JPH0242978A - 均質の哺乳類造血幹細飽組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、造血幹細胞の分離方法並びに増殖因子を検出
するために及び無防備状態宿主に血液細胞系統を回復す
るために本発明により得られた組成物の使用に関する。

〔背　景〕

哺乳類の血液細胞のすべては、単一の前駆幹細胞に由来
する。幹細胞は、再生性細胞の連続した源を維持するた
めに自己増殖することができる。

さらに、特別な環境及び／又は要因にゆだねられる場合
、幹細胞専用前駆細胞に分化することができる（ここで
、前記専用前駆細胞は、限定された数の血液細胞タイプ
への原型細胞として作用することができる）。これらの
原型細胞は、最終的に成熟細胞に達する前、多くの段階
を通過するであろう。

造血細胞の種類は、リンパ球、骨髄細胞及び赤芽細胞を
包含する。これらの種類のそれぞれは、哺乳類宿主にお
いて不可欠な役割を演する。多くの疾病状態において、
疾病は成熟過程におけるある欠損の結果である。他の情
況、たとえば移植においては、移植物を拒絶することか
ら造血システムを防ぐことができることに興味がある。

この情況においては、コンジェニック移植物に対する免
疫応答を実質的に阻止するために宿主を照射することに
よって拒絶を阻止することが所望される。

新形成の場合、患者は、新形成組織を破壊するために照
射されそして／又は化学療法剤により処理され得る。こ
れらの及び他の処置は急速に増殖する細胞を殺すので、
新形成細胞だけでなく、また造血システムの細胞に対し
ても影響を及ぼすであろう。宿主は免疫無防備状態にな
り、そして適当な感染にゆだねられ、そして血小板の損
失により出血しやすくなる。

上記情況の他に、幹細胞の実質的な減少をもたらす、免
疫システムへの損傷をもたらす情況がまた存在する。こ
れらの情況においては、時々、宿主に幹細胞を補充する
ことが所望されるであろう。

しかしながら、コンジェニック宿主からの骨髄は通常、
免疫無防備状態の宿主とは異なった組織適合性を有する
であろう。これらの情況においては、骨髄移植片は外来
体として宿主を認識し、移植片対宿主の疾病をもたらす
。しかしながら、この問題は、生来のものとして宿主を
認識するように育成されるために、導入される幹細胞の
みが純粋なものであり、そして宿主に適合されるように
なる場合、見出され得ない。従って、純粋なものである
細胞を得ることに実質的な興味が存在する。さらに、こ
れらの細胞は、増殖因子を同定するために、増殖因子を
スクリーンするために、造血細胞の増殖を研究するアッ
セイに使用するために及び同様のもののために種々の方
法で使用され得る。

〔関連文献〕

マウス胸腺サブセットは、ＣＤ４及び［’Ｄ８マーカー
により分けられ得る。Ｓｗａｉｎ、　　［ｍｍｕｎｏｌ
、Ｒｅｖ、（１９８３）７４　：１２９　；Ｆｏｗｌｋ
ｅｓ　ｆｅｅ、、　Ｊ、ＥｘｐｌＭｅｄ、　（１９８５
０６２：８０２゜Ｆｏｗｌｋｅｓなど、、はまた、養子
移入において胸腺を再増殖する二重陰性胸腺細胞は、低
レベルのＬｙ−１抗原（Ｌｙ−１”）を発現することを
報告する。

仮に幹細胞抗原１及び２　（Ｓｃａ−１及び５ｃａ−２
）と命名されたモノクローナル抗体が報告されている。

Ａｉｈａｒａなど、、　　Ｂｕｒ、　Ｊ、　ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　（１９８６）　１６　：　１３９１゜造血前駆
体のための限界希釈法が、Ｗｈｉｔｌｏｃｋ　ａｎｄ報
告されている。Ｔｈｙ−１は、再構成性骨髄幹細胞の表
面マーカーである。Ｂｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｂａ５ｃｈ
、　Ｅｘｐ。

ど、、　Ｃｅ１ｌ（１９８６）４４　：６５３は、Ｔｈ
ｙ−１１０Ｌｉｎ−細胞を記載する。アメリカ特許第４
．７１４．６８０号は、ヒト幹細胞組成物を記載する。

〔発明の要約〕

実質的に均質な哺乳類幹細胞の組成物の単離のための、
モノクローナル抗体を使用する方法が提供される。幹細
胞は、幹細胞を欠失する宿主の造血システムを再生する
ことに、造血細胞系統の増殖に適切な増殖因子を検出し
、そして評価することに及び造血細胞増殖に関連する因
子をアッセイすることに使用される。

〔特定の態様の記載〕

すべての造血細胞系統のために前駆体として作用するこ
とができる、実質的に均質な哺乳類幹細胞組成物が提供
される。その幹細胞は、モノクローナル抗体により同定
される特定のマーカーにより同定される。その実質的に
均質な組成物は、幹細胞に関連するエピトープ特性を示
す、分化された細胞に関連するマーカーを有さない細胞
の選択的単離により得られる。

幹細胞は、抗体により同定される特異的エピトープ部位
に関連するマーカーの存在及び一定のマーカーの不在の
両者により特徴づけられる。それらは、細胞表面上の特
定のマーカーのレベルによりさらに特徴づけられ得る。

選択は、幹細胞に対して特異的なマーカーにより達成さ
れる必要はない。陰性選択（細胞の除去）及び陽性選択
（細胞の単離）の組合せを用いることによって、実質的
に均質な幹細胞組成物が得られる。

単離方法は、初めに骨髄又は他の造血細胞源から主な細
胞種を除くために“比較的あらい”分離を用いるであろ
う。たとえば、磁気性ビーズ分離が、初めに多量の細胞
、すなわち造血システムの主要細胞集団、たとえばＴ−
細胞、種々の系統、たとえばＢ−細胞（プレーＢ細胞及
びＢ−細胞の両者）、頚粒球、骨髄卓球細胞及び血小板
、又は主要でない細胞集団、たとえば巨核球細胞、肥満
細胞、好酸球、及び好塩球を除くために使用され得る。

−船釣に、合計造血細胞の少なくとも約７０％、普通８
０％又はそれ以上の細胞が除されるであろう。初期段階
であらゆる専用細胞クラス、特に主要でない集団メンバ
ー及び血小板並びに赤血球を除くことは必須でない。本
発明の最後で陽性選択が存在するので、専用細胞は後に
残すであろう。しかしながら、最終の陽性選択において
、専用細胞の数を最少にするために、細胞系統のすベて
についての陽性選択が存在することが好ましい。

