば、以下の方法が挙げられる。
本発明に用いられるホタルとしては、自然界より採集し
たもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何なるもの
でもよく、そして、ホタル尾部には、ルシフェラーゼが
多量に存在するためにホタル尾部はルシフェラーゼ分離
源として好適であるＯ そして、緩衝液に、ホタルを添加して粉砕し、粉砕物を
得る。
たもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何なるもの
でもよく、そして、ホタル尾部には、ルシフェラーゼが
多量に存在するためにホタル尾部はルシフェラーゼ分離
源として好適であるＯ そして、緩衝液に、ホタルを添加して粉砕し、粉砕物を
得る。
緩衝液としては、本酵素を失活させるものでなければ、
如何なるものでもよく、例えば、トリス（ヒドロキシ）
アミノメタン−塩ｍ緩衝液、りｙシン・塩化ナトリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等にそれぞれ
１０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加したもの
等が挙げられる。
如何なるものでもよく、例えば、トリス（ヒドロキシ）
アミノメタン−塩ｍ緩衝液、りｙシン・塩化ナトリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等にそれぞれ
１０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加したもの
等が挙げられる。
粉砕手段としては、乳鉢及び乳棒を用いる方法、ホモゲ
ナイザー、ワーリングプレンダー、フレンチプレス等を
用いる方法等が挙げられる。
ナイザー、ワーリングプレンダー、フレンチプレス等を
用いる方法等が挙げられる。
次いで、粉砕物より通常の遠心分離あるいは濾過処理等
により残渣を除去して、粗酵素液を得るか、これに必要
により凍結屹燥法、アルコール沈殿法、アセトン沈殿法
などを適宜選択して実施することにより粗酵素粉末を得
る。
により残渣を除去して、粗酵素液を得るか、これに必要
により凍結屹燥法、アルコール沈殿法、アセトン沈殿法
などを適宜選択して実施することにより粗酵素粉末を得
る。
上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさらに精製酵素標
品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル
もしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換
体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶
出法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、７フノニテイク
ｐマド法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分
画法等を適宜選択し、組み合わせて実施することにより
、精製された酵素原品を得ることが出来る。
品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル
もしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換
体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶
出法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、７フノニテイク
ｐマド法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分
画法等を適宜選択し、組み合わせて実施することにより
、精製された酵素原品を得ることが出来る。
ホタル由来ルシフェラーゼを含有せしめる溶液としては
、水溶液、緩衝液等該酵素を失活させない溶媒の溶液で
あれば如何なるものでも使用することができる。
、水溶液、緩衝液等該酵素を失活させない溶媒の溶液で
あれば如何なるものでも使用することができる。
本発明においては、ホタル由来ルシフェラーゼを含む溶
液に、エチレングリコールを添加、溶解し、均一化させ
ることにより、安定化されたホタル由来ルシフェラーゼ
を得ることができる。
液に、エチレングリコールを添加、溶解し、均一化させ
ることにより、安定化されたホタル由来ルシフェラーゼ
を得ることができる。
ナオ、グリセリンもエチレングリコールと同様の効果が
達成でき、添加量は、１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）程度であ
る。
達成でき、添加量は、１０〜５０％（Ｖ／Ｖ）程度であ
る。
エチレングリコールの添加量は、如何なる添加量でもよ
く、好ましくは、５〜１０％（Ｖ／Ｖ）である。
