JPH0236197A - チモシンα↓１を合成する固相法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、チモシンα１を製造する方法に関する。さら
に詳しくは、本発明は、連続的アミノ酸の各々のアルフ
ァーアミノ酸を４−メトキシベンジルオキシカルボニル
（Ｍｏｚ）保護基で保護し、次いで酸加水分解的接触切
断する、チモシンα１の固相ペプチド合成に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである＝４−メトキシ
ベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）を使用して、チモ
シンα１の固相ペプチド合成において使用するアミノ酸
のアル７アーアミノ基を保護する。Ｍｏｚ基はＣＨ２Ｃ
１、中の５〜１０％トリフルオロ酢酸で急速にかつ完全
に除去された。

固相ペプチド合成におけるＢｏｃ−アミノ酸法を越えた
Ｍｏｚ−アミノ酸を利用するときの利点は、Ｎ″−Ｍｏ
ｚ基の酸加水分解的切断の間におけるトリフルオロ酢酸
の消費を少なくして、高い収率および純度が得られるこ
とである。使用した溶媒の回収および再循環に関する他
の改良は、中和剤としてトリエチルアミンの代わりにト
リブチルアミンを使用することによって得られ、液体廃
棄物から塩化メチレンを低沸点のトリエチルアミンによ
る汚染の不存在下に蒸留できる。メチルベンズヒドリル
アミン樹脂は好ましい樹脂支持体である。

樹脂支持体からの切断および保護されたチモシンα１の
保護された側鎖基の脱保護は、スカベンジャーとしてア
ニソールおよびチオアニソールを使用して、ＨＢｒまた
はトリフルオロ酢酸中のトリフルオロメタスルホン酸を
使用して達成できる。

生物学的に活性なペプチドは、一般に、非常に少ない投
与量、例えば、ナノゴブラム以下のレベルで生物学的活
性を示す。したがって、初期のスクリーニングおよび試
験の時期の間、対応する少量で、例えば、数ミリグラム
ないし数グラムで問題のペプチドを製造することで十分
である。このような場合において、合成および精製工程
の間要求される液体試薬、例えば、溶媒、反応成分、希
釈剤、洗浄剤などの体積は、しばしばかなりなものであ
り、例えば、数ないし数十ガロンであるが、それにもか
かわらず、コスト、貯蔵空間、廃棄などにおいて管理可
能である。しかしながら、大規模の製造、例えば、数グ
ラム以上、例えば、約１００グラムないし２キログラム
、ことに２５０ｇ〜１ｋｇ　（乾燥基準）のために、生
成物の回収、生成物の純度、および試薬の取り扱い、貯
蔵および廃棄の問題は、満足な大規模の製造を利用でき
ないような困難をもって生ずる。結局、大規模の臨床的
試験または他の商業的用途のために、大きいバッチの量
で、商業的に興味あるペプチド物質を製造できる、固相
ペプチド合成法が大きく要求されている。

この要求は、比較的長いペプチド、すなわち、ペプチド
中の約１０以上のアミノ酸、ことに約１５〜５０アミノ
酸配列についていっそう緊急的である。例えば１、自動
化固相ペプチド合成装置を使用してさえ、官能基の保護
、カップリング、樹脂からのペプチドの切断、精製など
の完全なサイクルの各々は１日〜数日または数週を要し
、全体の製造法はある場合において６〜８か月を要する
であろう。この期間はバッチのサイズに大きく依存し、
単位の基準で、製造コストは、小さいグラム数の量を製
造するときにのみ、極端に高いことを容易に理解できる
であろう。

米国特許第４，０７９，１２７号において、チモシンσ
１は、ｐＨ３〜５のスラブゲルの等電点電気泳動によっ
て決定して、３，１０８の分子量および４．０〜４．３
の範囲のｐｌ’　を有することが示されている。この化
合物は次の配列を有する： Ａｃ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｔ−Ａｓ
ｐ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖα１−Ｖα１−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−ＧｌｕＡ　ｓ　ｎ　−ＯＨ。

チモシンα１は、Ｔ細胞の分化および機能を測定するｔ
；めに設計された、いくつかの生体外および生体内アッ
セイ系においてチモシン分画５よりもｌＯ〜１、０００
倍活性であることが発見された。チモシンσ１は、温血
動物に非経口的に、静脈内、皮下または筋肉内に投与す
ることができる。

この化合物は、静脈内投与について、約１−１００μｇ
／ｋｇ体重／日の範囲の１日量で効力のある免疫増強剤
である。明らかなように、要求される投与量は、処置す
る特定の状態、状態のひどさおよび処置の期間に依存す
る。

米国特許第４．１４８，７８８号において、本発明者は
固相ペプチド合成および断片縮合によるチモシンσ１の
合成を記載した。これらの方法は七−ブチルオキシカル
ボニル（Ｂｏｃ）ｔ−α−アミノ酸の保護基としてＣ−
末端アミノ酸の固体樹脂支持体へのカップリング反応の
間において、および連続的アミノ酸の各々のカップリン
グの両者のために使用した。

Ｂｏｃ基は、縮合（カップリング）条件に対する安定性
、ペプチド結合の分解またはペプチド鎖中の不斉中心の
ラセミ化の不存在下の除去容易性、および低いコストを
かんがみて、固相ペプチド合成のために好ましいアミノ
保護基であった。ＢＯＣ保護基のこの好ましさは、明ら
かに特許および一般の文献において、アルファーアミノ
酸を保護するための保護基としてＢｏｃがほとんど使用
されていることによって立証される。

例えば、Ｇ、ＢａｒｎｙおよびＲ，Ｂ、Ｍｅｒｉｆｉｌ
ｄ、ペプチド、分析、合成、生物学・（Ｔ「ペプチド合
成における特別の方法（Ｓｐｅｃｉα１　　Ｍｅｈｏｄ
ｓ　　ｉｎ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｊ、部Ａ、Ｅ、Ｇｒｏｓｓ編およびＪ、Ｍｅｉｅｎｈｏ
ｆｅｒ、Ａｃａｄｅｍ＋ｃ、Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、ニ
ューヨーク、１９８０、は、１章、固相ペプチド合成、
ｔｏｔ−ｔｏ２ページにおいて、「し−ブチルオキシカ
ルボニル（Ｂｏｃ）基は０９９９．固相ペプチド合成に
おいてα−アミノ保護のために広く機能的に使用されて
いる。」と述べている。ここで述べられているα−アミ
ノ保護基を形成する他のｔ−アルキルウレタンは、ｔ−
アミルオキシカルボニル（八〇Ｃ）、アダマンチルオキ
シカルボニル（Ａｄ。

ｃ）、およびｌ−メチルシクロブチルオキシカルボニル
（Ｍｃｂ）を包含する。このテキストは、また、溶媒（
通常無水）混合物中の無機酸（プロトン性またはルイス
）および有機（カルボン酸を包含する）の組み合わせを
記載している。これらの組み合わせの例は、純粋な無水
トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）およびＴＦＡ　　ＣＨ
ｚＣ１２、ｌ：４〜ｌ：・ｌの比（ｖ／ｖ）、２５°０
，２０〜３０分、である。

標題「３、酸加水分解により除去可能な他のアミノ−保
護基」、１０６−１０７ページに、ＢａｒｎｙおよびＭ
ｅｒｉｆｉｌｄは、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基
、強酸、例えば、酢酸中のＨＢｒによって除去される、
は、固相合成で検査した最初の基であるが、 「現在の方法の全体の状態が与えられると、ベンジルオ
キシ基によるＮ・−保護は多分ペプチドのＮＨ２−ｔｍ
残基に限定されるであろう。

加水素分解可能なＮ・−ベンジルオキシカルボニル基お
よび酸加水分解可能な側鎖のｔ−ブチル誘導体に頼る、
溶液合成のために広く用いられている保護基の方法は１
．１１．固相合成に適用されて来ていない。」 と述べている。

他方において、著者らは、また、フルフリルオキシカル
ボニル（Ｆ　ｏ　ｃ）およびｐ−メトキシベンジルオキ
シカルボニル（Ｍｏｚ）基を使用する他の者による研究
について報告している。かれらは、１０７ページに、こ
れらの 「基は同一の酸加水分解的条件下にかつｔ−ブチルオキ
シカルボニル基と本質的に同一の比で脱保護される第一
ウレタンであり１１９０．。

それゆえ、それらは時々固相合成における段階的に使用
された。［Ｍｏｚｌの紫外線吸収発色団は脱保護および
カップリングの工程を促進する。」 前述の米国特許第４，１４８，７８８号において、Ｂｏ
ｃのみがα−アミノ保護基として開示されているが、リ
ジン（Ｌｙｓ）のω−アミノ基のための保護基として、
ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）保護基が使用され、そ
して他のω−アミノ保護基が開示されており、それらは
次のものを包含する：芳香族環において次の基で置換さ
れたペンジルオキシカルボニル、例えば、４−クロロ、
２−ブロモ、４−ブロモ、２，４−ジニトロ、４−クロ
ロ、４−ニトロ、４−メトキン、３，５−ジメトキシ、
４−メチル、２，４．６−トリメチル、４−フェニルア
ゾ、４−（４−メトキシフェニルアゾ）、２−　（Ｎ、
Ｎ−ジメチルカーボンアミド）、４−ジヒドロキシボル
ニル、および２−ニトロ−４゜５−ジメトキシ、ウレタ
ンタイプ保護基、例えば、４−トルエンスルホニルエチ
ルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）および関連する基本切断基、５−ペン
ズイソキアゾリルメチレンオキシ力ルポニル、メチルチ
オ−およびメチルスルホニルエチルオキシカルボニル、
インニコチニルオキシカルボニル、ハロエチルオキシカ
ルボニル、ジインプロピルメチルオキシカルボニル、ベ
ンズヒドリルオキシカルボニル、インボルニルオキシカ
ルボニル、ジニトロジフェニルメチルオキシカルボニル
、ｔ−ブチルオキシカルボニル、（−アミルオキシカル
ボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチ
ルオキシカルボニル、など；アシル基、例えば、ホルミ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ベンゼンスル
ホニル、など；およびアリール−低級アルキル基、例え
ば、ジフェニルメチルおよびトリフェニルメチル。