幹細胞は、５ｃａ−１として言及される抗体により認識
される幹細胞抗原を有することによって特徴づけられ、
ここで前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマＥ１
３１６１−７　［Ｅ＋ｒｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　、　（１９８６）１６　：　１３９１）又は１２−８
　（Ｄｒ、Ｉｒｖｉｎｇ　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、　　Ｆ
ｒｅｄＨｕｔｃｈ＋ｎ５ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔ
ｅｒ、　５ｅａｔｔｌｅ、　ＷＡ、により報告されてい
る）により産生される。さらに、その細胞は、種々の成
熟造血系統のための抗原性マーカー、たとえばＢ２２０
抗原ＲＡ３−６Ｂ２に対するモノクローナル抗体により
同定される、ブレーＢ及びＢ−細胞に関連する表面マー
カー、ＲＢ６８Ｃ５抗−Ｇｒ−１抗体により同定される
顆粒球に関連するマーカーＭａｃ−１抗体により同定さ
れる骨髄卓球細胞に関連するマーカー、及びＴ−細胞又
はその同等種に関連するＣＤ４及びＣＤ８マーカーを欠
くことが見出される。さらに、その細胞は、有意ではあ
るが、但し低レベルの細胞表面分化抗原、ゲラ歯動物に
おけるＴｈｙ−１抗原、及び他の哺乳類細胞における同
等抗原、たとえばヒト同等物を含み、ヒト同等物に対す
る抗体は、Ｏｒ、Ｊｏｈｎ　Ｆａｂｒｅ、　Ｒａｄｃｌ
ｉｆｆｅｆｔｏｓｐｉｔａｌ、　０ｘｆｏｒｄ、　ＧＢ
により報告されている。

初めに、対象の幹細胞を得るためには、骨髄又は他の造
血源における他の細胞から多分化能性幹細胞を単離する
ことが必要である。初めに、骨髄細胞が骨髄源、たとえ
ば脛骨、大腿骨、を髄、胎児肝臓及び他の管腔から得ら
れる。造血幹細胞の他の源は、胎児肝臓、胎児及び成熟
膵臓、卵黄膜の血島及び血液を包含する。

骨髄の単離に関しては、適切な溶液を用いて骨をフラッ
ジし、そして前記溶液は、低濃度、−船釣に約５〜２５
ｍＭの許容できる緩衝液と共に、ウシ胎児血清又は他の
天然に存在する因子により便利に補充された、平衡塩類
溶液である。便利な緩衝液は、ヘペス（ＨＩＥＰ［１ｉ
Ｓ）　、ＩＪン酸緩衝液、乳酸緩衝液、等である。

種々の技法が、初めに専用系統の細胞を除くための細胞
分離に使用され得る。抗体は、分離を可能にするために
固体支持体に付着され得る。モノクローナル抗体は特に
、マーカーを同定するために有用である。使用される分
離技法は、収集されるべき画分の生存性の保持を最大に
すべきである。

“比較的あらい”分離、すなわちマーカーを有する存在
する合計細胞の１０％まで、普通約５％よりも高くない
、好ましくは約１％よりも高くない細胞が、保持される
べき細胞集団に残存することができる分離に関しては、
異なった効力を有する種々の技法が使用され得る。使用
される特定の技法は、分離の効率、方法論の細胞毒性、
実施の容易性及び速度及び複雑な装置及び／又は技術熟
練の必要性に依存するであろう。分離のための方法は、
抗体被覆性磁気性ビーズを用いる磁気分離、親和性クロ
マトグラフィー、モノクローナル抗体に結合される又は
モノクローナル抗体と共に使用される細胞毒性物質、た
とえば補体及び細胞毒素、及び固体マ）　ＩＪフックス
例えばプレートに接合されている抗体を有する“パンニ
ング（ｐａｎｎｉｎｇ）”を包含する。正確な分離を提
供する技法は、種々の程度の知識、たとえば多くのカラ
ーチャネル、鈍角及び鋭角光の牧乱検出チャネル、イン
ピーダンスチャネノベ等を有する螢光活性化細胞選別機
を包含する。

本発明の方法の典型的なものとして、第１段階において
、骨髄からの細胞を、Ｔ−細胞決定基に対して特異的な
飽和レベルの抗体と共に換算温度、−船釣に一１０〜１
０℃の温度で短時間インキュベートした後、その細胞を
ウシ胎児血清（Ｆｅ２）緩衝液により洗浄する。次にそ
の洗浄された細胞を上記の緩衝媒体中に懸濁し、そして
Ｔ−細胞決定基に対する抗体により分離する。

便利には、抗体は、他の細胞からＴ−細胞の分離を容易
にするために、マーカー、たとえば直接的な分離を可能
にする磁気性ビーズ、支持体に結合されるアビジンと共
に除去され得るビオチン、螢光活性化細胞選別機を使用
することができる螢光、たとえばフルオレセイン、又は
同様のものにより接合され得る。残存する細胞の生存性
に害を与えないいづれかの技法が使用され得る。

抗体に結合された細胞が除かれた後、それらは捨てられ
る。次に残存する細胞を、１種の細胞分化抗原又はその
混合物に対して特異的な飽和レベルの抗体と共に換算温
度で十分な時間インキュベートすることができる。これ
らの細胞について選択するためには、Ｔ−細胞を除去す
るために使用されるのと同じ又は異なった機構がこの段
階において使用され得、そして続く段階においては、未
結合細胞を使用することが意図される。

次に、細胞分化抗原を有するものとして選択される細胞
が、連続的に又は−段階で、Ｂ−細胞系統、骨髄単球系
統、頚粒球系統、巨核球系統、血小板、赤血球、等に対
して特異的な抗体により処理される（後で除去されるべ
き重要でない系統が保持されているけれども）。これら
の抗体に結合する細胞を上記のようにして除去し、そし
て所望により残る細胞を、ウシ胎児血清を含む媒体中に
集める。

次に残存する細胞が、選択性ではないが、しかし幹細胞
に対しては特異的なラベルされた抗体により処理され、
但しマウスのためには抗体５ｃａ−１及びＴｈｙ−１”
により処理され、ここでラベルは所望により、螢光活性
化細胞分離（ＦＡＣ３）を提供する。

多色分析がこの段階で又は前で使用され得る。細胞は、
細胞分化抗原のためには中間レベルの染色、５ｃａ−１
のためには高いレベルの染色に基づいて分離され、そし
て幹細胞に対して死細胞及びＴ−細胞に関連する染料を
提供することによって死細胞及びＴ−細胞に対して選択
される。所望により、細胞は、ウシ胎児血清を含む媒体
中に集められる。

