JPH0242979A - 化粧用または薬用組成物の製造 - Google Patents
化粧用または薬用組成物の製造Info
- Publication number
- JPH0242979A JPH0242979A JP1154375A JP15437589A JPH0242979A JP H0242979 A JPH0242979 A JP H0242979A JP 1154375 A JP1154375 A JP 1154375A JP 15437589 A JP15437589 A JP 15437589A JP H0242979 A JPH0242979 A JP H0242979A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hair growth
- cells
- dermal papillary
- gene
- papillary fibroblasts
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 21
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims abstract description 36
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 claims description 13
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 5
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 claims description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 229960003632 minoxidil Drugs 0.000 claims 3
- -1 minoxidil glucuronides Chemical class 0.000 claims 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims 2
- 229940124563 hair growth stimulant Drugs 0.000 claims 2
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 claims 2
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N Minoxidil Chemical group NC1=[N+]([O-])C(N)=CC(N2CCCCC2)=N1 ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 229930182480 glucuronide Natural products 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 abstract 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150072261 large T gene Proteins 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
- A61K8/494—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with more than one nitrogen as the only hetero atom
- A61K8/4953—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with more than one nitrogen as the only hetero atom containing pyrimidine ring derivatives, e.g. minoxidil
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0627—Hair cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
- A61K2800/86—Products or compounds obtained by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Birds (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、吐乳動物の皮膚に局所適用するための化粧用
又は薬用組成物、及びこの組成物の成分の製造方法に関
するものである。該成分は、毛髪成長を促進し得る育毛
促進剤（ａ ｈａｉｒ ｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｅｒ
；数種の物質の混合物であってもよい。）である。 １９８８年６月に公開されたヨー【】ツバ特許出願第８
７、３１１３１６．１号には、ヒト毛髪成長を増大させ
るための局所適用組成物中に含有される育毛促進剤が開
示されている。このＲ℃促進剤は培ｒＪ貞皮乳頭線維芽
細胞の細胞非含有上清から得ることができる。該成分番
よフットにおいても毛髪成長を促進することが出来、ま
たタンパク性物質であり、更に、 ａ）少なくとも５００ダルトンの見掛は分子鎖を有し、 ｂ）無血清培ｆ４ （ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ）
Ｎ１ｔｌ ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成を開始させることが
できる、という性質を右している。 本発明者等は、ＤＮＡ組換え技術により、真皮乳頭細胞
を形質転換（トランスフェクシヨン）させて無限増殖性
にする一方で、所望の細胞表現型を維持することができ
ることを見出した。その結果、実際に、所望の該表現型
を維持した状態Ｃ１他の普通の状態の場合より多く、恐
らり１０倍以−１細胞分裂さ１１゛ることが可能になっ
た。こうして得られた細胞は育毛剤の製造に利用するこ
とがぐきる。該育毛剤は数種の物質の混合物であり得、
前記ヨーロッパ特許出願に記載された物質を含むか、又
はその物質自体であることが望ましい。 本発明の第一の目的は、無限増殖性遺伝子（ｉｍｍｏｒ
ｔａｌｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ）を遺伝情報内に挿入する
ことによって形質転換（又はトランスフ１クシヨン）さ
れた真皮乳頭細胞を提供することである。 該無限増殖性遺伝子は、例えばポリオーマウィルスのよ
うな腫瘍ウィルスから得ることが出来るが、他のものか
ら得ること１３可能である。 本発明の第：二の目的は、ＤＮＡ組換え技術によって遺
伝情報内に無限増殖性遺伝ｆを挿入することで真皮乳頭
ｌ８１ｍを形質転換（トランスフ１クシ」ン）させるこ
とから成る、無限増殖化真皮乳頭細胞の製造方法を提供
することである。 本発明の第三の目的は、該無限増殖化真皮乳頭細胞から
の育毛促進剤の製造を提供することである。 該製造は、上記のように形質転換した真皮乳頭細胞を育
毛促進剤産生可能な条件下で培養することから成る。 本発明は、該育毛促進剤を含有する培養」−漬物及び組
成物をも提供づるものである。 以下に、本発明をさらに詳しく説明する。 ａ）り７［ＴＩＴベクターの構築 マウス（ａ＋ｕｒｉｎｃ）ポリオーマウィルスのラージ
Ｔ遺伝子は、不朽化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｉｎａ ）
、特性を示すことが報告されている。［１ｌａｓｓＯＵ
ｌ ｚａｄｃｇａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８０． ４３５４−８ （１９８
３）］。 本発明者らは、第２図に示り方法で、このラージＴｍ伝
子を公知のＤＺ［ｌ”Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１プラスミド
内に挿入した。該ｐＺＩＰ−Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１ブフ
スミドは、Ｃ（！ｐｋｏら、Ｃｅ１ｌ ３７．１０５
３−６２ （１９８４）に開示されている。 Ｂｏｙｅｒら、Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 ４１．４５９
−４７２ （１９６９）に開示されたＦ、 Ｃｏ１１
ＨＲＩＯＩ内に全てのプラスミドを維持し、且つこの
中でそれらを複製した。 Ｚｈｕら［Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５１．１７０−１８０ （
１９８４）］により開示された組換えプラスミドｐＰＶ
ＬＴ１を用いて、工程を開始１ノだ。このプラスミドは
、イントロンが欠失したポリオーマゲノムを含有し、ラ
ージＴ遺伝子のみを転写させるＤＡ’ｒ１５３ベクター
である（第１図） 。Ｂ（ＩＩＩとＨｉｎｃ Ｔとｒ
Ｉ）ＰＶＬＴｌを制限分解して作製した２、４９１塩基
対断片を、例えば、Ｈａｎｔａｔｉｓら、 ［Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ＨａｎｎｕａｌＪ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９
８２）に開示されたような標準的方法によって、分離し
且つ精製した。 ２４９１塩基対断ハを１’４ＯＮへポリメラーゼで処理
して平滑末端を生じさせ、これをリンカ−に結合し、さ
らにＢａｎ＋Ｈ１で線状化したＩ）ＵＣＯ内にクローン
化した。プラスミド分離および制限分析により、形質転
換体をスクリーニングして３個の挿入物含有クローンを
見い出した。このうら、ｐ １１ ＣＬ Ｔ ６と呼称
するプラスミドを使用した。 組換え体プラスミドｐＵｃＬＴ６をＢａ１ｌｌＨＴで切
断してラージＴｍ伝子とｐＵＣベクターの双方を作製し
、この混合物ヲｐ２ＩＰ−Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１ 内１
．ニー ’） ロー ン化し、ざらにｐＵ Ｃ８組換え
体が生起するのを防止するために、形質転換体を用いて
カナマイシン耐性クローンを選択した。 はじめに、３２Ｐニツクにより翻訳された、ラージＴ遺
伝子の［１Ｔ−Ｆ二ＣＯＲＩ断片をブ
又は薬用組成物、及びこの組成物の成分の製造方法に関
するものである。該成分は、毛髪成長を促進し得る育毛
促進剤（ａ ｈａｉｒ ｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｅｒ
；数種の物質の混合物であってもよい。）である。 １９８８年６月に公開されたヨー【】ツバ特許出願第８
７、３１１３１６．１号には、ヒト毛髪成長を増大させ
るための局所適用組成物中に含有される育毛促進剤が開
示されている。このＲ℃促進剤は培ｒＪ貞皮乳頭線維芽
細胞の細胞非含有上清から得ることができる。該成分番
よフットにおいても毛髪成長を促進することが出来、ま
たタンパク性物質であり、更に、 ａ）少なくとも５００ダルトンの見掛は分子鎖を有し、 ｂ）無血清培ｆ４ （ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ）
Ｎ１ｔｌ ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成を開始させることが
できる、という性質を右している。 本発明者等は、ＤＮＡ組換え技術により、真皮乳頭細胞
を形質転換（トランスフェクシヨン）させて無限増殖性
にする一方で、所望の細胞表現型を維持することができ
ることを見出した。その結果、実際に、所望の該表現型
を維持した状態Ｃ１他の普通の状態の場合より多く、恐
らり１０倍以−１細胞分裂さ１１゛ることが可能になっ
た。こうして得られた細胞は育毛剤の製造に利用するこ
とがぐきる。該育毛剤は数種の物質の混合物であり得、
前記ヨーロッパ特許出願に記載された物質を含むか、又
はその物質自体であることが望ましい。 本発明の第一の目的は、無限増殖性遺伝子（ｉｍｍｏｒ
ｔａｌｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ）を遺伝情報内に挿入する
ことによって形質転換（又はトランスフ１クシヨン）さ
れた真皮乳頭細胞を提供することである。 該無限増殖性遺伝子は、例えばポリオーマウィルスのよ
うな腫瘍ウィルスから得ることが出来るが、他のものか
ら得ること１３可能である。 本発明の第：二の目的は、ＤＮＡ組換え技術によって遺
伝情報内に無限増殖性遺伝ｆを挿入することで真皮乳頭
ｌ８１ｍを形質転換（トランスフ１クシ」ン）させるこ
とから成る、無限増殖化真皮乳頭細胞の製造方法を提供
することである。 本発明の第三の目的は、該無限増殖化真皮乳頭細胞から
の育毛促進剤の製造を提供することである。 該製造は、上記のように形質転換した真皮乳頭細胞を育