く、好ましくは、５〜１０％（Ｖ／Ｖ）である。
また、上記添加物を添加する際のホタル由来ルシフェラ
ーゼを含む溶液のｐＨ値は、該酵素の安定ｐＨ範囲（例
えば、６，０〜１Ｏ１５のｐＨ範囲）にあればよく、前
記溶液のｐＨ調整が必要である場合には、適宜な手段に
より安定なｐＨ範囲に調整する。
ーゼを含む溶液のｐＨ値は、該酵素の安定ｐＨ範囲（例
えば、６，０〜１Ｏ１５のｐＨ範囲）にあればよく、前
記溶液のｐＨ調整が必要である場合には、適宜な手段に
より安定なｐＨ範囲に調整する。
本発明によれば、比較的安易な操作によりホタル由来ル
シフェラーゼの失活を著しく防止することができ、ＡＴ
Ｐ の定量用酵素等として極めて有用な酵素剤を得る
ことができるので、本発明は、産業上極めて有意義であ
る。
シフェラーゼの失活を著しく防止することができ、ＡＴ
Ｐ の定量用酵素等として極めて有用な酵素剤を得る
ことができるので、本発明は、産業上極めて有意義であ
る。
以下実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。
実施例１
２５ ｍＭ トリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩
酸ｌｉｔ 新液に、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナ
トリウム及び２ ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフ
ルオリドを添加し、更に硫酸アンモニウムを １０％飽
和となる如く添加して得た混液（ｐＨ７，８） １５
ｍｌに、ゲンジボタル〔■四穴百貨店より購入〕の尾
部１５０匹分を添加し、ヒスコトロン〔■日音医理科器
械製作所製〕を用いて破壊したものを、１２．００Ｏｒ
、ｐ、ｍ、 で２０分間遠心分離処理し、２上清（粗酵
素溶液）１４．５ｍｌを得たＯ このようにして得た粗酵素溶液を常法により硫酸アンモ
ニウムを用いて塩析し、３０％〜６０％飽和で生成した
沈殿を３０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、 で１０分間遠心分離
処理し、その沈殿を２５ ｍＭ混合液〔少量の２５ ｍ
Ｍ Ｉ−リス（ヒト−キシ）アミノメタン−塩ｍＭｉ衝
液新液１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２−ナトリウム及
び１０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加して得
た溶液（ｐＨ７，８） ）に溶解させて溶液を得た。
酸ｌｉｔ 新液に、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナ
トリウム及び２ ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフ
ルオリドを添加し、更に硫酸アンモニウムを １０％飽
和となる如く添加して得た混液（ｐＨ７，８） １５
ｍｌに、ゲンジボタル〔■四穴百貨店より購入〕の尾
部１５０匹分を添加し、ヒスコトロン〔■日音医理科器
械製作所製〕を用いて破壊したものを、１２．００Ｏｒ
、ｐ、ｍ、 で２０分間遠心分離処理し、２上清（粗酵
素溶液）１４．５ｍｌを得たＯ このようにして得た粗酵素溶液を常法により硫酸アンモ
ニウムを用いて塩析し、３０％〜６０％飽和で生成した
沈殿を３０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、 で１０分間遠心分離
処理し、その沈殿を２５ ｍＭ混合液〔少量の２５ ｍ
Ｍ Ｉ−リス（ヒト−キシ）アミノメタン−塩ｍＭｉ衝
液新液１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２−ナトリウム及
び１０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加して得
た溶液（ｐＨ７，８） ）に溶解させて溶液を得た。
次いで、この溶液を、上記２５ ｍＭ混合液で平衡化さ
れたウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ） ＡｃＡ
３４（ＬＫＢ社製）カラ人中を通過させてゲル濾過クロ
マトグラフィーを行ない活性区分を得た。
れたウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ） ＡｃＡ
３４（ＬＫＢ社製）カラ人中を通過させてゲル濾過クロ
マトグラフィーを行ない活性区分を得た。
このようにして得た区分を、リン酸緩衝液（１０ｍＭ
リン酸１水素ナトリウム−リン酸２水素ナトリウム溶
液に、０．１Ｍ塩化ナトリウム及びエチレングリフール
１０％（Ｖ／Ｖ）を添加した緩衝液〕を用いて透析を行
ない、得られた溶液を、１０ ｍＭ ｌ）ン酸緩衝液で
平衡化されたヒドロキシ−アバタイ） ＨＰＬＣ（東
洋曹達工業社製、ＴＳＫ ｇｅｔ ＨＡ−１０００）