陽性選択のための他の技法（正確な分離を可能にする）
、たとえば親和性カラム及び同様のものが使用され得る
。その方法は、非幹細胞集団の約１％以下の残留量への
除去を可能にするであろう。

分離の特別な順序は臨界ではないが、但し、その示され
る順序が好ましい。好ましくは、細胞は初めに、所望と
しない細胞を示すマーカーにより分離され（陰性分離）
、続いて幹細胞集団に属する細胞を示すマーカー又はマ
ーカーレベルについて分離される（陽性選択）。

９０％以上、通常約９５％以上の幹細胞を有する組成物
は次の手段により達成され、ここで所望する幹細胞は、
低レベルのＴｈｙ−１細胞分化抗原を有することにより
、種々の系統関連抗原に対して陰性であることにより及
び５ｃａ−１抗原に対して陽性であることにより（前記
５ｃａ−１抗原は胸腺細胞のクローン原性骨髄前駆体及
びＴ−細胞前駆体又はすでに指摘したような哺乳類、た
とえばヒト相対物に関連する）同定される。

幹細胞は、中間の大きさのリンパ球、及び骨髄リンパ球
及び大きな骨髄細胞の間の大きさの丸型の中間体として
出現する。それらはさらに、幹細胞と相互関係する末期
形成ＣＦＵであることによって区別され、これによって
末期形成は、１２２日目少なくとも約２±０．８　ｍｍ
の実質的な大きさのコロニーを予定され、ところが８日
目でのコロニーは（もし存在するなら）、−船釣に約０
．５±０、２　ｍｍ以下である。

分化可能な幹細胞は、次の通りに定義され得る：（１）
すべての定義された血液リンパ球系統の子孫を生ぜしめ
；そして限定数の細胞が、それらの細胞が得られる致命
的に照射された宿主を完全に再構成することができる。

本発明の組成物においては、１００個以下の細胞、普通
７５個以下の細胞、より普通には５０個以下の細胞及び
約２０個はどの少ない細胞が、上記条件を満たすことが
できる。

従って、基本的な分化可能な幹細胞のために定められた
基準に基づいて、本発明の組成物はこれらの必要条件を
満たす。さらに、骨髄細胞の分析に基づく対象細胞は、
骨髄細胞の約０．０２〜０．１％の範囲で存在するよう
に思える。

本発明の方法は、を椎動物、特に哺乳類からの幹細胞を
単離するために使用され得る。マウスのために使用され
る抗体に類似する抗体が、霊長類、たとえばヒト、モン
キー、ゴリラ、等、家畜、ウシ、ウマ、羊、ブタ、等、
又は同様のものからの幹細胞を得るために使用され得る
。

幹細胞が単離された後、それらは、基質細胞、たとえば
因子の分泌に関連する骨髄又は胎児肝臓から得られる細
胞からのならし培地、又は幹細胞の増殖を支持する細胞
表面因子を含有する培地中で増殖することによって繁殖
され得る。基質細胞は、たとえば抗体−毒素接合体、抗
体及び補体、等による所望としない細胞の除去のために
適切なモノクローナル抗体を使用して幹細胞から解放さ
れ得る。

本発明の細胞組成物は、種々の方法で使用され得る。こ
の細胞は純粋なものであるので、それらは致命的に照射
された宿主、所望により同じ種又は属の宿主を完全に再
構成するために使用され得、そして種々の因子、たとえ
ばエリトロポエチン、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　、　Ｇ−Ｃ３Ｆ　
、　Ｍ−Ｃ３Ｐ、インターロイキン、たとえばＩＬ−１
，−２，−３，−４，−５，−６，−７、等、又は同様
のもの、又は特定の系統に傾倒するようになる幹細胞又
はそれらの増殖、成熟及び分化に関連する基質細胞を使
用することにより、１又は複数の選択された系統へのそ
れらの成熟、増殖及び分化を提供することによって、特
定の系統のための細胞の源として使用され得る。

幹細胞はまた、造血細胞の分化及び成熟に関連する因子
の単離及び評価にも使用され得る。従って、幹細胞は、
培地、たとえばならし培地の活性を決定し、そして細胞
増殖活性のための流体、特定の系統への関与又は同様の
ものを評価するためのアッセイにおいて使用され得る。

細胞は、流体窒素温度で凍結され、そして長期間貯蔵さ
れ、融解され、そして再使用され得る。

細胞は通常、１０％ＤＭＳ０　、５０％ＦＣ３，４０％
ＲＰＭＩ　１６４０媒体中に貯蔵されるであろう。融解
した後、細胞は、幹細胞の増殖及び分化に関連する増殖
因子又は基質細胞の使用により拡張され得る。次の例は
例示的であって、限定するものではない。

〔実　験〕

材料及び方法 マウス、　Ｃ５７ＢＬ６／Ｋａ（Ｂ／６．　Ｔｈｙ−１
，２）及びＣ５７ＢＬ６／Ｋａ−Ｔｈｙ−１，１（Ｂ／
６−Ｔｈｙ−１，１，’ｒｈｙ−ｔ、　１）を繁殖せし
め、そしてスタンフォード大学での動物施設中で養った
。

抗体、ラットモノクローナル抗体ＩＥ１３１６１−７（
抗幹細胞抗原ｌ　、　５ｃａ−１）及び８３８ｌ−２（
抗−幹細胞抗原２　、５ｃａ−２）並びに他の推定上の
抗−プレーＴ細胞抗体（第１表を参照のこと）は、前に
説明された［Ａｉｈａｒａなど、、　Ｂｕｒ、Ｊ、　１
ｍｍｕｎｏ１．　（１９８６）１６゜１３９１）。

第　　１　　表 推定上の抗−プレーＴ細胞抗体により認識される抗原の
組織分布 合計　Ｔｈｙ−１１０画分 ８１３１６１−７（Ｓｃａ−１）　　７．０　０．５８
（３３％）　　髄質、被膜、内皮ｌＥ３　８ｌ−２（Ｓ
ｃａ−２）　　１２．２　０．５４（３１％）　　皮質
１２７−９　　　　３５．３　０．５６（３２％）　　
髄質２３８−２　　　　４７．２　０．９８（５６％）
　　すべての胸腺細胞２０−３　　　　　　２．３　０
．０５（３％）　　　まれなりラスター３３　　　　　
　１．０　０．０７（４％）　　皮質正常な骨髄が、示
されたモノクローナル抗体（全体）により染色するため
に及び抗−Ｔｈｙ−１抗体（Ｔｈｙ−１”画分）により
同時に染色するために２１色免疫螢光により分析された
。

