JPH0242063A - 酵素活性測定用の化合物、酵素の検出法及び検出用試薬 - Google Patents

酵素活性測定用の化合物、酵素の検出法及び検出用試薬

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JPH0242063A
JPH0242063A JP1152038A JP15203889A JPH0242063A JP H0242063 A JPH0242063 A JP H0242063A JP 1152038 A JP1152038 A JP 1152038A JP 15203889 A JP15203889 A JP 15203889A JP H0242063 A JPH0242063 A JP H0242063A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、アミノ酸で置換された４−アミノピリン（
［４−アミノフェナジン」とも称しつる。）であって酵
素活性を測定するための基質として利用される新規なア
ミドに関するものである。特にこの発明はアミノ酸で置
換された４−アミノピリン、特にグルタミル−４−アミ
ノピリン、であって、置換体アミノ酸がアミノ酸を認識
する酵素により開裂されて４−アミノピリンが生成され
、その４−アミノピリンをアミノ色素中間体として酸化
剤の存在下で第２の色素中間体と反応させてクロモゲン
を生成させるように用いられるところの、アミノ酸で置
換された４−アミノピリンに係る。
〔従来の技術〕
全ゆる肝臓病で血清ガンマグルタミルトランスフェラー
ゼ（ＧＧＴ）が高められる（　Ｍｏ５ｓ、　Ｄ、　Ｗ、
　。
ｅｔ　ａｌ、　　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　　Ｉｎ　＋　’Ｉ
’ｅｉｔｚ、　Ｎ、　Ｗ、　、　ｅｄ、　Ｔｅｘｔｂｏ
ｏｋｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　　Ｃ１１ｅｍｉＣ１１ｅ
、　ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ　：　Ｗ、　Ｂ、　５ａ
ｕｎｄｅｒｓ。
５　：　７２１−７２２　（１９８６））。閉塞性黄痘
、胆管炎及び胆のう炎を検知するためにＧＧＴはアルカ
リンホスワアターゼ、５′−ヌクレオシダーゼ、ロイシ
ンアミノペプチダーゼ、及びトランスアミナーゼ類より
も感受性が大である（Ｍｏｓｓ、　Ｉ）、　Ｗ、、　ｅ
ｔａｌ、　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　　Ｉｎ　：　Ｔｅ１ｔｚ
、　Ｎ、　Ｗ、　、　ｅｄ、　Ｔｅｘｔｂｏｏｋｏｆ　
Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｐｈ１ｌａ
ｄｅｌｐｈｉａ　：Ｗ、　Ｂ、３ａｕｎｄｅｒｓ。
５　：　７２１−７２２　（１９８６））。ＧＧＴの上
昇は上述の他の酵素よりも早期薯こ生じ、より長く持続
する。
血清ＧＧＴの活性測定はアルコールに原因する肝臓病を
検知するのに極めて有用である。アルコール肝硬変症の
患者の血清中のみならず大多数の大酒飲みの血清中にも
、ＧＧＴ濃度の上昇が認められる　（Ｍｏｓｓ、　Ｅｌ
、　Ｗ、、　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　ｉ
ｎ：Ｔｅ１ｔｚ。
Ｎ、　Ｗ、＋　ｅｄ、　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃ１
１ｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｈ１ｌ−ａｄ
ｅｌｐｈｉａ　：　Ｗ、　Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ、　
５　：　７２１−７２２（１９８６））。
ＧＧＴを測定するための当初の方法には生理的な基質グ
ルタチオンを利用する方法（Ｈａｎｅｓ、　Ｃ，Ｓ−。
ｅｔ’　ａｌ、　：Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　５１．２
５−３５　（１９５２））が含まれていたが、これは厄
介であるため早期に合成基質を利用する方法にとって替
られた。Ｎ−（ＤＬ−ガンマ−グルタミル）アニリン（
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｊ　、。
