JPH0236235B2 - Tatonsgg1noseizohoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明に多糖NSG―１を製造する方法に関す
るものである。 更に詳細には、本発明は抗腫瘍活性を有する多
糖NSG―１を製造する方法に関するものである。 本発明では、インキユベーシヨンによつて糖質
から直接多糖NSG―１を生合成するために、き
わめて純度の高い抗腫瘍活性多糖NSG―１を多
量生産することができ、医薬界に貢献するところ
大なるものがある。 （従来の技術） キツネノワンタケ科（Sclerotiniaceae）に属
するきのこ菌がアブラナ科の植物の根や茎に形成
する菌核中にβ―（１→３）結合するＤ―グルコ
ピラノシル残基を骨格とし、この骨格３ケごとに
Ｃ―６に結合する１ケのＤ―グルコピラノシル残
基を有する多糖が含まれていることが知られてお
り（北原等岐阜大学農学部研究報告8100（1957）、
9139（1958）、日本農芸化学会誌35468（1961）、更
に上記きのこ菌を液体培養すると培養液中に北原
等の見い出した構造の多糖と同様の多糖が産生す
ることをUENO等スクレロチニア リベルチア
ナ（Sclerotinia libertiana）菌糸を（Agric.
Boil.Chem.，44(2)、353〜359、1980）がシユク
ロース、NaNO₃、MgSO₄・7H₂O、KH₂PO₄、
イーストエキスを含む培地中で中で24〜25℃で数
日間振盪培養した後の粘稠な培養液からメタノー
ル沈でん法によつて得ている。 上記多糖は通常スクレログルカンと称され（糖
質の化学上P95東京化学同人1986、７、１発行）
抗腫瘍活性を有している（フアルマシアレビユー
No.6P121日本薬学会）。 （発明が解決しようとする問題点） 上記菌核や培養液から多糖を分離採取する従来
の方法にあつては、菌核自体や培養液から移行す
る各種成分の除去に多くの煩雑な精製手段を要
し、実用面において解決されなければならない問
題が多く残されている。 （問題点を解決するための手段） この発明者らは、上記有用な多糖を容易に入手
する方法について鋭意研究した結果、キツネノワ
ンタケ科（Sclerotiniaceae）に属する機関保存
菌株であるスクレロチニア スクレロチオリウム
（Sclerotinia solerotiorum）IFO9395の培養菌糸
を窒素源、リン、カリ、マグネシウム等の通常微
生物の培養に必要な栄養成分を欠き、PHを酸性領
域とした糖質溶液に添加し、上記菌糸を糖質に酵
素的に作用させると溶液中に多量の多糖NSG―
１を生成することを知り、菌糸を除いた溶液にア
ルコールを加えるのみで殆んど純粋な多糖NSG
―１を得ることができたものであり、動物試験に
より抗腫瘍活性を確認でき、物理化学的試験によ
り、多糖NSG―１の構造が、前記スクレロチニ
ア リベルチアナの培養液から得られているβ―
（１→３）結合するＤ―グルコピラノシル残基３
ケごとに１ケのＤ―グルコピラノシル残基１ケの
分枝構造の多糖とはその構造を異にし、β―（１
→３）結合するＤ―グルコピラノシル残基２ケご
とにＣ―６に１ケのＤ―グルコピラノシル残基１
ケの分枝を有する構造の多糖であることが確認で
きた。 多糖NSG―１の生成に用いるキツネノワンタ
ケ科（Sclerotiniaceae）に属する菌株は、今関
六也、本郷次朗共著「原色日本菌類図鑑」（保育
社昭和54年発行）により子のう菌類
（Ascomycetes）、びようたけ目（Helotiales）、
キツネノワンタケ科（Sclerotiniaceae）に分類
され、同図鑑記載の特性を有するものであり、天
然から分離して純化、継代培養によりその形質を
保持しているもの或いは各種保存機関に在る保存
菌株等この発明の方法によつて、多糖NSG―１