染色される全体のＴｆｌｙ−１”細胞の両分は、括弧で
示される。

ラットモノクローナル抗体ＲＢ６−８Ｃ５（抗−Ｇｒ−
１、顆粒球マーカー）及びＲＡ３−６Ｂ２　（抗−８２
２０）は、Ｏｒ。

Ｒ，Ｃｏｆｆｍａｎ（ＤＮＡＸ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｏ、　　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ。

ＣＡ）　　により提供された。ラットモノクローナル抗
体５３−２．１　（抗−Ｔｈｙ−１，２）、Ｇｋｌ、５
　　（抗−ＣＤ　４　）、５３−６．７１（抗−ＣＤ　
８　）　、５３−７．３１３　（抗−Ｃ［１５）、Ｍｌ
／７０．１５．１１．５　（抗−Ｍａｃ−１）及びＩＭ
７，８．１（抗−食細胞糖タンパク質−１、Ｐｇｐ−１
、Ｌｙ−２４）は、すべてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから入手でき
る。マウスモノクローナル抗体１９Ｘ巳５（抗−’ｒｈ
ｙ−ｔ、　１）は、　Ｏｒ、Ｒ，Ｎｏｗｉｎｓｋｉ（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ　　Ｉｎｃ、、　　５
ｅａｔｔｌｅ１’ｌＡ）から提供された。

ラットモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿法
及びイオン交換クロマトグラフィーにより組織培養上漬
物から精製した。マウスモノクローナル抗体１９Ｘε５
を、デキストラン球体上に固定されたブドウ球菌のプロ
ティンＡを含む親和性クロマトグラフィーにより組織培
養上漬物から精製した。すべてのモノクローナル抗体を
、標準方法に従ってビオチン−スクシンイミドエステル
（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ、　Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、　ＣＡ）又はフル
オレセインインチオシアネート（ＢｅｃｔｏｎＤ＋ｃｋ
ｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）
により誘導体化した。マウスモノクローナル１９Ｘε５
が、Ｏｒ、　Ｐ、Ｌａ１ｏｒ（ｌｌｌａｌｔｅｒ　ａｎ
ｄ　８１ｉｚａ　Ｈａｌｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ
　ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、　Ｍｅｌｂｏｕｒ
ｎｅ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）によって７゜フィコシア
ニン（ＡＰＣ）により誘導体化された。

マウス免疫グロブリンにより吸収されたヤギ抗−ラット
ＩｇＧを得、Ｃａｌｔａｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（ＳｏｕｔｈＳａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）か
らのＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（ＴＲ）又はフルオレセイン（
ＦＬ）に接合せしめた。ストレプトアビジン及びヤギー
抗−ラットエｇに接合されたフィコエリトリン（ＰＥ）
を、８ｉｏｍｅｄａ　Ｃｏｒｐ。

（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）から得た。ＦＬ−
ラベルされたアビジンをＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ。

ＣＡ）から得、そしてＴＲ−ラベルされたアビジンをＣ
ｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　　Ｉｎｃ、　　
（Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、　　ＰＡ）から得た。

照射及び再構成、照射され、そして再構成された動物を
、抗生物質（ネオマイシン１．１ｇ／ｌポリミキシン０
．１１　ｇ　／β、任意に）上で維持した。

放射線（全射に対して９００ラツド）を３時間間隔で２
回の等しい投与量で放射し、この方法は非造血組織にお
いていくらかの放射線修復を可能にし［Ｇｅｒａｃｉな
ど、、　　Ｊ、Ｒａｄ、Ｏｎｃ、Ｂｉｏｌ、Ｐｈｙｓ、
　（１９７７）　２　＋６９３］　、そして従って再構
成された動物の生存率を高める（Ｆｅｒｒａｒａなど、
、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８７）４３
　：　４６１１　。２５０−ｋＶ　Ｘ−線マシン（Ｐｈ
ｉｌｌｉｐｓ）を用いて、１００ラツド／分で放射した
。すべての再構成は、後眼窩叢を通っての静脈内注入に
より存在した。

細胞懸濁染色、すべての細胞懸濁液を、５％ウシ血清（
Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、　Ｌｏｇ
ａｎ、　ＩＪＴ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）及び５ｍＭのアジ化ナト
リウムニより補足されたハンクス液中に調製した。照射
された動物の再構成のために骨髄細胞の懸濁液を同じ媒
体中に調製した（但し、０．５ｍＭのアジ化す）　ＩＪ
ウムを含んだ）。細胞懸濁染色は、はとんどの場合、直
接的にラベルされた抗体を利用した。第二段階の抗−ラ
ット免疫グロブリン染色が他のラット免疫グロブリンと
共に多色染色に利用される場合、細胞はまずラベルされ
ていない抗体と共にインキュベートされ、次に洗浄され
、そしてラベルされた第二段階抗体と共にインキユベー
トされる。

２回目の洗浄の後、細胞を正常なラット免疫グロブリン
（１０ｈｇ／ｍ、　Ｐｅ１−Ｆｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓ、　　Ｒｏｇｅｒｓ。

ＡＫ）１０ｐ１中に再懸濁し、そして１０分間インキニ
ベートし、その後ラベルされた試薬を直接添加した。す
べてのインキュベーション及び洗ｅは、氷上で行なった
。沃化プロピジウム（ＰＩ）を、分析のための染色の最
後の５分間、１０躍／−で又は選別のための最終細胞懸
濁液中に２Ｒ／ｍｌで添加した。ＰＩは、４色免疫螢光
分析から省かれた。

１０８　：　１９７）に記載のようにして改良された８
ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣ３を用いた。

二元レーザー装置は、４種の螢光パラメーター及び２種
の光散乱パラメーターがそれぞれの分析された細胞のた
めに記録されることを可能にする。残留赤血球及び死細
胞並びに残骸を、分散ゲート及びＰＩ染色により、又は
４色分析における分散ゲートのみにより分析から排除し
た。ＦＬ及びＰＥ、ＦＬ及びＰＩ、及びＴＲ及びＡＰＣ
の特殊オーバーラツプのための補正を、Ｐａｒｋｓ　ａ
ｎｄ　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、　１９８４、前記に記載
されるようにして電気的に調節した。血色染色は、異な
ったフルオロクロムに接合される同じ試薬のいくつかの
組合せを用いて行なわれ、その結果はフルオロクロムの
種々の特殊オーバーラツプにかかわらず一致しているこ
とを確かにした。さらに、４−色分析の結果は、２−及
び３−色分析からのデータとの比較により確証された。