毛促進剤産生可能な条件下で培養することから成る。 本発明は、該育毛促進剤を含有する培養」−漬物及び組
成物をも提供づるものである。 以下に、本発明をさらに詳しく説明する。 ａ）り７［ＴＩＴベクターの構築 マウス（ａ＋ｕｒｉｎｃ）ポリオーマウィルスのラージ
Ｔ遺伝子は、不朽化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｉｎａ ）
、特性を示すことが報告されている。［１ｌａｓｓＯＵ
ｌ ｚａｄｃｇａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８０． ４３５４−８ （１９８
３）］。 本発明者らは、第２図に示り方法で、このラージＴｍ伝
子を公知のＤＺ［ｌ”Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１プラスミド
内に挿入した。該ｐＺＩＰ−Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１ブフ
スミドは、Ｃ（！ｐｋｏら、Ｃｅ１ｌ ３７．１０５
３−６２ （１９８４）に開示されている。 Ｂｏｙｅｒら、Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 ４１．４５９
−４７２ （１９６９）に開示されたＦ、 Ｃｏ１１
ＨＲＩＯＩ内に全てのプラスミドを維持し、且つこの
中でそれらを複製した。 Ｚｈｕら［Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５１．１７０−１８０ （
１９８４）］により開示された組換えプラスミドｐＰＶ
ＬＴ１を用いて、工程を開始１ノだ。このプラスミドは
、イントロンが欠失したポリオーマゲノムを含有し、ラ
ージＴ遺伝子のみを転写させるＤＡ’ｒ１５３ベクター
である（第１図） 。Ｂ（ＩＩＩとＨｉｎｃ Ｔとｒ
Ｉ）ＰＶＬＴｌを制限分解して作製した２、４９１塩基
対断片を、例えば、Ｈａｎｔａｔｉｓら、 ［Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ＨａｎｎｕａｌＪ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９
８２）に開示されたような標準的方法によって、分離し
且つ精製した。 ２４９１塩基対断ハを１’４ＯＮへポリメラーゼで処理
して平滑末端を生じさせ、これをリンカ−に結合し、さ
らにＢａｎ＋Ｈ１で線状化したＩ）ＵＣＯ内にクローン
化した。プラスミド分離および制限分析により、形質転
換体をスクリーニングして３個の挿入物含有クローンを
見い出した。このうら、ｐ １１ ＣＬ Ｔ ６と呼称
するプラスミドを使用した。 組換え体プラスミドｐＵｃＬＴ６をＢａ１ｌｌＨＴで切
断してラージＴｍ伝子とｐＵＣベクターの双方を作製し
、この混合物ヲｐ２ＩＰ−Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１ 内１
．ニー ’） ロー ン化し、ざらにｐＵ Ｃ８組換え
体が生起するのを防止するために、形質転換体を用いて
カナマイシン耐性クローンを選択した。 はじめに、３２Ｐニツクにより翻訳された、ラージＴ遺
伝子の［１Ｔ−Ｆ二ＣＯＲＩ断片をブ
【］−１として用
い、組換え体ＤＮＡの５ｏｕｔｈｅｒｎブロツフイング
（二」ロ二−１０ツディング）によって、挿入物含有ク
ローンをスクリーニングしノた。次に、「陽性」二］口
二一のプラスミド分Ｗｉ Ｊ３よびイの制限分析を行っ
た。これによって、レンス方向にラージＴ遺伝子のコピ
ー１個を有する不朽化ベクターである構築物ｐＺＩ−「
１と、アンブヒンス方向にラージＴ遺伝子の−」ピー１
個を有する構築物ｐαＺＩＴとを含む多数の組換え体プ
ラスミドが示された。第３図はｐＺＩＴ１構築物の制限
地図を詳述するものである。 ｂ）ψ２：Ｚｒ１ｌｌｌ１１系の産生 Ｗｉｇｌｅｒら 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ 、＾ｃ
ａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ７６、 １３７３−６ （１
’９７９）に開示されたようなリン酸カルシウム共沈澱
法を用いて、ψ２細胞系内にｐ２１Ｔ１を導入した。該
ψ２細胞系は、Ｈａｎｎら、Ｃｅ１ｌ ３３．１５３−
９ （１９８３）に開示され−Ｃいる。このように、ｐ
７１Ｔ１を導入することにより、細胞系ψ２：ＺＩＴが
産生ｌノた。この細胞系を完成さぼるために、５％ウシ
胎児血清を補充したＥａｇｌｅ培地の改良型Ｄｕｌｂｃ
ｃｃｏｓ培地中に、ψ２細胞を維持した。トランスフＩ
クションの２４時間前に、２５ ｃＪ組織培養フラスコ
中に２×１０５ψ２細胞を接種し、またトランスフェク
シヨンの３時間面に、フラスコ当り５−の新鮮培地を咳
細胞に与えた。容量１１ｄ中、リン酸カルシウムを用い
てｐ７［１１１Ｊ＋９を共沈殿させ、これを各フラス」
に５００ρずつ添加した。４時間培養した後、トリス緩
衝化生理食塩水で細胞を洗浄し、新鮮な非選択培地を用
いてさらに２４時間培養した。 次に、培養物をトリプシン消化し、７５０ｉ ／ ｍｆ
！Ｇ４１８を含有する培地の入った７５ｃ＆組織培養ノ
ンス」中に、１Ｘ１０”個の細胞を接種ｔ）だ。ｐｌＩ
ロブラスミドは、動物細胞内でＧ４１８耐性を−」−ド
するトランスボゾンＴｎ５に由来する配列を含イイし、
また、選択培地中での培Ｍ１０日役には、プラスミドＤ
ＮＡでトランスフェクトされた細胞を含むフラスコは１
００個以上のクローンを含有していた。 各々個々のフラスコ中のクローンをプールし、ある細胞
系中に展開した（ｃｘｐａｎｄ）。ψ２：ＺＩＴはその
ような細胞系の１つであった。これに対して、リン酸カ
ルシウム沈澱物でのみ処理した細胞を含有する対照ノラ
ス］には、残存する生細胞は皆無であった。 Ｃ）組換え体欠陥レトロ イルスの採集 びその力価ｆ
ｆ１１１定 ｐ７１Ｐ−Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１ ニ基ツクヘクターヲ
保’ＧするΦ２１１１胞は、成長培地中に組換え体欠陥
レトロウィルスを直接放出した。レトロウィルスを採集
するために、抗生物質を含まない培地中で細胞を増殖し
、細胞が集密化づる２４時間前に、培地を、１７！ｉ、
＆！１織培養フラスコ当り２５ｔｄの新鮮培地と交換し
た。３７℃で２４時間培養後、ウィルス粒子を含有する
成長培地を集め、０．４５１ＪＪＲフイルターを通過さ