を生成する能力を有する菌株である。 この発明は、前記のようにキツネノワンタケ科
（Sclerotiniaceae）に属するNSG―１生産性スク
レロチニア（Sclerotinia）属菌株の菌糸をグル
コース等の糖質に酵素的に作用させることによつ
て多糖NSG―１を生成せしめ、これを分離採取
することを特徴とするものであるが、キツネノワ
ンタケ科（Sclerotiniaceae）に属する菌株を用
いてかかる手法で多糖を生成せしめることは従来
知られていない。 いま、この発明に用いることができるキツネノ
ワンタケ科（Sclerotiniaceae）に属する菌株の
代表例として良好に多糖NSG―１の生成をもた
らしたスクレロチニア（Sclerotinia）属の保存
菌株であるスクレロチニア スクレロチオリウム
（Sclerotinia Sclerotiorum）IFO9395による多糖
NSG―１について説明する。 スクレロチニア スクレロチオリウム
（Sclerotinia sclerotiorum）IFO9395の保存斜面
から菌糸体を含む寒天培地切片（５×５×２mm）
２片を例えばイーストエキス0.3％、ベプトン１
％、グルコース２％を含む培地100mlに接種して
28℃で４日間振盪培養し、培養物を遠心分離して
菌糸体を分別する。この菌糸体を十分に洗浄して
培地成分を除去した後、再度遠心分離してこの全
量をフラスコに移し水を加えて全量400mlとなし、
均一な懸濁液の40ml宛を別に用意するグルコース
５ｇ、クエン酸、0.5ｇを含み予めPHを2.5〜6.0の
試験値に調整（NaOHによる）した糖質液60ml
宛を分注するフラスコ８本に夫々注加し、28℃で
４日間振盪又は撹拌下で保持せしめると、第１表
に示すように各調整PHに対応して溶液中に多糖を
生成する。 すなわち、28℃で４日間保持した後、内容物を
夫々遠心分離により菌糸体を分離液とに分別し、
分離液にエタノール50ml宛を添加すると沈でん物
を生成する。この沈でん物をエタノールで洗浄
後、真空乾燥すると白色綿状の物質を得る。 上記で得た白色綿状の物質は後述するようにグ
ルコースのみを構成糖とするβ―グルカンで、抗
腫瘍活性を有する多糖NSG―１（以下、多糖と略
することが多い）である。

【表】 第１表から初発PHを2.5〜6.0とした場合、生成
量の多僅はあるがいずれの場合にも多糖の生成が
認められ、初発PHを3.0〜4.5とするとき生成量が
顕著であり、特に3.4〜4.5の範囲が好ましいこと
を認める。 この発明は、上記のように通常、微生物の培養
に不可欠な窒素源やリン、カリ、マグネシウム等
無機成分を含まず、糖質としてグルコースのみを
含み、他にはPH調整のための僅少のクエン酸と
NaOHを含む糖質溶液に菌糸体を添加してグル
コースから多糖を生成せしめたものであるから、
培養による菌体外多糖産生とは明らかに生成機構
を異にするもので、菌糸体が糖質として用いたグ
ルコースに酵素的に作用したものと認めることが
できる。 かように、この発明においてはスクレロチニア
（Sclerotinia）属に属する菌を培養して得る菌糸
体を糖質に酵素的に作用せしめるものであり、糖
質としては、上記グルコースの他に各種糖類が使
用でき、例えば、アラビノース、キシロース、フ
ラクトース、マンノース、ガラクトース、マルト
ース、シユクロース、メリビオース、ラクトー
ス、ラフイノース等の単糖類ないし三糖類、フラ
クトオリゴ或はガラクトオリゴ等に代表される各
種オリゴ糖、デンプン、デキストリン、アラビア
ゴム等の高分子物質及びこれらの加水分解物、そ
の他グリセリン、マニトールのような多価アルコ
ール、或は用途によつてはシユクロース、グルコ
ース、フラクトース、ラフイノース等を含有する
甘藷或は甜菜糖密を挙げることができるが、好ま
しくはグルコース、フラクトース、シユクロース