ｅｔ　ａｌ、　：　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　９１　、６１−７０（１９６０）　）
　、Ｌ−ガンマ−グルタミル−ナフチルア　ミ　　ド　
　（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ　、　　Ｍ、、　　ｅｔ　　ａｌ
、　　：　　Ｃ１１ｎ、　　Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ。
７．７５５−７６０　（１９６２））　、及びＬ−ガン
マ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド（５ｚａｓｚ、　
Ｇ　、　。
Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　１５．１２４−１３６　　（
１９６９））のような合成基質の利用法は全て開裂生成
物からの色素の生成を伴なうが、日常的に利用するのに
は一定の限界がある。ビーティ　（Ｂｇａｔｙ）等に附
与された米国特許Ｎα４，５１１，６５１及びベック（
Ｂｇｃｋ　）等に附与された米国特許Ｎα４，５６７．
１３８も、参照されたい。
現在ＧＧＴ活性の測定のために選択されている基質はＬ
−ガンマ−グルタミル−３−カルボキシ−４−−１−ト
ｏ　ア＝　＋）　ト（ｇｌｕｃＡＮＡ　）である（　Ｉ
　ＦＣＣＭｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　Ｍｅ
ａｓｕｒｅｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　
Ｃｏｎ−ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｇｎｚｙｍ
ｅｓ、　Ｐａｒｔ　　４．　ＩＦＣＣＭｅｔｈｏｄｆｏ
ｒ　　ｇａｒｒｍａ−Ｇｕｌｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ、　　Ｃ（ｇａｍｍａ　−Ｇｌｕｔａｍｙｌ）
　　−Ｐｅｐｔｉｄｅ　：　Ａｍ１ｎｏ　　Ａｃ１ｄ　
　ｇａｍｍａ−Ｇｕｌｔａｍｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅ、　ＥＣ２、３、２、２〕、　　１９８３’）。本
基質の高い転換率と溶解度は、それ以前に利用されてイ
タ低溶解度の基質Ｌ−ガンマーグル゛タミルーｐニトロ
アニリド（ｇｌｕＰＡ）　　と対比して一定の長所を附
与する。しかしこれらの両基質ともモル吸光係数が小さ
く、また基質と生成物とが重複するスペクトルを呈し、
色素の吸光ピークにおいてよりむしろスペクトルの肩の
部分で測定を行なわねばならない（Ｆｏｓｓａｔｉ、　
Ｐ、　、　ｅｔ　ａｔ、　：　Ｃ１１ｎ、　（ｈｅｍ。
３２、　１５８１−１５８４（１９８６））。
〔発明課題〕
したがってこの発明の目的とするところは酵素用の基質
として、色素中間体である４−アミノピリンを生成する
のに有用であるところのアミノ酸で置換された４−アミ
ノピリンである新規なアミドを、提供するにある。また
この発明は新規なアミノ酸置換−４−アミノピリンを利
用した酵素検出法と酵素検出試薬を提供することも、目
的とする。さらにこの発明は比較的安価で信頼性が高い
酵素の検出法と検出用試薬を提供することも、目的とす
るものである。
〔−収約な説明〕
この発明は一般式 〔式中、ＲＣ−は２個から６個までの間の炭素原子を含
むアミノ酸基である。〕で表される化合物に係る。
またこの発明は酵素と反応して複素環式アミノ色素中間
体を形成する複素環式化合物へ結合されているアミノ酸
を用いる酵素検出法であり、上記アミノ色素中間体が次
いで第２の色素中間体と結合してクロモゲンを形成する
ものである検出法であって、 （ａ）、一般式 〔式中、ＲＣ−は２個から６個までの炭素原子を含むア
ミノ酸基である。〕で表される化合物を、酵素との反応
により生成されるアミノ酸カルボニル基用の受容体と共
に水溶液の形で設け、（ｂ）、上記化合物を酵素と反応
させて、一般式で表される４−アミノ色素中間体、及び
上記受容体と反応するアミノ酸カルボニル基を形成し、
（Ｃ）、上記した４−アミノ色素中間体を酸化剤の存在
下で第２の色素中間体と反応させて、４−アミノ色素中
間体の４−アミノ基と第２の色素中間体との反応生成物
であるクロモゲン色素複合体を形成する、 ことを特徴とする酵素検出法に係る。
さらにこの発明はグルタミルトランスフェラーゼの検出
