JPH0242975A - 酵母の育種方法及び関連ベクター - Google Patents
酵母の育種方法及び関連ベクターInfo
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- JPH0242975A JPH0242975A JP19069288A JP19069288A JPH0242975A JP H0242975 A JPH0242975 A JP H0242975A JP 19069288 A JP19069288 A JP 19069288A JP 19069288 A JP19069288 A JP 19069288A JP H0242975 A JPH0242975 A JP H0242975A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、酵母の育種方法及び関連ベクターに関するも
のである。
のである。
本発明は、酵母、例えばパン酵母の優良株を得るだめに
、計画的に、染色体の特定部位間で組換えを起こし、育
種する方法に関するものである。
、計画的に、染色体の特定部位間で組換えを起こし、育
種する方法に関するものである。
本発明の方法によれば染色体の組換え頻度は著しるしく
高まり、酵母の優先株を得るのにきわめて有利であり、
酵母を利用する発酵工業に益するところ大なるものがあ
る。
高まり、酵母の優先株を得るのにきわめて有利であり、
酵母を利用する発酵工業に益するところ大なるものがあ
る。
（従来技術）
パン酵母では古くから優良株を得るために育種が行なわ
れている。しかし、その育種法は突然変異によるもの、
もしくは、自然に起こる相同染色体間の組換えを利用し
たものに過ぎなかった。この、自然に起る組換えは、頻
度が低く、各相同染色体同志の相同部位で、それぞれが
ほぼ同頻度で全く不特定に起るために、組換え部位の制
御が不可能であり、その結果、非常に多くの種類の子孫
が生じることになり、目的とする染色体の組換えのみが
起った株を得ることは、非常に困難であった。
れている。しかし、その育種法は突然変異によるもの、
もしくは、自然に起こる相同染色体間の組換えを利用し
たものに過ぎなかった。この、自然に起る組換えは、頻
度が低く、各相同染色体同志の相同部位で、それぞれが
ほぼ同頻度で全く不特定に起るために、組換え部位の制
御が不可能であり、その結果、非常に多くの種類の子孫
が生じることになり、目的とする染色体の組換えのみが
起った株を得ることは、非常に困難であった。
又、最近になって、非相同染色体間に相同性を持たせる
ことによる、組換え部位を限定した組換えの試み（例え
ば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８５年）も成されてい
るが、頻度がきわめて低く、効率の良いものではない。
ことによる、組換え部位を限定した組換えの試み（例え
ば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８５年）も成されてい
るが、頻度がきわめて低く、効率の良いものではない。
さらには、特定部位に限定した、高頻度な染色体の組換
え技術は未だ開発されていない。
え技術は未だ開発されていない。
（発明が解決しようとする問題点）
従来のパン酵母の育種法は突然変異によるものも、相同
染色体間の組換えによる（交雑法）ものも、偶然に依存
したものであり、優良株のスクリーニングには多大の労
力を必要とする欠点があった。
染色体間の組換えによる（交雑法）ものも、偶然に依存
したものであり、優良株のスクリーニングには多大の労
力を必要とする欠点があった。
非相同集体間で相同領域を持せることによる組換えの例
は、染色体の特定部位間の組換えといえるが、自然に起
る組換えよりも、さらに頻度が低く、育種への応用は事
実上不可能であった。
は、染色体の特定部位間の組換えといえるが、自然に起
る組換えよりも、さらに頻度が低く、育種への応用は事
実上不可能であった。
又１本発明と同様の組換え技術は、パン酵母（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に含ま
れる、２μｍＤＮＡの、分子内組換え系を利用しても可
能であると考えられるが、大多数のパン酵母中に、２μ
ｍＤＮＡが内在しているために、組換えタンパク質遺伝
子は常に発現した状態にあり、組換え時期の制御をする
ことは不可能といわなければならない。
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に含ま
れる、２μｍＤＮＡの、分子内組換え系を利用しても可
能であると考えられるが、大多数のパン酵母中に、２μ
ｍＤＮＡが内在しているために、組換えタンパク質遺伝
子は常に発現した状態にあり、組換え時期の制御をする
ことは不可能といわなければならない。
パン酵母を含む酵母の育種法において、組換えの頻度が
高く、かつ、組換えの制御が可能な方法の開発が待たれ
ていたのである。
高く、かつ、組換えの制御が可能な方法の開発が待たれ
ていたのである。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、染色体の組換え部位を限定し。
かつ、組換え頻度が高く、さらには組換え時期及び、位
置の制御が可能な酵母の育種法を求めて鋭意研究したと
ころ、本発明においてその方法を完成するに至った。
置の制御が可能な酵母の育種法を求めて鋭意研究したと
ころ、本発明においてその方法を完成するに至った。
ｐｓＲ１プラスミドは、６２５１塩基対の環状ＤＮＡ分
子で、全ヌクレオチド配列が決定されている（Ａｒａｋ
ｉら、１９８５年）。
子で、全ヌクレオチド配列が決定されている（Ａｒａｋ
ｉら、１９８５年）。
本プラスミドは、従来、醤油酵母
（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ
）中に含まれるプラスミドであり、その特長は、分子内
に９５９塩基対からなる、一対の逆向き反復配列をもち
、このため。
）中に含まれるプラスミドであり、その特長は、分子内
に９５９塩基対からなる、一対の逆向き反復配列をもち
、このため。
分子が二つの特有な領域に分断されているところにある
。
。
さらに重要な特長は、逆向き反復配列内にある５８塩基
対に限定された組換え部位間で、分子内組換えが起る（
Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、１９８８年）結果、二つの特有
な領域の向きが反転したＴｙｐａＡとＴｙｐｅＢとの、
