JPH0242983A - 生体触媒の製法及びラセミ分割のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、親水化ポリオレフィン繊維を基礎とする粗製
膵臓リパーゼの固定化物の簡単で経済的な製法、この固
定化物自体及びラセミ体アルコールのエステルをラセミ
分割するためのその使用に関する。

リパーゼの固定化技術は公知である。ＵＳ４６２９７４
２によれば、固定化のためにカンジダ・シリンドラセア
からのリパーゼが、そして担体として、きわめて費用の
かかる方法で製造された疎水性の微多孔質重合体が用い
られる。

ＥＰ−Ａ２１０４９９などに膵臓リパーゼについても記
載されている酵素、ポリエポキシド及びボリアばンから
のゲル形成による固定化法は簡単であるが、その小さい
機械的安定性及び低い流体力学的特性（濾過性；これを
充填したカラム中での流れ抵抗性）のため、工業的使用
にはほとんど適しない。

ラセミ体エステルを豚膵臓リパーゼにより実験室的規模
でエナンチオ選択的に分割することも公知である（　Ｗ
、Ｅ、Ｌａｄｎｅｒ　ａｎｄ　（）、　Ｍ。

Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ　、　ＪＡＣ８１９８４＋　１０
６　＋　７２５０〜７２５１　）。

その際、粗製の固定化されていないリパーゼが用いられ
る。この方法は工業的実施には不適当であり、経済的な
方法は固定化を必要とする。

この種の普通の方法例えば前記の米国特許の方法では、
固定化物の比活性が低（、操作中に極めて急激に低下す
るので、目的はかなえられない。

従って本発明の課題は、光学活性アルコールエステルの
ラセミ分割のための工業的規模に適する簡単で経済的な
方法を実施できるように、粗製豚膵臓リパーゼの固定化
物を容易に価格相応に製造することであった。好適な生
体触媒の重要な基準は、長い寿命及び高い空時収量であ
る。

この課題は、第１ないし第９請求項に記載の方法よって
解決される。生体触媒の製造は、親水化ポリオレフィン
繊維、リパーゼ及び水を、ｐＨ５〜９好ましくは５．５
〜８及び温度０〜４００Ｃ好ましくは１０〜３０°Ｃで
混合し、１分ないし６日後好ましくは１〜２４時間後に
涙過し、フィルターケーキを水、緩衝液又は水溶性有機
溶剤を用いて洗浄することにより行われ、その際、リパ
ーゼとしては粗製の、すなわち天然不純物（特に蛋白質
）を９９重量％まで含有し、従って容易に安価に入手で
きる市販の豚膵臓リパーゼが用いられ、そしてこの水性
混合物に、リパーゼの安定剤（その活性の時間的延長の
ため）として、２〜６個の炭素原子及び２〜６個の水酸
基を有する水溶性脂肪族アルコールの少なくとも１種が
、場合により１〜４個の炭素原子を有する１価アルコー
ルと混合して添加される。

ポリオレフィンとは、ポリエチレン、ポリプロピレン、
その混合物及び共重合体を意味する。

親水化（水ぬれ性の改善のため）は下記の方法により行
うことができる。

１、　できあがった繊維を親水化剤例えばポリビニルア
ルコール（ＤＥ−ＰＳ　２２５７３０６　）又はメラミ
ン−ホルムアルデヒド−重縮金物（ＤＥ−ＰＳ　２５４
３０８１又は２５４５７２７　）により処理する。

２、繊維の製造の際に、例えばＤＥ−ＡＳ　２１１７６
７０により、ポリオレフィン溶液に親水化剤（例えば前
記のもの）を添加することができるので、これは機械的
に繊維内に組込まれる（例えばＤＥ−Ｏ８２２０８５５
３参照）。

６、繊維生成オレフィンと親水性コモノマー例えば酢酸
ビニル（続いてけん化）、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ
−ブチルアクリレート、アクリル酸又はアクリルアミド
との共重合体（例えばＵＳ４２１０６１５参照）。