法であって、 （ａｌ、　　］−］フェニルー２−メチル−３−メチル
４−グルタミルアミノ−３−ピラゾリン−５−オンを、
酵素とグルタミル基との反応により生成されるグルタミ
ルカルボキシル基用の受容体と共に水溶液の形で設け、 （ｂ）、この水溶液中にグルタミルトランスフェラーゼ
を導入して、アミノ色素中間体としての１−フエニル−
２−Ｎ−メチル−３−メチル−４−アミノ−３−ピラゾ
リン−５−オン及びグリタミルカルボキシル基と上記受
容体との反応生成物を形成し、 （ｃ）、　　］−］フェニルー２−Ｎ−メチル−３−メ
チル４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンを酸化剤及
び第２の色素中間体と反応させて、アミノ色素中間体の
４−アミノ基と第２の色素中間体との反応生成物である
色素複合体を形成する、検出法に係る。
またこの発明は、アミノ酸を開裂してアミノ色素中間体
を形成する酵素を、上記アミノ色素中間体を酸化剤の存
在下で第２の色素中間体と反応させてクロモゲンを形成
することにより検出する酵素検出用試薬であって、 （ａ）、−形成 〔式中、ＲＣ−は２個から６個までの間の炭素原子を含
むアミノ酸基である。〕で表され、上記酵素と反応して
４−アミノ色素中間体を形成する化合物、 （ｂ）、上記した４−アミノ色素中間体と反応してクロ
モゲン色素複合体を形成する第２の色素中間体、 （Ｃ）、上記した４−アミノ色素中間体の４−アミノ基
と第２の色素中間体との間の反応を生じさせて上記クロ
モゲン色素複合体を生成させる酸化剤、及び （ｄ）、上記した化合物が酵素と反応することにより遊
離されるアミノ酸カルボニル基のための受容体、 を含む酵素検出用試薬に係る。
この発明に係る新規化合物は、アミノ酸−４−フエナゾ
ニルアミドまたはＮ−（アミノ酸）−フエナゾニルアミ
ドと称しうる。望ましい化合物は４−グルタミルフェナ
ジンアミドと称しうる。これはまた、グルタミル−４−
フエナゾニルアミドまたはＮ−（グルタミル）−フエナ
ゾニルアミドとも称することができる。グルタミル基は
、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼによって認識
されるし一ガンマー異性体であるのが望ましい。
アミノ酸−４−アミノフェナジンアミドはトランスフェ
ラーゼと反応して４−アミノピリンを生成し、４−アミ
ノピリンは酸化剤の存在下で第２の色素中間体と反応し
てクロモゲン色素複合体を形成する。このクロモゲン色
素複合体は、フェノールとの反応により生成されるとこ
ろの４−アミノピリンの４−モノイミノ誘導体であるの
が望ましい。クロモゲン色素複合体はまた、アミノ基を
含む第２の色素中間体との反応によって生成されるアゾ
誘導体であってもよい。４−アミノ酸フェナゾンアミド
化合物は溶液中で本質的に無色であり、したがって色の
全てがクロモゲン色素複合体によって発現されることか
らして該複合体の測定に対し干渉しない。
グルタミル−４−アミノピリンはガンマ−グルタミルト
ランスフェラーゼ（ＧＧＴ）と反応して色素中間体とし
ての４−アミノピリンを生成し、この４−アミノピリン
はビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＸ　）のような酸化剤
の存在下で２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼン
スルホン酸（ＨＤＣＢＳ）のような第２の色素形成中間
体と反応してクロモゲン色素複合体、特に特定試薬で赤
色を呈する複合体を、形成する。フェリシアン化カリウ
ムのような何れの強力な酸化剤も、クロモゲン色素複合
体の形成反応を促進するために使用することができる。
第２の色素形成中間体としてはフェノール化合物が適当
しており、その例としては２−ヒドロキシー３，５−ジ
クロロベンゼンスルホン酸、２゜５−ジメチルフェノー
ル、及び一般にフェノール類、ナフトール類とそれらの
誘導体がある。酸化剤としてのオキシダーゼには例えば
ビリルビンオキシダーゼ、アスコルバートオキシダーゼ
、ラッカーゼ、及び過酸化水素または有機過酸化物と共
に用いるペルオキシダーゼ或はマイクロペルオキシダー
ゼ（チトクロムＣ分子のヘム部分）がある。
化学的な酸化剤としては例えばフェリシアン化カリウム
がある。アゾ色素複合体を形成するための中間体として
は例えばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロオキシ−３−ス
