JPH0239882A - 動物細胞培養用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は動物細胞培養用培地、特にモノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマなどの動物細胞を増殖させる
ために有用な動物細胞培養用培地に関するものである。

〔従来の技術〕

一般に動物細胞培養用培地は、基本的に、ビタミン類、
無機塩類、アミノ酸などを含有してなる基礎培地に各種
の添加物が添加されて成るものである。そして、基礎培
地については種々の組成のものが市販されているので、
培養すべき動物細胞の種類に応じて所望のものを容易に
入手することができるが、これに添加すべき添加物の種
類や量については不明瞭な部分が多いのが現状である。

従って、ある増殖因子の性能の評価においては、評価す
る者の個人差、培養対象である動物細胞の種類や培養条
件などによって結果が大きく変動することとなる。

斯かる状況において、比較的安定な結果が得られる添加
物として牛胎児血清が知られている（文献「細胞培養マ
ニュアル」、講談社すイエンティフィク社刊、１９８２
）。そして同じ牛由来の血清であっても、成牛や子牛由
来のものは動物細胞の増殖を阻害する物質を含んでいる
とされ、一般に牛胎児血清と同様な細胞増殖能を期待す
ることはできない。

しかしながら、牛胎児血清を添加した培地は、当該牛胎
児血清の供給が安定でないため、動物細胞を工業的規模
で培養する場合の培地として好ましいものではない。

また、牛胎児血清は基礎培地に対して通常５〜１５％も
の大きな割合で添加する必要があるが、その結果、牛胎
児血清に由来するタンパク質が基礎培地に多量に含まれ
ることとなり、例えば、牛胎児血清を基礎培地に１０容
量％添加した場合にはタンパク質濃度は３０００〜４０
００μｇＺｍｌもの高濃度となり、そのため、動物細胞
から培地中に産生される有用物質の分離および精製が非
常に困難になっていた。しかし、牛胎児血清の添加量を
減少させることは、細胞の増殖速度が低下するので、有
利なことではない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、上記のような現状から、含有タンパク質量が
低く、安価でかつ安定的な供給を確保することができ、
しかも性能の安定した動物細胞培養用培地を提供するこ
とを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の動物細胞培養用培地は、肝臓および／または胃
臓由来の抽出成分を含有することを特徴とする。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明においては、基礎培地に、肝臓および／または胃
臓由来の抽出成分を添加して含有させることにより、動
物細胞培養用培地を得る。

本発明において、基礎培地としては、培養すべき動物細
胞の種類に応じて選択される市販の培地を使用すること
ができる。その具体例としては、例えばｒ　ＲＰＭＩ　
１６４０　Ｊ、「ハムＦ１２」、「ダルベツコ改変イー
グルメディウムＪ　（ＤＭＥＭ）、ｒミニマルエッセン
シャルメディムＪ　（ＭＥＭ）などを挙げることができ
るが、これらのうち、浮遊系細胞培養用として開発され
たＲＰＭｌ　１６４０を特に好適に使用することができ
る。また、これらの培地は適宜混合して使用することも
できる。

本発明において含有される抽出成分は、肝臓および／ま
たは腎ＩＩ！（以下「特定の臓器」という）由来のもの
である。この抽出成分を得るための特定の臓器は、牛、
豚、馬、鳥、魚などのものを用いることができるが、入
手が容易な点で特に牛または豚のものが好ましい。

本発明において抽出成分は、新鮮な特定の臓器から、水
、リン酸緩衝液、０．１５Ｍ程度の塩化ナトリウム水溶
液などを用いて直接抽出液として調製することもできる
が、特定の臓器を一旦アセトン粉末となし、使用時にこ
のアセトン粉末から特定の臓器由来の抽出液（以下、単
に「抽出液」という）を調製する方法が、抽出成分の工
業的な大量処理が可能となると共に保存も容易となるこ
とから好ましい。