せて全細胞性物質を除去し、−７０℃に保存した。 以下の方法を用いて、保存ウィルスの力価を測定した。 ４ Ｘ １０”個の３Ｔ６細胞（マウスＩｉＮ芽細胞系
）を１００＃Ｉの組織培養皿中に接種した。２４時間後
、保存ウィルスの１０倍Ｊ３よびおよび１００倍希釈物
を、完全培地および最終濃度８埒／−となるように添加
したポリブレン中でｌＡ１１１シた。細胞から培地を除
去し、２厩のウィルス希釈物を、複製時に添加される各
希釈物の入った各培養皿に添加した。これらの培養皿を
、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気中、３７℃で２．５時間
培養した。次に、１０ｄの新鮮培地を各培養皿に添加し
た。さらに４８時間培養後、各培養皿から採集した２Ｘ
１０’個の細胞を、７５０巧／ Ｉｎ１のＧ４１８を含
有する培地の入った複製用培養皿中に移した。１０へ・
１４日後、ウィルス粒子を含有する培地を用いて感染さ
Ｖた培養■中では、コロニーが視覚的に捕えられたが、
成長培地またはψ２細胞由来の培地でのみ処理した培養
皿中では、生細胞は全く残存しなかった。１％グルタル
アルデヒドで固定し、１００％メタノールで抽出し、ざ
らにギムザで染色した後、コロニーを甜数し、旧つ力価
を算出した。ψ２：／ＩＴ細胞は、約ｌＸ１０’コロニ
ー形成ユニツト／ｄの力価でウィルス粒子を産生するこ
とが分かった。 上記の方法を用いて、３Ｔ６細胞の実質フラウン」ンを
感染させ、１１つ抗生物質０４１８に耐性となるように
することが可能である。 ｄ）毛包からの真皮乳頭の分離および真皮乳頭細胞の培
養 ラット毛包から微小解剖により真皮乳頭を分離した。 分離した真皮乳頭を、１５容量％のウシ胎児血清（Ｆｅ
２）を含有する培地中に維持し、細胞および培地を、最
適ｐＨ値６．５〜７．５に維持するために５％ＣＯ２／
９５％空気雰囲気中、３７℃に保持した。 使用した培地は、細菌汚染の危険性を減少させるための
ペニシリン、ストレプトマイシンおよびカナマイシンと
１５容量％のＦｅ２とを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏｓ改
良型［ａｇｌｅ培地であった。 真皮乳頭を培養容器に付着させた後、解剖した乳頭から
移植した細胞を、上記栄養培地中、定期的に培地を交換
しながら数週間増殖し、ペニシリン、ストレプトマイシ
ンおよびカナマイシンを含まない新鮮培地中に継代して
、組換え体レトロウィルス感染用ｗ４ｆａの準集密化細
胞単層（５ｕｂｃｏｎＮｕｃｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｃｒ
ｓ）を産生じた。継代は、培地を除去し、加温したトリ
プシン／ＥＤＴＡ溶液（３７℃）を約５分間で添加し、
丸くなった細胞を脱着し、さらに新鮮培地と血清とを含
有する新しい培養容器中に採取した細胞を「分割」づる
ことによって達成された。 血清の存在中では、はとんどの細胞が培養容器の表面上
に再付着し、且つ一面に広がり散在する細胞単層を形成
した。 ｅ）組換え体欠陥しト［１ウイルスを用いる 伝転換 １−で詳述した培養法により調製した真皮乳頭細胞の分
散培養物を、２４−ウェルの組織培養プレート中で準集
密化細胞単層に展開した。細胞は準集密的であり、分散
培養物を調製後、約４８時間ウィルスに暴露する。培地
を除去し、８１１３／ｍｌのポリブレンを含む１１ｄの
非希釈保存ウィルスを各々のウェルに加えた。プレート
を５％の二酸化炭素を含む空気雰囲気下で３７℃にて２
時間３０分培養し、３０分毎に静かに振盪した。その後
、各々のつ１ルについて、ポリブレンを含む保存「ウィ
ルスを０．５ｄの新鮮培地で希釈した０５−の新しい保
存ウイルスナツブルと取り換え、感染期間をさらに２４
時間継続した。次いでウィルスを含む培地を除去し、細
胞が集密的状態になるまで新鮮な培地中で培養した。各
々のウェルから細胞を集め、いくつかの新しいつ１ルに
分割し、２００埒／ ｄのＧ４１８を含む培地に移した
とき準集密化細胞単層を形成するようになるまで十ｊホ
のよう培養した。数週間後（規則的に培地を変えながら
）、ウィルス粒子を含む培地によって細胞が感染させら
れたウェルの中ではクローンが見えるようになったが、
ψ２細胞からの培地で処理されたつ】ニル中には生細胞
は残存していなかった。 個々のクローンを取り出し、Ｅツクローナル細胞系が達
成されるまで、表面積が漸増する培養容器を用いてｄ）
で述べたように細胞を継代した。 あるいは、いくつかのり［］−ンからの細胞をプールし
、同じ方法を用いて、ポリクロ−１ル細胞系に展開した
。 ラットのモノク［］−ナル抗ラうジ丁、αＰｙ１．Ｔ−
１で染色づる間接的免役蛍光法を用いて、Φ２二ＺＩ’
ｒｌ［ｌ胞により産生されるウィルス粒子で感染させた
細胞によってラージＴタンパクが発現されることを確認
した。 ｆ）不朽イ細胞系の維持 上述のように遺伝子転換して不朽化Ｌｉた真皮乳頭細胞
を、１５％ＦＣ８を補充したＤｕ ｌ ｂｃｃｃｏｓ改
良型Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）と２００７１１ ／
ｄ （７） Ｇ ４１８とを含む組織培養容器中に維持
した。その後、１−記ｄ）項に記載のようにして細胞を
新しい培地量で繰り返し「継代」し、不朽化細胞系を継
続的に増殖させた。 Ω）凍結保存 真皮乳頭細胞系を血清と１０・〜１５％のジメチルスル
ホギシドのような保存剤とを含む培地中で凍結し、液体
窒素中で保存した。また、Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる動物
細胞の培養［八Ｍａｎｕａｌ ｏｒ Ｂａ５ｉｃ 丁ｅ
ｃｈｎｉｑｕｅ、 Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９０−１９８ （１９８３）］
に記載のようにして、凍結保存状態から元の状態に戻し
た。 ｈ）肛ＪＬＬ墳ａｈａ里 不朽化細胞系を、−し記［）におけると同様にして通１
信培地に接種した。これらの細胞が集密化あるいはほぼ
ｆ！密化した培養物に達したとき、培地を、血清Ｊ３よ
びＧ４１８を含まない培地に変えた。 ２４時間後、この培地をさらに血清およびＧ４１８を含
まない新鮮培地と交換した。約３日後、培養上清を細胞
から除去し、浮遊細胞および細胞破片を遠心分離あるい
はｉｌ：Ｉ過して除き、次いで濃縮し、例えば分画分子
量５００Ｄ 、 ２００００、もしくは５０００Ｄ（１
〕−ダルトン）のアミコン限外濾過装置を用いて等張塩
溶液に対して透析した。 毛髪成長促進剤を含有する、濃縮し透析した培養」−清
は、本出願人が出願中の欧州特許出願８７゜３１１３１
