JPH023662A - ホスホリパーゼ基質、およびホスホリパーゼを光学的に定量する方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ホスホリパーゼ基質、およびホスホリパーゼ
を光学的に定量する方法および試薬に関する。

従来の技術 ホスホリパーゼは、ａｎ−３−ホスホグリセリドの加水
分解に触媒作用する。

基質が水浴液中”でミセルを形成し、かつ＃木が脂負−
水界面に作用する。

殊に重要である一連のホスホリパーゼ、とりわけＰＬ　
ＣおよびＰＬＡ２（これらは人体の最も検査されるＰＬ
である）が公知である。特定の疾患、例えば膵臓炎、感
染症、自己免＆扶息、アレルギーの場合、血ａｈよび他
の体液中のＰＬ　Ａ２　咲度が増大する。従って、ＰＬ
Ａ２活性の画定が診断学的に極めてｍ喪である。

最近、ＰＬＯ，とくにまたホスファティゾル−イノシト
ール固有のＰＬ　Ｃ＝　ＰＩナーセ゛が益々１、安住を
増した。ｉＡ節糸であるホス７アテイゾルーイノシツト
が多数の研冗集−により集中的に研究されている。さら
にまたＰＬ　Ｏは、換結合蛋白員が剥離する際の役ａｔ
＋’を来す。

またＰＬＡ２は若干の蛇毒（コブラ、がうがラヘビ）に
も含■され曵いて、大きい製置は致命的である。ＰＬ　
Ａ２は消化酵素に数えられ、かつその測定か、臨床化学
だけでなく、生化学、製薬化学かよひ食品化学において
も大きい役割を果すＣＧ、Ｅ、ホフマｙ　（Ｈ＋）ｆｆ
ｆｎａｎｎ　）、デーチーφｒス拳エフ・クリ７・クム
・ニー・７アウ（Ｄｃ、　Ｇａｓ、　ｆ、　Ｋｇｎ、　
Ｃｈｅｍ、　ｅ、　Ｖ、　）報告第４巻、１９６頁（８
６年）〕。

すでに、多数のホスホリパーゼ測定法、例えば、ニス・
チル分解に際し遊離せる脂肪酸の滴定による定量〔フイ
がレラ（Ｆｉｇａｒｅｌｌａ　）　、スカンド・ジエイ
・がストロエンド（８ｃａｎｄ、　Ｊ＊ｏａｓｉｒｏｅ
ｎｃ、　）第６巻、１６３頁（７１年）〕筐たは放射能
ｍａ１．せる遊離脂肪酸の測定〔シエキーア（８ｈａｋ
ｉｒ　）、アナル・ビオケＡ　（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　ｉＲｇ４巻、６４ｍ！（８１年
）〕が公知である。しかし、これら方法は常用目的には
極めて費用がかかりかつ故障し易い。

さらに、側光法による定量法が公知である：ａ）ヘンド
リクソン（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ　）、ジエイ・すｅ
ド・レス（Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、　）　ｅＫ　２
４巻、１５３２頁（８３年）、 ｂ）ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ　）、デヘーテーーｒ
ス・エフ・クリン串ケム（０％、　Ｇａｓ、　ｆ。

Ｋｇｎ、　Ｃｈｅｍ、　）　梠告第４巷、２０１頁（８
６年）。

ａ）について： この方法は、−８Ｒ基の分触とそのＤＴＮＢ　ｔ−使用
する画定に基づくが、感度不良であると判明した。

ｂ）について： 和元社（Ｆａ　、Ｗａｋｏ、　Ｊａｐａｎ　）による脂
肪酸の全＃木的測定法は費用がかかりかつ極めて故障し
易い（多数のｔペット測定工程）。

ＮＥＦＡ−Ｃ−試験 ’！７１ｃ、基負としての螢光性ホスホリピドが公知で
ある〔トクーレン（Ｔｈｕｒｅｎ　）、　タリノ・ケＡ
　（Ｃｇｎ、　Ｃｈｅｍ、　）　ｔｉｐ、　３１巻、７
１４頁（８５年）〕。とりわけこの方法は極めて故障し
易く、かつ螢元画定装−の備えられている実験室は極め
てわずかである。

また公知であるのが、ＰＬＡの免役学的測定法である： 放射線免役アッセイ：西Ｊｇ１　（Ｎｉｓｈｉ３ｉｍａ
　）、ジエイ・ピオケム（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）
第９４巻、１３７真（８６年）、および螢元免役アッセ
イ：ニスコラ（Ｅｓｋｏｌａ　）、クリンーケＡ　（Ｃ
１ｌｎ。

Ｃｈｅｍ、　）第２９巻、１７７７頁（８３年）は、感
度の点で十分であるが、但し活性のホスホリパーゼＡｊ
？よびその不活性の前駆体間を区別することができない
。

ホスホリパーゼＣの定量にはわずかな方法が公知である
にすぎない。従って公知であるのは、基質を、補酵素と
してリパーゼを有するＰＬ　Ｏにより分解することによ
りグリセリンを遊離させ、かつその後にこの遊離せるグ
リセリンの全＃素法による定量を実施することである〔
グアーレフエルト・イン・ベルブマイヤー （Ｗａｈｌｅｆｅｌｄ　ｉｎ　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　）
　：　　メトーデンーデル・エンツイｉテイツシエンｅ
アナリーゼ（Ｍｅｚｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｅｎｚｙｍａ
ｃｉｓｃｈｓｎ　Ａｎａｌｙｓｅ　）、第３版、第１巻
、１９７Ｂ頁、クエルラーク会ヒエーミー・ヴアインハ
イム（Ｖｅｒｌａｇ　ＣｈｓｍｉｅＷｅｉｎｈｅｌｍ　
）　　１９７４年〕。しかし、この方法は極め℃故障し
易くかつ時間がかかる。

さらに、放射能＊ｍされ九基寅を使用することによるＰ
Ｌ　Ｃの定量が発光されている〔ワク（Ｗａｋｕ　）、
ゾエイ・ビオケム（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、）第７２巻
、１４９頁（７２年）〕。しかしながら、この方法Ｆｉ
煩雑かつ感度不良である。

