JPH0240327A - 腎疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 炎亙又１ 本発明は、腎炎の予防治療用の薬学的組成物に関する。

更に詳細には、ヒト全身性紅斑性狼渣（ＳＬＥ）に伴な
って発症する腎疾患の予防治療用の薬学的組成物に関す
る。本発明によれば、活性成分としてのヘパリン、その
誘導体又はそのフラグメントを、抗凝固剤としての効果
を発揮するには低用ｍすきるが本発明の意図する効果を
発揮するには十分な最の投与量で用いる。

背坦技術 ヒト又はマウスの全身性紅夏性狼ｆｆ１（ＳＬＥ）に伴
なって腎疾患を併発することがＳＬＥによる死亡の主た
る原因となっている。腎炎は、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体複
合体が形成されて体内を循環し腎によってトラップする
ことによって起こると考えられている。他の原因として
は、糸球体の基底膜の主たるグリコサミノグリカン構成
成分であるヘパリンスルフェートなどの正常な腎におい
て見られる構成成分に抗ＤＮＡ狼癒自己抗体が直接結合
することによると考えられている。

本発明者らは、ヒト患者又はＭＬＲ／ｊ！ｐｒ／１ｐｒ
マウス（狼癒を自然発症したマウス）から１９た抗ＤＮ
Ａ抗体とヘパリン又はその誘導体とが交差反応すること
を見出し、またこれらのマウスをヘパリンなどの交差反
応性を示す化合物で処置することによって根源性腎炎が
発症するのを予防できることを見出した。

発明の要旨 本発明は、ヒト全身性紅斑性根１１（ＳＬＥ）に伴なっ
て発症する腎疾患の治療予防用薬学的組成物に関する。

本発明の組成物中には、ヒト患者又は狼癒が自然発症し
たＭＬＲ／ｊ！　ｐｓ／１ｐｓマウスから得た抗ＤＮＡ
抗体と交差反応するに十分な聞のヘパリン、その誘導体
又はそのフラクションが含有される。マウスをヘパリン
等で処置することにより、腎疾患の発症を防止あるいは
遅らせることができることが判った。Ｈ２ＳＯは、ＭＬ
Ｒ／ＩＤｒ／ｉ！ｐｒｖウス由来の抗ＤＮＡ抗体（モノ
クローナル）である。この抗体は、これらのマウスの血
消抗ＤＮＡ抗体の主要イディオタイプを有しており、腎
疾患を発症したＭＬＲ／１　ｐＳ／ｊ　ｐｓｌマウス腎
から溶出したイムノグロブリン中に見出されている。本
発明は、Ｈ１３０モノクローナル抗体及びＭＬＲ／１ｐ
ｒ／１０ｒマウス腎由来のイムノグロブリンが、ヘパリ
ン、そのＫ２Ｓ体又はそのフラクションと交差反応し、
根源を発症したマウスに長期間ヘパリン等を投与するこ
とによって根源性腎炎の発症が抑制されるという知見に
基づいている。この事実は、ヒトの患者でも同様の効果
を示すことを示している。

ＸＳ： ■ １、抗ＤＮＡ抗体 ａ、　　Ｈ１３０マウスモノクローナル抗体［Ｒａｕｃ
ｈ、　Ｊ、　１．　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｉｎ＋ｍｕ
ｎｏ１．　１２９　：２３６　（１９８２）：Ｔｕｆｔ
ｓ大学〈ボスｌ−ン）のＲ，Ｓ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚか
ら贈与された］は、ＭＬＲ／ｊ！Ｄｒ／ｊ！ｐｒマウス
の族ＤＮＡ応答の主要イディオタイプを有している。こ
の抗体はこれらの動物の血清中に高レベルに存在し、ま
た病気にかかった腎から溶出されるイムノグロブリン中
にも高レベルで存在する。血清中のこの抗体レベルは病
気の程度と関連している。従って８１３０抗体は腎炎の
原因と考えられる。