最近公開された欧州特許出願第０　００２　４０４号、
１９８６年１１月５日発行および対応する米国特許出願
第７２２．２１８号、１９８５年１１月４日提出、現在
放棄された、および対応する同時継続米国特許出願第８
４９．８３５号、１９８６年４月９日提出において、本
出願人は固体支持体としてメチルベンズヒドリルアミン
（ＭＢＨＡ）および切断および脱保護剤として臭化水素
（ＨＢｒ）およびトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）およ
びアニソールおよびチオアニソールを使用する、チモン
ンσ１の改良された固相ペプチド合成を開示した。ここ
で、また、Ｂｏｃは好ましいとして開示されており、モ
してα−アミノ保護基として使用されている。述べられ
ている他のα−アミノ保護基は、次のものをを包含する
：ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）　、ビフェニルイソ
プロピルオキシ力ルポニル、（−アミルオキシカルボニ
ル、インボルニルオキシカルボニル、■、１−ジメチル
−３，５−ジメチルオキシベンジルオキシカルポニル（
Ｄｄｚ）、Ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シア
ノ−仁−ブチルオキシカルボニルおよび９−フルオロメ
チルオキシカルボニル。

この特許文献は、チモシンα，以外のペプチドの固相ベ
グチド合成を開示しており、また、Ｂ。

Ｃをα−アミノ保護基としてしてもっばら例示している
が、それにもかかわらず、他の保護基、例えば、ベンジ
ルオキシカルボニル（Ｚ）および置換Ｚ基、例えば、ω
−α−アミノ官能基の保護基として前述したものの一般
開示が存在する。

他方において、古典的な液相（溶液）ペプチド菌株反応
のため、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）およびＢｏｃ
α−アミノ保護基はほぼ同等の頻度で使用されている。

こうして、α−アミノ保護基の酸加水分解的切断は化な
りの研究の主題であったが、この分野における一般的結
論はＢｏｃまたは４−メトキシ置換ｚ１すなわち、４−
メトキンベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）保護基の
酸感受性がほぼ等しいということであった。しかしなが
ら、出願人が知るかぎりにおいて、正確なまたは厳密な
比較は、固相ペプチド合成におけるＢｏｃおよびＭｏｚ
の相対的酸感受性を試験するために、これまで実際にな
されて来ていない。

前述の米国特許出願第７２２．２１８号および米国特許
出願第８４９，８３５号、および対応する欧州特許出願
第０　　００２　　４０４号において、より高度に腐食
性の７ツ化水素のの代わりに酸切断および脱保護剤とし
て臭化水素を使用する利点が記載された。

しかしながら、ＨＢｒの使用は気体であるという欠点を
もち、それは気体のＨＢｒを、通常、トリフルオロ酢酸
中の樹脂結合保護されたペプチドの溶液中に泡立てて通
人することによって樹脂結合保護されたチモシンα，と
接触すると考えられる。泡立てて通入する手順は、遅い
ばかりでなく、かつまた加圧気体のタンクを必要とし、
そしてなおその使用に熟練を要する。したがって、フッ
化水素に固有の腐食の問題を発生せず、そして通常の実
験室のガラス器具まｔ；はプラスチックをともに使用で
き、少なくとも樹脂結合保護されたチモシンα１ペプチ
ドの酸切断および脱保護において高度に効率良くかつ選
択的である、液体酸切断剤を発見することが望ましい。

したがって、本発明の目的は高い収率および純度のチモ
シンα、の改良された固相合成を提供することである。

本発明の他の目的は、高度の熟練を必要とせず容易にか
つ効率良〈実施することができ、そして樹脂結合保護さ
れたチモシンσ１ペプチドの切断および脱保護のための
気体の反応成分の使用を回避する、改良されたチモシン
α１の固相合成を提供することである。

他の目的は、標準の装置を使用して大規模の合成が可能
である、チモシンα、の合成を提供することである。

本発明のこれらの目的および他の目的は、添付図面を包
含する、次の説明および好ましい実施態様から明らかと
なり、合成の間、アミノ酸の各々のσ−アミノ基（Ｎ“
）の窒素を４−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍ
ｏｚ）に結合し、そして切断を大きく減少した量のトリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用する、チモシンα１の製
造のための固相ペプチド合成により達成される。

本発明の他の面によれば、その好ましい実施態様におい
て、樹脂結合保護されたチモシンα１ペプチドの切断大
きく脱保護の工程は、トリフルオロメタスルホン酸（Ｔ
ＦＭＳＡ）を使用して、ＴＦＭＳＡを、好ましくはアニ
ソール大きくチオアニソールと一緒に、好ましくは、ト
リフルオロ酢酸中の、樹脂結合保護されたチモシンα１
ペプチドの懸濁液に添加することによって実施する。

本発明によれば、チモシンα１、またはその生物学的に
活性な類似体または断片は、固相ペプチド合成により、
工程 （ａ）チモシンα、ペプチドのＣ−末端アミノ酸上の、
アルファー位置における反応性アミノ基、およびベータ
カルボン酸基以外の、他の反応性基を一時的に化学的に
保護し： （ｂ）保護されたＣ−末端アミノ酸を、その保護されて
いないカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を経て、樹脂支持体
へ化学的゛に結合し；　（Ｃ）液状トリフルオロ酢酸溶
媒を使用する酸加水分解的切断により樹脂結合保護され
たアミノ酸の反応性アミノ基を化学的に脱保護し； （ｄ）工程（ｃ）からの樹脂結合アミノ酸を次のアミノ
酸と所望の配列で、アルファー位置において、カルボン
酸基以外の反応性基のすべてを化学的に保護して、カッ
プリング剤存在下に、接触させることによって、ペプチ
ド結合を経て次のアミノ酸を所望の配列で化学的にカッ
プリングし；（ｅ）液状トリフルオロ酢酸溶媒を使用す
る酸加水分解的切断により工程（ｄ）からのカップリン
グしたアミノ酸の反応性アミン基を化学的に脱保護し； （ｆ）保護されたペプチドの合計の所望の配列が樹脂上
に構成されるまで、連続的アミノ酸を所望の配列で１度
に１つずつ付加して、工程（ｃ＋）および（ｅ）を反復
することにより合成を続け：そして （ｇ）保護されたペプチドを樹脂支持体から切断し、そ
して液状トリフルオロ酢酸溶媒をを使用して保護された
反応基を脱保護する、によって、チモシンα３、または
その生物学的に活性な類似体または断片を製造する方法
において、連続的アミノ酸の各々のアル７アーアミノ基
を４−メトキシベンジルオキシカルボニルで一時的に化
学的に保護し、これにより工程（ｃ）および（ｅ）にお
いて使用する液状トリフルオロ酢酸溶媒の体積を実質的
に減少させる、ことよって調製される。

好ましくは、工程（ｂ）における樹脂支持体はメチルベ
ンズヒドリルアミン樹脂であり、そして工程（ｇ）は臭
化水素またはトリフルオロメタスルホン酸を使用して実
施する。

本発明をここで開示し、そしてこれは本発明の本質を形
成し、ここでＭｏｚ−アミノ酸は固相ぺプチド合成にお
いて対応するＢｏｃ−アミノ酸よりも有意に酸切断（脱
保護）に対して感受性である。このより大きい感受性は
、実際において、非常に少ない量の酸性脱保護剤を必要
とする脱保護の非常に高い速度によって立証される。

酸脱保護へのＭｏｚ基のより大きい不安定性は、Ｎ゛保
護基と側鎖上ののベンジルに基づく保護基または樹脂へ
の定着結合との間の選択性が非常に大きいことを意味す
る。したがって、早期の側鎖の脱保護による支持体から
のペプチド鎖の損失は、最小となるであろう。さらに、
Ｎ“基の不完全な除去はいっそう容易に回避することが
できる。Ｍｏｚ基の他の利点は、カップリング大きい脱
保護反応をスペクトル的に監視できることにある。固相
ペプチド合成において、Ｂｏｃ−アミノ酸の代わりにＭ
ｏｚ−アミノ酸を使用する他の利点は、かなりのコスト
が節約できることである。なぜなら、非常に少ないＴＦ
Ａを、ことに生物学的に活性なペプチドの大規模製造に
おいて、必要とするからである。さらに、調製が高価で
ある他の酸感受性アミノ保護基、例えば、２−（ｐ−ジ
フェニル）プロピル−２−オキシカルボニル（Ｂｏｃ）
、α、σ−ジメチルオキシカルボニル（Ｄｄｚ）などと
異なり、Ｍｏｚ−アミノ酸誘導体の調製のコストはＢｏ
ｃ−アミノ酸とほぼ同じである。