従って、簡単な装置で実施されかつ直接に可視的に制御
されることのできる比色定量法が必要である。

発明が解決しようとするｖＪＡｍ 従って、本発明の根底をなす課題は、基質および、この
基質の使用下にホスホリパーゼを定量するための、公知
の測定法の欠点を有せず、正確な結果が得られ、操作が
簡単であり、高い感度を有し、かつわずかな遅蝙工程を
有するにすぎず、従って槍々の自動分析装置への適用が
容易である方法をつくり出すことである。

腺Ｍ１を解決するための手段 本発明によれはこの課題が、−１式： ％式％ 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜１６を有するアル中しンーま九はアル
ケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜２０ｔ−有するアル中ルー、
アルケニル−またはアシル基、またはアルキル基中の炭
素原子数１〜８ｔ−有する、場合によりアル中ルｇｇ％
されたアリール−ま九はアルアルキル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−ま７’？はチオール化合物、お
よびそれぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−ま７’（は−〇
− が水素原子または基：　（ＣＨ２）ｎＮＲ二（式中ｎが
２〜４の数およびＲ２がＨまたＦｉＣＨ，を表わす）、
またはイノシトール、まｆｃはセＩＪン−Ｃ）１２−Ｏ
Ｈ−ＣＯ２−ＨｔたはグリセリンであることがシＨ２ できる〕のホスホリパーゼ基買に上り解決される。

ホスホリパーゼが作用した際に、本発明によるホスホリ
パーゼ基質が基Ｘに相応する芳香族ヒドロ卑シーま九は
チオール化合物の遊離下に分解され、これら化合物は直
接に光学的に定量されるか、または過当な発色−または
螢光体とカップリングさせかっこのカップリング生成物
を測定するかまｆｃは場合にょ９袖＃木を添加した後に
測定する。

Ｒは、有利にＣ原子数６〜２０．殊に有利にＣ原子数１
２〜１８を有する。意外にも判明したのは、天然の基質
がアシル基を有するにせよ、Ｒ＝アルキル、アルケニル
またはアルアルキルを有する化合物が良好なホスホリパ
ーゼ基質であることである。

只の例は、アルキル基としてメチル−、エチル−ゾロぎ
ルー、ブチル−、ペンチル−、ヘヤシルー、ヘプチル−
、オクチル−、ノニル−デシル−クンデシル−ドデシル
−、テトラデシル−、ヘキサデシル−およびオクタデシ
ル基、並ひに相応するアシル基、例えは、アセテルー、
プロピオニル−、ブチリル−、バレリル−カプロニル−
ｆＪ　ｆ　リルー　カフ’　ＩＪニルラクリルー　ミリ
スチル−、バルミチルーおよびステアリル基、オレイル
−クロトニルリノリル基、フェニル−、ペンシル−また
はオクチルフェール基である。

さらに本発明によるホスホリパーゼ基質は、ジカルボン
酸の基：　Ｃ００Ｈ−Ａ−ＣＯＯＨＣ式中、Ａは有利に
Ｃ原子数３〜７を有する〕を含有する。

Ａが紡導される酸の例は、マロン酸、コハク酸、グルタ
ル酸、アジピン酸、ピメリン酸、コルク酸、アゼライン
酸、セバシン酸、ノナンジカルボン酸、デカンジカルボ
ン酸およびクンデカンジカルボン酸である。有利なのが
、グルタル酸からアゼライン酸までの酸である。Ｃｙｉ
Ｌ子数４重数４以上るＡＫは、補＃素の添加が推奨され
る。

Ｘは、発色団であるかまたは差当り逐次反応により色素
に変換されることのできる芳香族ヒドロキシ−またはチ
オール化合物であればよい。

代六例が、フェノール、チオフェノール、ナフトール、
チオナフトールおよびそれらの誘導体、並ひに自体発色
性の化合物、例えば、レゾルフィン−クロルフェノール
レッド−、インドキシル−ま次はチオフルオレセイン基
である。過当なヒドロキシ−まｆＣはチオール化合物を
全て列挙することはそれらが多数であることにより不可
症である、しかしながら当業者には、直接に発色性の、
または発色団に変換可能な芳香族ヒドロキシ−またはチ
オール化合物が公知であるＯ 一般式（１）ないしは（Ｉｔ）の化合物として有利なの
が、 １−０−オクタデシル−２−グルタル酸−メチルレズル
フインエステル−８ｎ−グリセロ−３−ホスホ；リン、 １−ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−ｐ−二トロフ
ェニルエステルーｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、 １−０−ドデシル−２−グルタル酸−ニトロフェニルエ
ステル−ｒａｃ−グリセロ−６−サルフェート、 １−０−ドデシル−２−アジピン酸−ニトロフェニルエ
メテルーｒａｃ−グリセロ−３−サルフェートおよび／
ｌたは １−０−へ＝？′ｙ″デシルー２−グルタル酸−ニトロ
ツエニルエステルーｒａｃ−グリセロ−３−？ルフエー
ト・である。

色素を得るための繭記逐次反応は、直接のカップリング
〔例えば、４−クロル−２−メチルベンゾールジアゾニ
クム塩（ファスト・レッド）、４−ベンズアミド−２−
メト中シー５−メチルベンゾールージアゾニウム塩（フ
ァスト・バイオレット）、ジアゾ化スルファニル酸、２
，４−および２　、５−＠換フエニルジアゾニウム塩、
ＰＪｔｔｆ２．４−ゾクロルフェニルゾアゾニクムー１
．５−ナフタリン−ジスルホン酸のようなジアゾニウム
塩との〕によるか、または例えば４−アミノアンチピリ
ンまたは他のアミノピラゾロン（例えば、トリメチルア
ミノピラゾロン、ジアミノアンチオリン）またはＭＢＴ
Ｈ８（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン−ヒドラゾ
ン−６−スルホン［）との酸化形カップリングにより行
なわれることができる。