ルホノピリル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピルアニリン、或はＮ−スルホプロピルアニリ
ンがある。複素環式アミノ化合物を用いて種々のクロモ
ゲン色素複合体を形成する方法は周知であり、アーチス
（Ａｒｔｉｓｓ）等によりＭｉｃｒｏｃｈｅｒ′ｒＩｉ
ｃａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　２６．４８７５０５（１９
８１）に記載されている。Ｋ　、　’Ｉ’ａｍａｏｋｕ
。
ｅｔａｌ＞知ａ１．　Ｃｈｉｒｒｈ　Ａｃｔａ　　１３
６．１２１　（１９８２）及び　Ｃｈｅｍ、　　　Ｐｈ
ａｒｍ　　Ｂｕｌ’１．　３　０．　　２４９２（１９
８２）に記載されているようなトリンダー試薬（Ｔｒｉ
ｎｄｅｔ’ｓＲｅａｇｅｎｔｓ　）を、用いることがで
きる。
受容体としては例えば、４−アミノ酸フエナゾンのアミ
ド基から開裂されるカルボニル基と反応するグリシルグ
リシン（ｇｌｙ）を用いることができる。他の受容体と
しては例えば、グリシルグリシルグリシン或は水がある
。
検出可能な酵素にはＬ−ガンマ−グルタミルトランスフ
ェラーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、グリシルトラ
ンスペプチダーゼ等がある。アミノ酸は酵素に対応させ
て選択される。
この発明に係る化合物は構造式 で表され、式中φはフェニル、ＲＣはアミノ酸基である
。好ましいＲＣはグルタミル基であり、この基をもつ化
合物は通称でグルタミル−４−アミノピリンまたはグル
タミル−４−アミノフェナジンと称しえ、より正確には
１−フエニル−２−メチル−３−メチル−４−グルタミ
ルアミノ−３−ピラゾリン−５−オンと称しうる。好ま
しい他のＩ ＲＣＮＨ−基は アラニル、 酸（或は他のアミノ酸）、例えばＮ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−
グルタミン酸−アルファーベンジルエステル（ここにｔ
−ＢＯＣはｔ−ブチルオキシカルボニル）を、ジシクロ
へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び溶剤（例えばジ
オキサン或はテトラヒドロフラン）の存在下で４−アミ
ノピリンと先ず０℃で、次に常温で反応させることがで
きる。αマスクの生成物を反応混合物から分離精製し、
次に塩化メチレン中でトリフルオル酢酸によりＢＯＣ基
を除去し、水素添加分解によりアルファーベンジル基を
除去して、グルタミル−４−アミノピリンを遊離させう
る。反応式は次のようである。
ＮＨ２ＣＨ２Ｃ−ＮＨ＝ である。
アミノ酸−４−アミノピリンを調製するためには両アル
ファ官能基をマスキングしたグルタミン（工Ｖ） （Ｖ） （エエエ） 他の可能な合成法はＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１９
．　７８．．９−７９７　（１９７０）、Ｊ　、　Ｃｈ
ｅｍ、　　ＳＯ，Ｃ，３３１５（１９４９）、Ｊ、　Ａ
ｍｅｒ、　（：ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　７２．２４６９（
１９５０）から類推して、またＪ、Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ
、　８８６　（１９５７）に類似して出発無水物の合成
、ガンマ−アミド結合の形成、及び次いでのヒドラジン
水和物を用いた脱フタロイルといった、次の式で表され
る方法である。
化合物グルタミル−４−アミノピリンはまた、Ｌ−ガン
マ−グルタミン酸メチルエステルを溶剤（クロロホルム
）中での塩基の存在下で４−アミノピリンと反応させる
ことによっても製造できる。
得られた化合物は使用に供するため、残留アミノを除去
するように精製しなければならない。
以下にグルタミル−４−アミノピリンを製造するための
好適した方法を記載する。
工程１ａ Ｎ−（ｔ−ＢＯＣ）−グルタミン酸−α−ベンジルエス
テル（３３，７重量部（ｐｂｗ　−ｐａｒｔｓ　ｂｙ　
ｗｅｉｇｈｔ））トリエチルアミノ（１０，１ｐｂｗ　
）とをクロロホルムに溶かした溶液を０℃に冷却して撹
拌し、クロルギ酸イソブチル（１３，７ｐｂｗ）を１滴
ずつ加えて行った。浴を取去り、反応混合物を１６時間
撹拌した。この時点で４−アミノアンチピリン（２０３
ｐｂｗ　）を少しずつ加え、反応混合物を常温で１晩撹
拌した。その反応混合物を真空中でストリッピング処理