ｂ、ＭＬＲ／１ｐｒ／ｊ！ｐｒｖウスＷからｉｉＩ接溶
出したイムノグロブリン［Ｔｕｆｔｓ大学（ボス１−ン
）のＨ，Ｈａｄａｉｏから贈与された］。

ｃ、ＭＬＲ／ｌｐｒ／７ｐｒｖウス及ヒ（ＮＺＢ／ＮＺ
Ｗ）Ｆｌマウスの血清イムノグロブリン。血清抗体は腎
炎の原因とはならない。

ｄ、　　Ａ−５２：　（ＮＺＢ／ＮＺＷ）Ｆｌから得た
抗ＤＮＡモノクローナル抗体［Ｏｒ、　Ｄ、　Ｅｉｌａ
ｔ（エルサレム）から贈与された］。

ｅ、　ヒト根源患者の腎から直接溶出されたイムノグロ
ブリン。

２．３日ラベル化ＤＮＡはＨｅＷ　ＥｎｌＪＩａｎｄＮ
ｕｃｌｅａｒ　　（Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓ）から購
入した。

３、ヘパリン、ヘパリンフラグメント（ＡＭ７１２２８
）　、フラグミン（８４９２１−５１）、Ｎ１０デスル
フエートヘパリン、Ｎ−アセチルＯ−デスルフエートヘ
パリン及びＮ−アセチルヘパリンを、ＫａｂｉＶｉｔｒ
ｕｍ　（ストックホルム）から入手した。

４、マウス 雌性ＭＬＲ／Ａｐｒ／ｊ！ｐｒｖウス及び（ＮＺＢ／Ｎ
ＺＷ）マウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　（Ｂａｒ−１１ａｒｂｏｒ、　Ｈａｉｎｃ　）から
購入した。

Ｌ迭 ａ、ＤＮＡと抗体との反 ミクロボアフィルターアッセイを用いて抗ＤＮＡ抗体の
検出を行なった。血清溶出物、腎溶出物、Ｈ１３０モノ
クロ−プル抗体及びΔ５２モノク１：１−ナル抗体は、
０．２Ｍボレー］・食塩水バッファー（ａｌ１８．０）
の一連の希釈液として調製した。３（」ラベル化ＤＮＡ
　　１０μｍ（約６，００　０ｃｐｍ　　、　　Ｎｅｗ
　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ、　　Ｂｏｓｔ
ｏｎ、　　　ＭＡ　　）を、各種の抗体希釈液１００μ
ｌに加えた。混合物を３７℃で３０分間インキュベート
し、次いで４℃で少なくとも６０分間インキュベートし
た。

混合物を０．４５μｍニトロセルロースフィルター　（
Ｈｉｌｆｏｒｄ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ　）に通し
た。フィルターを３ｍ！ボレートバッファーの２７リコ
ートで洗浄し、それぞれプラスチックバイアルに入れた
。

フィルターを室温で少なくとも１６時間放置して乾燥し
、トルエンベースシンチレーション液とともにベーター
カウンターで計測した。

ｂ、　　ＤＮＡとヘパリンとの　差戻応性ＤＮＡとヘパ
リンとの交差反応性を、競合抑制アッセイにより測定し
た。ボレートバッファー（１１８，０）を用いて、各種
濃度のヘパリン及びヘパリン誘導体溶液を［１した。こ
のインヒビター５０μｍをＤＮＡ結合イムノグロブリン
に加え、上記した直接結合アッセイによりＤＮＡへ結合
した残りの混合物の樋を測定した。

Ｃ１ヘパリン処理 １０匹のＭＬＲ／１ｐｒ／ｊ！ｐｒｖウス及び１０匹（
７）（ＮＺＢ／ＮＺＷ）Ｆ１７’／スに一１ｆＨ日ヘパ
リン（５μ／Ｉｄ、０．１−）を皮下注射した。

これらのマウスのコントロール群には毎日食塩水（０，
１ｍ）を注射した。６遍令のマウスを用いて４ケ月間こ
の処置を実施した。処置後、マウスを殺してその器官を
光学顕微鏡及び電子顕微鏡で調べた。

ｄ、光２顕微　による・査 肺、腎、リンパ節、肝及び膵臓の組＄１ＩＪ−ンブルを
１０％ポルマリンに入れ、パラフィン中に固定化した。

６マイクロメーターの断片をヘマトシリンエオシン、Ｒ
ＡＳ、マソントリクローム及び銀染色により発色せしめ
た。自己免疫疾恣の形態学的パラメーターを、特に腎で
評価した。調査の最後にのみ利用し得るコードを用いて
ダブルブラインドにより組織ナンブルの評価を実施した
。