カラムに吸着させ、１０〜１００ｍＭ迄のリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）によるリニアグラジェント（Ｌｉｎｅｒ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ ）溶出を行なうことにより純化さ
れたゲンジボタル由来のルシフェラーゼ活性区分２００
μｌ〔酵素活性：３．５ Ｘ １０２キロカウント（Ｋ
ｃｏｕｎｔ ） ）を得た。
リン酸１水素ナトリウム−リン酸２水素ナトリウム溶
液に、０．１Ｍ塩化ナトリウム及びエチレングリフール
１０％（Ｖ／Ｖ）を添加した緩衝液〕を用いて透析を行
ない、得られた溶液を、１０ ｍＭ ｌ）ン酸緩衝液で
平衡化されたヒドロキシ−アバタイ） ＨＰＬＣ（東
洋曹達工業社製、ＴＳＫ ｇｅｔ ＨＡ−１０００）
カラムに吸着させ、１０〜１００ｍＭ迄のリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）によるリニアグラジェント（Ｌｉｎｅｒ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ ）溶出を行なうことにより純化さ
れたゲンジボタル由来のルシフェラーゼ活性区分２００
μｌ〔酵素活性：３．５ Ｘ １０２キロカウント（Ｋ
ｃｏｕｎｔ ） ）を得た。
このようにして得られたゲンジボタル由来のルシフェラ
ーゼ１０キロカウントを、５０ ｍＭ リン酸緩衝液／
１ ｍＭ ＥＤＴＡ ／ １００ ｍＭ硫酸アンモニ
ウム／ ０．０５％（Ｗ／Ｖ ） ウシ血清アルブミ
ン緩８７液／ ｔｏ％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールを
含む溶液に添加し、温度３７°Ｃで１時間加温した際の
残存活性１裏、下表に示すとおりであった。
ーゼ１０キロカウントを、５０ ｍＭ リン酸緩衝液／
１ ｍＭ ＥＤＴＡ ／ １００ ｍＭ硫酸アンモニ
ウム／ ０．０５％（Ｗ／Ｖ ） ウシ血清アルブミ
ン緩８７液／ ｔｏ％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールを
含む溶液に添加し、温度３７°Ｃで１時間加温した際の
残存活性１裏、下表に示すとおりであった。
（零発１１１１）
なお、比較のために１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコー
ルを添加しない場合の酵素液の残存活性も下表に示した
。（対照） 第 ２ 表 上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し、安定化
効果が優れていることが判る。
ルを添加しない場合の酵素液の残存活性も下表に示した
。（対照） 第 ２ 表 上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し、安定化
効果が優れていることが判る。
実施例２
２５ ｍＭ ）リス（ヒドロキシ）７ミノメタンー塩
酸緩衝液に、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウ
ム及び２ ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリ
ドを添加し、更に硫酸アンモニウムを １０％飽和とな
る如く添加して得た混液（ｐＨ７，８） １５ ｍｌ
に、ヘイケボタル〔■四穴百貨店より購入〕の尾部２０
０匹分を添加し、ヒスコトロン〔■日音医理科器械製作
所製〕を用いて破壊したものを、１２．００Ｏｒ、ｐ、
ｍ、 で２０分間遠心分離処理し、上清（粗酵素溶液）
１４．５＋＋＋ｔを得た。
酸緩衝液に、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウ
ム及び２ ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリ
ドを添加し、更に硫酸アンモニウムを １０％飽和とな
る如く添加して得た混液（ｐＨ７，８） １５ ｍｌ
に、ヘイケボタル〔■四穴百貨店より購入〕の尾部２０
０匹分を添加し、ヒスコトロン〔■日音医理科器械製作
所製〕を用いて破壊したものを、１２．００Ｏｒ、ｐ、
ｍ、 で２０分間遠心分離処理し、上清（粗酵素溶液）
１４．５＋＋＋ｔを得た。
このようにして得た粗酵素溶液を常法により硫酸アンモ
ニウムを用いて塩析し、３０％〜７０％飽和で生成した
沈殿を３０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、 で１０分間遠心分
離処理し、その沈殿を２５ ｍＭ混合液〔少量の２５
ｍＭ トリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩酸緩衝液
に、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び１