６中で説明し−（いるように、毛髪成長促進用組成物の
調製に用いることができる。その際、この１−清は、そ
のままで用いるか、または例えば凍結乾燥により乾燥し
てベヒクル中に分散させることが可能である。
い、組換え体ＤＮＡの５ｏｕｔｈｅｒｎブロツフイング
（二」ロ二−１０ツディング）によって、挿入物含有ク
ローンをスクリーニングしノた。次に、「陽性」二］口
二一のプラスミド分Ｗｉ Ｊ３よびイの制限分析を行っ
た。これによって、レンス方向にラージＴ遺伝子のコピ
ー１個を有する不朽化ベクターである構築物ｐＺＩ−「
１と、アンブヒンス方向にラージＴ遺伝子の−」ピー１
個を有する構築物ｐαＺＩＴとを含む多数の組換え体プ
ラスミドが示された。第３図はｐＺＩＴ１構築物の制限
地図を詳述するものである。 ｂ）ψ２：Ｚｒ１ｌｌｌ１１系の産生 Ｗｉｇｌｅｒら 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ 、＾ｃ
ａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ７６、 １３７３−６ （１
’９７９）に開示されたようなリン酸カルシウム共沈澱
法を用いて、ψ２細胞系内にｐ２１Ｔ１を導入した。該
ψ２細胞系は、Ｈａｎｎら、Ｃｅ１ｌ ３３．１５３−
９ （１９８３）に開示され−Ｃいる。このように、ｐ
７１Ｔ１を導入することにより、細胞系ψ２：ＺＩＴが
産生ｌノた。この細胞系を完成さぼるために、５％ウシ
胎児血清を補充したＥａｇｌｅ培地の改良型Ｄｕｌｂｃ
ｃｃｏｓ培地中に、ψ２細胞を維持した。トランスフＩ
クションの２４時間前に、２５ ｃＪ組織培養フラスコ
中に２×１０５ψ２細胞を接種し、またトランスフェク
シヨンの３時間面に、フラスコ当り５−の新鮮培地を咳
細胞に与えた。容量１１ｄ中、リン酸カルシウムを用い
てｐ７［１１１Ｊ＋９を共沈殿させ、これを各フラス」
に５００ρずつ添加した。４時間培養した後、トリス緩
衝化生理食塩水で細胞を洗浄し、新鮮な非選択培地を用
いてさらに２４時間培養した。 次に、培養物をトリプシン消化し、７５０ｉ ／ ｍｆ
！Ｇ４１８を含有する培地の入った７５ｃ＆組織培養ノ
ンス」中に、１Ｘ１０”個の細胞を接種ｔ）だ。ｐｌＩ
ロブラスミドは、動物細胞内でＧ４１８耐性を−」−ド
するトランスボゾンＴｎ５に由来する配列を含イイし、
また、選択培地中での培Ｍ１０日役には、プラスミドＤ
ＮＡでトランスフェクトされた細胞を含むフラスコは１
００個以上のクローンを含有していた。 各々個々のフラスコ中のクローンをプールし、ある細胞
系中に展開した（ｃｘｐａｎｄ）。ψ２：ＺＩＴはその
ような細胞系の１つであった。これに対して、リン酸カ
ルシウム沈澱物でのみ処理した細胞を含有する対照ノラ
ス］には、残存する生細胞は皆無であった。 Ｃ）組換え体欠陥レトロ イルスの採集 びその力価ｆ
ｆ１１１定 ｐ７１Ｐ−Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）１ ニ基ツクヘクターヲ
保’ＧするΦ２１１１胞は、成長培地中に組換え体欠陥
レトロウィルスを直接放出した。レトロウィルスを採集
するために、抗生物質を含まない培地中で細胞を増殖し
、細胞が集密化づる２４時間前に、培地を、１７！ｉ、
＆！１織培養フラスコ当り２５ｔｄの新鮮培地と交換し
た。３７℃で２４時間培養後、ウィルス粒子を含有する
成長培地を集め、０．４５１ＪＪＲフイルターを通過さ
せて全細胞性物質を除去し、−７０℃に保存した。 以下の方法を用いて、保存ウィルスの力価を測定した。 ４ Ｘ １０”個の３Ｔ６細胞（マウスＩｉＮ芽細胞系
）を１００＃Ｉの組織培養皿中に接種した。２４時間後
、保存ウィルスの１０倍Ｊ３よびおよび１００倍希釈物
を、完全培地および最終濃度８埒／−となるように添加
したポリブレン中でｌＡ１１１シた。細胞から培地を除
去し、２厩のウィルス希釈物を、複製時に添加される各
希釈物の入った各培養皿に添加した。これらの培養皿を
、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気中、３７℃で２．５時間
培養した。次に、１０ｄの新鮮培地を各培養皿に添加し
た。さらに４８時間培養後、各培養皿から採集した２Ｘ
１０’個の細胞を、７５０巧／ Ｉｎ１のＧ４１８を含
有する培地の入った複製用培養皿中に移した。１０へ・
１４日後、ウィルス粒子を含有する培地を用いて感染さ
Ｖた培養■中では、コロニーが視覚的に捕えられたが、
成長培地またはψ２細胞由来の培地でのみ処理した培養
皿中では、生細胞は全く残存しなかった。１％グルタル
アルデヒドで固定し、１００％メタノールで抽出し、ざ
らにギムザで染色した後、コロニーを甜数し、旧つ力価
を算出した。ψ２：／ＩＴ細胞は、約ｌＸ１０’コロニ
ー形成ユニツト／ｄの力価でウィルス粒子を産生するこ
とが分かった。 上記の方法を用いて、３Ｔ６細胞の実質フラウン」ンを
感染させ、１１つ抗生物質０４１８に耐性となるように
することが可能である。 ｄ）毛包からの真皮乳頭の分離および真皮乳頭細胞の培
養 ラット毛包から微小解剖により真皮乳頭を分離した。 分離した真皮乳頭を、１５容量％のウシ胎児血清（Ｆｅ
２）を含有する培地中に維持し、細胞および培地を、最
適ｐＨ値６．５〜７．５に維持するために５％ＣＯ２／
９５％空気雰囲気中、３７℃に保持した。 使用した培地は、細菌汚染の危険性を減少させるための
ペニシリン、ストレプトマイシンおよびカナマイシンと
１５容量％のＦｅ２とを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏｓ改
良型［ａｇｌｅ培地であった。 真皮乳頭を培養容器に付着させた後、解剖した乳頭から
移植した細胞を、上記栄養培地中、定期的に培地を交換
しながら数週間増殖し、ペニシリン、ストレプトマイシ
ンおよびカナマイシンを含まない新鮮培地中に継代して
、組換え体レトロウィルス感染用ｗ４ｆａの準集密化細
胞単層（５ｕｂｃｏｎＮｕｃｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｃｒ
ｓ）を産生じた。継代は、培地を除去し、加温したトリ
プシン／ＥＤＴＡ溶液（３７℃）を約５分間で添加し、
丸くなった細胞を脱着し、さらに新鮮培地と血清とを含
有する新しい培養容器中に採取した細胞を「分割」づる
ことによって達成された。 血清の存在中では、はとんどの細胞が培養容器の表面上
に再付着し、且つ一面に広がり散在する細胞単層を形成
した。 ｅ）組換え体欠陥しト［１ウイルスを用いる 伝転換 １−で詳述した培養法により調製した真皮乳頭細胞の分