細胞選別に関しては、染色されたサンプルを、選別工程
を通して４℃で維持した。少量の選別物を、水浴中、円
錐形ガラス管のウシ胎児血清（ＳｔｅｒｉｌｅＳｙｓｔ
ｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｌｏｇａｎ、　ＬＩＴ）に集め
た。三色選別は、ヘマトリンパ球系統−陽性細胞（たと
えばＢ２２０．　Ｍａｃ−１，Ｇｒ−１，ＣＤ４及び／
又はＣＤ８を発現する細胞）を分類するためにＰＥ、及
び死細胞を分類するためにＰＩを利用し、そして両シグ
ナルは検出され、そしてＦＡＣ３単チャネルに排除され
た。

ＦＡＣ３による細胞集団の単離の後、サンプルをＨＢＳ
Ｓにより１：１に希釈し、ＲＣＦ２００で１０分間遠心
分離し、そして血球計数器による計数のためにＨＢＳＳ
５０〜１００　ｄ中に再懸濁した。

免疫組織化学、リンパ球器官のクリオスタット切片を用
意し、そしてビオチニル化されたウサギ抗−ラット免疫
グロブリンにより検出される変性されていない抗体（マ
ウス血清により吸収される）及びホスラディシュペルオ
キシダーゼーアビジンＤ（両者ともＶｅｃｔｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ。

ＣＡからである）を用いて、Ｒｅ１ｃｈｅｒｔなど、、
　Ｃｅ１ｌ（１９Ｂ４）　３８　：　８９に記載のよう
にして染色した。着色を、基質として３−アミノ−９−
エチルカルバゾール（Ｋ　ａｎｄ　Ｋ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏ−ｒｉｅｓ、　Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、　ＮＹ）を用い
て可視化し、スライドをヘマトキシリンにより軽く逆染
色し、そしてＣｒｙｓｔａｌ／！Ｊｏｕｎｔ媒体（Ｂｉ
ｏｍｅｄａ　Ｃａｒｐ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、
ＣＡ）を用いて永久的に固定した。

分化可能な造血幹細胞の精製 骨髄細胞が、５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２．　Ｓｔｅｒｉ
ｌｅＳｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、　　Ｌｏｇａｎ、　　
ＵＴ）及びｌＱｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｃ１ｅｖｅｌ
ａｎｄ、　０Ｈ）（ＨＢＳＳ）により補足された、フェ
ノールレッド（Ｇｉｂｃ。

しａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｈａｇｒｉｎ　Ｆａｌ
ｌｓ、　ＯＨ）を含まないハンクス液により１０Ｃ５７
ＢＬ／Ｋａ−Ｔｈｙ−１，１？ウスの睡骨及び大腿骨を
フラッシュすることによって得られた。その細胞を、Ｃ
Ｄ４及びＣＤ８Ｔ−細胞決定基に対して特異的な直接的
にフルオレセイン化された飽和レベルのラット抗体（そ
れぞれ抗体ＧＫ−１，５及び５３−６．７２）と共に氷
上で３０分間インキニベートした。ＦＣ３緩衡液により
洗浄した後、細胞を、羊−抗一フルオレセイン抗体（Ａ
ｄｖａｎｃｅｄ　ＭａｇｎｅｔｉｃｓＩｎｃ、、　Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）に結合された磁気性ビーズ０
．６ｍｌを含むＨＢＳＳ　６　ｍｌ中に再懸濁し、そし
て一定に混合しながら２０分間室温でインキュベートし
た。ラベルされたＴ−細胞を磁気分離により除去しくＢ
ｉｏ−Ｍａｇ　５ｅｐａｒａｔｏｒ、　Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、　　Ｉｎｃ、）、そして揄で
た。残存する細胞を、Ｔｈｙ−１，，１対立遺伝子性決
定基に対して特異的な直接的にフルオレセイン化された
飽和レベルのマウス抗体（抗体１９ＸＢ５）と共に氷上
で３０分間インキュベートした。磁気性ビーズを添加し
、そして上記のようにしてインキュベートし、そしてラ
ベルされた細胞を磁気分離により回収した。元の細胞懸
濁液の約２．０％が回収された。

磁気的に分離された細胞を次の試薬と共に順序よくイン
キュベートしたくそれぞれの段階は氷上で２０分間であ
り、そしてＦＣ３緩衝液を含むＨＢＳＳによる洗浄によ
り停止せしめた）：１回のインキュベーションでの抗−
８２２０、−Ｍａｃ−１及び−Ｇｒｌ（それぞれラット
抗体ＲＡ３−６Ｂ２．　Ｍｌ／７０．１５．１１．５、
及びＲｅ６−８［’５　　；これらの抗体はＢ−細胞、
マクロファージ及び顆粒球の分化されたヘマ）　ＩＪン
パ球糸系統定義する）；フィコエリトリン接合のヤギー
抗−ラット免疫グロブリン（マウス免疫グロブリンによ
り吸収された、Ｂｉｏｍｅｄａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｆｏｓ
ｔｅｒＣｉｔｙ、　ＣＡ）　　；正常なラット免疫グロ
ブリン（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ
、　Ｒｏｇｅｒｓ、　ＡＫ）　　；ビオチニル化された
ラット−抗−３ｃａ−１（抗体８１３１６１−７）　；
及びＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ接合のアビジン（Ｃｏｏｐｅｒ
　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＩｎｃ、、　Ｗｅｓｔｃｈｅｓ
ｔｅｒ、　ＰＡ）。最終洗浄の後、細胞を、２河／彪の
沃化プロピジウムを含むＨＢＳＳ中に再懸濁した。

ラベルされた細胞を、前記のようにして改良された二元
レーザー螢光活性化細胞選別器（ＦＡＣ３゜Ｂｅｃｔｏ
ｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅ
ｗ、　ＣＡ）を用いて分析し、そして分離した。選別さ
れるべき細胞を、中間レベルのフルオレセイン染色（Ｔ
ｈｙ−１”）　、高い直角の散乱（磁気性ビーズの細胞
表面結合によって）、高いレベルのＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ
（Ｓｃａ−１”）　、中間の前方への散乱（ＲＢＣ１遊
離ビーズ及び細胞凝集体を排除するために）及び低レベ
ルのフィコエＩＪ　）リン／沃化プロビジラム（死細胞
及びＴ−系統細胞を排除する、１つのＦＡＣＳチャネル
に一緒に検出される）に基づいて選択した。選別された
細胞集団は、ＦＡＣ３に基づいての再分析により評価さ
れる場合、それらのＴｈｙ−１”Ｌｉ＋ｒＳｃａ−１＋
表現型に関して９０％以純粋であった。細胞を溶解剤（
ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ、　ＭｃＧｒａｗ　Ｐａｒｋ、　　ＩＬ）　ヘの暴
露により溶解し、そして１０躍／−の沃化プロピジウム
による染色の後、核を分析した。