等を使用するのがよい、また上に挙げた糖質は
夫々単独又は２種以上の混合で用いてよい。 糖質溶液の初発PHの調整には、通常クエン酸、
酒石酸、乳酸のような緩衝性の強い有機酸を用い
るが、塩酸、硫酸等の鉱酸のほか、緩衝液も使用
できる。更に第１表に見られるように時間の経過
につれてPH低下が認められるので、初発PH維持の
ため、中途において上記酸類によりPH調整を行つ
てもよい。 糖質と菌糸体の振盪又は撹拌による両者接触は
20〜30℃の範囲で２〜８日行うが、28±１℃、３
±１日がより好ましい。 尚、スクレロチニア（Sclerotinia）属に属す
る菌株の菌糸体は、培養後分離してただちに用い
ても、一旦凍結貯蔵したものを使用の都度解凍使
用してもよい。更に一度多糖生成に供した使用済
の菌糸体を新たに調製した糖質溶液に添加し多糖
生成に供することもでき、反復使用により糖質生
成量は若干減ずるが、少なくとも同一菌糸体を３
回の多糖生成に使用可能である。 次に、第１表において初発PH3.5にて得た多糖
NSG―１の組成及び糖構造について分析した結
果は次のとおりである。 (1) 組成分析、 全糖分 全窒素 灰分 95％以上 検出限度以下 検出限度以下 但し全糖分は、フエノール硫酸法により定量
し、グルコースとして示したもである。 (2) 構成糖、 三弗化酢酸（CF₃COOH）による加水分解物
を水素化ホウ素ナトリウム（NaBH₄）で還元
し、これのアルジトールアセテート誘導体をガ
スクロマトグラフイー分析した結果、グルコー
スのみを明確に検出し、フコース、キシロー
ス、マンノース、ガラクトース等の他の糖は検
出しない。 (3) 構成糖の結合様式 箱守法によるメチル化分析の結果は２，３，
４，６―テトラメチル―Ｏ―Ｄ―グリシトー
ル：２，４，６―トリメチル―Ｏ―Ｄ―グリシ
トール：２，４―ジメチル―Ｏ―Ｄ―グリシト
ールが1.0：0.9〜1.1：0.9〜1.1の比で得られる
ことから１→３結合Ｄ―グルコピラノシル残基
２個ごとに１→６結合Ｄ―グルコピラノシル残
基１ケの分枝を有するグルカンであることが知
られる。 (4) スミス分解生成物 完全スミス分解により、生成物としてグルコ
ースとグリセリンを検出し、緩和スミス分解物
の透析外液からグリセリンをそして内液の加水
分解液からグルコースのみを検出したことか
ら、１→３結合とＣ―６に分枝を有する構造の
グルカンであることが知られる。 (5) 赤外線吸収スペクトル 日立215型赤外線分光々度計を用いKBr法で
測定した結果は第１図のとおりで、波数880cm
^-1にβ―グリコシド結合配向に特徴的な吸収
（Ｐ）を認めることから、β―グリコシド結合
構造であることが認められる。 (6) ¹³C―NMRスペクトル 重ジメチルスルフオキシド（DMSC―d₆）に
溶解し、JEOL―FX200スペクトルメーターに
より60℃で測定した結果は第２図のとおりで、
δ値68ppm域のβ（１→６）結合に含まれるＣ
―６の炭素の帰属を含むシグナルS₁と、δ値
86ppm域のβ（１→３）結合に含まれるＣ―３
の炭素に帰属するシグナルS₂と、δ値103ppm
域のβ―結合のＣ―１の炭素に帰属するシグナ
ルS₃が特徴的に認められ、更にシグナルS₂が２
つのピークを示すことから、β（１→３）結合
が２個あり、β（１→６）が１個あるβ―グル
カン構造が知られる。 以上の検討結果から、この多糖はβ―１，３結
合のＤ―グルコピラノシル残基を主鎖としこのＤ
―グルコピラノシル残基２ケごとにβ―１，６結
合のグルコピラノシル残基１ケを分枝構造として
持つβ―グルカンであると認められ、以下の諸性
質を示す。 (イ) 元素分析値等 Ｃ：42.2〜44.0％、Ｈ：5.9〜6.2％、Ｎ：定
量限界以下、ハロゲン、硫黄は定量されない。 (ロ) 分子量 0.2モルNaOH／８モル尿素平衡セフアロー
スCL―4B（フアーマシア・ジヤパン）カラム