特定の臓器の抽出成分をアセトン粉末とする場合におい
て、その調製法は特に限定されるものではないが、その
−例を示すと次のとおりである。

まず新鮮な特定の臓器から結合組織を除去して十分に放
血させ、次いで凍結させ、この凍結臓器を粗く砕いたも
のを、５〜２０倍量の一２０〜１０℃程度のアセトン（
以下、「冷アセトン」という）および５〜１０倍量のＯ
〜２０℃程度の冷水と共にブレンダーに投入し、数分間
ホモジナイズして摩砕物を得、更にこの摩砕物を濾過し
て固形物を得、この固形物を冷アセトンおよび一２０〜
１０℃程度のエーテル（以下、「冷エーテル」という）
で十分に洗浄し、その後低温条件下で乾燥させ、必要に
応じて繊維状物をふるい分けにより除去して、目的とす
る特定の臓器のアセトン粉末を得る。このアセトン粉末
は、例えば５℃以下の冷暗所に長期間にわたって保存す
ることが可能である。

以上のように、アセトン粉末の調製は、冷アセトンおよ
び冷エーテルを用いて行うことができる（参考文献：新
実験化学講座２０．生物工学Ｉ　２゜６〜７）が、他の
有機溶剤を併用して行うこともできる（参考文献：　Ｒ
ｏｂｅｒｔ　Ｌ、　　Ｈｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｓ、　　ｐＪ５．　　１９５４＞。　　その具体的−例
を示すと次のとおりである。例えば凍結状態にある特定
の臓器をグラインダーで粉砕したもの３００ｇに対して
１００〜２００顎の水と共にブレンダーに投入し、２〜
６℃程度で数分間攪拌した上５０容量％程度のエタノー
ル水溶液３０〜１００ｍ１を加えて２〜６℃程度に保っ
たまま数時間静置し、次いで１０〜３１］ｔｌ！のクロ
ロホルムを含有する９５容量％程度のエタノール水溶液
１００〜２００　ｒｎｌを加える。モして濾別により固
形物を分離し、これに２〜６℃のアセトン３００〜６０
０　ｍ！！を加え、更に数時間静置して固形物を回収し
、これを再度冷アセトン３００〜６００　ｄに懸濁させ
、再び濾別により固形物を回収し、これを、５０〜１５
０　ｍＮのアセトン、３０〜１００−の冷アセトンと冷
エーテルとの等１混合物および３０〜１００ｍ１の冷エ
ーテルによって順次洗浄し、その後洗浄液を十分に除去
して減圧乾燥し、目的とするアセトン粉末を得る。

また、特定の臓器のアセトン粉末は市販されており、こ
れを使用することもできる。

上記特定の臓器のアセトン粉末から、基礎培地に添加さ
れる抽出液を調製するための方法は、特に限定されるも
のではないが、その−例においては、アセトン粉末にそ
の５０ｇ当り約３００〜６００ｍ１の０．１５Ｍ程度の
塩化す）　ＩＪウム溶液やリン酸緩衝液などの生理的塩
類溶液あるいは使用される基礎培地と同一の液体を加え
、３７℃で約１０〜６０分間撹拌し、得られる懸濁液を
例えば３０００ｒｐｍで約１０〜６０分間遠心分離処理
して上澄み液を得、これを抽出液とする。この抽出液は
、フィルターで濾過して滅菌し、必要に応じてタンパク
質濃度を測定した上で例えば−２０℃以下で凍結保存す
る。

以上のようにして得られる抽出液におけるタンパク質濃
度は、通常、１〜１００■／−の範囲である。

本発明においては、以上のようにして得られる抽出液を
、通常、基礎培地に対してタンパク質濃度が１〜１００
■／ｄとなる割合で添加する。

本発明においては、基礎培地に対し、上記抽出成分と共
に、その細胞増殖能をさらに発揮させるために種々の物
質を添加してもよい。その具体例としては、基礎培地中
での濃度が１〜１００μｇ／ｍｆとなる割合のインスリ
ン、１〜１００μｇ／ｍｌ！となる割合のトランスフェ
リン、２〜２００μｇ／ｍｌとなる割合のエタノールア
ミン、１０−’〜１０−９モル／！となる割合の２−メ
ルカプトエタノール、１０−７〜１０−９モル／ｆｌと
なる割合の亜セレン酸ナトリウム、１〜１００μｇ／ｒ
ｎｌとなる割合のフェツインなどを挙げることができる
。

更に本発明の動物細胞培養用培地による培養においては
、当該培地に脂質を加えることがきわめて有効である。

この脂質としては特に卵黄由来のリポタンパク質が好ま
しく、これを添加することにより、上記抽出液の細胞増
殖能を一層高くすることができる。リポタンパク質を得
るための卵黄は、特に制限されるものではないが、人手
の容易性、価格などの点から鶏卵の卵黄が好適に使用さ
れる。

