JPH024279B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血清アルカリ性ホスフアターゼ活性
の測定方法に関し、特にチモールフタレインモノ
燐酸を基質として活性を測定する方法において、
ジエタノールアミン・塩酸緩衝液を使用すること
により測定の正確さと信頼性を高めたものであ
る。

アルカリ性ホスフアターゼは燐酸エステルを加
水分解する酵素で、生体中では腎の近位尿細管、
肝の毛細胆管、乳線、小腸繊毛、骨芽細胞、胎盤
などに在存し、その局在が細胞膜であることか
ら、膜を通しての能動輸送に関与しているとされ
る。従つて、血清アルカリ性ホスフアターゼを測
定することは、肝、胆道疾患、骨疾患あるいは妊
娠の結過観察などの鑑別診断に有用であり、今日
では日常スクリーニング検査として広く行なわれ
ている。その測定方法は、シノワラ
（Shinowara）等の方法、ベツシイ−ロウリイ
（Bessey−Lowry）法、およびカインド−キング
（Kind−King）法などの報告により基礎が確立
し、更に基質として各種のモノ燐酸エステルを用
いた測定法が試みられ、例えばバブソン
（Babson）等により提案されたフエノールフタレ
インモノ燐酸を基質として用いる方法（Ａ・Ｌ・
Babson・Clin・Chem・・12・(8)482（1966））等
がある。しかし、これらの測定法は、血清中の共
存物質であるヘモグロビン、ビリルビン、および
混濁などの影響をうけ、正確な測定値が得られな
い場合も少くない。

その後、これらの方法を改良した全く新しい測
定法が提案された（Ａ・Ｖ・Roy・Clin・
Chem・・16・(5)431（1970））。その方法（以下ロ
イの方法という）は、基質としてチモールフタレ
インモノ燐酸を使用し、２−アミノ−２−メチル
−１−プロパノールを緩衝成分とした、37℃・10
分間測定によるもので、従来法に比し感度が良
く、前記のような血清中の共存物質の影響を殆ん
ど受けずに測定することが可能となつた。しかし
ながら、その基質緩衝液は、冷蔵・密栓保存する
と、わずか１ケ月でPHが0.05以上変化し、かつ測
定における盲検値の上昇が著しいなど、日常検査
に適用するには安定性に乏しく、測定の信頼性に
欠けるという問題がある。

本発明は、上記のロイの方法の欠点を解消した
もので、緩衝液として、２−アミノ−２−メチル
−１−プロパノールに代え、ジエタノールアミン
を使用することにより、基質およびPHの安定性を
高め、少くとも６ヶ月間はアルカリ性ホスフアタ
ーゼを正確に測定することを可能にしたものであ
る。

以下、本発明について詳しく説明する。

本発明によれば、基質としてチモールフタレイ
ンモノ燐酸を含むジエタノールアミン・塩酸緩衝
液を検体に加え、遊離するチモールフタレインを
アルカリ性で発色させ、その吸光度を測定するこ
とにより、アルカリ性ホスフアターゼ活性の正確
な値が求められる。

本発明測定法に使用される試薬は、チモールフ
タレインモノ燐酸を含む基質緩衝液と、反応を停
止させ、かつ遊離したチモールフタレインを発色
させるためのアルカリ性反応停止液、およびチモ
ールフタレインを一定濃度含有する標準液とから
成る。基質緩衝液は、ジエタノールアミン・塩酸
緩衝液に、チモールフタレインモノ燐酸（溶解性
の点より、ナトリウム塩、マグネシウム塩、アン
モニウム塩などが用いられる）、アルカリ性ホス
フアターゼの賦活剤（好ましくは、塩化マグネシ
ウムなど）、およびチモールフタレインの析出沈
澱を防止するための界面活性剤（好ましくは、
Brij−35など）、更に必要なら防腐剤（例えば、
アジ化ナトリウムなど）を配合してなるもので、
基質であるチモールフタレインモノ燐酸の濃度は
0.15〜0.2％、液PHは9.75〜9.85（37℃）に調製さ
れたものが好ましい。反応停止液は、水酸化ナト
リウムと炭酸ナトリウムを含む水溶液であり、そ
の濃度はそれぞれ0.1M程度でもよいが、約0.5M
前後の高濃度に調節することにより、反応停止
後、未遊離のチモールフタレインモノ燐酸に起因
する黄色を退色させ、吸光度測定において遊離し
たチモールフタレインの青色を正確に反映させる
ことができる。標準液は、アルコール水溶液にチ
モールフタレインを界面活性剤（好ましくは、
Brij−35など）にて溶解したもので、チモールフ
タレイン濃度は0.1〜0.2％が適当である。上記各
試薬の好ましい組成例を示せば下記のごとくであ
る。

基質緩衝液： チモールフタレインモノ燐酸ナトリウム
…3mM Brij−35 …0.5（Ｗ／Ｖ）％ 塩化マグネシウム …1mM アジ化ナトリウム …0.1（Ｗ／Ｖ）％ 上記を含む0.6Mジエタノールアミン・塩酸緩
衝液（PH9.80±0.05・液温37℃。