した。残分を酢酸エチルと共に微細化し、濾過した。ｐ
液を真空中でストリッピング処理し、ガラス状の残分を
得た。ＮＭＲ及びＭＳ分析により予期した通りの構造を
確認した。粗製品の収量は実質的に定量的であった。
工程１ｂ Ｎ−ＣＢＺ−クルタミン酸−α−ベンジルエステル（５
０ｐｂＷ）とトリエチルアミノ（１５ｐｂｗ　）の冷却
−（０℃）クロロホルム溶液に、クロロギ酸イソブチル
（２０，３ｐｂｗ　）を１滴ずつ加えた。反応混合物を
常温で１晩、撹拌した。その反応混合物を真空中でスト
リッピング処理し、雪泥状の残分を酢酸エチルと共に撹
拌した。この混合物を濾過し、ｐ過ケークを酢酸エチル
で洗滌した。有機物Ｐ液を希ＨＣＩ　、水、重炭酸ナト
リウムの着水溶液及び水で洗浄し、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥させた。乾燥剤をｐ過除去した上で有機物溶液
を真空中でストリッピング処理し、橙赤色の粘性な油を
９７％の収率で取得した。薄層クロマトグラフィー（シ
リカゲル、酢酸エチル中にエタノール′２％）による分
析でいくつかの僅かな不純物が存在することが示された
。取得物質をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラ
フィー法（酢酸エチル中にエタノール２９６゜空気圧で
駆動する類カラムクロマトグラフィー法□Ｗ、　ＣＩａ
ｒｋ　３ｔｉｌｌ　　ｅｔａｌ、：　　Ｊ、　Ｑｒｇａ
ｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４３．２９２３（１９７
８）参照）で精製した。製品はレモン様の黄色の固体と
して得られた。ＮＭＲ及びＭＳ分析により構造を確認し
た。
工程２ａ：脱ベンジル Ｎ　−（ｔ　−ＢＯＣ）　−４−（γ−グルタミルアミ
ド）−アンチピリン−α−ベンジルエステル（４２２ｐ
ｂｗ　）のジメチルホルムアミド溶液に、ギ酸アンモニ
ウム（３０，０ｐｂｗ　）を加えた。混合物を、炭素（
３０，０ｐｂｗ　）上の１０％パラジウムを加えながら
撹拌した。撹拌は出発物質が薄層クロマトグラフィー（
シリカゲル、酢酸エチル中にメタノール３％）上で認め
られなくなる迄、継続した。これには約１時間を要した
。反応混合物を短長のＣｅ１ｉｔｅ　（登録商標）層を
通して吸引濾過した。Ｐ液を高真空中において、ジメチ
ルホルムアミドの大部分を除去した。残分を酢酸エチル
中にとり、飽和食塩水で洗滌し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥させた。有機物溶液を濾過し、ｐ液を真空中でス
ｌ−ＩＪッピング処理して純白でない粘性の油を収穫し
た。組物質の収率は９８９６であった。ＮＭＲ及びＭＳ
分析によって構造を確認した。
窒素雰囲気下で無水のアセトニｌ−ＩＪルに溶かしたＮ
　−（ｔ　−ＢＯＣ）　−４−（γ−グルタミルアミド
）−アンチピリン（２１，６ｐｂｗ）の溶液に、ヨウ化
ナトリウム（２２，５ｐｂｗ　）を加えた。混合物を、
澄んだ溶液が得られるまで常温で撹拌した。
？−１／）　溶液に塩化トリメチルシリル（１０，８ｐ
ｂｗ）を、いちどに加えた。薄層クロマトグラフィー（
シリカケル、１９６の酢酸を含む酢酸エチル中にメタノ
ール１０％）により出発物質が認められなくなる迄、約
２時間撹拌を続けた。反応混合物にメタノールを加え、
１５分間撹拌した上で冷蔵庫に１晩おいた。反応混合物
を真空中でス）　ＩＪッピング処理し、残分をエーテル
と３０９６の酢酸水溶液とに分配させた。水溶液相を、
エーテルを加えて洗浄し、次に数粒の重亜硫酸ナトリウ
ム結晶を加えて脱色した。溶液をＡｍｂｅｒｌ　ｉｔｅ
　（登録商標）ＸＡＤ−２レジン床（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈ
ａａｓ　Ｃｏ、製）を通過させ、最初蒸留水で、次に１
：１のエタノール蒸留水で、溶離処理した。水・エタノ
ールによる溶出液を真空中でストリッピング処理して、
所望の生成物を淡黄色ガラス状の形で得た。ＮＭＲ及び
ＭＳ分析により構造を確認した。
無水エタノールにＮ−ＣＢＺ−４−（γ−グルタミルア
ミド）−α−ベンジルエステルを溶かした溶液を、炭素
上の】０％Ｐｄを触媒として用い３気圧の水素ガスで処
理した。水素の理論量の消費が認められたときに薄層ク
ロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸１９６を含む酢酸