Ｍｏｚ−アミノ酸の有用性を明らかにするために、モデ
ルのＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａ　ｌ　　（ＬＡＧＶ
）の自動化合成を実施した。合成のため、その詳細は下
の参考例２に示し、１０％のＴＦＡを利用して、合成サ
イクルの各々においてＭｏｚ基を脱保護した。対照実験
において、同一ペプチドを使用する平行合成を、合成材
料としてＢｏｃ−アミノ酸および脱保護剤としてＣＨ，
Ｃ１２中の４０％のＴＦＡを使用して、正確に同一の条
件下に実施した。

こうして、例えば、Ｇ１５ｉｎ、Ｂ、Ｆ、、ヘルベチカ
・ヒミカ・アクタ（ＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａ
　　Ａｃｔａ）、５６．１４７６ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、
第２版、Ｊ、Ｍ、ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ、Ｄ、Ｙｏｕ
ｎｇ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃα１　　Ｃｏ、、イリ
ノイ州ロックフォード（１９８４）（これらの開示をこ
こに引用によって加える）に開示されているセシウム塩
の方法によって、ＣＩ　ＣＨ！　　Ｃａ　Ｈを−樹脂お
よびＭｏ　ｚ−Ｖａ　ｌ　−ＯＨから調製したＭ　ｏ　
ｚ　−Ｖα１−○ＣＨ２−Ｃ，Ｈ，−樹脂を、Ｍ　ｏ　
ｚ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　ｌ　
−ＯＣＨ，−Ｃ，Ｈ。

−樹脂の自動化合成の出発物質として使用した。

このテトラペプチド樹脂のＨＦ切断後、粗製ＬＡＧｖの
試料を得た。アミノ酸分析およびＨＰＬＣ分析は、この
材料が約９８％の純度であることを示した。次いで、そ
れを、Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆ６６０−６６８　（１９７
４）（この開示をここに引用によって加える）に記載さ
れている手順によって、アミノ酸分析器でイオン交換ク
ロマトグラフィーの分析にかけた。結果を、Ｂｏｃ−ア
ミノ酸を使用する平行合成から得られた対応する粗製Ｌ
ＡＧＶから誘導した結果と比較した。Ｍｏｚ試料中に存
在する欠失ペプチドのレベルは、Ｂｏｃ試料中に存在す
るそれより一般に低いことが分かった。

表１ Ｍｏｚ−アミノ酸またはＢｏｃ−アミノ酸から調製した
粗製Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖα１（ＬＡＧＶ）”（
％）　　（％）（％）　（％）　（％）Ｍｏｚ−法から
　　　９８．８　０．３２　０．２７　０．３２　０．
２８Ｂｏａ−法から　　　９７．９　０．４３　０．４
０　０．３１　０．９７ａ　差を増大するために、単一
のカップリングをこの比較に使用した。欠失ペプチドは
二重カップリングのプロトコルによって大きく減少した
。記載する数値は２回の分析の平均である。

ｂ　ペプチド樹脂のＨＦ切断からの粗製試料を直接アミ
ノ酸分析器［ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ　ｎ）　１２０
　Ｂｌ中に注入し、ここでペプチドは良好に分離された
。試料中に存在する所望のテトラペプチドのＬＡＧＶお
よび欠失ぺプチドの比率を表に示す。

それ以外同一のへブタペプチド上のＭｏｚ−アミノ酸お
よびＢｏｃ−アミノ酸のｆｆｌ護基の異なる相対的感受
性のそれ以上の指示として、ＭｏｚＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖα１−○ＣＨ２−Ｃ
Ｉ　ＣＨ，−ＣａＨ，−樹脂およびＢｏｃ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ　−０
ＣＨ２−ＣＩＣＨ。

−Ｃ６Ｈ，−樹脂を調製し、そしてＣＨｆＣ１□中の異
なる濃度のＴＦＡで別々に処理した。種々の時間間隔で
、小さい試料を抜き出し、直ちに希釈トリエチルアミン
（Ｅｔ、Ｎ）で急冷し、次いでＣＨ，ＣＩ、でよく洗浄
した。次いで、中和した試料をＮ、Ｎ’−ジシクロヘキ
シルカーボンアミド（ＤＣＣ）中でＢｏｃ　　Ｐｈｅ−
ＯＨと、ニンヒドリン試験に対して陰性となるまで、カ
フプリングした。アミノ酸分析を試料の各々について実
施し、モしてＰｈｅ／Ａｌａの比の増加をヘプタペプチ
ド−樹脂上のＭｏｚ基およびＢｏｃ基の酸加水分解的切
断の速度として取った。切断反応の詳細を下の参考例３
に示す。結果は第１図に要約する。

理解できるように、Ｍｏｚ基の脱保護は急速かつ完全に
進行して、Ｂｏｃ基の脱保護より非常に少ないＴＦＡを
必要とした。５％のＴＦＡ中のＭ。

Ｚ切断の時間経過は４０％のＴＦＡにおけるＢ。

Ｃ切断とそれとほとんど完全に一致する。１０％のＴＦ
Ａにおいて、Ｍｏｚは０．３分より短い半減期でほとん
ど瞬間的に除去されることが観測される。

同様な実験をＭｏｚ−１１ｅ−Ａｌａ−ＬｅｕＬｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ　−ＯＣＨ，−ＣＩ
　ＣＨ２−Ｃ６Ｈ，−樹脂およびＢｏｃ−１１ｅ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　
１−ＯＣＨ２−ＣＩＣＨ２−Ｃ。

Ｈｌ−樹脂について実施して、Ｔｉｅの酸加水分解の速
度がＡｌａのそれと異なるかどうかを決定し、結果は対
応する速度が同一であることを示した。保護基をｌ１ｅ
−ペプチド−樹脂またはＡｌａ−ペプチド−樹脂のいず
れかから切断したとき、差は観測されなかった。

これらの研究に基づいて、本発明者は、前述の米国特許
出願第８４９，８３５号および米国特許出願第７２２．
２１８号、または前述の米国特許第４，１４８，７８８
号（これらの開示をここに引用によって加える）に一般
に記載されているが、式： １ｏ４−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）
を、式： ％式％ ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）の代わりにα−
アミノ酸保護基として使用して、チモシンａ１の固相ペ
プチド合成を実施した。Ｎ“−Ｂ。

Ｃ−アミノ酸を使用する合成反応に比較して、Ｎ”−Ｍ
ｏｚ−アミノ酸を使用する反応は少ない不純物を生成し
、そして酸溶媒として実質的に少ないトリフルオロ酢酸
（Ｔ　Ｆ　Ａ）を必要とした。

本発明によれば、次の配列 Ａｃ−５ｅ　　ｒ−Ａｓ　　ｐ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａ　
　ｌ　　ａ−Ｖａ　　１−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−５
ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｖα１−Ｖα１−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ａｓｎ−ＯＨ を有するチモシンα１、またはその生物学的に活性な類
似体または断片が、普通の方法を使用する固相ペプチド
合成によって生成するが、ただしＮ“−アミノ保護基と
して、４−メトキシベンジルオキシカルボニルを使用し
、そして酸切断溶媒として実質的に少ない体積のトリフ
ルオロ酢酸を必要とする。

Ｍｏｚ−アミノ酸の調製は、文献、例えば、Ｇ。

Ｂａｒｒ＋ｙおよびＲ，Ｂ、Ｍｅｒｉｆｉｌｄ、ぺｓ、
Ｂｉｏｌｇｙ）、Ｖｏ１、２．ｒペプチド合成における
特別の方法（Ｓｐｅｃｉα１　　Ｍｅｈｄｓ Ｐｅｐｔ　　Ｘ　ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓＪ、部Ａ、Ｅ、Ｇｒｏｓｓ編およびＪ、Ｍｅｉｅｎ
ｈｏｆｅｒ、　　Ａｃａｄｅｍｉｃ、　　Ｐｒｅｓｓ、
　　Ｉ　ｎ　ｃ、　、　ニューヨーク、１９８０．３１
−３２ページ（この開示をここに引用によって加える）
に記載されているようなりｏｃ−アミノ酸の調製と同様
に実施した。

本発明による、チモシンα１の固相ペプチド合成におけ
る工程の各々を、ここで説明する。

工程（ａ）。アミノ酸分析の脱保護 チモシンα、のＣ−末端アミノ酸はアスパラギン（Ａｓ
ｎ） である。Ａｓｎは樹脂支持体にアスパラギン酸（Ａｓｐ
）として結合し、アミド結合は ベータカルボン酸基と樹脂支持体との間に形成する。し
たがって、アルファー炭素原子上のアミン基およびカル
ボキシル基は化学的に保護されている。

本発明によれば、式： の４−（またはｐ−）メチルオキシベンジルオキシカル
ボニル（Ｍｏｚ）をＮ“基を保護するために使用する。

σ−カルボン酸基はカルボン酸保護基のいずれによって
も保護することができるが、好ましくは簡単なベンジル
エステルで保護する。こうして、樹脂支持体に結合すべ
き保護されたＣ−末端アミノ酸は好ましくはＮ“−Ｍｏ
ｚ−α−ベンジル−し−アスパラギン酸である。

工程（ｂ）。　樹脂支持体への保護されたＣ−末端アミ
ノ酸の結合 前述の米国特許出願環８４９．８３５号、１９８６年４
月９日提出、に記載されているように、好ましい樹脂支
持体はメチルベンズヒドリルアミン樹脂であるが、ベン
ズヒドリルアミン樹脂を使用することもできる。