有利な発色団は、わずかな極性を１しかつ親油性である
ものである。しかしながらこの場合さらに水蔭性が９４
Ａ！［Ｉｌｌ、されなけれはならない。

前記発色団の親油特性は、過当な置換基により、例えは
アルキル基で有利に調節ちれることができる。レゾルフ
ィン基に適当な置換基として判明し九のが、とりわけメ
チル−、ジメチル−およびエチル基であり、並びに臭素
原子による置換が適当である。

本発明による化合物は新規である。これらは、不整中心
を有しかつ従つ℃光学的に活性である。

ホスホリパーゼ基質として、常用の製造法で生じるラセ
ミ化合物もまた光学的異性体も使用されることができる
。しかしながら、有利なのが光学異性体である。

本発明によるホスホリパーゼ基質の製造は自体公知の方
法により行なわれることができる。

従って適当であると判明したのが、例えは、メンツヅ・
イン・エンチモロジ−（Ｍｅｃｈｏｄａ　ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　）　第９８巻、６２３１（１９８！を年
）およびビオキム・ビオフイズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｚａ　）　８４６６６巻
、２３０頁（８１年）に記載され℃いるニーチル−グリ
セロ−およびアシル−グリセロ−ホスホコリンの合成法
である。サルフェートの合成が、例えばパイルシュタイ
ン（Ｂａ１ｌｓｚｅｉｎ　）第２巻、ＥＩＩ、３５６頁
に記載されている。

この場合、記載された１−アル中ルーないしＦｉｌ−ア
シル−３−０−）リテルーグリセリン化合物から出発し
、相応する無水ジカルボン酸と水不含の媒体、例えはク
ロロホルム／ピリジン中で反応させることにより、相応
するグリセロジカルボン酸−モノエステルが得られる。

無水ジカルボン酸の適当な製造法が、ホウペンーグエイ
ルーミュラー（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ−ＭＭｌｌｅｒ
　）の”メトーデン・デル・オルがニラフェン・ヒエ　
ミ　−　”　（Ｍｅｚｈｏｄｅｎ　　ｄｓｒ　　ｏｒｇ
ａｎｉａｃｈｅｎ　　Ｃｈｅｍｉｅ）第１Ｖ／４巻、７
８６頁に記載されている。

３−０−　）　ＩＪチル基の代りに、他の保護基、例え
ばベンジル−も使用されることができる。

例えは、基Ｘを篩尋する芳香族ヒドロキシ−またはチオ
ール化合物を使用するモノエステルのエステル化が、ジ
カルボン酸モノエステルと芳香族アルー−ルまたはチオ
ールとを水抽出剤、例えはジシクロへΦジルカルボシイ
ミドの存在において直接に反応させることにより実施さ
れることができる。選択的に、ジカルボン酸モノエステ
ルが差当り活性形エステル、例えばヒドロヤシスクシン
イミドエステルまたはイミダゾリドへ変換され、かつそ
の後にこの活性形エステルが芳香族アルコールま六はチ
オールと反応される。

また同じく可能であるのが、差当りジカルボン酸と芳香
族アルコールまたはチオールとのモノエステル、例えば
、アシｔ：／酸−モノニトロ７　工＝　ルｘ　スｆ　Ａ
／　ｔ　ｆｔ　ｔｒｉ　／’ルタル酸七ノ７工二ルエス
テルを製造し、かつその後にこれをアル中ルーないしは
−アシルグリセリンで、例えば酸クロリド、−無水物ま
たは活性形エステルの中間的形成を経てエステル化する
ことである。

例えば、芳香族アルコールまたはチオールを使用するジ
カルボン酸モノエステルの製造ハ、酸無水物および芳香
族化合物（モル比１：１）から、ｔたはジカルボン酸お
よび芳香族化合物（モル比２：１）から、または易離脱
性の保護基を有するジカルボン酸モノエステルおよび芳
香族化合物から行なわれることができる。適当な方法が
、例えばアーク・ファーム（Ａｒｃｈ。

Ｐｈａｒｍ、）第２８７巻、５１４頁（１９５４年）に
記載されている。

選択的に、１−Ｏ−アル中ルーないしは１−０−７−／
＃−３−０−）リテルグリセロージヵルポン酸モノエス
テルが、差当リゾカルボン酸モノエステルをジカルボン
酸および易離脱性のアルコール、例えばベンジルアルコ
ールま九は２　、２　、２−　）　リクロルエチルアル
コールカラ製造し、かつその後にこうして得られた酸を
前記アル中ルーないしはアシル−３−０−トリチル−グ
リセリンでエステル化することによっても製造されるこ
とができる。引続ぎ保護基を除去し、かつ芳香族アルコ
ールまたはチオールとの反応を前記のように実施する。

その後に前記生成物において、保り基を離脱δせかつＣ
−３−ＯＨ位置をサルフェート化またはホスホリル化す
る。

もう１つの製造法は、差当シ保護されたグリセリン、例
えば１．２−インプロピリデングリセリンとジカルボン
酸モノエステルとを相応する保論されたグリセロ−３−
ジカルボン酸ゾエステルの形成下に反応させ、その後に
グリセリンの保護基を除去しかつ遊離せる１−ＯＨ基お
よび遊離せる２−ＯＨ基をアルキル化ないしはアシル化
することである。最後に、差当り導入された七ノエステ
ル基（カルボ中シル保謙基）を離脱させかつ芳香族アル
コールまたはチオールと反応させる。Ｃ−１−ＯＨの保
護基を離脱した後、ホスフェート化またはサルフェート
化する。

さらに、所望の基質が、相応するリゾ化合物（例工ば１
−アル中ルーグリセロー３−サルフェート）から出発し
、例えば活性化され次シカＡ／ホン酸モノエステルと反
応δせることによシ製造されることができる。

本発明による基質の前記製造は全てではなく、かつ当業
者に使用される他の一連の公知方法がそれぞれの本発明
による化合物を直接に喪遺することを可能にする。所望
の場合には、前述の方法により得られたラセミ生成物か
ら、公知の分離法により純粋な光学異性体が得られるこ
とができる。しかしまた同じくこれら異性体は、同じく
自体公知の方法による立体特異性に進行する合成によっ
ても得られることができる。