０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加して得た溶
液（ｐＨ７，８） ）に溶解させて溶液を得た。
ニウムを用いて塩析し、３０％〜７０％飽和で生成した
沈殿を３０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、 で１０分間遠心分
離処理し、その沈殿を２５ ｍＭ混合液〔少量の２５
ｍＭ トリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩酸緩衝液
に、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び１
０％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加して得た溶
液（ｐＨ７，８） ）に溶解させて溶液を得た。
次いで、この溶液を、上記２５ ｍＭ混合液で平衡化さ
れたウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ） ＡｃＡ
３４（ＬＫＢ社製）カラム中を通過させてゲル濾過クロ
マトグラフィーを行ない活性区分を得た。
れたウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ） ＡｃＡ
３４（ＬＫＢ社製）カラム中を通過させてゲル濾過クロ
マトグラフィーを行ない活性区分を得た。
このようにして得た区分を、リン酸緩衝液［１０ｍＭ
リン酸１水素ナトリウム−及びリン酸２水素ナトリウ
ム溶液に、０．１Ｍ塩化ナトリウム及びエチレングリコ
ール１０％（Ｖ／Ｖ）を添加した緩衝液〕を用いて透析
を行ない、得られた溶液を、１０ ｍＭ ！ｊン酸緩衝
液で平衡化されたヒドロキシ−７パタイト ＨＰＬＣ（
東洋曹達工業社製、ＴＳＫ ｇｅｌ ＨＡ−１０００
）カラムに吸着させ、 １０〜１００ｍＭ迄のリン酸緩
衝液（ｐＨ７，５）によるリニアグラジェント（Ｌｉｎ
ｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ）溶出を行なうことにより純
化されたベイケポタル由来のルシフェラーゼ活性区分１
８０μｌ〔酵素活性： ２．４ Ｘ １０２キロカウ
ント〕を得た。
リン酸１水素ナトリウム−及びリン酸２水素ナトリウ
ム溶液に、０．１Ｍ塩化ナトリウム及びエチレングリコ
ール１０％（Ｖ／Ｖ）を添加した緩衝液〕を用いて透析
を行ない、得られた溶液を、１０ ｍＭ ！ｊン酸緩衝
液で平衡化されたヒドロキシ−７パタイト ＨＰＬＣ（
東洋曹達工業社製、ＴＳＫ ｇｅｌ ＨＡ−１０００
）カラムに吸着させ、 １０〜１００ｍＭ迄のリン酸緩
衝液（ｐＨ７，５）によるリニアグラジェント（Ｌｉｎ
ｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ）溶出を行なうことにより純
化されたベイケポタル由来のルシフェラーゼ活性区分１
８０μｌ〔酵素活性： ２．４ Ｘ １０２キロカウ
ント〕を得た。
以上の如くして得られたヘイケボタル由来のルシフェラ
ーゼ１０キロカウントを、５０ｍＭリン酸緩衝液／新液
ｍＭ ＥＤＴＡ ／ １００ ｍＭ硫酸アンモニウム
／ ０．２％（Ｗ／Ｖ ）ウシ血清アルブミン緩衝液／
１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールを含む溶液に添
加し、温度４５°Ｃで３０分間加温した際の残存活性は
、下表に示すとおりであった。
ーゼ１０キロカウントを、５０ｍＭリン酸緩衝液／新液
ｍＭ ＥＤＴＡ ／ １００ ｍＭ硫酸アンモニウム
／ ０．２％（Ｗ／Ｖ ）ウシ血清アルブミン緩衝液／
１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールを含む溶液に添
加し、温度４５°Ｃで３０分間加温した際の残存活性は
、下表に示すとおりであった。
（本発明）
また、対照として１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコール
を添加しない場合の酵素液の残存活性も下表に示した。
を添加しない場合の酵素液の残存活性も下表に示した。
第 ３ 表
上表より、本発明は、対照に比し安定化効果において顕
著に差があることが判明した。
著に差があることが判明した。
実施例３
アメリカホタル由来のルシフェラーゼ（シグマ社製）１
０キロカウントを、５０ｍＭリン酸緩衝液／新液 ｍＭ
ＥＤＴＡ ／ １００ ｍＭ硫酸アンモニウム／ ０
．０５％（Ｗ／Ｖ ）ウシ血清アルブミン緩衝１７１０
％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールを含む溶液に添加し、
温度３７°Ｃで１時間加温した際の残存活性は、下表に
示すとおりであった。（本発明） また、対照として１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコール
を添加しない場合の酵素液の残存活性も下表に示した。