メチルベンズヒドリルアミン 例えば、塩化アルミニウムの存在下に不活性溶媒、例え
ば、ジクロロエタン中で、低温、好ましくは０〜５°Ｃ
において、商業的に入手可能なポリスチレン樹脂ビーズ
（１％のジビニルベンゼン、２００〜４００メツシユ、
米国標準篩）をＩ）−）ルオイルクロライドと反応させ
てＩ）−トルオイル樹脂、ＣＨ．−Ｃ．Ｈ，−ＣＯ−（
、Ｈ，−樹脂を形成することによって調製することがで
きる。この樹脂をギ酸アンモニウム、ホルミアミドおよ
びギ酸の混合物と、還流温度（１６０〜１７０°Ｃ）に
おいて２４時間反応させて、Ｎ−ホルミルメチルベンズ
ヒドリルアミン樹脂、Ｃ　Ｈ　ｓ　　Ｃ　６　Ｈ　４　
　Ｃ　Ｈ　（　ＣＨ　−　Ｃ　Ｏ　　Ｈ　）　　Ｃ　＊
　Ｈ　４−樹脂を生成した。希塩酸中で加水分解すると
、所望のメチルベンズヒドリルアミン樹脂、すなわち、
ＣＨｓ　　ＣｉＨａ　　ＣＨ　（ＮＨ，・ＨＣ　ｌ）Ｃ
．６Ｈ．−樹脂が形成する。

そのように形成したメチルベンズヒドリルアミン樹脂を
中和し、モしてＮ，Ｎ’　−ジシクロヘキシルカーボン
アミドの存在下に工程（ａ）において形成したＮ“−Ｍ
ｏｚ−α−ベンジル−し−アスパラギン酸でアシル化す
る。

さらに詳しくは、Ｎ“−Ｍｏｚ−α−ベンジル−し−ア
スパラギン酸保護されたＣ−末端アミノ酸ヲメチルベン
ズヒドリルアミン樹脂に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル
カーボンアミド（ＤＤＣ）／ｌ−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール（Ｈ　Ｂ　Ｔ）仲介カップリングによって、約
２〜２４時間、好ましくは約１２時間、約１０〜５０°
Ｃ１好ましくは２５℃において、溶媒、例えば、ジクロ
ロメタンまたはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、好
ましくはジクロロメタン中でメチルベンズヒドリルアミ
ン樹脂に取り付ける。

工程（ｃ）。化学的脱保護 Ｎ“−Ｍｏｚ基の化学的脱保護は、トリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）を使用する酸加水分解によって達成される。し
かしながら、無水ＴＦＡまたはＴＦＡ　：　１　：　４
〜ｌ　：　ｌ　　（Ｖ／Ｖ）のＣＨ２Ｃｌ□混合物を使
用する従来の脱保護方法と異なり、ＣＨ２Ｃ　ｌ　を中
のＴＦＡ濃度は大きく減少することかでき、例えば、■
＝５〜ｌ：５０、好ましくはｌ：５〜ｌ：２０であるこ
とができる。通常、ＴＦＡは約ｌＯ％ｖ　／　ｖの濃度
、例えば、８〜１５％の濃度で使用されるであろう。こ
れらの低い濃度において、ベンジルエステル保護基は酸
加水分解的切断に対して非常に抵抗性であり、その結果
、より少ない副生物および欠失生成物がこの合成におい
て形成する。

ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃ１，を使用する脱保護は、好ましくは
、少量のインドール、例えば、ＴＦＡおよびｃＨ，Ｃ１
，の合計重量に基づいて約０．Ｏ１〜０．１重量％のイ
ンドールの存在下に実施する。

このインドールは、ＴＦＡ中に不純物として存在しうる
、潜在的に有害な酸化体、例えば、アルデヒドのための
スカベンジャーとして機能する。脱保護の温度は約０〜
５０°Ｃであることができるが、室温、例えば、約１８
〜２５℃は好ましく、そして２５℃はことに好ましい。

２５℃における脱保護反応は一般に約１０〜６０分であ
るが、通常３０分は十分である。クロロホルム（ＣＨＣ
ｌ３）をＣＨ，Ｃ１２の代わりに使用することができる
。

Ｎ″−Ｍｏｚ基保護基を除去、酸加水分解的ＴＦＡ脱保
護工程の後かつ次のカップリング工程前に、脱保護され
たペプチド−樹脂を中和する。この中和は通常ペプチド
−樹脂塩を溶媒、例えば、ＣＨ２Ｃ１、、ＣＨＣｌ３ま
たはＤＭＦ中の過剰（例えば、２．５５〜ｌＯ％ｖ／ｖ
）の第三アミンに暴露する。第三アミンとして、トリエ
チルアミン（ＥｚＮ）は最も普通に使用される。しかし
ながら、本発明の好ましい実施態様において、トリブチ
ルアミン（ＢｕａＮ）を第三アミン中和剤としてＥｔ、
Ｈの代わりに、溶媒として特にＣＨ。

Ｃ１□またはＣＨＣ１、、ことにＣＨ，ＣＩ、とともに
使用する。

こうして、ＴＦＡおよびＥｚＮは、それぞれ、７２．４
°Ｃおよび８９〜９０°Ｃの比較的接近した沸点を有し
、これに対してＢ　ｕ　、Ｎは２１６〜２［７℃で沸騰
する。しｔ；がって、Ｂｕ、Ｎは蒸留物を汚染しないの
で、蒸留による廃棄駅（主として塩化メチレン（ＣＨＩ
ＣＩ　ｚ）、（沸点＝４１°Ｃ）またはクロロホルム（
ＣＨＣｌｓ、沸点−６１２°Ｃり、ＴＦＡ、イソプロピ
ルアルコール、酸、塩基、過剰の試薬およびアミノ酸（
少量）の量をより少なくして）からのＣＨ，ＣＩ□また
はＣＨＣ１、溶媒の回収は大きく促進され、これにより
ＣＨ２Ｃｌ２またはＣＨＣ１、の大部分を再循環が可能
となる。

工程（ｄ）、（ｅ）およびＣｆ）。反復カップリング／
脱保護 完全に保護された樹脂結合チモシンｔｒｌの好ましい保
護された形態は、次の式によって表すことができる： Ａｃ−３ｅｔ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ａｔａ
−Ａ　Ｉ　ａ−Ｖａ　ｌ−Ａｓ　ｐ（ＯＢｚ　Ｉ）−Ｔ
ｈ　ｒ（Ｂｚ　　Ｉ）−３ｅ　ｒ（Ｂｚ　　１）−Ｓｅ
　ｒ（Ｂｚ　１）−Ｇｌ　ｕ（ＯＢｚ　ｌ）　−１１ｅ
−Ｔｈ　ｒ−（Ｂｚ　Ｉ）−Ｔｈ　ｒ（Ｂｚ　Ｉ）−Ｌ
ｙ　ｓ（ＣＩ　Ｚ）−Ａｓ　ｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−Ｇｌｕ（ＯＢｚ　１）−Ｌｙ　ｓ（
ＣＩ　Ｚ）−Ｌｙ　ｓ（ＣＩ　Ｚ）−Ｇ　ｌ　ｕ（ＯＢ
ｚ　１）−Ｖａ　１−Ｖａ　１−Ｇｌｕ（ＯＢｚ　１）
−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢ’ｚｌ）
−Ａｓ　ｐ（ＮＨ−ＣＨ（ＣｉＨａ　　ＣＨ３）Ｃ８Ｈ
４−樹脂）０Ｂｚｌ ここで保護基Ｂｚ　１、ＯＢｚ　ｌおよびＣＩＺは、そ
れぞれ、ベンジル、ベンジルエステルおよび２−クロロ
ベンジルオキシカルボニル てＡｃは酢酸である。

特定の保護基をチモシンα１の合成の好ましい実施態様
の説明において使用してきたが、同等の普通の側鎖保護
基を使用することは当業者の技量の範囲内である。側鎖
の保護基は（１）カップリング反応において使用する条
件下に安定でありかつ側鎖官能基を不活性とし、（２）
σ−アミン保護基を除去するとき使用する条件下に安定
であり、そしてペプチド鎖の構造、またはその中に含有
されている不斉中心のラセミ化を変化しない又応条件下
の、所望のアミノ酸配列の完結時に、容易に除去される
べきである。

アミノ酸みら適当な側鎖の保護基は、例えば、ｍ１ｓｔ
ｒｙ）、Ｍ、ＭｃＯｍｉｅ編、　Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒ
ｅｓｓ、＝ニーヨーク、１９７３；Ｇ。

Ｂａｒｎｙおよび前述のＲ，Ｂ、Ｍｅｒｉｆｉｌｏ１、
３、に記載されている。

連続的保護されたアミノ酸のカップリングは、自動化ア
ミノ酸分析器において、この分野においてよく知られて
いるように実施することができる。

保護されたアミノ酸の各々は、好ましくは、はぼ２．５
〜３．０モル以上の過剰量で導入し、そしてカップリン
グはジクロロメタン、ジクロロメタン／ＤＭＦＩＷ、合
物、ＤＭＦなど中で、ことに塩化メチレン中で室温にお
いて実施することができる。

ペプチド形成縮合反応において有用であることが知られ
ている他の溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド、ピリ
ジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロ７ラン
、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドンなど、ならびにそ
れらの適当な混合物を使用することができる。