二種類の異性体として存在することにあり。
対に限定された組換え部位間で、分子内組換えが起る（
Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、１９８８年）結果、二つの特有
な領域の向きが反転したＴｙｐａＡとＴｙｐｅＢとの、
二種類の異性体として存在することにあり。
２μｍＤＮＡで起る分子内組換えと同様にコピー数の制
御機構（Ｖｏｌｋｅｒｔら、 １９８６年）に関与する
ものと考えられる。
御機構（Ｖｏｌｋｅｒｔら、 １９８６年）に関与する
ものと考えられる。
即ち、第１図にプラスミドｐＳＲ１のＴｙｐｅＡとＴｙ
ｐｅＢが示されるが、第１図において、プラスミドρＳ
ＲＩには一対の逆向き反復配列内にそれぞれ１ケ、すな
わち、一対の組換え部位（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
５ｉｔｅ）（Ｒ５：以下Ｒ５という）を有し、１つの
プラスミド内の２ケのＲ３で組換えを起こしＴｙｐｅＡ
とＴｙｐｅＢとの２つの型が混合して酵母中に存在して
いるのである。
ｐｅＢが示されるが、第１図において、プラスミドρＳ
ＲＩには一対の逆向き反復配列内にそれぞれ１ケ、すな
わち、一対の組換え部位（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
５ｉｔｅ）（Ｒ５：以下Ｒ５という）を有し、１つの
プラスミド内の２ケのＲ３で組換えを起こしＴｙｐｅＡ
とＴｙｐｅＢとの２つの型が混合して酵母中に存在して
いるのである。
また、このＲ５を用いる組換えには第１図のＲで示され
る。 ｐｓＲ１プラスミド自体に存在するＲ遺伝子が生
産するＲタンパク質のみが必要とされているのである（
Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、１９８８年）。
る。 ｐｓＲ１プラスミド自体に存在するＲ遺伝子が生
産するＲタンパク質のみが必要とされているのである（
Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、１９８８年）。
本発明においては、プラスミドρＳＲＩで起っていルＲ
ＩＬ ｍ エ現象を酵母の育種法に取り入れることに成
功したのである。
ＩＬ ｍ エ現象を酵母の育種法に取り入れることに成
功したのである。
即ち、酵母の育種法では、まず、染色体の２ケ所にＲ３
を組み込まなければならない。
を組み込まなければならない。
Ｒ３を酵母の染色体に組込むために１本発明においては
、まず、プラスミドｐｓＲ１上に存在するＲ５を導入し
た染色体組込み型ベクター、即ちＹＩｐ型ベクターを作
成した。ＶＩＰ型ベクター（組込み型ベクター）はプラ
スミドルＳ旧がらＲ３を含むＤＮＡ断片を切出すと同時
に大腸菌のプラスミドＰＢＲ３２２、さらにＲ５を導入
しようとする、酵母染色体部位にある遺伝子を用いて、
Ｒ３を１ケづつ含むプラスミドを作成した。
、まず、プラスミドｐｓＲ１上に存在するＲ５を導入し
た染色体組込み型ベクター、即ちＹＩｐ型ベクターを作
成した。ＶＩＰ型ベクター（組込み型ベクター）はプラ
スミドルＳ旧がらＲ３を含むＤＮＡ断片を切出すと同時
に大腸菌のプラスミドＰＢＲ３２２、さらにＲ５を導入
しようとする、酵母染色体部位にある遺伝子を用いて、
Ｒ３を１ケづつ含むプラスミドを作成した。
本プラスミドは、例えば、酵母ＵＲＡ３遺伝子を含むｐ
ＨＭ１４７、また、例えば、酵母ＨＩＳ３遺伝子を含む
ｐＨＭ７１−１であり、染色体組込み部位の指定と同時
に、酵母細胞への導入の確認を、栄養要求性の相補（そ
れぞれ、ウラシル・ヒスチジン）で確認できるように設
計した。さらに、これらベクターは、各酵母遺伝子中で
、それぞれ制限＃素ＮｃｏＩ、 ＸｈｏＩで、ただ−か
所切断される様に、即ち、パン酵母への導入の際、この
制限酵素で切断することにより、高頻度で、目的部位に
組込まれる（Ｉｔｏら、１９８３年）ように設計した。
ＨＭ１４７、また、例えば、酵母ＨＩＳ３遺伝子を含む
ｐＨＭ７１−１であり、染色体組込み部位の指定と同時
に、酵母細胞への導入の確認を、栄養要求性の相補（そ
れぞれ、ウラシル・ヒスチジン）で確認できるように設
計した。さらに、これらベクターは、各酵母遺伝子中で
、それぞれ制限＃素ＮｃｏＩ、 ＸｈｏＩで、ただ−か
所切断される様に、即ち、パン酵母への導入の際、この
制限酵素で切断することにより、高頻度で、目的部位に
組込まれる（Ｉｔｏら、１９８３年）ように設計した。
プラスミドｐＨＭ１４７を含む大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＡ ２２１（ｐＨＭ １４７
）として、ＦＥＲＭＰ−１００７３の寄託番号で、また
プラスミドＰ）１Ｍ７１−１を含む大腸菌は、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＡ ２２１ （ｐＨＭ７
１−１）としてＦＥＲＭ Ｐ−１００７５の寄託番号で
微工研に寄託されている。
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＡ ２２１（ｐＨＭ １４７
）として、ＦＥＲＭＰ−１００７３の寄託番号で、また
プラスミドＰ）１Ｍ７１−１を含む大腸菌は、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＡ ２２１ （ｐＨＭ７
１−１）としてＦＥＲＭ Ｐ−１００７５の寄託番号で
微工研に寄託されている。
また、本発明においては、Ｒ遺伝子の発現にょるＲタン
パク質の存在によって組換えを行なわせるＲタンパク質
の非存在によって組換えを停止させることを実施するた
めに、Ｒ遺伝子及びその上流にＧＡＬＬ又はＧＡＬ１０
のプロモーターを導入したＲ遺伝子の発現調節可能なベ
クターを作成しなければならない。
パク質の存在によって組換えを行なわせるＲタンパク質
の非存在によって組換えを停止させることを実施するた
めに、Ｒ遺伝子及びその上流にＧＡＬＬ又はＧＡＬ１０
のプロモーターを導入したＲ遺伝子の発現調節可能なベ
クターを作成しなければならない。
そこで１本発明では、プラスミドｐｓＲ１からＲ遺伝子
を切出すと同時に、プラスミドｐＢＲ３２２を利用する
とともに、Ｒ遺伝子上流には、パン酵母のガラクトース
代謝形酵素遺伝子ＧＡＬＩ又はＧＡＬ１０のプロモータ
ーをつないで、培地中に炭素源としてガラクトースのみ
が存在するときのみに発現するように、コントロールす
べく設計し、また、パン酵母中でのマーカーとしては、
ＬＥＵ２遺伝子を用い。
を切出すと同時に、プラスミドｐＢＲ３２２を利用する