反応停止液： 水酸化ナトリウム …0.5M 炭酸ナトリウム …0.5M 標準液： チモールフタレイン …3mM Brij−35 …1.5（Ｗ／Ｖ）％ 上記を含む60％エタノール水溶液。

本発明に使用される各試薬の調製後の安定性
を、ロイの方法におけるそれと比較すれば、下記
のように、両者の反応停止液、標準液の室温での
安定性はかわらないが、基質緩衝液のPHおよび基
質の安定性の点で本発明の方がすぐれており、日
常検査の観点から、本発明測定法の信頼性が高い
ことがわかる。

基質緩衝液（温度２〜８℃保存） 本発明：12週間PHの変化なし、 ロイ：３週間でPH0.05低下。

反応停止液（密栓保存） 本発明：変質なし ロイ：変質なし 標準液（密栓保存） 本発明：変質なし ロイ：原液のみ不変（但し、２−アミノ−２−
メチル−１−プロパノール・塩酸緩衝液で100倍
希釈した使用液は長期保存でチモールフタレイン
が析出する）。

盲検のブランク値 本発明：６ヶ月で10％上昇 ロイ：１ヶ月で30％上昇。

本発明測定法の実施例について説明すれば、ま
ず小試験管３本を用意し、それぞれ検体、標準、
盲検とし、それぞれに基質緩衝液0.5mlを加え、
37℃で５分間加温する。ついで各試験管に血清、
標準液、精製水を0.05mlずつ加え混和して正確に
10分間反応させる。その後、反応停止液をそれぞ
れ５mlずつ加えよく混和し、37℃で15分間加温す
ると、アルカリ性ホスフアターゼによつて遊離し
たチモールフタレインが発色する。その発色はア
ルカリ性ホスフアターゼ活性と比例するから、盲
検を対照として標準と検体の590nmにおける吸光
度を測定すれば、下式により検体の活性が求めら
れる。

検体の活性＝検体の吸光度／標準の吸光度×標準の活
性値 上記測定により30検体について得られた測定結
果を第１図に示す。図は、アルカリ性ホスフアタ
ーゼの標準的な測定法とされているカインド−キ
ング法による同一検体について得られた測定値と
対比したものである。図から明らかなように、カ
インド−キング法による測定値が正常値（2.7〜
10King−Armstrong単位）であつた19検体は本
発明法による測定値もすべて正常値を示し、カイ
ンド−キング法で異常値を示した11検体は、多少
値のことなるものもあるが本発明法による測定値
も同様の異常値を示しており、両法の測定値の間
には高い相関関係が認められ（相関係数γ＝
0.9678）、その回帰式として、Ｙ＝1.006X＋1.237
（Ｙ：カインド−キング法の測定値、Ｘ：本発明
法の測定値）が得られた。

また、異常値を示した検体のうち、本発明法測
定値とカインド−キング法測定値とが著しく異な
る２検体ａとｂについてみると、本発明法測定値
（ａ：11.4K−Ａ単位、ｂ：12.0K−Ａ単位）は正
常値に近いのに対し、カインド−キング法測定値
（ａ：21.3K−Ａ単位、ｂ：21.7K−Ａ単位）は著
しく高い。そこで、この２検体についてアイソザ
イムを検索した結果、２検体とも、肝、骨に由来
するアルカリ性ホスフアターゼの値には異常はな
く、小腸由来のそれが高いことがわかつた。すな
わち、上記２検体について本発明測定法が正常値
に近い低い値を示したのは、本発明測定法の基質
であるチモールフタレインモノ燐酸が、カインド
−キング法の基質であるフエニル燐酸よりも、小
腸由来のアルカリ性ホスフアターゼに対する基質
特異性が低いことに起因する。通常、疾患の体外
鑑別診断のためのアルカリ性ホスフアターゼの測
定においては、肝、骨由来のそれが測定対象とな
ることからすれば、小腸由来のそれに対する基質
特異性の低い本発明法により得られる測定値は、
カインド−キング法のそれに比し、より正確にア
ルカリ性ホスフアターゼの異常の有無を反映てい
ると言うことができる。また、このことを利用
し、カインド−キング法と併用すれば、小腸由来
のアイソザイムを検出することも可能である。

本発明測定法は、従来のロイの方法に比し、日
常検査に適しており、正確な測定値を得ることが
できる。また、現在標準的な方法とされているカ
インド−キング法とくらべても、鑑別診断用とし
てすぐれている。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法とカインド−キング法によ
る血清アルカリ性ホスフアターゼ測定値を示すグ
ラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 基質としてチモールフタレインモノ燐酸を含
   むジエタノールアミン・塩酸緩衝液を検体に加
   え、遊離するチモールフタレインをアルカリ性に
   て発色させ、その吸光度を測定してアルカリ性ホ
   スフアターゼ活性を求めることを特徴とする血清
   アルカリ性ホスフアターゼ活性測定方法。