膵臓コロニー形成単位（ＣＦｔｌｓ）活性を、未分離骨
髄細胞又は単離された造血幹細胞を致死的に照射された
（９００　ｒ　）同系マウスに静脈内導入した後、１２
日目に評価した。直線の回帰分析によれば、１つの膵臓
コロニーが、導入された１０個の造血幹細胞光たりに（
ｒ＝０．９１）　、又は７２００個の未分離骨髄細胞当
たりに（ｒ　＝０．９３）形成された。

精製された幹細胞による胸腺コロニー形成胸腺コロニー
形成単位（ＣＦＵｔ）活性を、単離された造血幹細胞を
半致死的に照射された（７００　ｒ　）、Ｔｈｙ−１及
びＬｙ−５遺伝子座で幹細胞集団にコンジェニックなマ
ウスに胸腺的導入した後、４週目に評価した。供与体対
立遺伝子決定基を発現する細胞のＦＡＣ３分析により検
出された胸腺コロニーは、１×１０５〜１×１０８個の
細胞サイズを有した。コロニーサイズは、３個の細胞の
ある受容体が１０７個の供与体由来の細胞から成る胸腺
コロニーを含む場合、導入された細胞の数により変化し
なかった。

限界希釈分析によれば、１つのＣＦＵｔが、４個の造血
幹細胞光たりに導入された（ｒ＝０．９Ｘ）。

精製された幹細胞による複数のヘマトリンパ糸回集団 制限数の造血幹細胞が、複数のへマドリンパ球系統を再
構成するであろう。４０個のＴｔｌＶ−１”Ｌｉｎ−″
５ｃａ−ド細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−ＬＶ−５，２）を、
２００個の宿主由来の幹細胞と一緒に致死的に照射され
た（９００　ｒ　）Ｌｙ−５同系マウス（Ｃ５７ＢＬ、
’Ｋａ、　Ｌｙ−５，１）の静脈内に導入した。その浸
種々の時間で、供与体由来の細胞（ｔ、ｙ−５，２）を
、末梢血液中に検出し、そして２色ＦＡＣ５分析により
表現型分析した。再構成後９週間で、このマウス中の末
梢血液の５０％が４０個の造血幹細胞に由来していた。

これらは、６０％の循環性Ｔ−細胞、５０％のＢ−細胞
及び５０％の好中球を含有した。

精製された幹細胞による致死的照射の保護１０〜２０匹
のマウスグループを、致死的に照射しく９００ｒ）、そ
して類別された数の精製された造血幹細胞により静脈内
再構成した。５０％の受容体動物が、３０個の細胞が導
入された場合、その照射を残存した。対照的に、約１３
．０００個の未分離骨髄細胞が、同じレベルの放射性保
護を達成するためには必要とされる［Ｖｉｓｓｅｒなど
、　、　Ｊ、　［ｉｘｐ、　！、ｌｅｄ。

（１９８４）５９　：　１５７６：］。

結果 骨髄幹細胞を、比較的少ないサブ集団、すなわちＴＩＴ
Ｙ−１”Ｌｉｎ−として表現型化される０、１〜０．２
％の細胞に限定する〔Ｍｕｌｌｅｒ−３ｉｅｂｕｒｇな
ど、、　Ｃｅ１ｌ（１９８６）　４４　：　６５３〜６
６２〕。この集団は、個々のヘマトリンパ球系統のため
の前駆体、たとえば胸腺細胞前駆体を含む。５ｃａ−１
と呼ばれる他のモノクローナル抗体がまた、胸腺細胞の
ほとんどくすべてではない）のクローン原性骨髄前駆体
及びそれらのＴ−細胞子孫を選択する（Ａｉｈａｒａな
ど、、　１９８６、前記）。たった２０〜３０％のＴｈ
ｙ−１１０Ｌｉｎ−細胞が５ｃａ−ドである。骨髄Ｔ−
細胞の免疫磁気性ビーズ援助の除去、続＜　Ｔｈｙ−１
”細胞の免疫磁気性ビーズ援助の富化、続＜　Ｔｈｙ−
１１０１ｉｎ　５ｃａ−１”細胞のＦＡＣ３選択の組合
せを用いて、中間サイズのリンパ球のように見える丸型
の細胞の実質的に純粋な集団を得た。これらの細胞は、
ＦＡＣ５ＡＣ５分析示されるようなＴｈｙ−１”　Ｌｉ
ｎ−３ｃａ−１”である。前方への散乱分析によれば、
それらは、骨髄リンパ球と大骨髄細胞との間の大きさの
、単一型をピークとする中間体として出現する。すべて
ではないが、はとんどのこれらの細胞は有糸分裂周期の
ｃｏ／Ｇ。

相にあり；沃化プロピジウムにより染色された核のＦＡ
Ｃ３分析によれば、２９７％がＤＮＡの量であった。

肺臓コロニー形成アッセイは、分化可能な造血幹細胞活
性を正確に評価するものとして長く児なされて来たが、
最近の証拠は、後期形成性（１２日目）ＣＦＵのみが幹
細胞の真の活性と相互関係することを示す［：Ｍｏ１ｉ
ｎｅａｕｘなど、、　Ｂｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ。

（１９８６）　１４　：　７１０：］。ＦＡＣ３分析に
より見出されるように、Ｔｈｙ−１１０Ｌｉｎ−３ｃａ
−１”骨髄細胞は、完全な骨髄に比べて、１２日目で１
０００倍高いＣＦＵ活性を有する。８日目では、実質的
なＣＦＵ活性の増大は見出されない。

１つの膵臓コロニーが、静脈内導入された１０個の幹細
胞光たりに観察された。肺臓移植のための接種因子（ｆ
）は、肺臓コロニーを形成することができる幹細胞の絶
対数の問題を複雑にする。

ｆ　＝０．１０〜０．２０として肺臓接種因子を受は入
れる場合〔Ｈｅｎｄｒｙ、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　
Ｋｉｎｅｔ、（１９７１）　４　：　２１１　；Ｔｉ１
ｌ　ａｎｄ　ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ、　Ｓｅｒ、Ｈｅｍａ
ｔ、　（１９７２）第７巻、２：１５Ｌ１２日目に肉眼
で見える肺臓コロニーを形成することができるＴｈｙ−
１”Ｌｉｎ　５ｃａ−ド細胞集団における細胞の実際の
頻度は、１〜２個の細胞光たり１である。