卵黄からリポタンパク質を得るための代表的な方法は以
下のとおりである。１００個の鶏卵の卵黄に対し、０．
１〜０．２Ｍの塩化ナトリウム溶液１．５〜３ｆｌを加
えて室温で１０〜６０分間程度撹拌し、これを約３００
Ｏｒｐｍで５〜１５分間程度遠心分離処理して上澄み液
を得、更に例えば１７０００　ｒｐｍで１０〜６０分間
程度遠心分離処理して上澄み液を得、これを蒸留水によ
って透析し更に濾過し滅菌してリポタンパク質溶液を得
る。このリポタンパク質溶液の基礎培地に対する添加量
はタンパク質濃度が２０〜５００μｇ／ｍｆとなる割合
である。

さらに、本発明の動物細胞要用培地には、牛胎児血清を
添加してもよい。

本発明の動物細胞培養用培地は、モノクローナル抗体の
産生細胞とミエローマの融合により得られるハイブリド
ーマ、浮遊系細胞であるリンパ系細胞、３ａｌｂ／Ｃマ
ウスの膵臓細胞とＮ５−１細胞とのハイブリドーマ、黒
色種由来のＢＯＷＥＳ細胞、ハイブリドーマの作製に用
いる親株であるミエローマ、例えばＳＰ２１０−Ａｇ−
１４（以下ｒｓＰ２１０細胞」という）、Ｐ３／ＮＳｌ
−Ａｇ４−１　（以下ｒＮｓ−１細胞」という）などの
培養に好適に使用することができるが、これらに限定さ
れるものではなく、種々の動物細胞の培養に利用するこ
とができる。

〔実施例〕

以下本発明の実施例について説明するが、本発明がこれ
らによって制限されるものではない。

実施例１ く豚腎臓アセトン粉末の調製〉 屠殺直後の豚の腎雀から結合組織を除去し、十分に放血
させた上当該臓器を凍結させて粗粉砕した。この臓器片
２００ｇを、４℃に保った２０００　ｇのアセトンと２
０００　ｇの５℃の水と共にブレンダーに投入し、１０
分間ホモジナイズして摩砕物を得、この摩砕物を濾過処
理して固形物を濾別した。この固形物を約４５００　ｇ
の冷アセトンで十分に洗浄し、更に約３０００　ｇの冷
エーテルで洗浄し、５℃において送風機による乾燥を２
日間行って粉末を得、この粉末から繊維状物をふるい分
けにより除去して豚腎臓アセトン粉末を得た。この豚腎
臓アセトン粉末は、５℃の冷暗所に約６ケ月間以上保存
することが可能なものであった。

〈抽出液の調製〉 液体基礎培地ＲＰＭ１１６４０とハムＦ１２とを体積比
で３；ｌの割合で混合して得られる混合液５００ｍｊ！
を、上記の豚腎臓アセトン粉末１００ｇに加えて３７℃
で約３０分間撹拌し、得られた懸濁液を３００Ｏｒｐｍ
で約３０分間遠心分離処理して上澄み液を得、これを０
．２２即のフィルターで濾過し滅菌して抽出液を調製し
た。この抽出液は各々容量５０ｆｆＬｌ！のチニープに
充填して一２０℃で凍結保存した。これを「抽出液■」
という。この抽出液■のタンパク質濃度をバイオランド
プロティンアッセイによる吸光光度法で測定したところ
、１２ｍｇ／ｒｎｌであった。

く培地の調製〉 粉末基礎培地ＲＰＭＴ１６４０の３０．６　ｇと、粉末
基礎培地ハムＦ１２の１０．６　ｇとを混合し、これを
超純水３．７１に溶解させた。これにＬ−グルタミン酸
１．２ｇと、炭酸水素ナトリウム４．０ｇを添加して溶
解し、ＩＮの塩化ナトリウム水溶液によりｐＨ７，３に
調整し、更に超純水を添加して全量を４１とした後、濾
過し滅菌して基礎培地を得た。