とともに、Ｒ遺伝子上流には、パン酵母のガラクトース
代謝形酵素遺伝子ＧＡＬＩ又はＧＡＬ１０のプロモータ
ーをつないで、培地中に炭素源としてガラクトースのみ
が存在するときのみに発現するように、コントロールす
べく設計し、また、パン酵母中でのマーカーとしては、
ＬＥＵ２遺伝子を用い。
選択培地中で栄養要求性（ロイシン）の相補によって形
質転換体（発現ベクター導入株）のスクリーニングを行
なえるように設計し、目的に合致したプラスミドｐＨ８
１５３を得た。
質転換体（発現ベクター導入株）のスクリーニングを行
なえるように設計し、目的に合致したプラスミドｐＨ８
１５３を得た。
プラスミドｐＨＭ１５３を含む大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＡ ２２１（ｐ）１Ｍ１５３
）として、ＦＥＲＭＰ−１００７４の寄託番号で微工研
に寄託されている。
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＡ ２２１（ｐ）１Ｍ１５３
）として、ＦＥＲＭＰ−１００７４の寄託番号で微工研
に寄託されている。
本発明の育種方法においては、酵母、例えばパン酵母に
プラスミドｐＨＭ１４７を制限酵素ＮｃｏＩで切断後、
Ｋｌ法（Ｉｔｏら、１９８３年）により導入し、ウラシ
ルの要求性の相補で形質転換株をスクリーニングし、染
色体にｐＨＭ１４７すなわちＲ５が導入された酵母のみ
を選択し、次いで、この酵母にプラスミドＰＨＭ７１−
１を制限酵素ＸｈｏＩで切断後、同方法で導入し、ヒス
チジンの要求性の相補で、形質転換株即ち、 Ｒ５を染
色体に組込んだ株を選択し、結局１酵母の染色体に２ケ
のＲ５が導入された酵母を得る。
プラスミドｐＨＭ１４７を制限酵素ＮｃｏＩで切断後、
Ｋｌ法（Ｉｔｏら、１９８３年）により導入し、ウラシ
ルの要求性の相補で形質転換株をスクリーニングし、染
色体にｐＨＭ１４７すなわちＲ５が導入された酵母のみ
を選択し、次いで、この酵母にプラスミドＰＨＭ７１−
１を制限酵素ＸｈｏＩで切断後、同方法で導入し、ヒス
チジンの要求性の相補で、形質転換株即ち、 Ｒ５を染
色体に組込んだ株を選択し、結局１酵母の染色体に２ケ
のＲ５が導入された酵母を得る。
次いで、染色体に２つのＲ５が導入された酵母にプラス
ミドｐＨＭ１５３を同方法にて導入しくロイシン非要求
性で選択）、ガラクトース存在培地で培養すればＲ遺伝
子が発現してＲタンパク質を生成し、染色体の組換えが
起る。１０〜５０時間程度でガラクトース非存在培地に
移し、組換えを停止させた。
ミドｐＨＭ１５３を同方法にて導入しくロイシン非要求
性で選択）、ガラクトース存在培地で培養すればＲ遺伝
子が発現してＲタンパク質を生成し、染色体の組換えが
起る。１０〜５０時間程度でガラクトース非存在培地に
移し、組換えを停止させた。
この処理によって、酵母の染色体の組換えは酵母の１０
％において生起しているのがパルスフィールド電気泳動
によって確認される。
％において生起しているのがパルスフィールド電気泳動
によって確認される。
さらに、完全培地中で、この組換え株を約２０時間培養
することにより、はぼ、半数の酵母から自然に、ｐＨ８
１５３を脱落させることができる。
することにより、はぼ、半数の酵母から自然に、ｐＨ８
１５３を脱落させることができる。
ここで起った組換え型は、以下に示す組換え型の５（ト
ランスロケーション２）に相当するが、染色体上へのＲ
３の組込み位置により、さらに、以下のような組換え（
計６パターン）が生起する。
ランスロケーション２）に相当するが、染色体上へのＲ
３の組込み位置により、さらに、以下のような組換え（
計６パターン）が生起する。
１、 インバージョン１
同一染色体の、同一腕上に、２個のＲ３を逆方向に組込
み、その間で逆位を起こす。
み、その間で逆位を起こす。
この場合、成育に影響はなく、染色体の長さも変わらな
い。
い。
２、 インバージョン２
同一染色体の、逆腕上に、それぞれ１個のＲ３を逆方向
に組込み、その間で逆位を起こす。
に組込み、その間で逆位を起こす。
この場合、成育に影響はなく、染色体の長さも変わらな
い。
い。
３、ループアウト１
同一染色体の、同一腕上に、２個のＲ５を同方向に組込
み、その間での欠失を起こす。
み、その間での欠失を起こす。
この場合、２個のＩＲ間に必須遺伝子が乗っていると致
死となる。但し、ループアウトした部位が、ＹＲＰ型の
プラスミドとして存在すると成育は可能である。
死となる。但し、ループアウトした部位が、ＹＲＰ型の
プラスミドとして存在すると成育は可能である。
４、 ループアウト２
同一染色体の、逆腕上に、それぞれ１個のＲ５を同方向
に組込み、その間での欠失を起こす。
に組込み、その間での欠失を起こす。
この場合、致死である。但し、ループアウトした部位に
、セントロメアが乗っているので、ＹＣｐ型プラプラス
ミド状染色体）として存在可能である。
、セントロメアが乗っているので、ＹＣｐ型プラプラス
ミド状染色体）として存在可能である。
ソ（７） 場合、ループアウトした以外の領域に５必須
遺伝子がなければ、成育は可能である。
遺伝子がなければ、成育は可能である。
５、トランスロケーション１
異染色体に、それぞれ１個のＲ５をそれぞれの染色体の
セントロメアに対して同方向に組込み、その間での転位
を起こす。
セントロメアに対して同方向に組込み、その間での転位
を起こす。
この場合、成育に影響はないが、それぞれの染色体の長
さが変わる。
さが変わる。
６、トランスロケーション２
異染色体に、それぞれ１個のＲ３をそれぞれの染色体の
セントロメアに対して逆方向に組込み、その間での転位
を起こす。
セントロメアに対して逆方向に組込み、その間での転位
を起こす。
この場合、致死である。一方の染色体は、２個のセント
ロメアを持ち、他方の染色体はセントロメアを持たなく
なる。双方とも、細胞分裂の際。
ロメアを持ち、他方の染色体はセントロメアを持たなく
なる。双方とも、細胞分裂の際。
その分配が不安定となる。
又、以上の６タイプの組換えは、１倍体株を用いた場合
の組換えであるが、２倍体株を用いることにより上記、
６タイプの組換えのうち、致死になるものも生存させる
ことができ、さらに上記以外に５タイプの組換えを行な
える。即ち、７、重複−欠失型組換え−１ 相同染色体上の同一腕上の異なった位置にそれぞれ１ヶ
のＲ３を同方向に組込み、その間での転位を起こす。
の組換えであるが、２倍体株を用いることにより上記、
６タイプの組換えのうち、致死になるものも生存させる
ことができ、さらに上記以外に５タイプの組換えを行な
える。即ち、７、重複−欠失型組換え−１ 相同染色体上の同一腕上の異なった位置にそれぞれ１ヶ