縮合／カップリング反応のための反応温度は、ペプチド
形成縮合反応のために有用であることが知られている範
囲から選択することができる。こうして、それは通常焼
く一り０℃〜やつく６０℃、好ましくは焼く一２０°Ｃ
〜約３０°Ｃの範囲内であろう。カップリング剤はジク
ロロメタン中の通常ＤＣＣであるが、Ｎ、Ｎ’　−ジシ
クロヘキシルカーボンアミドまたは他のカーポジイミド
の単独またはＨＢＴまたはＮ−ヒドロキシスクイシンイ
ミドの存在下でであることができる。あるいは、保護さ
れたアミノ酸活性エステル（例えば、ｐ−ニトロフェニ
ル、ペンタ７ルオロフエニルたは対照無水物を使用する
ことができる。

連続的カップリング反応後、Ｎ”−Ｍｏｚ基を工程（ｃ
）において記載したように脱保護する。

工程（ｇ）。切断／脱保護 Ｎ末端残基、これはチモシンα１の場合において酢酸で
ある、を樹脂結合ペプチドにカップリングした後、保護
されたペプチドを樹脂支持体から切断する。好ましい実
施態様において、樹脂支持体からの保護されたペプチド
の切断および保護された側鎖の官能基の脱保護は、切断
および脱保護反応の適当な選択によって同時に実施する
。メチルベンズヒドリルアミン樹脂を樹脂支持体として
使用するとき、臭化水素またはトリフルオロメタスルホ
ン酸を切断および脱保護剤として使用することが好まし
い。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用する場合、フッ化
水素を使用する。切断／脱保護は次のように実施する。

保護されたチモシンσ１樹脂をトリフルオロ酢酸中に懸
濁し、そして通常の温度（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）におい
て約１時間乾燥臭化水素気体で処理して、ポリペプチド
を側鎖から除去すると同時にすべての保護基をアミノ酸
残基の側鎖から除去する。

臭化水素は単独で使用できるが、乾燥臭化水素で処理す
るとき、トリフルオロ酢酸中のアニソール、最も好まし
くは、アニソールおよびチオアニソールの混合物を含め
ることが好ましい。前述の米国特許出願第８４９．８３
５号に記載されているように、ＨＢｒ，ＴＦＡおよびア
ニソールの混合物を脱保護および切断混合物として使用
するとき、チモシンα１の収率は、ＴＥＡおよびＨＢｒ
の混合物を使用するときより、約５０％だけ増加する。

ＨＢｒ，ＴＦＡ，アニソールおよびチオアニソールの混
合物を使用するとき、収率は約９０％だけ改良される。

アニソール：チオアニソールの容量比は、好ましくは約
２０：約８０、最も好ましくは約５０：５０（すなわち
、約１＝１）である。

別の実施態様において、トリフルオロメタスルホン酸、
ＣＦ、・５Ｏ３Ｈを、再び、ＨＢｒの代わりに切断／脱
保護剤として、好ましくはアニソールとともに、ことに
アニソールおよびチオアニソールとともに、ＴＦＡ中で
使用する。ＴＦＡ中の樹脂結合保護されたペプチドの懸
濁液を通してゆっくり泡立てて通人するＨＢｒと異なり
、トリフルオロメタスルホン酸は液体であるので５、ゆ
っくり、例えば、嫡々添加することができる化か、ある
いは−度に、一般に通常の温度において、ゆっくり、例
えば、滴々添加することができ、モしてＨＢｒのように
、取り扱いのだめの実験室の特別の装置は必要ではない
。

次いで、過剰の酸を４０°Ｃにおいて減圧下に蒸発させ
、そしてアニソールおよびチオアニソールをエーテルで
洗浄する。粗製チモシンα１を残留物から酢酸アンモニ
ウム（例えば、１〜２％）で抽出し、そして、例えば、
セファデックス（Ｓｅｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ）カラム
で脱塩し、０．ＩＮの酢酸で溶離することができる。そ
の後、チモシンα１をＨＰＬＣＣＣ１＊逆相カラム、５
．７Ｘ３０ｃｍ）によって精製する。分析用ＨＰＬＣに
かけると、そのようにして得られたチモシンα１は断片
縮合方法によって調製した参照チモシンα１と同じよう
に挙動する。その上、現在合成されたチモシンσ１は天
然チモシンα１と区別不可能であり、そして満足すべき
アミノ酸分析を与えることが分かつｔこ　。

カップリングおよび脱保護／切断反応は典型的には約２
５℃において実施するが１、それより高いか、あるいは
低い温度において、例えば、−１０℃〜＋５０°Ｃは、
また、適当である。特定の反応のために正確な温度は、
もちろん、基質、試薬、溶媒などに依存し、すべては当
業者の技量の範囲内である。

さらに、脱保護したチモシンα１ペプチドの精製工程の
１つの特定の順序は前述したが、他の手順を使用するこ
とができる。一般に、完全に脱保護されたポリペプチド
はクロマトグラフィー工程の順序によって、次のタイプ
のいずれかまたはすべてを使用して精製することができ
る：アセテートをの弱塩基性ＤＥＡＥ−セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ａ−２５のイオン交換クロマトグ
ラフィー；ゲル透過クロマトグラフィー例えば、セファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５、非誘導化ポリ
スチレン−ジビニルベンゼンの疎水性吸着クロマトグラ
フィー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　　ＸＡＤ）；シ
リカゲル吸着クロマトグラフィー：または自流分配ニオ
クチルーまたはオクタデシルシリル−シリカ結合相カラ
ム充填のＨＰＬＣ，ことに逆相ＨＰＬＣ。

上の記載は、その特定したアミノ酸配列および特定の保
護された側鎖基を使用した、チモシンα１の同相ペプチ
ド合成を特定に強調してきたが、当業者は認識するよう
に、本発明の方法は、チモシンα、の完全な２８アミノ
酸配列、Ｎ末端セリン−酢酸で開始し、モしてＣ−末端
アスパラギン、まｊ；はその逆を包含する、の断片−よ
り短いアミノ酸配列−に適用することができる。また、
チモシンα１のアミノ酸残基の１つまたは数個を他のア
ミノ酸残基で置換して特定の性質を達成すると同時に、
チモシンσ１の本質的な特性を保持することができる。

同様に、Ｎ末端およびＣ末端の一方または双方において
、ｌまたは２以上、例えば、約１０まで、好ましくは約
６までのアミノ酸残基を付加して、約４８まで、好まし
くは約４０までのアミノ酸から構成され、そしてその中
にチモシンσ１ペプチドを含むペプチドを得ることがで
きる。

しかしながら、Ｎ’−Ｍｏｚ基保護基の使用から由来す
る最も顕著な利点は、一般に、少なくとも約２０アミノ
酸のより長いペプチド配列について観察されるであろう
。なぜなら、Ｎ・−Ｍｏｚ基のより温和な酸加水分解的
脱保護の累積的効果および酸溶媒（Ｔ　Ｆ　Ａ）の体積
の節約はカップリング／脱保護サイクルの数がぞうかす
るにつれていっそう顕著となるからである。

チモシンα１の断片または類似体をアミド基（−〇　〇
　Ｎ　ＨりをもたないＣ−末端アミノ酸を使用して調製
するとき、好ましいメチルベンズヒドリルアミン樹脂ま
たはベンズヒドリルアミン樹脂よりむしろ普通の固体の
支持体が使用されるであろう。

固相ペプチド合成に有用ない適当な固体支持体は、試薬
および段階的縮合−脱保護反応の反応条件に対して不活
性であり、ならびに使用する媒質中に不溶性である物質
である。適当な固体支持体の例は次の通りである：クロ
ロメチルーポリスチレンージビニルベンゼンポリマー　
ヒドロキシメチル−ポリスチレン−ジビニルベンゼンポ
リマー官能化、架橋ポリ−Ｎ−アクリルイルピロリドン
樹脂など、ことにクロロメチルポリスチレン−１％（ま
たは２％）のジビニルベンゼンポリマークロロメチル−
ポリスチレン−ジビニルベンゼン型の樹脂への取り付け
は、Ｍｏｚ−アミノ酸を、そのセシウム、テトラメチル
アンモニウム、トリエチルアンモニウム、４，５−ジア
ザビシクロ−［５，４，ＯＦ　ウンンデクー５−エン、
または同様な塩として、エタンノール、アセトニトリル
、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など中で、
ことにＤＭＦ中のセシウム塩を、クロロメチル樹脂と、
高温、例えば、４０℃〜６０°Ｃ１好ましくは約５０℃
において、約１２〜４８時間、好ましくは約２４時間反
応させることによってなされる。

次の実施例によって本発明をさらに説明する。

参考例１ メチルベンズヒドリルアミン樹脂 ５９．９ｇのポリスチレン樹脂ビーズ［コポリスチレン
−１％−ジビニルベンゼン、２００〜４００メツシユの
ビーズ、ラブ・システム（ＬａｂＳｙｓｔｅｍ、Ｓａｎ
　　Ｍａｔｅｏ、カリフォルニア州］を、５００ｍＱの
ジクロロエタン中に懸濁させた。この混合物を氷浴中で
おだやかに機械的に撹拌しながら、温度が５°Ｃ以下に
なるまで、冷却した。