この基礎培地に、下記の物質を添加して動物細胞培養用
培地を調製した。

抽出液■９，３ｍｌ トランスフェリン　　　　　　　５６　　　ｍｇインス
リン　　　　　　　　　　３２　　　ｍｇエタノールア
ミン　　　　　　　７２　　　ｍｇ２−メルカプトエタ
ノール　　４Ｘ１０−＠モル亜セレン酸ナトリウム　　
　　６Ｘ１０−＠モル実施例２ く豚肝臓アセトン粉末の調製〉 層殺直後の豚の新鮮な肝臓を実施例１と同様に凍結し、
粗粉砕した臓器片３００ｇと、２５００　ｇの冷アセト
ンと２３００　ｇの５℃の水を用いた以外は実施例１と
同様の方法により、豚肝臓アセトン粉末を得た。

〈抽出液の調製〉 上記豚肝臓アセトン粉末１２０ｇにＲＰＭ１１６４０培
地液８００ｍ１を加えて３７℃で約４０分間撹拌し、得
られた懸濁液を３００Ｏｒｐｍで約３０分間遠心分離処
理して上澄み液を得、これを０．２２ｕｍフィルターで
濾過し滅菌して抽出液を調製した。これを「抽出液■」
という。この抽出液Ｈのタンパク質濃度を実施例１と同
様の方法で測定したところ、１０．５■／ｘｉ！であっ
た。

くリポタンパク質の調製〉 新鮮な鶏卵２００個から卵黄を取出し、０．１６Ｍの塩
化す）　＋Ｊウム水溶液４βを加えて室温で４０分間撹
拌し、この溶液を３００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離処
理して上澄み液を得、この上澄み液を更に１７０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離処理して３．ＯＲの上澄み液を
得、これを蒸留水によって透析した後、２遮、０、８０
ＪＬＱｌおよび０．２２ｕ＋ｎのフィルターでこの順に
濾過し滅菌してリポタンパク質溶液を調製し、これを小
バイアルに小分けして一２０℃で保存した。これを「リ
ポタンパク質溶液Ａ」という。このリポタンパク質溶液
へのタンパク質濃度を実施例１と同様の方法で測定した
ところ、１９ｍｇ／−であった。

〈培地の調製〉 ５、ＯＡの液体基礎培地ＲＰＭ１１６４０に、以下の物
質を添加して動物細胞培養用培地を調製した。

抽出液ＩＩ　　　　　　　　　　　　９ｒｎｌリポタン
パク質溶液Ａ　　　　　２２　−トランスフェリン　　
　　　　　８５　　　■インスリン　　　　　　　　　
　５５　　　■エタノールアミン　　　　　　　９０　
　　ｍｇ２−メルカプトエタノール　　６Ｘ１０−モル
亜セレン酸ナトリウム　　　　５Ｘ１０−モル実施例３ く牛腎臓アセトン粉末の調製〉 層殺直後の牛の”ｚｍを実施例１と同様に処理し、粗粉
砕された臓器片３５０ｇと３３００　ｇの冷アセトンと
３４００　ｇの冷水とを用い、摩砕物を５２００　ｇの
冷アセトンで洗浄した以外は実施例１と同様の方法によ
り牛賢臓アセトン粉末を得た。

く抽出液の調製〉 液体基礎培地ＲＰＭ１１６４０とノ＼ムＦ１２とＤＭＩ
ＥＭとを体積比で３：１：１となる割合で混合して得ら
れる混合液４５０−を、上記アセトン粉末９０ｇに加え
て３７℃で約４０分間撹拌し、得られる懸濁液を３００
゜ｒｐｍで約３０分間遠心分離処理して上澄み液を得、
これを肌２２遮フィルターで濾過し滅菌して抽出液を調
製した。これを「抽出液■」という。この抽出液■のタ
ンパク質濃度を実施例１と同様の方法で測定したところ
、１３．７　ｍｇ　／　ｍｆ！であった。

く培地の調製〉 粉末基礎培地ＲＰＭｉ１６４０　ノ３０．６ｇと／％ム
Ｆ１２＋７）１０、６　ｇとＯＩＡＥＭの９．５ｇとを
混合し、この混合物を４，６１の超純水に溶解させ、こ
れにＬ−グルタミン酸１゜５ｇと、炭酸水素ナトリウム
５．０ｇとを添加して溶解し、ＩＮの塩化す）　ＩＪウ
ム水溶液によりｐＨ７，３に調整し、更に超純水を添加
して全量を５．Ｏｌとした後、濾過し滅菌して基礎培地
を得た。この基礎培地に、以下の物質を添加して動物細
胞培養用培地を調製した。