のＲ３を同方向に組込み、その間での転位を起こす。
この場合、成育に影響はないが、一方は染色体の一部の
領域が重複し、またもう一方は、他方が重複したのと同
じ領域が欠失し、それぞれの染色体の長さが変わる。
領域が重複し、またもう一方は、他方が重複したのと同
じ領域が欠失し、それぞれの染色体の長さが変わる。
８、重複−欠失型組換え−２
相同染色体の通読上に、それぞれ１ヶのＲ５を逆方向に
組込み、その間での転位を起こす。
組込み、その間での転位を起こす。
この場合、成育に影響はない。双方の染色体とも、一部
の領域が欠失し、一部の領域が重複する。
の領域が欠失し、一部の領域が重複する。
一方の重複する領域は、他方が欠失した領域に相当する
。
。
９、トランスロケーション型組換え一３相同染色体の同
腕上に、それぞれ１ヶのＲ５を逆方向に組込み、その間
での転座を起こす。
腕上に、それぞれ１ヶのＲ５を逆方向に組込み、その間
での転座を起こす。
この場合、トランスロケーション２と同様に致死である
。
。
１０、トランスロケーション型組換え一４相同染色体の
通読上に、それぞれ１ヶのＲ３を同方向に組込み、その
間での転座を起こす。
通読上に、それぞれ１ヶのＲ３を同方向に組込み、その
間での転座を起こす。
この場合、トランスロケーション２と同様に致死である
。
。
１１、ホットスポット型組換え
相同染色体の同位置に、それぞれ１ヶのＲ３を同方向に
組込み、その間での組換えを起こす。
組込み、その間での組換えを起こす。
この場合、自然に起る組換えと同一の様式となる。但し
、Ｒ３を組込んだ位置でのみ、組換えが高頻度で起る。
、Ｒ３を組込んだ位置でのみ、組換えが高頻度で起る。
かくして、これまでの育種法においては類を見ない、染
色体自体が改変された酵母が得られ、しかも非常に高頻
度で得られるので、組換え体のスクリーニングにも多大
の労力を必要としない。
色体自体が改変された酵母が得られ、しかも非常に高頻
度で得られるので、組換え体のスクリーニングにも多大
の労力を必要としない。
従って、本発明の育種方法は、すぐれた酵母を作り出す
技術を提供したといえるものである。
技術を提供したといえるものである。
次に本発明の実施例を示し、さらに詳細に説明する。し
かし１本発明は、これらの実施例のみに限定されるもの
ではない。即ち、上記の計１１の組換えパターンは、形
質転換の際の適当なマーカーとなる遺伝子、例えば栄養
要求性を相補するもの、又１例えば薬剤耐性を付与する
ものと、目的とする組込み位置の遺伝子を用いることに
より、染色体を限定することなしに行なえ、しかも、染
色体の位置を問わずに行なうことができるからである。
かし１本発明は、これらの実施例のみに限定されるもの
ではない。即ち、上記の計１１の組換えパターンは、形
質転換の際の適当なマーカーとなる遺伝子、例えば栄養
要求性を相補するもの、又１例えば薬剤耐性を付与する
ものと、目的とする組込み位置の遺伝子を用いることに
より、染色体を限定することなしに行なえ、しかも、染
色体の位置を問わずに行なうことができるからである。
またさらに、これら、１１の組換えパターンのほかに、
次の操作により、巨大ＤＮＡ分子の酵母染色体上への導
入が可能である。
次の操作により、巨大ＤＮＡ分子の酵母染色体上への導
入が可能である。
例えば、酵母染色体上の−か所に、 Ｒ３を組込み、こ
の組込みを有する酵母中でＲタンパク質を発現させた状
態に保ち、環状であり、Ｒ３を１ヶ組込んだ、環状ＤＮ
Ａを導入する。この操作により、 ＤＮＡ分子を、高頻
度で、染色体上の目的位置に組込むことができる。即ち
、複数の遺伝子によって構成される、遺伝子群を、−度
に、しかも安定に、酵母細胞中に導入することが可能で
ある。
の組込みを有する酵母中でＲタンパク質を発現させた状
態に保ち、環状であり、Ｒ３を１ヶ組込んだ、環状ＤＮ
Ａを導入する。この操作により、 ＤＮＡ分子を、高頻
度で、染色体上の目的位置に組込むことができる。即ち
、複数の遺伝子によって構成される、遺伝子群を、−度
に、しかも安定に、酵母細胞中に導入することが可能で
ある。
実施例１
プラスミドｐｓＲ１の種々の位置に、５ａｌＩリンカ−
を挿入したもののうち、ｐＳＲＴ３２２（Ｍａｔｓｕｚ
ａｋｉら。
を挿入したもののうち、ｐＳＲＴ３２２（Ｍａｔｓｕｚ
ａｋｉら。
１９８８年）、 ｐｓＲＴ３１０ （Ｊｅａｒｎｐｉｐ
ａｔｋｕｌら、１９８７年） ヲ制限酵素５ａｌＩとＭ
ｌｕＩで切断し、それぞれ７５０塩基対、 １３４０塩
基対のＤＮＡ断片を分離・回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
処理することにより２０９０塩基対の両端が制限酵素５
ａｌＩの切断部位になったＤＮＡ断片を得、これを大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２ （例えば、５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９７９年）の制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより切断したＤＮＡを、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼにより末端を平滑化したもノニ、５’−
ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’ ノ８塩基対より成るＸｈｏＩ
リンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入し、再び、制
限酵素ＸｈｏＩで切断したものと混合と、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ処理することにより、大腸菌プラストＰＢＲ３２
２の制限酵素）ｆｉｎｄ ＤＩ切断部位にＸｈｏＩリン
カ−を介して、プラスミドルＳ旧のＲ３を含む逆向き反
復配列の、一方を組込んだプラスミド（Ａ）を得る。さ
らに、酵母プラスミドＹＲｐ１４（Ｈｉｅｔｅｒら、１
９８５年）を制限酵素５ａｌＩ ・ＥｃｏＲＩで切断す
ることにより得られる、５５００塩基対のＤＮＡ断片と
上記プラスミド（Ａ）を、制限酵素５ａｌＩ・ＥｃｏＲ
Ｉで切断することにより得られる２７１０塩基対のＤＮ
Ａ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理することにより結合
して、上記プラスミド（Ａ）に、 酵母ＵＲＡ３遺伝子
を含むＤＮＡを挿入し、第２図に示したプラスミドｐＨ
Ｍ１４７を作成した。