ｅ、電子顕微　による調査 電子顕微鏡用に採取した組織を、直ちに４％小ルムアル
デヒドー１％グルタルアルデヒド固着剤で固定化した。

ウラニルアセテートでブロック染色し、次いでエタノー
ル及びプロピレンオキサイド中で脱水した。Ａｒａｌｄ
ｉｔｏ中で固定化し、源い断片をクエン酸銅で染色した
。１ｌｅｏｌ　　１００　ＣＸ電子顕微鏡により８０Ｋ
Ｖで断片を調べた。

■ １、ヘパリンと　ＤＮＡ　　　との ヘパリンは、ＤＮＡとＨ１３０モノクローナル抗体との
結合及びＤＮＡとＭＬＲ／ｊｐｒ／Ａｐｒ腎溶出物との
結合を阻止した（５０％阻止にそれぞれ０．０４μｆｆ
／ｄ、１０μｇ／＃Ｉｉ！を要した。表１参照）。ヘパ
リンは、ＤＮＡとＭＬＲ／１１）　ｒ／ｊ！　ｌ）　ｒ
血清、（ＮＺＢ／ＮＺＷ）Ｆ１血清又はＡ５２モノクロ
ーナル抗体との結合は阻止しなかった。ヘパリンは高い
親和性を持ってＨ１３０抗ＤＮΔ抗体と反応することが
判った。

（ＮＺ８／ＮＺＷ）Ｆｌマウス由来のＡ５２モノクロー
ナル抗体とヘパリンとの反応は観察されず、従ってヘパ
リンとＨ１３０抗ＤＮＡ抗体との反応は特異的であった
。ヘパリンとＤＮＡとの交差反応性は、ヘパリン分子中
のスルフニー１・部分にその原因の一部があることが判
った。ヘパリン分子のデスルフエート化を完全に行なう
と交差反応性が全くなくなり、他方、部分的にデスルフ
エート化を行なった場合にはヘパリンとＨ１３０抗ＤＮ
Ａ抗体との結合親和性は減少する（この結果は示されて
いない）。

２、ヘパリン処　による腎病理の効果 （ｉ）１１皇１１ 食塩水処置したＭＬＲ／１マウス　コントロール群では
、重い糸球体腎炎が発症した。全てのマウスで糸球体の
病変が観察された。９０％以上の糸球体に広い三日月状
の形状が観察された。ヒトＳＬＥの場合のガラス状血栓
と同様のガラス状のものを伴ったキＡアピラリールーグ
状の壊死が見られた。ワイヤーループ状の病変部分が共
通に観察された。糸球体は広く現われており、また増殆
及び浸出液の浸出が断たれていた。また、丸い細胞に裂
は目が入って炎症が生じ同時に管状の第２次的退縮及び
膨張が見られた。

いくつかのメディウム及び小さな脈管には脈管炎が見ら
れ壊死を起こしていた。脈管炎は、他の器官、即ち肝、
肺、膵臓及び膵臓にも観察された。

炎症が生じた裂は目の入った丸い細胞が肝、肺、膵臓及
び心臓にも観察された。ヘパリンで処置したＭＬＲ＃！
ｌ）ｒ／ｊ！１）ｒｖ’ウステハ、糸球体腎炎は軽い症
状しか観察されなかった。またこの群では、糸球体が正
常なものから糸球体間質細胞過多及び糸球体間質マトリ
ックスの増加が見られたものまであった。最も重い症状
の場合では糸球体の厚い脈管壁がしばしば観察された。

浸出性の病変部分並びに三日月状の形状形成ははと／ν
ど観察されなかった。細管の外観は正常であった。まれ
には炎症を有する丸いｍ砲が観察されたが、間質には何
んらの変化も見られなかった。腎及び他の器官において
も、脈管炎はいずれの処置群マウスでも観察されなかっ
た。（ＮＺＢ／ＮＺＷ）マウスの全ては、ヘパリン又は
食塩水のいずれの場合でも、重い糸球体腎炎が広く発症
していた。

（ｉｉ）　　７ｊｔ五！皇」 食塩水で処置したＭＬＲ／ｊ！ｐｒ／Ｊｐｒｖウスから
得た全ての糸球体を電子顕微鏡で観察した所、キャピラ
リー基底膜に電子濃密部分が多く観察された。この濃密
部分のまわりの基底膜の厚い病巣にはスパイク状の形状
が見られた。はとんどの濃密部分は上皮下部分に見られ
たが、内皮下及び膜内部分でも′ｆａｆｉ部分が観察さ
れた。また、糸球体間質部分の領域が広がっており、細
胞の増殖過程及び小さなオスミウム親和性部分が観察さ
れた。