ＳｃｈｗａｒｚｗＫｌｄｅｒ　Ｔｅｘｔｉ１ｗｅｒｋｅ
社製のポリエチレン−合成パルプが特に好ましいことが
知られた。

ポリオレフィン繊維の平均長さは、それぞれの使用に応
じて０．０５〜１０闘好ましくは０．１〜４闘である。

その下限は、濾過可能性並びにこれを充填したカラムの
流体力学的抵抗性によって決められる。長さ対直径の比
は少なくとも５：１で、一般に１０：１ないし２〇二１
である。水ぬれ性を改善するために用いられる親水化添
加物は、繊維重量に対して０．１〜１０％好ましくは０
．４〜４％である。

リパーゼ自体は水溶性であるが、粗製リパーゼの多くの
成分は水不溶性であり、反応混合物中に懸濁される。

水溶性アルコールとは、２０°Ｃで少なくとも１０重量
％さらに良好には少なくとも２０重量％が水に溶解する
ものを意味する。任意の割合で水と混合できるアルコー
ルが特に好まし℃・。

アルコールの「価」は水酸基の数を意味する。

水溶性アルコールとしては、例えば下記のものが用いら
れる。

エチレングリコール、１，２−及び１，６−フロパンジ
オール、１．２−　１．３−　１．４＝及び２．６−ブ
タンジオール、１，２−及び１，３−インブタンジオー
ル、１．２−及ヒ１．ｓ−ヘンタンジオール、ジエチレ
ングリコール、グリセリン、エリスリット、ペンタエリ
スリット、アラビット、キシリット、ソルビット、マン
ニット、ズルシット及びこれらの混合物。これらの多価
アルコールの一部を１種又は数種の次の１価アルコール
により置き換えることもできる。メタツル、エタノール
、１−及び２−７’ロバノール、２−ブタノール及び三
級ブタノール。２〜６個の水酸基を有する水溶性多価ア
ルコールを単独で又は種々の価のアルコールとの混合物
として、特にグリセリン並びにグリセリンとメタノール
、エタノール、１，５−ペンタ／ジオール及び特に２−
グロパノールとの混合物を用いることが好ましい。

ｐＨ価を５〜９好ましくは５．５〜８の範囲に調整する
ためには、普通の緩衝混合物例えば第１又は第２燐酸塩
、硼砂、トリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアミン
とその塩酸塩との混合物、酢酸塩緩衝混合物を用いるこ
とが好ましい。

全体の混合物は下記の組成を有する。

親水化ポリオレフィン繊維１〜５０％好ましくは２〜３
０％、 粗製豚膵臓リパーゼ１〜３０％好ましくは５〜２５％、 少なくとも１種の前記の水溶性多価アルコール１〜６８
％好ましくは２０〜３０％（その際、１％以上好ましく
は５％以上特に１０％以上の量を、１〜４個の炭素原子
を有する水溶性１価アルコールにより置き換えることが
できる）、水３０〜９７％、 並びにｐＨ価調整添加物（その重量はほとんど重要でな
い）。％はそれぞれ全体の混合物の重量に対する。

各成分は任意の順序で混合でき、好ま−しくは粗製リパ
ーゼを水とアルコールの混合物に懸濁し、次いで繊維を
加える。

この混合物は１分間ないし６日間好ましくは１時間ない
し１日間、Ｏ〜４００Ｃ好ましくは１０〜３０°Ｃで滞
留させることが有利であり、その際好ましくは運動状態
（例えば攪拌、揺動）に保持する。次いで濾過する。フ
ィルターケーキは直接に、洗浄するか又はせずに、含水
媒質中でエステル分割に使用できる。しかしリパーゼを
固定するため、あらかじめ架橋剤の水溶液又は水−アル
コール溶液を用いて、１分間ないし２時間好ましくは２
分間ないし１時間、室温（１０〜３０°Ｃ）で処理し、
即ち接触させることが特に有利である。好適な架橋剤は
、例えばジアルデヒド特にグルタルジアルデヒド及びグ
リオキサール、並びにＥＰ−Ａ　２７０４９９により２
〜６個の炭素原子を有する多機能性アルーール又はモノ
−もしくはジサッカライドの１当量（ＯＨ基に関し）当
り１〜３０当世の一般式 （式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は水素原子、メチル基又はエ
チル基を示す）で表わされるエポキシドを付加させ、得
られた付加物をＯＨ１当量当り１モルのエピクロルヒド
リンと反応させ、次いでエポキシドに環化させることに
より製造される水溶性グリシジルエーテルである。