によるゲル濾過クロマトグラフイーにより分子
量の分布範囲が10⁶〜10⁷である。 (ハ) 融点 約230℃で黒色化熱分解する。 (ニ) 比旋光度 20℃における水中濃度0.1ｇ／100mlの〔α〕_D
が10±5゜を示す。 (ホ) 溶解性 水、アルカリ、ジメチルスルフオキシド
（DMSO）に易溶、エチルアルコール、メチル
アルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒
には不溶である。 (ヘ) 呈色反応 モーリツシユ反応、アンスロン硫酸反応、フ
エノール硫酸反応はいずれも陽性を呈し、ニン
ヒドリン反応、ビユーレツト反応が共に陰性で
あることから蛋白質、ペプチドの存在を示さな
い。 (ト) 水溶性の塩基性、酸性、中性の別 １％水溶液は中性域（PH６〜6.5）を示す。 この発明の方法で得る多糖は、上記した物理、
化学的諸性質を有するβ―グルカンで後述のよう
に抗腫瘍活性を示すことから、薬用として有用
で、かつ製法自体も極めて簡単であるから、この
発明によるときは、抗腫瘍活性多糖を安価に提供
するものであり、この多糖は腹腔内投与、静脈内
投与、腫瘍内投与及び経口投与として使用できる
ほか、各種態様での使用が期待できるものであ
る。以下この発明の製造方法とこれにより得る多
糖の薬理作用について具体的に説明する。 実施例 １ スクレロチニア スクレロチオリウム
（Sclerotinia sclerotiorum）IFO9395の継代培地
より５×５×２mmの切片２ケをイーストエキス
0.3％、ポリペプトン１％、グルコース２％を含
みオートクレーブ処理した培地50mlに接種した25
℃、１週間静置培養してこれを１次種菌とする。
次いで上記と同じ組成のオートクレーブ処理培地
100mlに一次種菌５mlを接種し、25℃、４日間振
盪培養してこれを二次種菌とする、次いで上記と
同じ組成の培地６を10容量のジヤーフアーメ
ンターに採り、これに上記二次種菌の２本分
（200ml）を加え、通気量３／min、28℃で３日
間培養して、培養液100ml当り、菌糸体乾物重量
423.2mgの培養物を得た。この内容物の全量を濾
紙（No.２）にて吸引濾過し水で十分に洗浄した
後、除水してこの全量を、10容量のジヤーフア
ーメンターに収容したグルコース５％、クエン酸
0.5％を含み5N―NaOHにてPH3.5に調整した糖質
溶液６に加え、通気量３／min、撹拌数
250rpm、温度28℃で40時間処理した後、内容物
を濾紙（No.２）にて吸引濾過、冷水で洗浄後、濾
液5.8にエタノール5.8を加えて沈でんを生成
せしめ、50〜100メツシユのナイロンネツトにて
濾過して得た沈でんを80〜90℃の温水１に溶解
し、冷却後エタノール１を加えて生成した沈で
んを80〜90℃の温水１に加えて20KHz、140W、
１時間の超音波処理のもとに溶解し、これを
3000r.p.m5分で遠心分離して得た分離液全量を凍
結乾燥して白色綿状の多糖1.972ｇを得た。 この多糖は先に説明した物理、化学的諸性質を
示した。 実施例 ２ 実施例１において、糖質の処理を終えて濾別し
た湿潤菌糸体を実施例１に示す糖質溶液６を収
容する10容量ジヤーフアーメンターに加え、通
気量３／min、撹拌数250r.p.m温度28℃で69時
間処理した後、内容物を濾紙（No.２）にて吸引濾
過、冷水洗浄後濾液5.9にエタノール5.9加え
て沈でんを生成せしめ、前記同様ナイロンネツト
にて濾過して得た沈でんを80〜90℃の温水１に
溶解し、冷却後エタノール１を加えて生成した
沈でんを80〜90℃の温水0.5に加えて超音波処
理のもとに溶解し、後は実施例１と同様に処理し
て白色綿状の多糖1.595ｇを得た。ここで得た多
糖も実施例１と同様の性質を示した。 実施例 ３ 実施例２において、糖質の処理を終えて濾別