ホスホリパーゼを光学的に定論するための本発明による
方法は、本発明によるホスホリパーゼ基質に、ホスホリ
パーゼを含有する被検体を作用させ、かつ遊離せる芳香
族ヒドロキシ−またはチオール化合物のｍｔ−直接に、
または適当な発色体とカッブリングした後これによシ形
成逼れた色相を光学的に測定することを特徴とする。場
合によシ、１鴇または２糧の補＃木の添加が心安である
。

本発明のもう１つの目的は、ホスホリパーゼ１に光学的
に定量するための簡単かつ良保存性の試薬に関し、この
ものは本発明によるホスホリパーゼ基質および後衛剤と
ともに、表面活性剤、例えはとくに胆汁飯、発色性カッ
プラーンよび／または塩、例えば塩化カルシウムをも含
有する。さらにこの試薬は、有利に保存剤および・／ま
たは活性化剤を含有してもよい。

有利な組成の場合、この試薬は、それぞれ使用準備ので
きた、試薬としての耐液に対し、基質０．０５〜１０ダ
／成、有利に０．５〜１０即／ａ＆。

胆汁酸２〜５０■／創、 塩化カルシウム（活性剤）０．５〜１０ｍＭ／ｇ弐面活
性剤２０〜２５０吐／ｌ。

緩衝剤２０〜２５０　ｍＭ／１ を含有する。

胆汁酸基の表面活性剤として挙げられるのがコール酸、
シクロコール酸、デスオ中シコール酸、タフロデスオキ
シコール酸、グリコデスオ印シコール酸ないしはそれら
のアルカリ金属塩、とくにナトリウム塩である。有利な
量が０．５〜１．５ｍＭ／ｊである。選択的ま九は付加
的に、この試薬は１楕ま７？、はそれ以上の非イオン性
表面活性剤を含有してもよい。

表面活性剤として、イオン性のまた非イオン性の表面活
性剤が使用されることができる。有利に使用されるのが
、非イオン性弐面活性剤、例えばトライトン（Ｔｒｔｚ
ｏｎ”　：アル中ルア１７−ルボリエーテル）である。

殊に過当な濃度範囲が０〜１０Ｉｌ／ｌである。殊に有
利に使用される濃度範囲が１〜５９／ｌである。

緩衝剤として過当なのが、本発明による試薬の範囲内で
一価を６．０〜１０．５に調節することのできる後衛剤
である。有利な一価範囲が７．０〜９．５である。過当
な＊爾剤の例が、ジェタノールアミン緩衝剤、トリエタ
ノールアミン緩衝剤、トリス緩衝剤および良Ｖ＆衝剤、
例えば、ヘグス緩函剤（凍結乾燥前の添加に好適）、タ
ラジス緩衝剤、ＣＨＥ８後衛剤後衛−（シクロヘキシル
アミノ）−二タンスルホンｉ＊）ｅよぴバイシン（Ｂｉ
ｃｉｎｅ　）　　である。殊に有利なのがトリス緩衝剤
である。有利な後責剤輩が２０〜２５０ｍＭ　／　ｌで
ある。

本発明の範囲内で保存剤とじ℃使用されるのが、測定す
べきホスホリパーゼの酵素活性に不利に作用しないもの
である。殊に適当なのが、アルカリ金属アシド、とくに
ナトリ９ムアジドである。しかしながら、他の保存剤、
例えばチオシトおよび他の硫黄含有保存剤も同じく適当
である。有利な保存剤量が０．００１〜２１Ｒｇ／継で
ある。

活性剤として適当なのが、アルカリ出金属イオン、有利
にカルシウムイオンである。このものはデスオ孝シコー
ル酸とともに不溶性の化合物を形成するので、カルシウ
ムが存在する場合には胆汁酸としてタクロデスオキシコ
ール酸が有利である、それというのもこのものが１〜５
ｍモルの範囲内の大きいカルシウム＠腿を許容するから
である。

本発明による試薬が□、最終的な組成物に希釈するため
に特定の、乾燥まｆｃは濃縮せる形で使用される場合、
このものは前記成分を相応する量比で、並ひに有利に保
護コロイド中に含有する。

保賎コロイドとして挙げられるのが、当業者に公知の物
質、例えば、ポリヒドロキシ化合物、血漿アルブミン、
ポリビニルぎロリドン、固体ポリエチレンオキシド等で
ある。有利なのが、ポリヒドロキシ化合物、とくに１分
子中のペントース−ないしはへΦソース単位数１〜１０
を有するペントースまたはへキソースモノマーまたはポ
リマー、および／または室温で固体のポリエチレングリ
コールである。適当なポリヒドロキン化合物の有利な例
が、マンニットおよび類似の糖アルコール、ダルコース
のオリゴブツカライド、マンノース、マルトヘプタオー
ス、平均分子１ｔ３５００〜７０００を有するポリエチ
レングリコール等である。他の使用可能な保賎コロイド
は、例えば、アミノ酸、例えばアラニン、植物ゴム、例
えはアラビアゴム等である。

保賎コロイドないしは保賎コロイドの混合物の有利な菫
が２０〜９０に振力である。殊に適当であると判明した
のが、糖アルコールとポリアルキレングリコールとの混
合物である。

また本発明による試薬は、適当なキャリヤ材料に含浸さ
れて存在してもよい。挙げられるのが、吸収性のキャリ
ヤ材料、また膨潤性、可溶性のフィルム形成性印ヤリャ
材料である。この形で、本発明による試薬は試験ストリ
ップの製造が可能であり、このものは直接可視的に、ま
たは適当な測定装置を使用し評価されることができる。

ホスホリパーゼを定量するための本発明による呈色試薬
は、高い感度で極め曵正確な結果が得られる。操作が極
めて簡単であり、かつ試験ス）　ＩＪツブとしても適当
である。極めてわずかな遅延工８を有するにすぎないか
ま次はこれを全く有しないので、本発明による試薬は檀
々の自動分析装置に直接に適合されることができる。

定量自体は、終点測定としてもまた動的測定としても実
施されることができる。多数の公知の方法と比べ、動的
に実施可能である利点は、停止もまた形成され九反応生
成物の振とり抽出も実施される心安がないことである。