１５．５ｇのｐ−）ルオイルクロライドおよび１３．３
ｇの塩化アルミニウムを、滴下漏斗内の２５０　ｍ１２
のジクロロエタン中で混合した。この溶液を冷却し撹拌
した樹脂ビーズの懸濁液に約４０分かけて滴々添加し、
そして反応混合物が５°Ｃ以上にならないように注意し
た。撹拌を室温において４時間続け、このとき樹脂を順
次にイソプロパツール、イソプロパツールー水（１：１
混合物）、イソプロパツールで洗浄し、そして乾燥して
５３．８ｇのｐ−トルオイル樹脂を得た。次いで、この
樹脂１６８ｇのギ酸アンモニウム、２０１ｍＱのホルム
アミド、１３４ｍＱのギ酸および３５０ｍ１２のニトロ
ベンゼンと混合した。この混合物を徐々に１６５〜１６
８℃に還流しながら加熱し、そして１日間維持し、その
間約１１５ｍ（２の水性相がディーンースタークトラッ
プに集められた。

この樹脂を上のように洗浄および乾燥すると、５５．５
ｇのＮ−ホルミルメチルベンズヒドリルアミン樹脂が得
られた。この生成物を３００ｍ１２の１２Ｎ塩酸および
インプロパツールの各々の混合物中で還流下に３時間加
水分解した。得られる樹脂の洗浄および乾燥後、５４．
９ｇのメチルベンズヒドリルアミン樹脂の塩酸塩の形態
が得られた。

それはニンヒドリン試薬に対して非常に強い陽性の反応
を示し、そして中和したとき０，４ミリモルのＭｏｚ−
Ａｌａ−ＯＨを加え、モしてＮ、Ｎ−ジシクロヘキシル
カーボンアミドの存在下にＭｏｚ−Ａｈａ−ＯＨとカッ
プリングした。

参考例２ Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　ｌの合成Ｍｏｚ−
Ｖａ　１−ＯＣＨ，−Ｃ，Ｈ，−樹脂（１゜０ｇ；０．
５２ミリモル／ｇ）をベックマン９９０Ｂ自動化ペプチ
ド合成装置の反応カップ内に入れ、そして合成をＭｏ　
ｚ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＯＨ（０，５ｇ）を第１サイクルにお
いて使用して実施し、第２サイクルにおいてＭｏｚ−Ａ
ｌａ−ＯＨ（０゜５３ｇ）を使用して実施し、そしてＤ
ＣＣ（０゜４３ｇ）を利用する最後のサイクルにおいて
Ｍ。

ｚ−Ｌｅｕ−ＯＨ（０，６２ｇ）を使用して実施した。

計器はサイクルの各々において次の工程を実施するよう
にプログラミングした：　ｌ）０．０５％のインドール
を含有するＣＨ２Ｃ１、中の１０％のＴＦＡの２０体積
を使用する予備洗浄、２）１０％のＴＦＡ中の２８分の
撹拌、３）ＣＨ，ｃ１２を使用する３回の洗浄、４）　
ＣＨｘＣｌ　ｚ中の１０％のトリエチルアミン（Ｅｔｓ
Ｎ）を使用する予備洗浄、５）１０％のＥｔ、Ｎ中の５
分間の撹拌、６）ＣＨ２Ｃｌ２を使用する３回の洗浄、
７）Ｍｏｚ−アミノ酸およびＤＣＣの添加、次いで１２
０分間の撹拌、各々（ａ）ＣＨ，ＣＩ　、、（ｂ）イソ
プロピルアルコール（ｉ−ＰｒＯＨ）：ＣＨ，Ｃ１，混
合物（１：　ｌ）および（ｃ）ＣＨ，Ｃ１，を使用する
洗浄。二重カップリングを全体の合皮に使用した。完成
したテトラペプチド−樹脂Ｍｏ　ｚ−Ｌｅ　ｕ−Ａ　ｌ
　ａ−Ｇ　］　ｙ−Ｖａ　ｌ　−ＱＣＨニーＣ，Ｈ，−
樹脂（１，１５ｇ）をＨＦ（１０ｍ（２）でアニソール
（１ｍ１２）の存在下に０℃において４５分間処理した
。過剰の酸およびアニソールを真空除去し、そして水で
抽出すると、０゜２２ｇの粗製のＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｖα１が得られた。それは次のアミノ酸組成を有し
た：Ｇ１３’１０．９５；Ａｌａ、　　１．０３；Ｖα
１。

１．０１；Ｌｅｕ、　　■−００゜ベック７フーアルテ
ツクス３４４型勾配システムの分析用ＨＰＬＣ。

ハミルトン（ｈａｍｉ　Ｉ　ｔｏｎ）ＰＲＰ−１逆相カ
ラム（４，ＩＸ１５０ｍｍ）を使用する、をｐＨ６，０
，０，０３モルのリン酸カリウム、４〜１２．５％のア
セトニトリルの直線の勾配で溶離すると、この物質は約
９９％の純度であることが示された。それをベックマン
１２０Ｂ型アミノ酸分析器で分析して、イオン交換クロ
マトグラフィーにより欠失ペプチドの含量を決定し、そ
して結果を表１に記載する。

同一化合物の平行分析を同一条件下に実施したが、ただ
しＢ　ｏ　ｃ　　Ｖ　ａ　ｌ　　ＯＣＨ２Ｃ＊　Ｈ４樹
脂およびＢｏｃ−アミノ酸［ ペプチド研究所（Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｉｎ５ｔｉ；仁ｕ
ｔｅ、Ｉｎｃ、）、大阪］をＭｏｚ−誘導体の代わりに
使用した。得られるＢｏａ−Ｌｅｕ−ＡＩ　ａ−Ｇ　ｌ
　ｙ−Ｖａ　Ｉ　−０ＣＨ２−（、ＣＨ４−樹脂（１，
１０ｇ）をＨＦ−アニソールで処理し、そして上のよう
に仕上げると、０．２０ｇの粗製のＬｅ　ｕ−Ａ　ｌ　
ａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　ｌが得られ、これはＭｏｚ−実
験から得られたものとほとんど同一のＨＰ　Ｌ　Ｃパタ
ーンを示した。アミノ酸分析：Ｇｌｙ、０．９７；Ａｌ
ａ、１．００；Ｖａｔ、１゜００；Ｌｅｕ、０．９７゜
アミノ酸分析器による欠失ペプチドの分析の結果を、ま
た、表１に示す。

参考例３ ＴＦＡによるＭｏｚ基およびＢｏａ基の切断速度参考例
２において使用したのと同一の手順に従って調製した、
Ｍｏｚ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａ　ｌ　−ＯＣＨ。

Ｃ，Ｈ４−樹脂（０，５ｇ、Ｏ−４２ミリモル／ｇ）を
、ＣＨ，Ｃ１，中の５％のＴＦＡの２０体積とともに撹
拌した。所望の時間間隔において、試料（各々合計の２
０％）を抜き出し、直ちに焼結ガラスのフィルター上に
配置し、吸引乾燥し、ＣＨ，Ｃ１□の１０％のＥｔ、Ｎ
で洗浄し、そしてさらにＣＨ，ＣＩ２で完全に洗浄した
。中和したペプチド−樹脂試料にニンヒドリン陰性）を
小さいキャップ付きのバイアルに移し、そして各々をＢ
ｏｃ−Ｐｈ　ｅ　−ＯＨ（５３ｍｇ）およびＤＣＣ（４
１，２ｍｇ）とともに１　ｍＱ　（７）ＣＨ，ＣＩ　、
中で撹拌した。

このペプチド−樹脂はニンヒドリン陰性となった。

ＣＨ２Ｃｌ２゜ｉ　　ＰｒＯＨＣＨｚＣＩｚ（１：　ｌ
）およびＭ　ｅ　ＯＨで洗浄し、次いで乾燥し、試料を
１００℃において２４時間ジオキサン−ＨＣＩ（１：１
）中で個々に加水分解し、次いでそれらのアミノ酸組成
について分析した。最終のカップリング前に除去されＩ
；保護基の関数として、Ｐｈｅ／Ａｌａの比を取った。

同一実験を１０％のＴＦＡを使用してＭｏｚ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ　
−０ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５−樹脂について反復し、そして、
また、４０％、２０％、２０％および５％のＢｏａ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ
　ｌ−０ＣＨ２−カップリングについて反復する。結果
を第１図に示す。