０キロカウントを、５０ｍＭリン酸緩衝液／新液 ｍＭ
ＥＤＴＡ ／ １００ ｍＭ硫酸アンモニウム／ ０
．０５％（Ｗ／Ｖ ）ウシ血清アルブミン緩衝１７１０
％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールを含む溶液に添加し、
温度３７°Ｃで１時間加温した際の残存活性は、下表に
示すとおりであった。（本発明） また、対照として１０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコール
を添加しない場合の酵素液の残存活性も下表に示した。
第 ４ 表
上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し、安定化
効果において、優れていることが判る。
効果において、優れていることが判る。
第１図はゲンジボタル由来のルシフェラーゼの至適ｐＨ
域を示す図であり、第２図はゲンジボタル由来のルシフ
ェラーゼの安定ｐＨ範囲を示す図であり、第３図はヘイ
ケボタル由来のルシフェラーゼの至適ｐＨ域を示す図で
あり、また第４図はへイケボタル由来のルシフェラーゼ
の安定ｐＨ範囲を示す図である。 特許出願人 キッコーマン株式会社 ａｏ ７．Ｏａｏ ９．０ １０．０ １１．
ＯＨ ４．０ ５．０ ６．０ ７０ ａｏ ９．０ １
００１１０ｐＨ ６，０７，０８，０９，０＋０．０ Ｉ＋、○Ｈ
域を示す図であり、第２図はゲンジボタル由来のルシフ
ェラーゼの安定ｐＨ範囲を示す図であり、第３図はヘイ
ケボタル由来のルシフェラーゼの至適ｐＨ域を示す図で
あり、また第４図はへイケボタル由来のルシフェラーゼ
の安定ｐＨ範囲を示す図である。 特許出願人 キッコーマン株式会社 ａｏ ７．Ｏａｏ ９．０ １０．０ １１．
ＯＨ ４．０ ５．０ ６．０ ７０ ａｏ ９．０ １
００１１０ｐＨ ６，０７，０８，０９，０＋０．０ Ｉ＋、○Ｈ
Claims (1)
- （１）ホタル由来ルシフェラーゼを含む溶液に、エチレ
ングリコールを添加することを特徴とするホタル由来ル
シフエラーゼの安定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12796389A JPH02308792A (ja) | 1989-05-23 | 1989-05-23 | ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12796389A JPH02308792A (ja) | 1989-05-23 | 1989-05-23 | ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02308792A true JPH02308792A (ja) | 1990-12-21 |
Family
ID=14973004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12796389A Pending JPH02308792A (ja) | 1989-05-23 | 1989-05-23 | ホタル由来ルシフェラーゼの安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02308792A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994011528A1 (en) * | 1992-11-17 | 1994-05-26 | Celsis Limited | Bioluminescence reagent formulation |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57102185A (en) * | 1980-12-19 | 1982-06-25 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized urease solution |
-
1989
- 1989-05-23 JP JP12796389A patent/JPH02308792A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57102185A (en) * | 1980-12-19 | 1982-06-25 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized urease solution |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994011528A1 (en) * | 1992-11-17 | 1994-05-26 | Celsis Limited | Bioluminescence reagent formulation |
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