架橋は初期活性をいくらか害するので、強すぎる架橋を
行うべきでないが、繰り返し使用における活性は比較的
安定に持続する（実施例１．２及び５）。

固定化物は普通の手段で例えばカラム中又は撹拌式反応
器内で使用できる。

本発明方法によって初めて豚膵臓リパーゼは、反復使用
可能で濾過性が良好なカラム中での使用に適する、高い
比活性及び長い寿はを有する固定化物に変えられる。粗
製リパーゼの副成分が妨害しないという事実は、この方
法を特に経済的にする。

パンクレアチンの酵素活性の測定： ｐＨ調節装置内で、硼砂／ＨＣｌ−緩衝ｉ（２０ｍＭ、
ｐＨ７，５）　５０ｍ１及びグリシジルブチレート１ｍ
ｌ！を混合し、そして３０℃で激しく攪拌する。適量（
通常１〜１０ｍ９）の粗製膵臓リパーゼ又は試験用の固
定化物（５ｏｏｉ９）を添加したのち、０．５　Ｎ　−
ＮａＯＨ溶液を自動秤量添加することによりｐＨを一定
に保持する。比酵素活性Ａｓ、は下記式により算出され
る。

△Ｖ−Ｎ Ａ　　　　＝ ｓｐ　　　△ｔ−ｍ ここにΔＶ／Δｔは反応開始までの苛性ソーダ液の消費
量（ｍｌ１分）、Ｎは苛性ンーター液（５００μモルフ
ｍｌ）の規定度、モしてｍは酵素又は固定化物の秤量を
意味する。

酵素活性のための通常の単位は１ユニツト（略称：ｕ）
であり、これは１μモル／分のＮａＯＨ消費量に相当す
る。

固定化に用いられるＮｏｒｄｍａｒｋ社製のパンクレア
チンの比活性は１７　ｕ／ｍ９である。

下記実施例中の部及び％は重量に関する。エステル分割
のために常に酪酸−グリシジルエステルを用いた。

固定化物の製造 実施例１ ｐＨ７の２００ｍモル〜燐酸塩緩衝液８ｏ部、グリセリ
ン１０部及びイソプロパノール１０部の混合物１８ｇ中
に、粗製豚膵臓リパーゼ２ｇを懸濁した。この懸濁液に
、ポリエチレン繊維（平均繊維長Ｑ、　６ｍｘ　、ポリ
ビニルアルコール含量４％）　０．５　ｇ及び水０．５
１からなるポリエチレン合成パルプＳＷＰ　ＥＳＳ　２
１Ｆ　（ＳｃｈｗａｒｚｗＫｌｄｓｒＴｅｘｔ、ｉｌｗ
ｅｒｋｅ　５ｃｈｅｎｋｅｎｚｅｌ１社製）１ｇを加え
た。混合物を１夜攪拌し、次いでグルタルジアルデヒド
（２５％水溶１）５．４．！９を混合した。

さらに１時間攪拌したのち、濾過し、ｐＨ７の２００ｍ
モル−燐酸塩緩衝液８０部、グリセリン１０部及びイソ
プロパノール１０部かラノ混合物で洗浄し、よく吸引し
た。固定化物２．０ｐが得られた。これを５回エステル
分割に用いた。

その比酵素活性を次表に示す。

Ａ　ｓ　ｐ　　＝比活性 Ａｒｅ工＝最初の活性に対する相対活性実施例２ 実施例１と同様に操作し、ただしグルタルアルデヒドで
架橋しなかった。固定化物２．４ｇが得られた。