エチル中にメタノール１０９６）は、出発物質の痕跡も
示さず工程３ａで得た物質と同一のＲｆ　　を有する斑
点を示した。
反応混合物を、短長のＣｅ１ｉｔｅ　（登録商標）層を
通して吸引濾過した。Ｐ液を真空中でストリッピング処
理した。残分である所望の４−（γ−グルタミルアミド
）−アンチピリンを、純白でない固体として取得した。
構造はＮＭＲ及び質量分析により確認した。この物質が
工程３ａで得た物質と同一であることは高性能液体クロ
マトグラフィー（ＨＰｉ、Ｃ）により、試料を個別的に
共通するカラムに注入して通すことによって示された。
反応過程を次頁に示す。次頁においてｒＲＪは基Ｃ６Ｈ
６ＣＨｆ−を、また［ｐｒｏｔＪはＢＯＣとかＣＢＺと
いったマスキングに用いた基を、それぞれ示している。
″″３ 区 〔明細な説明〕 以下に述べる実施例は、供与体基質を用いてガンマ−グ
ルタミルトランスフェラーゼの活性を測定する例に係る
。
血清中のガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧ
Ｔ）の活性を測定する比色法において供与体基質である
し一ガンマーグルタミルー４−アミノピリン（ｇＡＡＰ
）を、開裂されるカルボニル部分のための受容体として
のグリシルグリシン（ｇＩｙ）と共に用いる。２−ヒド
ロキシ−３，５−ジクロルベンゼンスルホル酸はビリル
ビンオキシダーゼ（ＢＯＸ　）の存在下で、遊離される
生成物４−アミノアンチピリン（４ＡＡＰ）と反応して
赤色の色素複合体を生じさせる。この色素複合体の吸光
ピークは５１０ｎｍで現れる。供与体基質は可視スペク
トルの全体にわたって吸光性を示さない。
反応は全ての試薬を単一の作業溶液に含ませた単一のキ
ュベツト中でおこる。本方法は自動化に適している。
本方法は呈色生成物を形成するのに無色の供与体基質を
用いる点で有利である。ＧＧＴは、ｇＡＡＰからガンマ
−グルタミルを奪取して生ぜしめられるカルボニル基を
グリシルグリシンに引渡す。４−アミノアンチピリンが
遊離されて、ＢＯＸの存在下でＨＤＣＢＳ　（２−ヒド
ロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸）と結合
して赤色の色素複合体を形成する。試料中に存在するＧ
ＧＴの活性に比例する１分毎の吸光度の変化から、反応
を動的に鑑視できる。ＢＯＸはペルオキシダーゼ類似の
活性を示すラッカーゼ或はアスコルバートオキシダーゼ
等の他の酵素に置き換え得、また過酸化水素または有機
過酸化物の存在下でペルオキシダーゼ或はマイクロペル
オキシダーゼ自体に置き換え得る。
材料と方法 菜垂・・・温度制御可能なキュベツト保持器を備えたＵ
Ｖ−２６０複光束分光計（日本国家都市の３　ｉｍａｄ
ｚｕ製）を使用した。
材料・・・ＢＯＸ　（ビリルビンオキシダーゼ）はアメ
リカ合衆国、バージニア州、トロイのＡｍａｎｏ　Ｉｎ
−ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ、から購入した。Ｂ
ＯＸの１単位を、ｐ）（７，Ｏ、温度３７℃で１分間に
１μｍｏｌのビＩＪ　）レビンを酸化する酵素の量で定
義した。ＨＤＣＢＳ（２−ヒドロキシ−３，５−ジクロ
ロベンゼンスルホン酸）は、スイス国、チューリッヒの
ＢｉｏｓｙｎｔｈＡＧから入手した。ウシＧＧＴ、グリ
シルグリシン及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００はアメリカ
合衆国、ミズーリ州、セントル４　、スのＳｉｇｍａ　
　Ｃｈｅｒｒｉｉｃａｌ、Ｃｏ−力）ら購入し、Ｔｒｉ
ｓ（ヒドロオキシメチル）アミノメタンはアメリカ合衆
国、ニューシャーシー州、７ｚアローンのＦｉｓｈｅｒ
　　３ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｃｏ、から購入した。
試薬・・・単一試薬は１１当りＢＯＸ５０００単位、ｇ
ＡＡＰ　２０．ＯｍｍｏｌＳＨＤ　ＣＢ　Ｓ　１３．０
ｍｍｏｌ　、グリシルグリシ：ｙ　５．０　ｍｍｏｌ、
５０ｍｍｏｌ／Ｊ？のＴｒｉｓ　−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７，９）中でＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００１５ｇを含む。
ＧＧＴの標準品も、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍｍ
ｏｌ／　ｌ　、　　ｐＨ７，９）で調製した。