実施例 以下に、本発明を実施例につぎ詳説する。

例１ １−０−オクタデシル−２−グルタル酸−ｐ−二トロフ
ェニルエステルーａｎ−りＩＪ七クロー３ホスホコリン ａ）ｊ−０−オクタデシル−２−グルタル酸−８ｎ−グ
リセロ−６−ホスホコリン １−０−オクタデシル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リンｉｙ、無水グルタル酸０．７３，９゜ジメチルアミ
ノビリジン０．２．１−、ビリシン３０紅中で７０時間
５０℃に加熱する。その後に１！！ｒ剤を蒸発させ、か
つ残渣′ｆｒＬＨ２０（浴離剤：クロロホルム／メタノ
ール１：１）上でクロマトグラフ鴛処理する。引続ぎＲ
Ｐ　１　ｓ　（展開剤：インプロパノール／水９：１）
上でクロマトグラフ処理する。

牧童：　０．８７　＆ ＤＣ：　ｌ）（Ｒ，ｌ　＝　０．２６　Ｃ，シリカゲル
；メタノール） 噴霧試薬：ヘインズーイシャーウッド試薬（Ｈａｎｅｓ
−Ｉｓｈｅｒｖｏｏｄ−Ｒｅａｇｅｎｚ）ｌＨ−ＮＭＲ
（ＣＤＣ１３）　’　ａ［ｐｐｍ〕’　０−８７（Ｚ−
３）１）　ｓｌ　−２６（ｍ＝　３２）１）　ｓ　ｇ−
９０（，２１（）　：　２．４０（ｍ、４Ｈ）ｐ　３−
３−１−３−６（１３Ｈ）　１３−３−７８（２Ｈ）　
ｐ　４４−０２（、２１（）　；　４．２５（ｍ、　２
Ｈ）　；　５−５−１８（ＩＨ）。

ｂ）１−ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニト
ロフェニルエステル−５ｎ−グ！Ｊセロ−６−ホスホコ
リン １ａ）の化合物３１０ＩｎＧＩを水／テトラヒドロ７ラ
ン１：１より成る混合物に浴解し、かつｐ−二トロフェ
ノール７０１ｎ９、Ｎ−エチルーゾージメチルアミノグ
ロ曾ルカルボジイミド４８０■を混合する。引続ｔ！４
０時間６０℃で攪拌する。

溶剤を蒸発させた後、ＲＰ　１８　（浴離剤：インプロ
パノール／水８：２）上でクロマトグラフ処理する。

ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ　＝０．２Ｉ　Ｃ，ＲＰ　１８　；
イソプロパツール／水８：２） ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　’　　Ｊ［ｐｐ！ｎ〕：
　ｏ、５ａ（ｔ＄　３Ｈ）　ｐｌ　、２５（ｍ、３２Ｈ
）；　　２．０４（ｍ、２Ｈ）；　　２．２−２．８＜
ｍ。

４Ｈ）：　　３．１−３．６（ｍ、１３Ｈ）；　　３．
８０（ｍ、２Ｈ）；３．９６（ｍｌ　　２Ｈ）；　　４
．２８（ｍ、２Ｈ）；　　５．１５（ｍ、１′Ｈ）；　
　７．３０（ｄ、２Ｈ）；　　８．２６（ｄ、２Ｈ）。

例２ ｌ−ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−メチルレゾル
フィンエステル−８ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン 衣記化合物を、１ｂ）と類似に、１＆）の化合物６１ｍ
９、水／テトラヒドロフラン（１：１）１０都、４−メ
チルレゾルフィンｇ０ｇ１！７、Ｎ−エチルーゾーゾメ
チルアミノプロｔルカルボジイミド４８〜から製造する
。

ＤＣ：　１月Ｒ５１＝［１，２０（Ｒｐ　１８　；イソ
プロパツール／水８：２） ｌＨ−ＮＭＲ（ｄ　４−Ｍｅ　ｃｈａｎｏ　ｌ　）　：
δ［ｐｐｍ）　：　０．９０（ｚ、３Ｈ）ｙ　　１．２
８（ｍ、３２Ｈ）ｐ　１．９２（ｍ、２Ｈ）；　　２．
１６　（ｓ。

３Ｈ）　；　２．４４（ｍ、　４Ｈ）　；　３．５１（
ｍ、　２）１）　；　３．６９（ｍ、　ｇＨ）　；　４
．００（ｍｌ　２Ｈ）　；　４−４−２９（２Ｈ）　；
４．４７（ｍ、　２）ｉ）　；　５．２（ｍ、ＩＨ）　
；　６．７−７．９（ｍ、５Ｈ）。

例３ １−０−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニトロフェニ
ルエステル−グリセロ−３−？ルフェート ａ）１−０−ドデシル−２−グルタル＃−３−０−トリ
チルーグリセリン １−０−ドデシル−３−０−トリチル−グリセリン２０
，ｇ１　、無水グルタル酸９．２ｇおよびジメチルアミ
ノｔリシン０．４．９　ｔ−、ピリジン１００Ｉｌｔ中
で８時間５０’Ｏに加熱する。溶剤を蒸発させ、残渣を
酢酸エステルにとり、かつ０．０５　Ｎ塩酸で掘とりす
る。酢酸エステル相を硫酸ナトリクム上で乾燥し良後、
溶剤を蒸発させ、かつ残ａｔ″シリカゾル（展開剤：酢
酸エステル／石油エーテル１　：４）でクロマトグラフ
処理する。

収Ｊｌ：１４ＩＩ ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ　＝　０．２０　（シリカゲル；酢
酸エステル／石油エーテル１：１） ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：ａ［ｐｐＪｎ〕：　０
−８８（Ｃ２３Ｈ）　ｓｌ１−２５（，２０Ｈ）；　　
１．９９（ｑ、２Ｈ）ｐ　　２．４３（ｃ、４Ｈ）；　
　３−３−１５−３−４５（４１（）；　　３．５９（
ｄ、２Ｈ）；　５．２２（ｍ、ＩＨ）ｓ　　７７−３（
＋　　１５Ｈ）。