散培養物を、２４−ウェルの組織培養プレート中で準集
密化細胞単層に展開した。細胞は準集密的であり、分散
培養物を調製後、約４８時間ウィルスに暴露する。培地
を除去し、８１１３／ｍｌのポリブレンを含む１１ｄの
非希釈保存ウィルスを各々のウェルに加えた。プレート
を５％の二酸化炭素を含む空気雰囲気下で３７℃にて２
時間３０分培養し、３０分毎に静かに振盪した。その後
、各々のつ１ルについて、ポリブレンを含む保存「ウィ
ルスを０．５ｄの新鮮培地で希釈した０５−の新しい保
存ウイルスナツブルと取り換え、感染期間をさらに２４
時間継続した。次いでウィルスを含む培地を除去し、細
胞が集密的状態になるまで新鮮な培地中で培養した。各
々のウェルから細胞を集め、いくつかの新しいつ１ルに
分割し、２００埒／ ｄのＧ４１８を含む培地に移した
とき準集密化細胞単層を形成するようになるまで十ｊホ
のよう培養した。数週間後（規則的に培地を変えながら
）、ウィルス粒子を含む培地によって細胞が感染させら
れたウェルの中ではクローンが見えるようになったが、
ψ２細胞からの培地で処理されたつ】ニル中には生細胞
は残存していなかった。 個々のクローンを取り出し、Ｅツクローナル細胞系が達
成されるまで、表面積が漸増する培養容器を用いてｄ）
で述べたように細胞を継代した。 あるいは、いくつかのり［］−ンからの細胞をプールし
、同じ方法を用いて、ポリクロ−１ル細胞系に展開した
。 ラットのモノク［］−ナル抗ラうジ丁、αＰｙ１．Ｔ−
１で染色づる間接的免役蛍光法を用いて、Φ２二ＺＩ’
ｒｌ［ｌ胞により産生されるウィルス粒子で感染させた
細胞によってラージＴタンパクが発現されることを確認
した。 ｆ）不朽イ細胞系の維持 上述のように遺伝子転換して不朽化Ｌｉた真皮乳頭細胞
を、１５％ＦＣ８を補充したＤｕ ｌ ｂｃｃｃｏｓ改
良型Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）と２００７１１ ／
ｄ （７） Ｇ ４１８とを含む組織培養容器中に維持
した。その後、１−記ｄ）項に記載のようにして細胞を
新しい培地量で繰り返し「継代」し、不朽化細胞系を継
続的に増殖させた。 Ω）凍結保存 真皮乳頭細胞系を血清と１０・〜１５％のジメチルスル
ホギシドのような保存剤とを含む培地中で凍結し、液体
窒素中で保存した。また、Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる動物
細胞の培養［八Ｍａｎｕａｌ ｏｒ Ｂａ５ｉｃ 丁ｅ
ｃｈｎｉｑｕｅ、 Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９０−１９８ （１９８３）］
に記載のようにして、凍結保存状態から元の状態に戻し
た。 ｈ）肛ＪＬＬ墳ａｈａ里 不朽化細胞系を、−し記［）におけると同様にして通１
信培地に接種した。これらの細胞が集密化あるいはほぼ
ｆ！密化した培養物に達したとき、培地を、血清Ｊ３よ
びＧ４１８を含まない培地に変えた。 ２４時間後、この培地をさらに血清およびＧ４１８を含
まない新鮮培地と交換した。約３日後、培養上清を細胞
から除去し、浮遊細胞および細胞破片を遠心分離あるい
はｉｌ：Ｉ過して除き、次いで濃縮し、例えば分画分子
量５００Ｄ 、 ２００００、もしくは５０００Ｄ（１
〕−ダルトン）のアミコン限外濾過装置を用いて等張塩
溶液に対して透析した。 毛髪成長促進剤を含有する、濃縮し透析した培養」−清
は、本出願人が出願中の欧州特許出願８７゜３１１３１
６中で説明し−（いるように、毛髪成長促進用組成物の
調製に用いることができる。その際、この１−清は、そ
のままで用いるか、または例えば凍結乾燥により乾燥し
てベヒクル中に分散させることが可能である。
第１図は、ブ７ スミトｐＺ■Ｐ−Ｎｅｏ ５Ｖ（Ｘ）
１１３ ヨＴｊｐｐｙｃｒｉの制限地図であり、本願明
細古および図面中で説明する制限エンドヌクレアーゼの
切断部位を示１ノでいる。 第２図は、本願用ａｌｌ中に記載のレトロウィルスベク
ターｐｚｍのｍ築を示す概略図である。 第３図は、ラージＴ遺伝子がｌ’ ｔシス−１方向にあ
るｐ７ＩＴＩ Ｉ！築物の選択された制限部位の地図で
ある。 ｓｔｌ 手続ネ市正書 １．事例の表示 平成１１持５Ｔ願第１５１３７５号 発明の名称 化粧用または薬用組成物の製造 ３、補正をする名 事件との関係
１１３ ヨＴｊｐｐｙｃｒｉの制限地図であり、本願明
細古および図面中で説明する制限エンドヌクレアーゼの
切断部位を示１ノでいる。 第２図は、本願用ａｌｌ中に記載のレトロウィルスベク
ターｐｚｍのｍ築を示す概略図である。 第３図は、ラージＴ遺伝子がｌ’ ｔシス−１方向にあ
るｐ７ＩＴＩ Ｉ！築物の選択された制限部位の地図で
ある。 ｓｔｌ 手続ネ市正書 １．事例の表示 平成１１持５Ｔ願第１５１３７５号 発明の名称 化粧用または薬用組成物の製造 ３、補正をする名 事件との関係
Claims (25)
- （１）真皮乳頭線維芽細胞の遺伝情報内に無限増殖化遺
伝子を組込むことによってトランスフェクトされた前記
細胞。 - （２）無限増殖化遺伝子が腫瘍ウィルス由来である請求
項１記載の細胞。 - （３）無限増殖化遺伝子がポリオーマウィルス由来であ
る請求項２記載の細胞。 - （４）真皮乳頭線維芽細胞の遺伝情報内に無限増殖化遺
伝子を組込むために組換えＤＮＡ技術によって前記細胞
をトランスフェクトすることからなる、無限増殖化され
た真皮乳頭線維芽細胞の製造方法。 - （５）真皮乳頭線雑芽細胞を収集して培養し、この培養
細胞を無限増殖化遺伝子を担持する組換えベクターでト
ランスフェクトし、無限増殖化遺伝子でトランスフェク
トされた細胞を選択することからなる請求項４記載の方
法。 - （６）（ａ）毛包から真皮乳頭線維芽外植片を切開し、
（ｂ）前記外植片を組織培養で維持および／または処置
して個々の真皮乳頭線維芽細胞を前記外植片から移動さ
せ、 （ｃ）前記真皮乳頭線維芽細胞を組織培養で維持および
／または処置してサブコンフルエントな単層を生じさせ
、 （ｄ）培養した真皮乳頭線維芽細胞を、無限増殖化遺伝
子と形質転換体の選択を補助する遺伝子とを担持する１
個以上の組換えベクターでトランスフェクトし、 （ｅ）この真皮乳頭線維芽細胞を組織培養で維持および
／または処置し、 （ｆ）無限増殖化遺伝子の組込みによってトランスフェ
クトされた真皮乳頭線維芽細胞を選択する ステップからなる請求項５記載の方法。 - （７）さらに、 （ｇ）選択したトランスフェクトされている無限増殖化
真皮乳頭線維芽細胞を組織培養で維持および／または処
置し、 （ｈ）無限増殖化された真皮乳頭線維芽細胞のバッチを