抽出液（ＩＩＩ）　　　　　　　　　　９　　　ｍｊ！
リポタンパク質溶液Ａ　　　　　　１６．４　　ｄトラ
ンスフェリン　　　　　　　４３　　　ｍｇインスリン
　　　　　　　　　　６３　　　ｍｇエタノールアミン
　　　　　　　１１０　　　ｍｇ２−メルカプトエタノ
ール　　６Ｘ１０−＠モル亜セレン酸ナトリウム　　　
　６Ｘ１０−”モルフェツイン　　　　　　　　　　７
２　　　ｍｇ実施例４ 〈抽出液の調製〉 実施例１において豚腎臓アセトン粉末の代わりに豚胃懺
アセトン粉末ｒＫ３８７５」（米国ングマ社製）　　１
５０ｇを用い、ｌｔＰＭ（１６４０と）＼ムＦ１２の混
合液の代りにリン酸緩衝液６００ｍ１を加えた以外は実
施例１と同様の方法で抽出液を得た。これを「抽出液■
」という。この抽出液■のタンパク質濃度を実施例１と
同様の方法で測定したところ、１７ｍｇ／ｍであった。

〈培地の調製〉 実施例３において抽出液Ｉ［［９ｍｆの代わりに抽出液
ＩＶ７．３ｄを用いた以外は実施例３と同様にして動物
細胞培養用培地を調製した。

実施例５ く培地の調製〉 実施例３において抽出液■の添加量を２３．６ｍｌ！と
じた以外は実施例３と同様にして動物細胞培養用培地を
調製した。

実施例６ 〈培地の調製〉 実施例３において抽出液■の添加量を２０．７ｍｌ！と
じ、リポタンパク質溶液Ａの添加量を２２．７ｒｎｌと
した以外は実施例３と同様にして動物細胞培養用培地を
調製した。

実験例 培養試験１ マウス骨髄腫（ミエローマ）由来の樹立細胞株である５
Ｐ２１０細胞、Ｎ５−１細胞、Ｂａ１ｂ／　Ｃ７ウスの
膵臓細胞とＮ５−１細胞とのハイブリドーマおよび黒色
種由来の８０ＷＥＳ細胞を培養細胞として使用し、実施
例１〜６で調製した動物細胞培養用培地を用い、以下の
手順に従って培養試験を行った。

細胞培養用２４穴マルチウエルの各ウェルに予め実施例
１〜６で調製した動物細胞培養用培地を各々１ｍｉづつ
入れて温度３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で平衡化させ
ておき、各ウェルに上記細胞をそれぞれｌＸｌ０’個の
割合で播種したものを細胞１種につき６組作り、温度３
７℃、５％炭酸ガス雰囲気下において培養した。培養を
開始してから３日目と５日目に細胞数をコールタ−カウ
ンターで計測し、同一条件の３つのウェルの細胞数の平
均イ直を求めた。

また対照培地として、以下の４種類の培地を用いて同様
の培養試験を行った。

対照培地１　：　ＲＰＭＩ　１６４０ 対照培地２　：３ＲＤＦ　（基礎培地ＲＰＭ１１６４０
　、Ｉ］旺およびハムＦ１２を３：１：１の割合で 混合した培地） 対照培地３　：　ＲＰＭ１１６４０に０．３容量％牛脂
児血清を添加したもの 対照培地４：３ＲＤＦに０．３容量％牛脂児血清を添加
したもの なお、対照培地３および４のタンパク質濃度は、抽出液
■とほぼ同じである。

結果を第１表〜第４表に示す。

第２表 （ＮＳ−１細胞培養試験） 第１表 （ＳＰ２１０細胞培養試験） 第３表 （ハイブリドーマ培養試験） 第４表 （ＢＯＷＥＳ細胞培養試験） も原料とされるものが肝臓および／または腎臓であるた
め安価でかつ安定的な供給を確保することができ、従っ
て動物細胞を利用してモノクローナル抗体や有用生理活
性物質を工業的に生産する場合における浮遊系および接
着依存性のいずれの動物細胞の培養にも有利に使用する
ことができる。

〔発明の効果〕

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）肝臓および／または腎臓由来の抽出成分を含有す
   ることを特徴とする動物細胞培養用培地。
2. （２）卵黄由来のリポタンパク質を含有する請求項１に
   記載の動物細胞培養用培地。