ｂ）１−０−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニトロフ
ェニルエステル−３−０−ト１７　？ルーグリセリン ３ａ）ｏ化合物８．６＆？クロロホルム１５０μにｂ解
し、かつ（臓次にニトロフェノール１．９４Ｉおよびジ
シクロへ中ジルカルボジイミド１４．４．９を添加する
。室温で１２時間攪拌した後、沈殿物を濾別しかつ濾液
を蒸発濃縮する。

残渣をシリカゲル（溶離剤：酢酸エステル／石油エーテ
ル１　：４）でクロマトグラフ処理する。

収振：８．ＢＩＩ ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ　＝　０．４２　（シリカｒル；ｒ
ｎ＃Ｉ！ステル／石油エーテル１：４） ｌＨＮＭＲ（”ＤＣ１３）　’　ｊ’［”ｐｐｍ〕’　
０−８８（ｃ＊　３Ｈ）ｙｌ、２５（ｍ、　２０Ｈ）　
；　２．１２（ｑ、　２）１）　；　２．５５（ｔ、＃
２Ｈ）　；　２．７１（ｔ、　２Ｈ）　；　３．２−３
．５（ｍ、　４Ｂ）　；３．５９（ｄ、　２Ｈ）　；　
５−５−２８（ＩＨ）　；　７．１８（ｄ、２Ｈ）；７
．３０（ｍ＝　　１５）１）　　ｓ　　８．２［］（ｄ
−２Ｈ）　　。

ｃ）１−０−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−二トロフ
ェニルエステルーグリセリン ３ｂ）の化合物６ｇを石油エーテルに溶解し、かつ硼酸
で処理したシリカゾルへ引上げる。生成物を石油エーテ
ル／酢酸エステル８：２で下方へ洗浄する。

収ｔ：２．７＆ ＤＣ：　ＩＨＲ，Ｉ　＝　０．２１　（シリカゾル；ク
ロロホルム／アセトン４９：１） ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）　：　ａ（ｐｐｍ：Ｉ　：
　０．８７（ｚ、　３Ｈ）　；１．２５（ｍ、　２０Ｈ
）　；　２．１０（ｍ、　２Ｈ）　；　２．５３（ｔ、
２ａ）；　２．７１（ｕ、　２Ｈ）　；　３．４５（ｔ
、、　２Ｈ）　；　３．６３（ｄ１２Ｈ）　ｐ　３．８
２（ｄ、２Ｈ）　ｐ　５．０４（ｍ、　ＩＨ）　ｐ　７
．２Ｂ（ｄ、　　２Ｈン　；　　８．２６（ｄ、　　２
Ｈ）　　。

ｄ）１−０−ドデシル−２−グルタル醒−ｐ−二トロフ
ェニルエステルーグリセロ−３−？ルフエート ６Ｃ）の化合物５００〜１にクロロホルム４Ｍにとりか
つぎリジン０．２２−を混合する。水冷下ニ、クロルス
ルホン酸０．１８１ｄのクロロホルム２虹中溶液を滴加
する。その後にこの反応浴液全、さらに２時間０°Ｃで
および１時間室温で攪拌する。水２滴を添加した後蒸発
ｆ＃１細し、かつ残渣ヲクロロホルムにとる。＊ｃＩＲ
ナトリウム上で乾燥した後、＃剤を蒸発させ、かつ残ｉ
ｔシリカｒル（展開剤二メチレンクロリド／メタノール
８：１）でクロマトグラフ処理する。

収り：１８０即 ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ　＝＝　０−２６　（シリカ’７”
　ｋ　＊　ｙ’　ｆ　しｙクロリド／メタノール６：１
） ”Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：　ａ［ｐｐｍ］　’　
０−８９０．３Ｈ）　＋１．２１（ｍ、　２０Ｈ）　；
　２．０２（ｍ、　２Ｈ）　；　２．５４（ｍ、４Ｈ）
；　３３−４５（，４Ｈ）　ｓ　４．１９（ｍ、２Ｈ）
　ｐ　５−５−３３（ＩＨ）　；　７．２８（ｄ、　２
Ｈ）　；　８．２２（ｄｌ　２Ｈ）。

例４ １−０−へキナデシル−２−グルタル［−ｐ−ニトロフ
ェールエステル−グリセロ−３−フルフェート ａ）１−０−へ中サブシル−２−グルタル酸−３−０−
トリチル−グリセリン 表記化合物を、３ａ）と類似に、１−０−ヘキサデシル
−３−０−トリチル−グリセリン１５ｇ％？リジン５０
ａ１無水グルタル酸６．２ｇ、ジメチルアミノピリジン
０．４９から製造する。

収量：　７．１４　＆ ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ　＝　０．３５　（シリか〜・；酢
酸エステル／石油エーテル２：３） ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：　Ｊ［ｐｐｍ〕：　０
．８７（ｔ、　３Ｈ）；ｇ−１−１−６５（＋　２８Ｈ
）　ｐ　２２−０（，２Ｈ）ｓ　２．４３（ｔｏ　４Ｈ
）　；　３．３２（ｍ、　４Ｈ）　；　３．５９（ｄｏ
　２）（）　：５．２１　（ｍ、　、ＩＨ）　；　７．
３３（ｍ、　１５ａ）。

ｂ）１−ｏ−ヘキサデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニト
ロフェニルエステル−３−０−トリチル−グリセリン 六記化合物ｖｓ３ｂ）と類似に、４ａ）の化合物３．５
＆、クロロホルム５０ｔｕ、ｐ−ニトロフェノール０．
８４＃、ジシクロへキシルカルボシイミド６．１８ｇか
ら製造する。

収＠　：　２．８５　＆ ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ＝０．４７（シＩＪ力ｒル；［酸！
ステル／石油エーテル１：４・） １）４−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：　ａ［ｐｐｍ）　：
　［１，８８（ｃ、　３Ｈ）　；１．２５（ｍ＝　２８
）１）　：　２−１３（ｑ　、２Ｈ）　；　２−５３（
ｃ、２Ｈ）ｐ　２−７（ｚ、２Ｈ）　ｓ　３．３３（ｍ
、　４Ｈ）　ｓ　３−５９（ｄ、２Ｈ）；　５．２８（
ｍ、　ＩＨ）　；　７．１７（ｄ、　２Ｈ）　；　７．
３３（ｍ、　１５Ｂ）　；　８．２０（ｄ、　２Ｈ）。