ａｔｋｕｌら、１９８７年） ヲ制限酵素５ａｌＩとＭ
ｌｕＩで切断し、それぞれ７５０塩基対、 １３４０塩
基対のＤＮＡ断片を分離・回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
処理することにより２０９０塩基対の両端が制限酵素５
ａｌＩの切断部位になったＤＮＡ断片を得、これを大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２ （例えば、５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９７９年）の制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより切断したＤＮＡを、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼにより末端を平滑化したもノニ、５’−
ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’ ノ８塩基対より成るＸｈｏＩ
リンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入し、再び、制
限酵素ＸｈｏＩで切断したものと混合と、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ処理することにより、大腸菌プラストＰＢＲ３２
２の制限酵素）ｆｉｎｄ ＤＩ切断部位にＸｈｏＩリン
カ−を介して、プラスミドルＳ旧のＲ３を含む逆向き反
復配列の、一方を組込んだプラスミド（Ａ）を得る。さ
らに、酵母プラスミドＹＲｐ１４（Ｈｉｅｔｅｒら、１
９８５年）を制限酵素５ａｌＩ ・ＥｃｏＲＩで切断す
ることにより得られる、５５００塩基対のＤＮＡ断片と
上記プラスミド（Ａ）を、制限酵素５ａｌＩ・ＥｃｏＲ
Ｉで切断することにより得られる２７１０塩基対のＤＮ
Ａ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理することにより結合
して、上記プラスミド（Ａ）に、 酵母ＵＲＡ３遺伝子
を含むＤＮＡを挿入し、第２図に示したプラスミドｐＨ
Ｍ１４７を作成した。
実施例２
プラスミドｐＨＭ７１−１の作成
実施例１に記載したのと、同方法にて得られる、両端が
、制限酵素５ａｌＩ切断点である２０９０塩基対のＤＮ
Ａ断片と、制限酵素５ａｌＩにより切断した大腸菌プラ
スミドｐＢＲ３２２とを、 Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理に
より連結し、さらに、これを制限酵素ＢａｍＨＩにより
切断し、制限酵素ＢａｍＨＩ切断点を両端に持ち、酵母
ＨＩＳ３遺伝子を含む、１７７０塩基対のＤＮＡ断片（
Ｓｔｒｕｈｌ、１９８５年）をＴ４ＤＮＡリガーゼ処理
により連結し、第３図に示すように、Ｒ３と酵母遺伝子
ＨＩＳ３を含むプラスミドｐＨ８７１−１を作成した。
、制限酵素５ａｌＩ切断点である２０９０塩基対のＤＮ
Ａ断片と、制限酵素５ａｌＩにより切断した大腸菌プラ
スミドｐＢＲ３２２とを、 Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理に
より連結し、さらに、これを制限酵素ＢａｍＨＩにより
切断し、制限酵素ＢａｍＨＩ切断点を両端に持ち、酵母
ＨＩＳ３遺伝子を含む、１７７０塩基対のＤＮＡ断片（
Ｓｔｒｕｈｌ、１９８５年）をＴ４ＤＮＡリガーゼ処理
により連結し、第３図に示すように、Ｒ３と酵母遺伝子
ＨＩＳ３を含むプラスミドｐＨ８７１−１を作成した。
実施例３
ＰＳＲｌの種々の位置に、５ａｌＩリンカ−・ＢａＩＩ
Ｈニリンカーを挿入したプラスミド（Ｊｅａｒｎｐｉｐ
ａｔｋｕ工ら、１９８７年）を利用して、Ｒ遺伝子を、
５ｊ末端を制限酵素ＢａｍＨＩ切断点、３′末端を制限
酵素５ａｌＩ切断点とする、１９４０塩基対のＤＮＡ断
片として分離し、プラスミドｐＢＭ １５０（Ｊｏｈｏ
ｎｓｔｏｎら、 １９８４年）を、制限酵素ＲａｍＨ１
，５ａｌＩで切断して得られる７９９ｏ塩基対のＤＮＡ
断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
Ｈニリンカーを挿入したプラスミド（Ｊｅａｒｎｐｉｐ
ａｔｋｕ工ら、１９８７年）を利用して、Ｒ遺伝子を、
５ｊ末端を制限酵素ＢａｍＨＩ切断点、３′末端を制限
酵素５ａｌＩ切断点とする、１９４０塩基対のＤＮＡ断
片として分離し、プラスミドｐＢＭ １５０（Ｊｏｈｏ
ｎｓｔｏｎら、 １９８４年）を、制限酵素ＲａｍＨ１
，５ａｌＩで切断して得られる７９９ｏ塩基対のＤＮＡ
断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
このプラスミドから、 制限酵素ＢａｍＨ１，５ａｌＩ
によって切り出した、ＧａＱ１プロモーターの下流に、
Ｒ遺伝子が連結された、２６２０塩基対のＤＮＡ断片を
、ＹＥｐ５１ （Ｂｒｏａｃｈら、１９８３年）の制限
酵素にｐｎＩ、５ａｌＩ切断点間（１８６０塩基対）を
、プラスミドＹＩｐ３２（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９７
９年）の同じく制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ、５ａｌＩ切断点
間（１３１０塩基対）に置き換えたプラスミドを制限酵
素Ｋｐｎ１．５ａｌＩで切断することによって得られる
６３６０塩基対のＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼに
より連結し、第４図に示すプラスミドｐＨＭ１５３を作
成した。
によって切り出した、ＧａＱ１プロモーターの下流に、
Ｒ遺伝子が連結された、２６２０塩基対のＤＮＡ断片を
、ＹＥｐ５１ （Ｂｒｏａｃｈら、１９８３年）の制限
酵素にｐｎＩ、５ａｌＩ切断点間（１８６０塩基対）を
、プラスミドＹＩｐ３２（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９７
９年）の同じく制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ、５ａｌＩ切断点
間（１３１０塩基対）に置き換えたプラスミドを制限酵
素Ｋｐｎ１．５ａｌＩで切断することによって得られる
６３６０塩基対のＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼに
より連結し、第４図に示すプラスミドｐＨＭ１５３を作
成した。
実施例４