これに対して、ヘパリンで処置したＭＬＲ／ｊ！ｐｒ／
ｊ！ｌ）ｒマウスの糸球体では正常な薄いキャピラリー
基底膜が観察され、上皮下部分の濃密部分はほとんど見
られなかった。ａに部分は、プレキャピラリ一部分の糸
球体間質部に見られた。

発明旧名らの研究により、根源ＭＬＲマウスの狼癒性腎
炎及び脈管炎は、長期間のヘパリンの低投与５１治療に
より阻止できることが明らかになった。ヘパリンによる
効果についての考えられるメカニズムは、狼癒自己抗体
との交差反応性である。

本実験から明らかなように、抗ＤＮＡ狼捻抗体であるＨ
２ＳＯがヘパリンと高い親和性を持って結合する。この
抗体はＭＬＲ／Ｊ！　ｐｒ／ｊ！　ｐｒマウス抗ＤＮＡ
抗体の一般的なイディオタイプを有しており、病気にか
かっている腎の溶出物に見い出される。ヘパリンによっ
て同様の自己抗体が腎に結合するのが阻止され、それに
よって腎炎が発症するのが阻止されるものと考えられる
。根石の抗ＤＮＡ抗体及び自己抗体と交差反応する他の
化合物も同様にして用いることが出来る。

本発明で用いるヘパリン、その誘導体、そのフラクショ
ン又はそのフラグメントの投与量は、１［ｌ当り通常０
．１１１！ｊ／に９〜１η／に９である。その投与ルー
トは通常皮下投与である。かかる投与に用いる剤型とし
ては、通常用いられている注射剤、例えば適当なｐＨ値
に調整された生理食塩水にヘパリンなどを溶解した注射
剤などが挙げられる。本発明の活性成分の投与量は、ヘ
パリンが抗凝固剤として使用される場合の投与量よりも
低く、約１０分の１以下であり、この場合には血液凝固
に対して実質的に影響を与えない。

表１ イムノグロブリンを各種濃度のヘパリンとともにインキ
ュベートし、フィルター結合アッセイによりＤＮＡに結
合している残りのイムノグロブリンを測定した。

Ｎ、１．はヘパリン１００μｇ／１１１でも抑制を示さ
ないことを示している。

表２ ヘパリン誘導体８ ンによる５０％抑制：μ３／！ｄ ヘパリン ヘパリンフラグメント Ｎ−アセチルヘパリン Ｎ−アセチル　Ｏ−デスシフエートヘパリンＮ１０デス
ルフエートヘバリン ０．０４ ０．０２ １、Ｏ Ｎ、ｌ’″９ Ｎ、Ｉ。

にａｂｉｖｉｔｒｕｍ　（ストックホルム）した。

から入手 ”　　Ｎ、１．＋　　１０μｇ／！ｌｔ！のヘパリンに
よっても抑制を示さない。

表３ 腎 腎 ヘパリン ＭＬＲ／ｊ！　Ｄｒ／ｊ！　Ｄ　ｒマウスに毎日食塩水
又はヘパリン（５００Ｕ／日）を皮下注射した。４ケ月
後に殺してその腎を光学顕微鏡及び電子顕微鏡で調べた
。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）に関連した抗ＤＮＡ
   抗体によつて発症する腎炎の予防治療用の薬学的組成物
   であつて、活性成分として、ヒトの血液凝固に実質的に
   影響を与えない有効量のヘパリン、その誘導体、そのフ
   ラクシヨン又はそのフラグメントを含有する上記薬学的
   組成物。
2. （２）抗凝固剤として用いる投与量の約１０分の１以下
   の投与量でヘパリンを用いる請求項１記載の薬学的組成
   物。
3. （３）活性成分がＮ−アセチルヘパリン又はそのフラグ
   メントである請求項１記載の薬学的組成物。
4. （４）活性成分が有効量のヘパリンフラグメントである
   請求項１記載の薬学的組成物。
5. （５）活性成分が、高分子量のヘパリンフラクシヨン又
   は誘導体、あるいは低分子量成分を欠いたヘパリンであ
   る請求項１記載の薬学的組成物。