ｃ）１−０−ヘキサデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニト
ロフェニルエステル−グリセリン弐配化合物を、３Ｃ）
と類似に４ｂ）の化合物２．８ｙから製造する。

収に：１．８＆ ＤＣ：　ＩＨｎｆ＋　＝　０−２２　（ン’）　力’ｙ
”　ル；りＣＩＯホルム／アセトン４９：１） ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：　ａ［ｐｐｍ］　’　
０−８７（Ｔ、、３Ｈ）　ｚｌ　−２５（ｍ＝　２８Ｈ
）　：　２−１２（ｑ１２”）　ｓ　２．５５（ｍ、４
Ｈ）ｐ　３．３５−４．０（ｍ、　６Ｈ）　；　５．１
（ｍ、　ＩＨ）　ｓ　７．２８（ｄ、　２Ｈ）　；　８
．２７（ｄ　、　２Ｈ）。

ａ）ｉ−ｏ−へキサダンルー２−グルタル酸−ｐ−ニト
ロフェニルエステルーグリセロ−６−サルフェート 戎記化合物を、３　ｄ）と類似に４ｃ）の化合物５００
Ｗｒ９から製造する。

収ｇ：　３１０〜 ＤＣ：　ＩＨＲ，Ｉ　＝　０．３０　（シリカゾル；メ
チレンクロリド／メタノール８：１） ＬＨ−−Ｒ（ＣＤＣ１３）　：　ａ［ｐｐｍ〕：　０．
８７（ｃ、　３Ｈ）　；１−２４（ｍｌ−２４（；　２
−２−０３（２Ｈ）　ｐ　２２−３−２−８（，４Ｈ）
　ｙ　３３−２Ｏ−３−７０（、４Ｈ）　＊　４．１９
（ｍ、２Ｈ）；　５．３１（ｍ、ＩＨ）　；　７．２９
（ｄ、　２Ｈ）　８．２３（ｄ、２Ｈ）。

例５ ｉ−ｏ−ドデンルー２−アジピン絵−ｐ−ニトロフェニ
ルエステル−クリセロ−３−ｆ’ルフエト ａ）１−０−ドデシル−２−〇−ペンシルーグリセロー
６−ｖルアエート １−０−ドデシル−２−〇−ベンジルーグリセリン２８
ｇをクロロホルム２００紅に俗解しピリジン２ＯＮを祭
加し、かつ０℃で、クロルスルホン酸ｇ．２＋Ｌ＆のク
ロロホルム８０μ中饅衣を少しづつ摘部する。引続き３
時間室温で攪拌し、かつその後にこの混合物を氷に注ぐ
。水相をクロロホルムで３回振とうし、かつ有機相を硫
酸ナトリウム上で乾燥した後蒸発濃縮する。

浅漬をシリカゲル（展開剤：クロロホルム／メタノール
４：１）でクロマトグラフ処理する。

収］ｇ１−　二　２３９ ＤＣ：　ＩＨＥｆｔ　＝　０．２５　（シリカデル；メ
チレンクロリド／メタノール９：１） 喫ｍｇ薬ニジクロルフルオレセ イン ”Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　’　ＪＣｐｐｍ）　’　
０−８８（Ｚ−３Ｈ）　ｐｌ、２４（ｍ、２０Ｈ）；　
　３．１５−３．５０（ｍ、４Ｈ）；　　３．７４（ｍ
＝ＩＨ）ｐ　　４．０（８，ＩＨ）ｐ　　４．２２（ｍ
、２Ｈ）ｓ　　４．５９（ｓ、ＩＨ）ｓ　　４−６４（
ｓ、ＩＨ）ｐ　　７−２６（７−２６（。

ｂ）１−ｏ−ドデンルーグリセロー３−？ルフエート ５ａ）の化付物２２．８ｇをメタノール５００酩ＶＣ−
俗解し、かつＰｄ、／ｃ　２．３　＆で水素添加する。

反【Ｉ、１過程をＤＣにより制御する。反応の経過波、
濾別しかつ蒸発濃縮する。浅漬をアセトンに懸濁しかつ
濾別する。

収ｔ　：　１５．６　ｇ ＤＣ’　Ｉ）］Ｒｙｌ　＝０．３４　（シ’）力’ｆｋ
ｐ　メチレンクロリド／メタノール４：１） ｌＨ−ＮＭＲ（ｄ、−メタノール）　　：　　ａｒｐｐ
ｍ〕　：　　０．８９（ｚ、　　３Ｈ）；１．２８（ｍ
、　２０Ｈ）　；　３．４−３．６（ｍ、　４Ｈ）　；
　３．９−４．１（ｍ、　３Ｈ）。

Ｃ）ｐ−二トロフェニルーアゾビン酸無水物アシヒン酸
−ｐ−ニトロフェニルエステル１中 ｇを２時間無水酢酸４０　ｇ”””ｔ’　８０℃で攪拌
する。

引続き醗剤１に蒸発させ、かつ残渣を高真空中で乾燥す
る。粗生成物を引続き反応させる。

ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ　＝０．６　（シ１７　力？’ｋ　
；酢０：Ｉ−スｆル） ｄ）ｉ−０−ドデシル−２−アゾビン酸−ｐ−二トロフ
ェニルエステルーグリセロ−３−？ルフエート ５ｂ）、５ｃ）の化合物０．４４．９およびジメチルア
ミノぎりシン１００〜ｔ−ピリジン５０ｇＬａ中で５時
間８０℃で攪拌する。溶剤を蒸発させた後シリカゾル（
展開剤：クロロホルム／メタノール６：１）でクロマト
グラフ処理する。