肺臓コロニーの一時的な進化は、８日以内に肺臓コロニ
ーを生成する骨髄細胞は分化の系統にゆだねられている
ように思われ、そして１２日後でのみコロニーを生成す
る細胞は中立的な分化可能な前駆体の特徴を有するよう
に、それらの前駆体細胞の成熟のレベルを指摘すること
ができる。候補体である初期の骨髄赤血球前駆体は１２
日目で肺臓コロニーを生ぜしめ、そしてより分化された
前駆体は８日目で膵臓コロニーを優先的に生せしめるこ
とが推定される。Ｔｈ’Ｊ　１”Ｌｉｎ−骨髄細胞の５
ｃａ−ド及び５ｃａ−１−画分により生成された＊ｍコ
ロニーを調べた。５ｃａ−ド画分は、８日目でのアッセ
イにおいてほとんど膵臓細胞を生せしめることができず
、そしてこれらのコロニーはひじょうに小さかった（０
．４８±０．０６ｍｍ）。しかしながら、１２日目で、
５ｃａ−ｒ画分により生成されたコロニーは、２．１２
±０．６９ｍｍの平均直径を有した。対照的に、それぞ
れ８日目及び１２日目で５ｃａ−１”’画分により生成
されたコロニーは、それぞれ１．１０±０．２４ｍｍ及
び２．３２±０．８２順であった。８日目でのＣＦ［Ｉ
ｓは１２日間を通して持続されず、その結果、８日目及
び１２日目で５ｃａ−１−画分により可視化されるコロ
ニーは同じ前駆体細胞の生成物でないことが一般的に受
は入れられている。従って、骨髄のＴｈｙ−１”Ｌｉｎ
−３ｃａ−ド画分は、２種の明確な細胞集団を含むこと
ができる。

ＴＩＩｙ−１”Ｌｉｎ−骨髄細胞の５ｃａ−ド及び５ｃ
ａ−１−画分の両者により生成される肺臓コロニーを、
どの両分が赤芽又は骨髄前駆体のために比較的富化され
るか又は消耗されるかを決定するために顕微鏡により評
価した。その結果は、５ｃａ−ド画分が完全な骨髄によ
り生成されるコロニーに類似するコロニーの分布を生成
し、そして純粋な赤芽コロニーに特に８日目で富化され
たことを指摘した。他方、５ｃａ−Ｐ画分は、９日及び
１２日目で、より多くの骨髄コロニー及び混合コロニー
を生成した。

１−Ｌ−考 Ｔｈｙ−１”Ｌｉｎ−５ｃａ−１−及び７ｈｙ−１”Ｌ
’ｉｎ　５ｃａ−ド骨髄細胞に由来する初期及び後期の
１１１１！［コロニーの組織学的分析８　　　　Ｔｈｙ
−１１０いｎ−３ｃａ−１”　　　　　　　１００　　
　　　３Ｔｈｙ−１１０ＬｉｒｒＳｃａ−１−４２４２
１７１２９Ｔｈｙ−１”Ｌｉｎ−３ｃａ−ド　　　４１
　　２８　　３１　３２Ｔｈｙ−１１０Ｌｉｎ−３ｃａ
−１−８０５１５２０１２Ｔｈｙ−１”Ｌｉ＋ｒＳｃａ
−ド　　　２７　　２７　　４６　１５Ｔｈｙ−１”Ｌ
＋ｎ−３ｃａ−１−２７２７４６１１照射された（９０
０ラツド〉受容体マウスのグループは、１０００個のＴ
ｈ、１　＋　ｏいｎ−５ｃａ−ド細胞又は２００個のＴ
ｈｙ−１１°Ｌｉｎ−３ｃａ−ド細胞を静脈内に受けた
。

骨髄は、致死的に照射された宿主中に静脈内導入するこ
とによって示されるように、クローン原生胸腺誘導性前
駆体（ＣＦ［Ｉｔ）の集団を含む。限界希釈分析によれ
ば、これらは静脈内注入された３５０００個の骨髄細胞
光たり約１個及び胸腺肉注入された５〜８０００個の細
胞当たり約１個の細胞を表わす。

単離されたＴｔｌｙ−１”　Ｌｉｎ−３ｃａ−ド骨髄細
胞画分ニ由来する胸腺細胞コロニーを、５個はどの細胞
の胸腺肉注入に従って確立することができる。１０個又
はそれ以上のこれらの細胞の胸腺肉注入は、注入された
胸腺葉の９５％又はそれ以上の胸腺コロニーをもたらし
た。限界希釈分析によれば、胸腺の微小環境に応答する
能力を有するこれらの細胞の頻度は、４個の細胞当たり
約１である。これは、胸腺肉注入された骨髄細胞のたっ
た約３０％が、注入の後数時間、胸腺に残存するので、
過小評価であるらしい［：Ｋａｔｓｕｒａ、など、、　
Ｊ、　Ｉｍ＋ｍｕｎｏ１．（１９８６）１３７　：　２
４３４］。

ネズミ分化可能造血幹細胞の定義は次の２つの要素があ
る：それぞれの幹細胞は、すべての定義されたへマドリ
ンパ球系統の子孫を生せしめることができるべきであり
；そして限定数の幹細胞は、致死的に照射されたマウス
を十分に再構成し、それらの長期の生存を導びくことが
できるべきである。限定数のＴｈｙ−１”Ｌｉｎ　５ｃ
ａ−１”骨髄細胞は、照射されたマウス中に注入される
場合、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞及び骨髄系統を再増殖するこ
とができた。

４０個のＴｈｙ−１”　Ｌｊｎ−３ｃａ−１”幹細胞は
、Ｔ−２００白血球の共通抗原のＬｙ−５，２対立遺伝
子決定基の発現により同定され得るヘマ）　ＩＪンパ球
の多数の系統を確立した。この抗原は、すべてのへマド
リンパ球系統の細胞により発現されるが、但し赤芽球及
び赤血球は例外である（Ｓｃｈｅｉｄ　ａｎｄ　Ｔｒｉ
ｇｌｉａ。

Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７９）　９　：　
４２３１　。約５０％の末梢血液リンパ球が４０個の注
入された幹細胞に由来し、そして残りの細胞は、４０個
の同系幹細胞と一緒に注入された３００個の同系Ｔｈｙ
−１”Ｌｉｎ−細胞に由来する。従って、Ｔｈｙ−１”
　Ｌｉｎ〜５ｃａ−ド細胞は、多くの系統を再構成する
ことができる。