凍結保存する ステップを含む請求項６記載の方法。 - （８）ステップ（ｃ）が細胞を植え継ぐことを含む請求
項６または７記載の方法。 - （９）無限増殖化遺伝子を腫瘍ウィルスから得る請求項
４〜８のいずれか一項に記載の方法。 - （１０）無限増殖化遺伝子をポリオーマウィルスから得
る請求項９記載の方法。 - （１１）組換えベクターがレトロウィルスである請求項
４〜１０のいずれか一項に記載の方法。 - （１２）無限増殖化する真皮乳頭線維芽細胞を用いる育
毛促進剤の生産。 - （１３）請求項１〜３のいずれか一項に記載の真皮乳頭
線維芽細胞、または請求項４〜１１のいずれか一項に記
載の方法によって製造された真皮乳頭線維芽細胞を利用
し、前記細胞が育毛促進剤を産生する条件下で前記細胞
を培養することからなる育毛促進剤の製造方法。 - （１４）（ａ）無限増殖化された真皮乳頭線維芽細胞を
組織培養で維持し、 （ｂ）育毛促進剤の産生に適した組織培養条件を維持す
る ことからなる請求項１３記載の方法。 - （１５）さらに、組織培養上清から育毛促進剤を回収す
ることを含む請求項１３または１４記載の方法。 - （１６）請求項１３、１４または１５記載の方法によつ
て産生された育毛促進剤。 - （１７）請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法
によって産生された育毛促進剤を含有する培養上清。 - （１８）請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法
によって産生された育毛促進剤を含有する組成物であつ
て、ラットに使用したとき、前記育毛促進剤を除いたコ
ントロール組成物を用いて得られるより少なくとも１０
％以上ラットの育毛を増強するのに充分である前記組成
物。 - （１９）育毛促進剤の少なくとも一部が、 ｉ）実質的にタンパク性であり、 ｉｉ）少なくとも５００ダルトンのみかけ分子量を有し
ており、 ｉｉｉ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞の無血清培養においてＤＮＡ
合成を開始させる能力を有する ことを特徴とする請求項１８記載の組成物。 - （２０）育毛促進剤が１×１０＾−＾６〜９９重量％、
好ましくは１×１０＾−＾３〜９０％を構成している請
求項１８または１９記載の組成物。 - （２１）前記培養上清に加えて、化粧品として許容し得
る基剤ビヒクルを含んでいる請求項１８〜２０のいずれ
か一項に記載の組成物。 - （２２）さらに、他の育毛刺激剤、タンパク安定剤およ
び浸透増強剤の中から選択された活性増強剤も含んでい
る請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。 - （２３）他の育毛刺激剤が、ミノキシジル、ミノキシジ
ルグルクロニド類、ミノキシジル硫酸塩類またはこれら
の混合物の中から選択される請求項２２記載の組成物。 - （２４）タンパク安定剤が、グリセロール、エチレンジ
アミンテトラ酢酸、システイン、α＿２−マクログロブ
リン、血清またはこれらの混合物の中から選択される請
求項２２または２３記載の組成物。 - （２５）請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の組成
物を投与することからなる育毛誘発方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888814476A GB8814476D0 (en) | 1988-06-17 | 1988-06-17 | Production of cosmetic/pharmaceutical composition |
| GB8814476.1 | 1988-06-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242979A true JPH0242979A (ja) | 1990-02-13 |
Family
ID=10638904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1154375A Pending JPH0242979A (ja) | 1988-06-17 | 1989-06-16 | 化粧用または薬用組成物の製造 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0352894A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0242979A (ja) |
| GB (1) | GB8814476D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006518596A (ja) * | 2003-02-24 | 2006-08-17 | ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド | 熱不安定性ホスファターゼの過剰発現、精製及び性状分析 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5091173A (en) * | 1989-06-29 | 1992-02-25 | The University Of Dundee | Hair growth composition |
| US5068315A (en) * | 1990-04-12 | 1991-11-26 | University Of Dundee | Composition for the regulation of hair growth |
| US5130142A (en) * | 1990-10-31 | 1992-07-14 | The Practer & Gamble Company | Hair growth regulating composition comprising epithelium cell supernatant-derived growth factor |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8630720D0 (en) * | 1986-12-23 | 1987-02-04 | Unilever Plc | Cosmetic compositions |
-
1988
- 1988-06-17 GB GB888814476A patent/GB8814476D0/en active Pending
-
1989