紋針：１００〜 ＤＣ：　ＩＨＲ，ｌ＝０．２９（シＩＪ力ｆル；１０ｏ
ホルム／メタノール６：１） ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：δ（ｐｐｍ〕：　０．
８６（ｃ、３ａ）　；１．２３（ｍ、　２０Ｈ）　；　
１．７３（ｍ、　４Ｈ）　；　２．２０−２．７５（ｍ
、４Ｈ）　ｐ　３３−２−３−７（，４Ｈ）　ｐ　４．
１６（ｍ、２Ｈ）　ｔ５−３１（ｍ、ＩＨ）　ｐ　７．
２９（ｄ、２Ｈ）：　８．２４（ｄ、２Ｈ）ｉｌｌに１
：　トリス後面ｌｄＪ　（ｐ’　７．１　）　１２５　
ｍＭ。

塩化カルンウム４．ＯｍＭ　１）ライドン（Ｔｒｉｃｏ
ｎ）　ｘ−１００２５０μｌ／　１００ｍｔｒ１ナトリ
ウムデスオキンコレート４１＊、ｚ／１００Ｉｕ。

蒸成２二浴准ｇ励に、載置である１−〇−ヘキサデシル
ー２−グルタル敵−ニト ロフェニルエステル−ｒａＣ−グリセロ−３−４１″ル
フエート２ダｔ＃Ｓ加し、わずかな加熱下にエマルジョ
ンが形成さ れるまで攪拌する。

このものに被検体＜ｎ素＃４液）２０ μＥを添加する。反応の経過を、測光 法によ抄λ＝　４０５　ｎｍで追跡する。

公知のホスホリパーゼ活性を基準として評価する場合、
蓼検体のホスホリパーゼ活性を以下のように計算する： ΔＥ／分：４Ｄ５ｎｍにおける１分画９の吸光度変動 前記反応条件において、′ｅＬ元係数が１＝９．０・１
・ＧＩｎ２・μモルー１である。

また、被検体のホスホリパーゼ活性の計算は下式によっ
ても可能である： ■　　＝測定パッチの総容積〔（：ＩｒＬ３〕ｅＢ Ｖ　Ｃ！検体）　：　被検体ノ容槓ＣＧＦＩＬ３］−：
発色体の４０５ｎｍＫｓ？けるｇ＆元係数ｄ：中具ベッ
トの層厚〔α〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） または ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜１６を有するアルキレン−またはアル
   ケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜２０を有するアルキル−、ア
   ルケニル−またはアシル基、またはアルキル基中の炭素
   原子数１〜８を有する、場合によりアルキル置換された
   アリール−またはアルアルキル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−またはチオール化合物、および
   それぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−または−Ｏ−、 Ｚが−ＳＯ＿３＾■または▲数式、化学式、表等があり
   ます▼を表わし、但しＲ＾１が水素原子または基：（Ｃ
   Ｈ＿２）＿ｎＮＲ＾２＿３（式中、ｎが２〜４の数およ
   びＲ＾２がＨまたはＣＨ＿３を表わす）、またはイノシ
   トール、またはセリン▲数式、化学式、表等があります
   ▼またはグリセリンであること ができる〕のホスホリパーゼ基質。 ２、ＲがＣ原子数６〜２０を有する請求項１記載のホス
   ホリパーゼ基質。 ３、ＡがＣ原子数３〜７を有する請求項１または２記載
   のホスホリパーゼ基質。 ４、Ｘが、場合により置換されたレゾルフイン基、クロ
   ルフェノールレッド−、インドキシル−、ナフトール−
   、チオフェノール−、チオフルオレセイン−またはフェ
   ノール基である請求項１、２または３記載のホスホリパ
   ーゼ基質。 ５、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） または ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜１６を有するアルキレン−またはアル
   ケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜２０を有するアルキル−、ア
   ルケニル−またはアシル基、またはアルキル基中の炭素
   原子数１〜８を有する、場合によりアルキル置換された
   アリール−またはアルアルキル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−またはチオール化合物、および
   それぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−または−Ｏ−、 Ｚが−ＳＯ＿３＾■または▲数式、化学式、表等があり
   ます▼を表わし、但しＲ＾１が水素原子または基：（Ｃ
   Ｈ＿２）＿ｎＮＲ＾２＿３（式中、ｎが２〜４の数およ
   びＲ＾２がＨまたはＣＨ＿３を表わす）、またはイノシ
   トール、またはセリン▲数式、化学式、表等があります
   ▼またはグリセリンであること ができる〕の基質にホスホリパーゼを含有する被検体を
   作用させ、かつ遊離せる芳香族ヒドロキシ−またはチオ
   ール化合物の量を直接にまたは、適当な色原体を結合さ
   せた後これにより形成された色相を光学的に測定するこ
   とを特徴とするホスホリパーゼを光学的に定量する方法
   。 ６、定量を、試薬中のカルシウム濃度０．５〜１０ｍＭ
   ／ｌで実施する請求項５記載の方法。 ７、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） または ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜１６を有するアルキレン−またはアル
   ケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜２０を有するアルキル−、ア
   ルケニル−またはアシル基、またはアルキル基中の炭素
   原子数１〜８を有する、場合によりアルキル置換された
   アリール−またはアルアルキル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−またはチオール化合物、および
   それぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−または−Ｏ−、 Ｚが−ＳＯ＿３＾■または▲数式、化学式、表等があり
   ます▼を表わし、但しＲ＾１が水素原子または基：（Ｃ
   Ｈ＿２）＿ｎＮＲ＾２＿３（式中、ｎが２〜４の数およ
   びＲ＾２がＨまたはＣＨ＿３を表わす）、またはイノシ
   トール、またはセリン▲数式、化学式、表等があります
   ▼またはグリセリンであること ができる〕の少くとも１種の化合物および緩衝剤、並び
   に胆汁酸、Ｃａ＾＋＾＋および場合により発色性カップ
   ラーおよび／または補酵素を含有することを特徴とする
   ホスホリパーゼを光学的に定量する試薬。 ８、それぞれ使用準備の出来た、試薬としての溶液に対
   し、 基質０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、 胆汁酸２〜５０ｍｇ／ｍｌ、 Ｃａ＾＋＾＋０．５〜１０ｍＭ／ｌ、 表面活性剤０〜１０ｇ／ｌ、 緩衝剤２０〜２５０ｍＭ／ｌ を含有する請求項７記載の試薬。 ９、キャリヤ物質に含浸配置されている請求項７または
   ８記載の試薬。