し、其の後凍結保存した菌糸体を用い糖質の処理
時間を120時間としたほかは実施例２と同様に処
理して白色綿状の多糖0.830ｇを得た。 試験例 １ 実施例１にて得た多糖について、その薬理作用
について試験した。 IRC―系６週令のマウス（雄、体重27〜30ｇ）
10匹を１群として、同種移植腫瘍サルコーマ180
腫瘍細胞５×10⁶ケをそけい部皮下に移植し、そ
の翌日より生理食塩水に溶解した上記多糖と種々
投与方法及び経路で投与し、移植５週間に腫瘍を
摘出してその重量を測定し、生理食塩水のみを投
与した対照群との比較を行い第２表の結果を得
た。

【表】

【表】 第２表から判明する如く、いずれの投与経路に
よつても高い抑止効果が認められ、特に経口投与
により50％以上の抑止率を認めたことはこの発明
の多糖の大きな特徴である。 試験例 ２ 実施例１にて得た多糖について同系移植腫瘍
Meth Ａ繊維肉腫及び乳ガンMM46に対する活性
を試験した結果第３表の如くで同系腫瘍に対して
も抗腫瘍活性を認めた。

【表】 （発明の効果） この発明の方法によるときは、煩雑な精製手段
を用いることなくきわめて容易に純良な製品とし
て収得できるので安価に量産をもたらし、収得し
た多糖は各種腫瘍に対し抗腫瘍活性を示し、使用
に当つては注射による投与のほか経口による投与
も可能とするもので、各種剤形で使用でき薬剤と
してきわめて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の多糖の赤外線吸収スペクト
ルを示し、第２図は同多糖のジメチルスルフオキ
シド中における ¹³C―NMRスペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スクレロチニア（Sclerotinia）属に属する
   下記物理化学的性質を有し、β―１，３結合のＤ
   ―グルコピラノシル残基を主鎖としこのＤ―グル
   コピラノシル残基２ケごとにβ―１，６結合のグ
   ルコピラノシル残基１ケを分枝構造として持つ多
   糖NSG―１生産菌株を培養し、得られた培養菌
   体を、糖質含有溶液中でインキユベーシヨンし、
   多糖NSG―１を生成せしめ、反応液から多糖
   NSG―１を採取することを特徴とする多糖NSG
   ―１の製造方法。 (1) 赤外線吸収スペクトル（KBr法） 波数880cm^-1にβ―グリコシド結合配向に特
   徴的な吸収（Ｐ）がある。 (2) ¹³C―NMRスペクトル（DMSO―d₆中） δ値68ppm域のβ（１→６）結合に含まれる
   Ｃ―６の炭素の帰属を含むシグナルS₁、δ値
   86ppm域のβ（１→３）結合に含まれるＣ―３
   の炭素に帰属する２ケのピークを示すシグナル
   S₂、δ値103ppm域のβ結合のＣ―１の炭素に
   帰属するシグナルS₃の特徴的なシグナルがあ
   る。 (3) 元素分析値：C42.2〜44.0％、H5.9〜6.2％、
   Ｎ定量限界以下。 (4) 分子量（ゲル濾過法）：10⁶〜10⁷範囲。 (5) 融点 約230℃で黒色化熱分解。 (6) 比旋光度：〔α〕_D10±5゜（Ｃ＝0.1，H₂O）。 (7) 溶解性：水、アルカリ、ジメチルスルフオキ
   シドに易溶。エチルアルコール、メチルアルコ
   ール、エーテル、アセトン等の有機溶剤に不
   溶。 (8) 呈色反応：モーリツシユ反応、アンスロン硫
   酸反応、フエノール硫酸反応が陽性。ニンヒド
   リン反応、ビユーレツト反応が陰性。 (9) 水溶液の塩基性、酸性、中性の別 １％水溶液は中性域（PH６〜6.5）を示す。 ２ 多糖NSG―１生産菌株がスクレロチニア
   スクレロチオリウム（Sclerotinia sclerotiorum）
   IFO 9395である特許請求の範囲第１項記載の多
   糖NSG―１の製造方法。