前の研究においては、致死的に照射されたマウスの５０
％の生存率が約４ＸｌＯ’個の骨髄細胞及び約１００個
のＴｈｙ−１”Ｌｉｎ−骨髄細胞により達成され得た〔
Ｗｈｉｔｌｏｃｋなど、、　Ｃｅ１ｌ（１９８７）４８
　：　１００９）。

この研究におけるＴｈｙ−１”ＬｉｒｒＳｃａ−１＋細
胞の活性を定量化するために、類別された数の細胞が、
致死的に照射された同系宿主中の静脈内に注入された。

驚くべきには、致死的に照射されたマウスのグループの
半分を救うために、２０〜３０個の７１．ｙ−１＋。

Ｌｉｎ　５ｃａ−ド骨髄細胞が必要とされ、そして同じ
結果が４Ｘ１０’個の未分化骨髄細胞から得られた。

ＣＦＬＩｓ及びＣＦＵｔアッセイに関しては、これは未
分離骨髄よりも１０００倍高い相対的富化を示す。Ｔｈ
ｙ　１１０Ｌｉｎ−３ｃａ−ド骨髄細胞のサブセットは
、すべての骨髄細胞のたった約０．０５％を示す。従っ
て、５０％の再構成をもたらす約４ＸＩＯ’個の完全な
骨髄細胞は、致死的に照射されたマウスの数及び再構成
において、約２０個のＴｈｙ−１”ＬｉＦＳｃａ−１＝
細胞に相当する。致死的に照射された宿主の十分に長い
期間のヘマ）　ＩＪンパ球の再構成及び生存は、Ｔｈｙ
−１”Ｌｉｎ−３ｃａ−１”細胞以下のいづれの細胞を
も必要としない（又は利用しない）ように思われ：すな
わち、すべてではないが、はとんどの分化可能なマウス
造血骨髄幹細胞はＴｈｙ−１１０Ｌｉｎ−３ｃａ−１”
である。

上記結果は、分化可能な幹細胞の実質的に均質な又は均
質な組成物が単離されたことを示す。試験された細胞は
、致死的に照射された宿主にすべての造血細胞系統を生
成せしめ、そして前記宿主に５０％の生存率を付与する
能力を示した。本発明の細胞は、胸腺に注入される場合
、高い効率でコロニーを生ぜしめ、そしてＴ−細胞集団
を生成せしめることが示される。従って、幹細胞は、特
定の因子についてのアッセイの同定を妨害し又は宿主へ
の注入後、宿主に疾病を引き起こす他の細胞を有さない
。その幹細胞は、たとえば移植、レトロウィルス性感染
、たとえばＡＩＤＳ又は同様のものの場合に、免疫無防
備状態の宿主中に免疫学的活性細胞を再構成するために
使用され得る。従って、本発明の造血幹細胞は、１又は
複数の造血系統が欠失し又は宿主が何らかの原因で免疫
無防備状態であるような広範囲の種類の条件下に使用さ
れ得る。

本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、
本発明が関与する技術の熟練のレベルの表示である。す
べての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組
込まれる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞集団として同じ哺乳類源からの生存哺乳類造血
   幹細胞から実質的に成る細胞組成物。 ２、前記細胞がマウス細胞である請求項１記載の細胞組
   成物。 ３、前記細胞が生理学的に許容できる媒体中に存在する
   請求項１記載の細胞組成物。 ４、請求項１記載の細胞組成物を調製するための方法で
   あって、 （１）骨髄細胞集団を、Ｔ−細胞マーカーによりＴ−細
   胞集団及び実質的にＴ−細胞を含まない集団に分離し； （２）骨髄細胞集団を、高レベルの細胞分化マーカー含
   有集団及び低レベルの細胞分化マーカー含有集団に分離
   し； （３）骨髄細胞集団を、造血専用細胞の主要細胞集団の
   マーカーを実質的に含まない集団及び造血専用細胞の少
   なくとも１つのマーカーを含有する細胞に分離し； （４）造血専用細胞のマーカーを実質的に含まない骨髄
   細胞集団を、幹細胞抗原に対する抗体に結合する細胞及
   び結合しない細胞（ここで幹細胞抗原に結合する前記細
   胞は、実質的に均等な幹細胞集団である）に分離するこ
   とを含んで成り、但し、段階（１）、（２）及び（３）
   はどんな順序でも良く、そして前の段階からの細胞が次
   の連続した段階に使用され、そして得られた骨髄細胞集
   団が段階（４）に使用されることを特徴とする方法。 ５、段階（１）を磁気性ビーズにより行ない、そして段
   階（４）を螢光活性化細胞選別により行なう請求項４記
   載の方法。 ６、段階（３）において、前記専用細胞の分離を同時に
   行なう請求項５記載の方法。 ７、前記同時分離を、磁気性ビーズ又は螢光活性化細胞
   選別を用いて行なう請求項６記載の方法。 ８、脊椎宿主中において少なくとも１種の造血細胞タイ
   プのレベルを高めるための方法であって：請求項１記載
   のコンジェニックな細胞組成物を前記宿主に投与するこ
   とを含んで成る方法。 ９、前記宿主が哺乳類宿主である請求項８記載の方法。 １０、免疫無防備状態の宿主の免疫応答を高めるための
   方法であって： 請求項１記載のコンジェニックな細胞組成物を前記宿主
   に投与することを含んで成る方法。 １１、専用造血細胞を産生するための方法であって： 請求項１記載の幹細胞と専用造血細胞に分化する前記幹
   細胞をもたらす少なくとも１種の増殖因子とを接触せし
   めることを含んで成る方法。 １２、前記増殖因子が基質細胞に起因する媒体に起因す
   る請求項１１記載の方法。 １３、専用造血細胞の混合物を生成するための方法であ
   って： 請求項１記載の幹細胞と少なくとも２種の異なった専用
   造血細胞に分化する前記幹細胞をもたらす少なくとも１
   種の増殖因子とを接触せしめる方法。 １４、特定の系統への幹細胞の分化を引き起こすことが
   できる増殖因子をアッセイするための方法であって： 請求項１記載の幹細胞と前記増殖因子を含むと思われる
   サンプルとを接触し；そして 前記系統の専用細胞の集団を決定することを含んで成る
   方法。 １５、幹細胞の増殖及び／又は自己再生を引き起こすこ
   とができる増殖因子についてのアッセイを行なうための
   方法であって： 栄養培地中に前記増殖因子を含むと思われるサンプル又
   は前記増殖因子を産生する細胞を混合し；そして 前記増殖因子の存在を示すものとして前記幹細胞又はそ
   の子孫の個体群の変化を決定することを含んで成る方法
   。