パン へのプラスミドＨＭ１４７、プラスミド財パン
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）の実験室株、ＮＢＶ５（（ｃｚ）ｐｈｏ３−１１
ｅｕ２−３，１１２ ｔｒｐｌ−２８９ｕｒａ３−１．
２ ｈｉｓ３−５３２ ａｄｅ２）をＹＰＤＡ培地（１
％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％
グルコース、ｉｏＯＬ１ｇ／１２アデニン）中で、３０
℃で一晩培養した後、この培養液１ｍＱを、 新たなＹ
ＰＤ培地８０ＩＩＱに移し、４〜６時間３０℃で培養後
、遠心分離機により、菌体を回収し、５ｎ＋Ｑのトリス
緩衝液（１０１トリス−塩酸緩衝液ＰＨ７，５）に懸濁
し、再び遠心分離機により、菌体を集め５社のＬＡ溶液
（０，１Ｍ酢酸リチウムをトリス緩衝液に溶解したもの
）に懸濁し、さらに、３０℃で１時間振どうする。こう
して得られたコンピテント細胞を、遠心分離機により分
離し、再び、０．４ｖｓＱのＬＡ溶液に懸濁する。この
うち、０．０５ｍＱを別の容器に移して、さらにここに
、制限酵素ＮＣ０Ｉで切断した。プラスミドｐＨＭ１４
７を加える。これらを混合した後、３０℃で３０分間静
置した後、４０％ポリエチレングリコール４０００を０
．６＋Ｑ加え、よく攪拌した後、さらに、３０℃で１時
間静置する。この溶液を遠心分離し、菌体を回収し、１
ｍＱのトリス緩衝液に懸濁し、再び遠心分離により菌体
を回収し、適当量のトリス緩衝液に懸濁した後、ＨＡ培
地（０，７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗ
ｌｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （Ｄｉｆｃｏ）、
２％グルコース、０．０００２％ウラシル、０．０００
２％トリプトファン、０．００２％ヒスチジン、０．０
０２％アルギニン、０．００２％メチオニン、０．００
２％チロシン、０．００３％リジン、ｏ、ｏｉｓ％バリ
ン、０．００６％フェニルアラニン、０．００３％ロイ
シン、０．０１％アデニン）よりウラシルを除いた寒天
培地上に塗布する。３７℃で２日間培養し、形質転換（
染色体上に９８Ｍ１４７すなわち、Ｒ５が組込まれた）
株を得た。この形質転換株をさらに、上記と同様の操作
により、プラスミドｐＨＭ ７１−１を制限酵素Ｘｈｏ
ｌで切断したもので形質転換し。
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）の実験室株、ＮＢＶ５（（ｃｚ）ｐｈｏ３−１１
ｅｕ２−３，１１２ ｔｒｐｌ−２８９ｕｒａ３−１．
２ ｈｉｓ３−５３２ ａｄｅ２）をＹＰＤＡ培地（１
％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％
グルコース、ｉｏＯＬ１ｇ／１２アデニン）中で、３０
℃で一晩培養した後、この培養液１ｍＱを、 新たなＹ
ＰＤ培地８０ＩＩＱに移し、４〜６時間３０℃で培養後
、遠心分離機により、菌体を回収し、５ｎ＋Ｑのトリス
緩衝液（１０１トリス−塩酸緩衝液ＰＨ７，５）に懸濁
し、再び遠心分離機により、菌体を集め５社のＬＡ溶液
（０，１Ｍ酢酸リチウムをトリス緩衝液に溶解したもの
）に懸濁し、さらに、３０℃で１時間振どうする。こう
して得られたコンピテント細胞を、遠心分離機により分
離し、再び、０．４ｖｓＱのＬＡ溶液に懸濁する。この
うち、０．０５ｍＱを別の容器に移して、さらにここに
、制限酵素ＮＣ０Ｉで切断した。プラスミドｐＨＭ１４
７を加える。これらを混合した後、３０℃で３０分間静
置した後、４０％ポリエチレングリコール４０００を０
．６＋Ｑ加え、よく攪拌した後、さらに、３０℃で１時
間静置する。この溶液を遠心分離し、菌体を回収し、１
ｍＱのトリス緩衝液に懸濁し、再び遠心分離により菌体
を回収し、適当量のトリス緩衝液に懸濁した後、ＨＡ培
地（０，７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗ
ｌｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （Ｄｉｆｃｏ）、
２％グルコース、０．０００２％ウラシル、０．０００
２％トリプトファン、０．００２％ヒスチジン、０．０
０２％アルギニン、０．００２％メチオニン、０．００
２％チロシン、０．００３％リジン、ｏ、ｏｉｓ％バリ
ン、０．００６％フェニルアラニン、０．００３％ロイ
シン、０．０１％アデニン）よりウラシルを除いた寒天
培地上に塗布する。３７℃で２日間培養し、形質転換（
染色体上に９８Ｍ１４７すなわち、Ｒ５が組込まれた）
株を得た。この形質転換株をさらに、上記と同様の操作
により、プラスミドｐＨＭ ７１−１を制限酵素Ｘｈｏ
ｌで切断したもので形質転換し。
＋１Ａ培地よりヒスチジンを除いた寒天培地に塗布し、
形質転換（染色体上にｐＨＭ ７１−１即ち、Ｒ３が組
込まれた）株を得た。これらの操作により、酵母染色体
の目的部位、即ち、第５染色体のＵＲＡ３座・第１５染
色体の）ＩＩ３３座に、各々１ケのＲ５を組込むことが
できる。
形質転換（染色体上にｐＨＭ ７１−１即ち、Ｒ３が組
込まれた）株を得た。これらの操作により、酵母染色体
の目的部位、即ち、第５染色体のＵＲＡ３座・第１５染
色体の）ＩＩ３３座に、各々１ケのＲ５を組込むことが
できる。
この、ウラシル、ヒスチジン共に非要求性となった形質
転換株の分子生物的解析を行なった。
転換株の分子生物的解析を行なった。
Ｓｃｈｗａｒｔｓらの方法（１９８４年）に従い、パル
スフィールド電気泳動により、染色体の分離パターンを
エチジウムブロマイドの染色により観察したところ、形
質転換前の株のそれと、同一のパターンを示した。ここ
で得たアガロースゲルを５ｏｕｔｈｅｒｎ （１９７５
年）の方法に従い、 ニトロセルロースフィルターにト
ランスファーした後、Ｒｉｇｂｙら（１９７７年）の方
法に従い３Ｚｐラベルした、上記Ｒ５を含む２０７０塩
基対のＤＮＡ断片をプローブとして、ＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリダイゼーションを行ないオートラジオグラフィー
を行なったところ、第５染色体と、第１５染色体の位置
で、ハイブリダイズするのを確認した。さらに、１ｌｅ
ｒｅｆｏｒｄら（１９７９年）の方法に従い、この酵母
の全ＤＮＡを抽出し、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ又例
えばＢａｍ１ｌＩで切断し、アガロース電気泳動をおこ