実施例１ チモシンα１の合成 参考例１において得られたＭＢＨＡ−樹脂（１゜００ｇ
；０．４０ミリモル／ｇ）をベックマン９９０Ｂ自動化
合成装置の反応カップ内に入れ、そして１０％のＥｔ、
Ｎで中和しく２０体積、１０分）、３回ＣＨ，ＣＩ、で
洗浄し、次いで３倍過剰量のＭｏｚ−アスパラギン酸σ
−ベンジルエステル（同等の量のＤＣＣ，２時間）とカ
ップリングした。自動化合成は、適当なＭｏｚ−アミノ
酸をサイクル各々における、参考例２に記載したモデル
のテトラペプチド合成についてプログラミングしたよう
にして添加することによって続けた。３倍過剰量のＭｏ
ｚ−アミノ酸およびＤＣＣを各サイクルにおいて使用し
ｔ；。Ｍｏｚ基の脱保護のために、ＣＨ，ＣＩ２中の１
０％のＴＦＡおよび１０％のインール（３０分）を利用
した。保護されたチモシンａ１−樹脂Ａｃ−３ｅ　ｒ　
（Ｂｚ　ｌ）　−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｖα１　−Ａｓｐ（ＯＢｚ　ｌ）　−Ｔｈ　ｒ　（Ｂ
ｚ　ｌ）　−３ｅ　ｒ　（Ｂｚ　Ｉ）−Ｓｅ　ｔ　（Ｂ
ｚ　］）−Ｇｌｕ　（ＯＢｚ　Ｉ）１１　ｅ−Ｔｈ　ｒ
　（Ｂｚ　ｌ）　−Ｔｈ　ｒ　（Ｂｚ　Ｉ）−Ｌｙ　ｓ
　　（ＣＩ　Ｚ）　　−Ａｓ　ｐ　　（ＯＢｚ　ｌ）　
　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　　（ＣＩＺ）　　　Ｇｌｕ　　（
ＯＢｚｌ）−Ｌｙｓ　　（ｃ＋ｚ）−ＬｙＳ　　（ｃ＋
ｚ）−Ｇｌｕ　　（ＯＢｚ　Ｉ）−Ｖａ　Ｉ−Ｖａ　Ｉ
−Ｇｌｕ　　（ＯＢｚ　Ｉ）−Ｇｌｕ　　（ＯＢｚｌ）
−Ａｌａ−Ｇｌｕ　　（ＯＢｚｌ）−Ａｓ　ｐ　（ＭＢ
ＨＡ−樹脂）がこのようにして３．５５ｇの量で得られ
た。

この保護されたペプチド−樹脂の一部（１，０５ｇ）を
ＴＦＡ　（１６ｍｆｆ　）　、アニソール（２ｍａ）お
よびチオアニソール（２，２ｍ＋２）の混合物中に通常
の実験室のガラス容器内において懸濁させ、そして乾燥
ＨＢｒの定常の流れを６０分間泡立てて通入した。過剰
量の酸を回転蒸発器で急速に蒸発させ（３８°Ｃ１５分
）、そして残留物を焼結ガラスフィルター上で乾燥エー
テルで洗浄した。追加のエーテルでさらに洗浄した後、
ペプチドを２つの部分の２５ｍ１２の２％の酢酸アンモ
ニウム中に抽出した。この溶液を小さい体積に濃縮し、
セファデックス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ）　
Ｇ　−１０カラム（２，６Ｘ９５ｃｍ；　ｏ、１モルの
ＨｏＡｃ）で脱塩し、そして凍結乾燥すると、０．３５
１ｇの粗製チモシンα１が得られた。粗製生成物を調製
用ＨＰＬＣ（ｐＨ５，０，０，３モルのリン酸カリウム
で溶離し、９％−１０，３７％のＣＨ３ＣＮの段階的勾
配）で精製し、次いでセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）Ｇ−１０カラム（５−２Ｘ９５ｃｍ；Ｏ，１モルの
ＨＯＡｃ）で脱塩すると０．１２３ｇ　（３５％の収率
）のチモシンσ１が得られ、これは分析用ＨＰＬＣにお
いて天然のホルモンおよびどこかで調製された標準と同
一に移動した。アミノ酸分析（２４時間の加水分解）：
Ａｓｐ、３．９５；Ｔｈｒ、２．８９；　Ｓ　ｅ　ｒ　
ｓ　２−６９　；　Ｇ　ｌ　ｕ　ｓ　６−２０　；　Ａ
　Ｉ　ａ　ｓ２．９０；Ｖａｔ、２．４４；ｌｉｅ、０
．９５；Ｌｅｕ、１．００；Ｌｙｓ、４．０１．（１０
０時間の加水分解）’　Ａｓｐｓ　４．０９　；Ｔｈ　
ｒ。

２．７４；Ｓｅｒ、２．１３；Ｇｌｕ、６．２６；Ａｌ
ａ、２．９２；Ｖα１、３．００；　Ｉ　Ｉｅｌｏ、９
５；ＬｅｕＳ　１．００；Ｌｙｓ、４．１３゜この保護
されたペプチド−樹脂のだの部分（０゜５５ｇ）を１ｍ
Ｑのアニソールと混合し、そして１０ｍＱのＨＦととも
に０℃においてＨＦ−装置内で４５分間撹拌した［Ｓ　
ｔ　ｅｗａ　ｒ　ｔ、Ｊ、Ｍ。

およびＹｏｕｎｇ％　Ｊ、Ｄ、（１９８４）同相ぺｒｃ
ｅ　　Ｃｈｅｍｉｃα１　　Ｃｏｍｐａｎｙｓイリノイ
州ロック７オードロック７オードバラ、Ｓ。

、キシダ、Ｉ８、キクチ、Ｙｏ、サカイ、Ｒｏ、および
カキウチ、Ｋ、（１９６８）日本化学学会！（Ｂｕｌ１
、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ）、４１．１２７３−
１２７６１゜揮発性成分を、まず水流ポンプで、次いで
高真空ポンプで蒸発させ、そして残留物を焼結ガラスの
フィルター上でエーテルで洗浄した。上のように仕上げ
ると、０．１８９ｇの粗製生成物が得られ、これは上の
物質のそれに類似するクロマトグラフィーのパターンを
示した（参照第２図）。

Ｍｏｚ−アミノ酸のの代わりにＢｏｃ−アミノ酸を使用
するチモシンα１の平行合成を同一のプログラムを使用
する自動化合成装置において同一の方法で実施したが、
ただし０．０５％のインドールを含有するＣＨ２Ｃｌ１
中の４０％のＴＦＡを脱保護剤として使用した。１．０
５ｇの同−ＭＢＨＡ−樹脂から、３．３６ｇの保護され
たペプチド−樹脂が得られた。このペプチド−樹脂の１
゜０１ｇを上に記載したＨＢｒ手順によって切断すると
、０．３２５ｇの粗製チモシンα、が得られた。調製用
ＨＰＬＣ尾脱塩後、０．０９５ｇ　（２９％の収率）の
純粋な物質が得られた。アミノ酸１元（２４時間の加水
分解）：Ａｓｐ、４．０１；Ｔｈｒ、２−９３；Ｓｅｒ
、２−４４；Ｇｌｕ。

６．１５；Ａｌａ、３．００；Ｖα１、２．３７；Ｉｌ
ｅ、０．８６；Ｌｅｕ、１．００；Ｌｙｓ１４．１４゜ Ｂｏｃ一方法からの同一の保護されたペプチドを、また
、ＨＦ手順によって切断した。０．５ｇの樹脂から、０
．１６６ｇの粗製ペプチドが得られた。それらの分析用
ＨＰＬＣのパターンを第２図に示す。

これらの実施例において、プレパック（Ｐｒｅｐａｃｋ
）　　５００／Ｃ＋ａを有するウォーターズ（Ｗａヒｅ
ｒｓ）ＰｒｅｐＬｃ／システムを、合成ペプチドの調製
用ＨＰＬＣ精製のために使用した。商業的に入手可能な
ＨＰＬＣ等級の溶媒および試薬等級の化学材料をそれ以
上精製しないで使用した。

アミノ酸分析のために、ベックマン６３００型高性能分
析装置を使用した。

実施例２ この実施例は、チモシンσ８−樹脂の脱保護及び切断の
ためにトリフルオロメタスルホン酸を使用することを立
証する。

実施例１に記載したようにＭＢＨＡ−樹脂からＭｏｚ−
アミノ酸を使用して自動化ペプチド合成装置（ベックマ
ン９９０Ｂ）でペプチド−樹脂した、保護されたチモシ
ンαよ一樹脂’Ｇ：、１ｍＱＩ）アニソール、１ｍαの
チオアニソール、３ｍＱのトリフルオロ酢酸と混合し、
そして１分の期間にわたって滴々添加したＱ、３ｍ１２
のトリフルオロメタスルホン酸比処理し、その間磁気棒
でおだやかに撹拌した。さらに６０分間撹拌した後、こ
の混合物をｌｏＯｍ（２の乾燥エーテル中に注いだ。

形成したゴム状沈澱をさらに数回新鮮なエーテルで洗浄
し、そしてペプチドを３０ｍｍの２％の酢酸アンモニウ
ムで抽出し、次いで数ｍＱの水で抽出した。次いで、−
緒にした抽出液を濾過して固体物質を除去し、小さい体
積の濃縮し、そしてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
）Ｇ−１０カラム（２，６Ｘ８５ｃｍＢ０．１モルのＨ
ＯＡｃ）で脱塩した。ペプチドのパックを凍結乾燥する
と、０．１６４ｇの粗製チモシンα１が得られた。第５
図ａはこの粗製チモシンσ１の分析用ＨＰＬＣの結果を
示す。

次いで、粗製ペプチドをハミルトンＰＲＰ−１（２１，
４Ｘ２５０ｍｍＳ　１０ミクロン、ｐＨ６，６，５％の
ア七ト二トリル）で精製して、０．０５７ｇの精製され
たチモシンα１を得た。この物質の分析用ＨＰＬＣは第
５図すに示す。

アミノ酸分析（６Ｎ塩酸、１００’ｏ）（２４時間の加
水分解）：Ａｓｐ、４．００；Ｔｈｒ、２゜９１；Ｓｅ
ｒ、２．８０；Ｇｌｕ、５．９９；ＡＩａ、２．８７；
Ｖａｔ、２．１３　；　Ｉ　ｌｅ、０゜９３；Ｌｅｕ、
１．Ｏｆ；Ｌｙｓ、３．８３゜（１００時間の加水分解
）：Ａｓｐ、４．００；Ｔｈｒ、２．７９；Ｓｅｒ、２
．３０；Ｇｌｕ。