- 1989-06-15 EP EP89306057A patent/EP0352894A3/en not_active Ceased
- 1989-06-16 JP JP1154375A patent/JPH0242979A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006518596A (ja) * | 2003-02-24 | 2006-08-17 | ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド | 熱不安定性ホスファターゼの過剰発現、精製及び性状分析 |
| JP2011167210A (ja) * | 2003-02-24 | 2011-09-01 | New England Biolabs Inc | 熱不安定性ホスファターゼの過剰発現、精製及び性状分析 |
| JP4812617B2 (ja) * | 2003-02-24 | 2011-11-09 | ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド | 熱不安定性ホスファターゼの過剰発現、精製及び性状分析 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0352894A2 (en) | 1990-01-31 |
| EP0352894A3 (en) | 1990-07-11 |
| GB8814476D0 (en) | 1988-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Woodley et al. | Normal and gene-corrected dystrophic epidermolysis bullosa fibroblasts alone can produce type VII collagen at the basement membrane zone | |
| Hager et al. | Long-term culture of murine epidermal keratinocytes | |
| US5698436A (en) | Introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells | |
| DE69535560T2 (de) | Ein verstärkter, durch viren vermittelter dna-transfer | |
| DE3587899T2 (de) | Transkriptionsfaktoren mit transaktivität. | |
| JP3015383B2 (ja) | 形質導入した線維芽およびそれらの使用 | |
| TW520395B (en) | Methods for enhanced virus-mediated DNA transfer using molecules with virus-and cell-binding domains | |
| CA2020053A1 (en) | Hair growth composition | |
| DE19856463B4 (de) | Retrovirale, mit LCMV pseudotypisierte Hybrid-Vektoren | |
| Borok et al. | Defined medium for primary culture de novo of adult rat alveolar epithelial cells | |
| JP3244696B2 (ja) | ヒト筋肉細胞の単離、増殖および分化 | |
| Dalton et al. | Ultrastructural comparison of placental virus with several type-C oncogenic viruses | |
| EP0263908B1 (en) | Method for the production of proteins by means of inducible expression systems in genetically modified eukaryotic host-cells multiplicated in-vivo | |
| CN114480505A (zh) | 间充质干细胞及其抗炎应用 | |
| Lim et al. | Human fetal trachea-SCID mouse xenografts: efficacy of vesicular stomatitis virus-G pseudotyped lentiviral-mediated gene transfer | |
| JPH0242979A (ja) | 化粧用または薬用組成物の製造 | |
| CN112608947A (zh) | 一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用 | |
| Kellermann et al. | Immortalization of early embryonic cell derivatives after the transfer of the early region of simian virus 40 into F9 teratocarcinoma cells | |
| DE69106353T2 (de) | Immortalisierte primate hepatozyte zellinie. | |
| EP0162319B1 (en) | Method of joining heterologous genes | |
| Gojo et al. | Ex vivo gene transfer into myocardium using replication-defective retrovirus | |
| JP2005528912A (ja) | 幹細胞におけるスプライセオソーム介在ｒｎａトランススプライシング | |
| CN116004725A (zh) | 间充质干细胞在疼痛相关疾病中的应用 | |
| Akiramasuda et al. | Establishment of functional epithelial cell lines from a rat thymoma and rat thymus | |
| DE60221519T2 (de) | Verfahren und zusammensetzung für hauttransplantate |