なった後、前記と同様の操作によりＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションによる解析を行なったところ、各プ
ラスミドｐＨＭ１４７・９８Ｍ７１−１がそれぞれ目的
の位置、即ち、ＵＲＡ３座・ＨＩＳ３座に、導入されて
いることが確認された。
スフィールド電気泳動により、染色体の分離パターンを
エチジウムブロマイドの染色により観察したところ、形
質転換前の株のそれと、同一のパターンを示した。ここ
で得たアガロースゲルを５ｏｕｔｈｅｒｎ （１９７５
年）の方法に従い、 ニトロセルロースフィルターにト
ランスファーした後、Ｒｉｇｂｙら（１９７７年）の方
法に従い３Ｚｐラベルした、上記Ｒ５を含む２０７０塩
基対のＤＮＡ断片をプローブとして、ＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリダイゼーションを行ないオートラジオグラフィー
を行なったところ、第５染色体と、第１５染色体の位置
で、ハイブリダイズするのを確認した。さらに、１ｌｅ
ｒｅｆｏｒｄら（１９７９年）の方法に従い、この酵母
の全ＤＮＡを抽出し、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ又例
えばＢａｍ１ｌＩで切断し、アガロース電気泳動をおこ
なった後、前記と同様の操作によりＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションによる解析を行なったところ、各プ
ラスミドｐＨＭ１４７・９８Ｍ７１−１がそれぞれ目的
の位置、即ち、ＵＲＡ３座・ＨＩＳ３座に、導入されて
いることが確認された。
この、染色体上に２ケのＲ５を組込んだ株に、上記と同
様の操作により、プラスミドｐＨＭ１５３の導入を計り
、ロイシン要求性を相補する、形質転換株を得た。
様の操作により、プラスミドｐＨＭ１５３の導入を計り
、ロイシン要求性を相補する、形質転換株を得た。
実施例５
組換えの生起と停止
実施例４で得られた、染色体上に２ケ所のＲ５を組込み
、ｐＨ８１５３を導入した酵母菌株を、５ａｌｌの、Ｈ
Ａ培地よりロイシンを除いた液体培地中で、３０℃１日
間培養し、ここから、遠心分離により菌体を回収し、生
理食塩水により、２度洗浄し、最終液量を１ｍ１２とし
、 このうち０．１ｍ１２を、同培地と、同培地の炭素
源をガラクトースに変えた培地とにそれぞれ加え、さら
に、２０時間培養した。
、ｐＨ８１５３を導入した酵母菌株を、５ａｌｌの、Ｈ
Ａ培地よりロイシンを除いた液体培地中で、３０℃１日
間培養し、ここから、遠心分離により菌体を回収し、生
理食塩水により、２度洗浄し、最終液量を１ｍ１２とし
、 このうち０．１ｍ１２を、同培地と、同培地の炭素
源をガラクトースに変えた培地とにそれぞれ加え、さら
に、２０時間培養した。
これらを、ＹＰＤＡ寒天培地に適当量を塗布し、さらに
、３０℃で、２日培養を行なった。この培地上に出現し
たコロニーをそれぞれ約５０ケずつＹＰＤＡ液体培地で
３０℃１日間培養し、パルスフィールド電気泳動と、そ
れにつぐ、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション解析
により、各染色体の長さを測定したところ、Ｒ３組込み
部位で、組換えが起ったために生じた新たな染色体二本
を検出した。即ち、概算７１０キロ塩基対長の、第五染
色体の左腕の左端より概算１７５キロ塩基対に位置する
ＵＲＡ３座と、概算１１６０キロ塩基対長の第十五染色
体の右腕の右端より概算３７０キロ塩基対に位置する１
ＩＩ５３座との間で繰換えが起った結果、概算９０５キ
ロ塩基対長、９６５キロ塩基対長の二本の新たな長さの
染色体が生起された。その頻度は、グルコースを炭素源
とした培養の結果２１５４、ガラクトースを炭素源とし
て培養した結果１１１５５で、明らかにガラクトースに
よる組換えの誘発が認められる。さらに、Ｒタンパク質
発現プラスミドｐｔ１Ｍ１５３のかわりに、このプラス
ミド中の、Ｒ遺伝子を挿入変異により不活化させたプラ
スミドを用いて同様の解析をしたところ、この組換えは
、全く検出されなかった。
、３０℃で、２日培養を行なった。この培地上に出現し
たコロニーをそれぞれ約５０ケずつＹＰＤＡ液体培地で
３０℃１日間培養し、パルスフィールド電気泳動と、そ
れにつぐ、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション解析
により、各染色体の長さを測定したところ、Ｒ３組込み
部位で、組換えが起ったために生じた新たな染色体二本
を検出した。即ち、概算７１０キロ塩基対長の、第五染
色体の左腕の左端より概算１７５キロ塩基対に位置する
ＵＲＡ３座と、概算１１６０キロ塩基対長の第十五染色
体の右腕の右端より概算３７０キロ塩基対に位置する１
ＩＩ５３座との間で繰換えが起った結果、概算９０５キ
ロ塩基対長、９６５キロ塩基対長の二本の新たな長さの
染色体が生起された。その頻度は、グルコースを炭素源
とした培養の結果２１５４、ガラクトースを炭素源とし
て培養した結果１１１５５で、明らかにガラクトースに
よる組換えの誘発が認められる。さらに、Ｒタンパク質
発現プラスミドｐｔ１Ｍ１５３のかわりに、このプラス
ミド中の、Ｒ遺伝子を挿入変異により不活化させたプラ
スミドを用いて同様の解析をしたところ、この組換えは
、全く検出されなかった。
即ち、この染色体間の組換えは、Ｒタンパク質が生起せ
しめたものであり、さらに、当初の目的通りＲ遺伝子の
発現制御は、培地中の炭素源により行なうことができる
。又、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（Ｔｈｏ
ｍａｓ、１９８０年）により、これらの菌株からＪｅｎ
ｓｅｎら（１９８３年）の方法、Ａｖｉｖらの方法（１
９７２年）に従い、抽出したメツセンジャーＲＮＡを、
実施例３に記した１９４０塩基対のＲ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片をプローブとして、解析したところ、明らかにガ
ラクトースによる、Ｒ遺伝子の転写活性の誘導が認めら
れた。
しめたものであり、さらに、当初の目的通りＲ遺伝子の
発現制御は、培地中の炭素源により行なうことができる
。又、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（Ｔｈｏ
ｍａｓ、１９８０年）により、これらの菌株からＪｅｎ
ｓｅｎら（１９８３年）の方法、Ａｖｉｖらの方法（１
９７２年）に従い、抽出したメツセンジャーＲＮＡを、