５．９０；Ａｌａ、２．８５；Ｖα１、２．６６；ｌ１
ｅｓ　ｏ、９６；ＬｅｕＳ　１．０９；Ｌｙｓ。

３．９３゜ 本発明による固相ペプチド合成においてＮ−保護基とし
てＭｏｚを使用した結果、目的チモシンσ、のより高い
収率およびより高い純度が達成されるばかりでなく、か
つまたさらにＢｏｃ保護基を使用するペプチドのほぼ同
一の収率と比較して、合計の体積の約２０％〜約２５％
のＴＦＡを消費するのみであるという追加の利点かえら
れる。したがって、液体廃棄物の廃棄はいっそう容易で
あり、そして環境中に逃げる汚染物質の量は大きく減少
されるであろう。

切断／脱保護剤としてＨＢｒまたはＨＦの代わりにトリ
フルオロメタスルホン酸を使用すると、ＨＢｒと同様な
利点が得られるが、さらに、加圧したＨＢｒ気体の使用
および懸濁したペプチド−樹脂への気体の泡立てた通人
が回避される。

全体の収率のなおそれ以上の改良は、チオアニソールお
よびアニソールを切断／脱保護の間に同時に使用すると
き、達成される。

全体の方法の効率は、さらに、中和剤としてトリブチル
アミンを使用して、これにより塩化メチレン、クロロホ
ルムまたはｐ他の比較的低沸点の溶媒の再循環を可能と
する。

理解を明瞭にするために、例示および実施例によって、
本発明を説明して来たが、ある種の変化および変更は特
許請求の範囲を逸脱しないで可能である。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１１固相ペプチド合成により、工程（ａ）チモシンα、
ペプチドのＣ−末端アミノ酸上の、アルファー位置にお
ける反応性アミノ基、およびベータカルボン酸基以外の
、他の反応性基を一時的に化学的に保護し；　（ｂ）保
護されたＣ−末端アミノ酸を、その保護されていないカ
ルボン酸（−Ｃ○○Ｈ）基を経て、樹脂支持体へ化学的
に結合し：（ｃ）液状トリフルオロ酢酸溶媒を使用する
酸加水分解的切断により樹脂結合保護されたアミノ酸の
反応性アミノ基を化学的に脱保護し；　（ｄ）工程（ｃ
）からの樹脂結合アミノ酸を次のアミノ酸と所望の配列
で、アルファー位置において、カルボン酸基以外の反応
性基のすべてを化学的に保護して、カップリング剤存在
下に、接触させることによって、ペプチド結合を経て次
のアミノ酸を所望の配列で化学的にカップリングし；　
（ｅ）液状トリフルオロ酢酸溶媒を使用する酸加水分解
的切断により工程（ｄ）からのカップリングしたアミノ
酸の反応性アミノ基を化学的に脱保護し：（ｒ）保護さ
れたペプチドの合計の所望の配列が樹脂上に構成される
まで、連続的アミノ酸を所望の配列で１度に１つずつ付
加して、工程（ｄ）および（ｅ）を反復することにより
合成を続け；そして（ｇ）保護されたペプチドを樹脂支
持体から切断し、そして液状トリフルオロ酢酸溶媒を使
用して保護された反応基を脱保護する、によって、チモ
シンα３、またはその生物学的に活性な類似体または断
片を製造する方法において、連続的アミノ酸の各々のア
ルファーアミノ基を４−メトキシベンジルオキシカルボ
ニルで一時的に化学的に保護し、これにより工程（Ｃ）
および（ｅ）において使用する液状トリフルオロ酢酸溶
媒の体積を実質的に減少させる、ことを特徴とする方法
。

２、工程（ｃ）は約５：ｌ〜約５０＝１の容量比の塩化
メチレン中のトリフルオロ酢酸の溶液を使用する酸加水
分解的切断によって、反応性アミノ基を脱保護するから
なる、上記第１項記載の方法。

３、トリフルオロ酢酸対塩化メチレンの容量比は約１：
５〜約１＝２０である上記第２項記載の方法。

４、トリフルオロ酢酸は約８〜約１５容量％で使用する
上記第２項記載の方法。

５、トリフルオロ酢酸は約１０％の体積で使用する上記
第２項記載の方法。

６、さらに、工程（ｃ）からの化学的に脱保護された樹
脂結合アミノ酸をトリエチルアミンで中和することを含
む上記第１項記載の方法。

７、さらに、工程（Ｃ）からの化学的に脱保護された樹
脂結合アミノ酸をトリブチルアミンで中和することを含
む上記第１項記載の方法。

８、樹脂支持体はメチルベンズヒドリルアミン樹脂から
なる上記第１項記載の方法。

９、臭化水素、アニソールおよびチオアニソールの混合
物を工程（ｇ）において使用して切断および脱保護を実
施する上記第８項記載の方法。

ｌＯ、アニソール対チオアニソールの容量比は約２０　
：　８０〜約８０　：　２０である上記第９項記載の方
法。

１１、アニソール対チオアニソールの容量比は約１：１
である上記第９項記載の方法。

１２、トリフルオロメタスルホン酸、アニソールおよび
チオアニソールの混合物を工程（ｇ）において使用して
切断および脱保護を実施する上記第８項記載の方法。

１３、アニソール対チオアニソールの容量比は約２０　
：　８０〜約８０　：　２０である上記第１２項記載の
方法。

１４、アニソール対チオアニソールの容量比は約ｌ：ｌ
である上記第１２項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、１０％のＴＦＡ　（・−・）によるおよび５
％のＴＦＡ　（○−○）によるＭｏｚ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−ＯＣＨ
，−Ｃ，Ｈ，−樹脂、および４０％のＴＦＡ　（△−Δ
）、２０％のＴＦＡ（−）、１０％のＴＦＡ　（ムーム
）および５％のＴＦＡ　（ママ）によるＢｏａ−Ａｌ　
ａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　
ｌ　−０ＣＨ２−Ｃ。 Ｈ６−樹脂の酸切断割合を表すグラフである。 第２図は、（ａ）Ｂｏｃ保護およびＨＦ切断、（ｂ）Ｂ
ｏｃ保護およびＨＢｒ切断、（ｃ）Ｍ。 ２保護およびＨＦ切断、および（ｄ）ＭｏｚおよびＨＢ
ｒ切断によって、製造された粗製チモシンα１について
のＨＰＬＣのクロマトグラフィーのトレースである。 第３図は、実施例１に記載する条件下のチモシンα、の
調製用ＨＰＬＣ精製のクロマトグラフィーのトレースで
ある。 第４図は、実施例１において得られた（ａ）粗製（左）
および（ｂ）精製（右）チモシンα１の分析用ＨＰＬＣ
のクロマトグラフィーのトレースである。 第５図は、実施例２において得られた（ａ）粗製（左）
および（ｂ）精製（右）チモシンσ１の分析用ＨＰＬＣ
のクロマトグラフィーのトレースである。 ＦＩＧ、　２ 図面の浄書（内容に麦藁なし） ＦＩＧ、　　１ ３０　　分 １゜ ３゜ ３ｏ＃ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ １゜ ３゜ ３０分 手続補正書は式） ％式％ １、事件の表示 平成１年特許願第１１５９４４号 ２、発明の名称 チモシンσ１を合成する固相法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　アルファートバイオメディカルズ・インコーホレ
ーテッド ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付 なし ６、補正の対象 ７、補正の内容

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、固相ペプチド合成により、工程（ａ）チモシンα＿
   １ペプチドのＣ−末端アミノ酸上の、アルファー位置に
   おける反応性アミノ基、およびベータカルボン酸基以外
   の、他の反応性基を一時的に化学的に保護し；（ｂ）保
   護されたＣ−末端アミノ酸を、その保護されていないカ
   ルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を経て、樹脂支持体へ化学的
   に結合し；（ｃ）液状トリフルオロ酢酸溶媒を使用する
   酸加水分解的切断により樹脂結合保護されたアミノ酸の
   反応性アミノ基を化学的に脱保護し；（ｄ）工程（ｃ）
   からの樹脂結合アミノ酸を次のアミノ酸と所望の配列で
   、アルファー位置において、カルボン酸基以外の反応性
   基のすべてを化学的に保護して、カップリング剤存在下
   に、接触させることによつて、ペプチド結合を経て次の
   アミノ酸を所望の配列で化学的にカップリングし；（ｅ
   ）液状トリフルオロ酢酸溶媒を使用する酸加水分解的切
   断により工程（ｄ）からのカップリングしたアミノ酸の
   反応性アミノ基を化学的に脱保護し；（ｆ）保護された
   ペプチドの合計の所望の配列が樹脂上に構成されるまで
   、連続的アミノ酸を所望の配列で１度に１つずつ付加し
   て、工程（ｄ）および（ｅ）を反復することにより合成
   を続け；そして（ｇ）保護されたペプチドを樹脂支持体
   から切断し、そして液状トリフルオロ酢酸溶媒を使用し
   て保護された反応基を脱保護する、によって、チモシン
   α＿１、またはその生物学的に活性な類似体または断片
   を製造する方法において、連続的アミノ酸の各々のアル
   ファーアミノ基を４−メトキシベンジルオキシカルボニ
   ルで一時的に化学的に保護し、これにより工程（ｃ）お
   よび（ｅ）において使用する液状トリフルオロ酢酸溶媒
   の体積を実質的に減少させる、ことを特徴とする方法。