手順・・・１０マイクロリットルの標準ＧＧＴを、１、
ＯＭｔの試薬に加えた。１２０秒間の導入期後薯こ５１
０ｎｍ、３７℃での吸光度の変化を１８０秒間、記録し
た。反応はブランク試薬におけるのと対照的に進行する
。
活性度の計算・・・活性度Ｕ／Ｌ＝（△Ａ／分）Ｘ力価
。
ここに力価＝（全容量（−）／試料容量（−））Ｘ（モ
ル／マイクロモル）１モル吸光係数＝　（１，０１１０
，０１）Ｘ（１０６／２６，０００）、＝３８８５結果 成分の濃度・・・反応は、１リツトルの緩衝溶液中にＨ
ＤＣＢＳ　１３．０ｍｍｏｌ　、グリシルクリシン５．
０ｍｍｏｌ、ｇＡＡＧ　２０．０　ｍｍｏｌ　、ＢＯＸ
　５００単位が含まれるとき反応混合物中に最大のＧＧ
Ｔ活性が生ぜしめられるように、最適となった。
色素のモル吸光係数・・・赤色の色素複合体のモル吸光
係数を、ｇＡＡＰｉｃ代えテ４ＡＡＰＩ７）増分ヲ０．
１００とｉ、ｏ　ｏ　ｏ間の吸光度値が与えられるよう
各種濃度の色素を定量的に生じさせるようにして加える
ことにより、測定した。５１０ｎｍでの色素のモル吸光
係数は２６．０００　Ｌ　ｍｏｌ　ａｇ　　であると算
出された。
ｇＡＡＰについて、ラインウイーヴアー・グルタ（Ｌｉ
ｎｅｗｅａｖｅｒ　−Ｅ３ｕｒｋ　）法でのプロットに
線形回帰して求めた。本酵素のＮ−（ガンマ−Ｌ−グル
タミル）−アルファーナフチルアミドを基質トする画分
Ａ及びＢについての読値が６．３及び６．８ｍｍｏｌ／
ｌであると報告されている（　３ｚｅｗｅｚｉｃｋ、　
Ａ、　、　ｅｔａｌ、　　：　＝Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃ
ｈｅ　　Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ３３８　３１７−３２
９（１９６３））のに対し、ＧＧＴの読値は約９．９ｍ
ｍｏｌ／４であると算出された。他の文献（Ａｌ　ｆｅ
ｎ、　Ｌ−Ｍ−。
ｅｔ　ａｌ、　：　Ｃｈｅｍ、　−１３ｉｏ！、　Ｉｎ
ｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ３３，３６１−３６５（１９８１
））では、ガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを
基質としてウシの腎臓ＧＧＴの膓とｖｍａＸがそれぞれ
、０．９８ｍｍｏ！／　（ｌ及び１７７マイクロモル／
分／ηであると報告されている。発明者が得たＶｍａｘ
は３６．８マイクロモル／分／■であった。
吸収スペクトル・・・生成物の最大吸収は５１０ｎｍで
みられた。供与体基質は可視スペクトルの全体にわたっ
て吸収を示さなかった。
反応経過・・・３７℃で５１０ｎｍにおけるＧＧＴの反
応速度は約２分後に直線的になった。
考察 この発明は高モル吸光係数をもつ赤色生成物を形成する
ところの新規な無色の供与体基質ｇＡＡＰを、利用する
ものである。前述したｇｌｕｃＡＮＡ或はｇｌｕＰＡを
利用する方法でみられていた基質と生成物とのスペクト
ルの重複は何ら存在せず、また試料量も１０分の１　（
１ｏｏｄから１０μ！りに減少する。
本基質の優れた溶解性、スペクトル特性、高い感受性、
及び自動化に対する適応性からして、本発明は汎用され
ているｇＩ　ｕ　ＣＡＮＡ或はｇｌｕＰＡによる方法の
好ましい代替法を提供する。
本方法は血清中のガンマ−グルタミルトランスフェラー
ゼ活性を測定するのに、特に有用である。
赤血球を除去して適当量の血清を、本発明の試薬と接触
させればよい。赤血球の除去は遠心分離或は濾過によっ
て行なわれる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、▲数式、化学式、表等があります▼は２個から
    ６個までの間の炭素原子を含むアミノ酸基である。〕で
    表される化合物。 ２、前記アミノ酸基がグルタミル基である、請求項１に
    記載の化合物。 ３、前記アミノ酸基がＬ−ガンマ−グルタミルである、
    請求項１に記載の化合物。 ４、前記アミノ酸基がアラニニル基である、請求項１に
    記載の化合物。 ５、アミノ酸を結合したアミノ色素中間体を用いる酵素
    検出法であつて、アミノ酸が酵素により上記アミノ色素
    中間体を形成するように開裂され、次に該アミノ色素中
    間体が第２の色素中間体と結合してクロモゲンを形成す
    る酵素検出法において、（ａ）、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、▲数式、化学式、表等があります▼は２個から