実施例３に記した１９４０塩基対のＲ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片をプローブとして、解析したところ、明らかにガ
ラクトースによる、Ｒ遺伝子の転写活性の誘導が認めら
れた。
実施例６
ｐＨＭ１５３の脱落及び組換えした染 体を含む酵母の
■ 実施例５で得た。染色体の組換えが起った酵母菌株から
の、プラスミドｐＨＭ１５３の脱落をはかり。
■ 実施例５で得た。染色体の組換えが起った酵母菌株から
の、プラスミドｐＨＭ１５３の脱落をはかり。
非選択培地（ＹＰＤＡ液体培地）で、１日間培養し適当
量を、同寒天培地に塗布しその栄養要求性を調べたとこ
ろ、約半数が、ロイシン要求性になっており、これらの
株はすべてプラスミドｐＨ８１５３を脱落していた。こ
のプラスミド脱落株を、約１００世代培養しても、染色
体の長さに変化はなかった。
量を、同寒天培地に塗布しその栄養要求性を調べたとこ
ろ、約半数が、ロイシン要求性になっており、これらの
株はすべてプラスミドｐＨ８１５３を脱落していた。こ
のプラスミド脱落株を、約１００世代培養しても、染色
体の長さに変化はなかった。
第１図はプラスミドＰＳＲ１のＴｙｐｅＡとＴｙｐｅＢ
を示す図である。第２図はプラスミドｐＨ８１４７の制
限酵素地図を示す図である。第３図はプラスミドｐＨＭ
７１−１の制限酵素地図を示す図である。第４図はプラ
スミドｐＨＭ１５３の制限酵素地図を示す図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 ｐＳＲ１ 第 ２ 図 ｃｏＲＩ ＹＰＥ Ａ ■■■： 口区コ： 口＝コ： 口＝コニ 鱒４−４伝子 ｐＳＲｌ 口ＮＡ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ２νｍ ＤＮＡ ■：峰４−３１伝手 臣区コニ ｐＳＲｌ ＤＮＡ ロコ： ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ＝：２戸ｍ ＤＮＡ 第 ４図 ■ ４母遺伝手 区コ・ｐＳＦ２１ ＤＮＡ 口＝コニ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ＝コ、２シｍ ＤＮＡ
を示す図である。第２図はプラスミドｐＨ８１４７の制
限酵素地図を示す図である。第３図はプラスミドｐＨＭ
７１−１の制限酵素地図を示す図である。第４図はプラ
スミドｐＨＭ１５３の制限酵素地図を示す図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 ｐＳＲ１ 第 ２ 図 ｃｏＲＩ ＹＰＥ Ａ ■■■： 口区コ： 口＝コ： 口＝コニ 鱒４−４伝子 ｐＳＲｌ 口ＮＡ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ２νｍ ＤＮＡ ■：峰４−３１伝手 臣区コニ ｐＳＲｌ ＤＮＡ ロコ： ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ＝：２戸ｍ ＤＮＡ 第 ４図 ■ ４母遺伝手 区コ・ｐＳＦ２１ ＤＮＡ 口＝コニ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ＝コ、２シｍ ＤＮＡ
Claims (3)
- （１）酵母の染色体上の２ヶ所に組換え部位を導入し、
かつ、この酵母にＲタンパク質発現プラスミドを存在さ
せ、この酵母をＲタンパク質発現条件下に置き、染色体
の組換えを生起せしめ、しかる後、Ｒタンパク質発現プ
ラスミドを脱落せしめることを特徴とする酵母の育種方
法。 - （２）プラスミドｐＳＲ１上に存在する組換え部位を導
入して成る染色体組込み型ベクター。 - （３）Ｒ遺伝子及びその上にＧＡＬ１又はＧＡＬ１０の
プロモーターを導入してＲ遺伝子の発現調節可能なベク
ター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19069288A JP2821884B2 (ja) | 1988-08-01 | 1988-08-01 | 酵母の育種方法及び関連ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19069288A JP2821884B2 (ja) | 1988-08-01 | 1988-08-01 | 酵母の育種方法及び関連ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242975A true JPH0242975A (ja) | 1990-02-13 |
| JP2821884B2 JP2821884B2 (ja) | 1998-11-05 |
Family
ID=16262276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19069288A Expired - Lifetime JP2821884B2 (ja) | 1988-08-01 | 1988-08-01 | 酵母の育種方法及び関連ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2821884B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0814165A3 (en) * | 1996-06-21 | 1998-04-08 | Suntory Limited | Method for constructing transformed yeast cells, that do not contain a selective marker gene |
-
1988
- 1988-08-01 JP JP19069288A patent/JP2821884B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0814165A3 (en) * | 1996-06-21 | 1998-04-08 | Suntory Limited | Method for constructing transformed yeast cells, that do not contain a selective marker gene |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2821884B2 (ja) | 1998-11-05 |
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