    ６個までの炭素原子を含むアミノ酸基である。〕で表さ
    れる化合物を、酵素との反応により生成されるアミノ酸
    カルボニル基用の受容体と共に水溶液の形で設け、 （ｂ）、上記化合物を酵素と反応させて、一般式▲数式
    、化学式、表等があります▼ で表される４−アミノ色素中間体及び上記受容体と反応
    するアミノ酸カルボニル基を形成し、（ｃ）、上記した
    ４−アミノ色素中間体を酸化剤の存在下で第２の色素中
    間体と反応させて、４−アミノ色素中間体の４−アミノ
    基と第２の色素中間体との反応生成物であるクロモゲン
    色素複合体を形成する、 ことを特徴とする酵素検出法。 ６、前記した第２の色素中間体がアニリン、ナフトール
    またはフェノール化合物であり、前記したクロモゲン色
    素複合体が前記化合物の４−モノイミノ誘導体である、
    請求項５に記載の酵素検出法。 ７、前記した第２の色素中間体が２−ヒドロオキシ−３
    ，５−ジクロロベンゼンスルホン酸である、請求項５に
    記載の酵素検出法。 ８、グルタミルトランスフェラーゼの検出法であつて、 （ａ）、１−フエニル−２−Ｎ−メチル−３−メチル−
    ４−グルタミルアミノ−３−ピラゾリン−５−オンを、
    酵素とグルタミル基との反応により生成されるグルタミ
    ルカルボキシル基用の受容体と共に水溶液の形で設け、 （ｂ）、この水溶液中にグルタミルトランスフェラーゼ
    を導入して、アミノ色素中間体としての１−フエニル−
    ２−Ｎ−メチル−３−メチル−４−アミノ−３−ピラゾ
    リン−５−オン、及びグリタミルカルボキシル基と上記
    受容体との反応生成物を形成し、 （ｃ）、１−フエニル−２−Ｎ−メチル−３−メチル−
    ４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンを酸化剤及び第
    ２の色素中間体と反応させて、アミノ色素中間体の４−
    アミノ基と第２の色素中間体との反応生成物である色素
    複合体を形成する、検出法。 ９、前記した第２の色素中間体が２−ヒドロオキシ−３
    ，５−ジクロロベンゼンスルホン酸である、請求項８に
    記載の検出法。 １０、前記酸化剤が酸化酵素である、請求項９に記載の
    検出法。 １１、前記酸化酵素がビリルビンオキシダーゼである、
    請求項１０に記載の検出法。 １２、前記酸化剤がフェリシアン化カリウムである、請
    求項９に記載の検出法。 １３、アミノ酸を開裂してアミノ色素中間体を形成する
    酵素を、上記アミノ色素中間体を酸化剤の存在下で第２
    の色素中間体と反応させてクロモゲンを形成することに
    より検出する酵素検出用試薬であつて、 （ａ）、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物であつて、上記酵素と反応して一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される４−アミノ色素中間体を形成する化合物、 （ｂ）、上記した４−アミノ色素中間体と反応してクロ
    モゲン色素複合体を形成する第２の色素中間体、 （ｃ）、上記した４−アミノ色素中間体の４−アミノ基
    と第２の色素中間体との間の反応を生じさせて上記クロ
    モゲン色素複合体を生成させる酸化剤、及び （ｄ）、上記した化合物が酵素と反応することにより遊
    離されるアミノ酸カルボニル基のための受容体、 を含む酵素検出用試薬。 １４、前記化合物を表わす一般式中のＲがグルタミル基
    である、請求項１３に記載の酵素検出用試薬。 １５、前記した第２の色素中間体がフェノール化合物で
    あり前記したクロモゲン色素複合体が４−モノイミノ化
    合物である、請求項１４に記載の酵素検出用試薬。 １６、前記フェノール化合物が２−ヒドロオキシ−３，
    ５−ジクロロベンゼンスルホン酸である、請求項１５に
    記載の酵素検出用試薬。 １７、前記酸化剤が酸化酵素である、請求項１６に記載
    の酵素検出用試薬。 １８、前記酸化酵素がビリルビンオキシダーゼである、
    請求項１７に記載の酵素検出用試薬。 １９、前記酸化剤がフェリシアン化カリウムである、請
    求項１３に記載の酵素検出用試薬。
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