実施例３ 実施例１と同様に操作し、ただし豚膵臓リパーゼを半量
用いた。固定化物１．９ｇが得られた。

４　　　　　　　９１゜ ５　　　　　　　　９ａ１ 実施例４ 実施例１と同様に操作し、ただし豚膵臓リパーゼを１／
４だけ用いた。固定化物１．７ｇが得られた。

実施例５ 実施例１と同様に操作し、ただしグルタルアルデヒドを
半量用いた。固定化物２．１ｇが得られた。

実施例６ ｐＨ８，０の５０ｍモル−硼砂緩衝液６５部、グリセリ
ン３０部及びエタノール５部からの混合物１８９中に、
粗製豚膵穢リパーゼ１ｇを懸濁した。この懸濁液に、ポ
リエチレン繊維（平均繊維長１．６ｆｌｌｌ、ポリビニ
ルアルコ−ｋ　含４ｉ　［１，４％）ｏ、３ｇｇ及び水
０．６５９からなるポリエチレン−合成パルプＳＷＰ　
Ｅ−７８０（実施例１に記載の会社）１ｇを加えた。こ
の混合物を３時間攪拌したのち、ツルピッ）−Ｅ○８ｏ
−エポキシド（下記参照）２．５．９を混合し、さらに
１時間攪拌した。この固定化物を吸引濾過し、硼砂、グ
リセリン及びエタノールからの前記の混合物で洗浄した
。固定化物２．６ｇが得られた。これを３回エステル分
割に用いた。その比活性を次表に示す。

ソルビット−Ｅｏ８ｏ−エポキシドは、エポキシ価１．
２ｍモル／Ｉを有し、下記のように製造された（　ＤＥ
　３５２７０１４　）。

ソルビット−ＥＯ８ｏ（ソルビット１モルとエチレンオ
キシド８０モルの反応生成物、ホウペン−ワイル著メト
ーデン・デル・オルガニツルェン・ヘミ−１４／２巻１
９６３年４５０頁参照）５７０５ｇにＢＦ３−２水和物
１４．８ｇを加える。

次いで７０℃で攪拌下にエピクロルヒドリン５５５ｇを
滴加する。さらに２時間７０°Ｃで攪拌し、次いで２０
〜６５°Ｃで５０％苛性ソーダ液５２８ｇを１〜２時間
かげて滴加する。苛性ソーダ液の約９０％が消費される
まで、さらに攪拌する。苛性ソーダ液消費量を滴定によ
り追跡する。

水の主要量を７０°Ｃで水流真空中で留去し、残りを熱
時（７０°Ｃ）吸引濾過する。

こうしてエピクロルヒドリンとソルビット−ＥＯ８ｏと
の反応生成物６４６９ｇ（ａｓ％）が得られ、これはエ
ポキシド滴定値１．２ｍモル／ｇを有する。

実施例７ ｐＨ８の２００ｍモル−燐酸塩緩衝液及びアルコールか
らの混合物（表参照）１８ｇ中に、粗製豚膵臓リパーゼ
２Ｉを懸濁した。この懸濁液に、ポリエチレン繊維（平
均繊維長１．６順、ポリビニルアルコール含ｉ０．７％
）　ｏ、　ｓ　、ｐ及び水０，５ｇからなるポリエチレ
ン−合成パルプＳＷＰ　Ｅ−７９０（前記の会社）１ｇ
を加えた。この混合物を１夜攪拌し、グルタルアルデヒ
ド（２５％水溶液）２．７ｇを混合し、１時間攪拌した
。

この固定化物を吸引濾過し、それぞれアルコルー燐酸塩
緩衝液で洗浄した。

グリセリン イソプロパノール　グリセリン １．５ベンタンジオール グリセリン メタノール　　グリセリン 実施例８ ｐＨ７，０の２００ｍモル−燐酸塩緩衝液８０部、グリ
セリン１０部及びインプロノくノール１０部からの混合
物５４０ｇ中に、粗製豚膵臓す・（ゼロ０ｇを懸濁した
。この懸濁液に、ポリエチレン繊維（平均繊維長０．６
順、ポリビニルア化コール含量４％）１５．！７及び水
１５ｇからなるポリエチレン−合成パルプＳＷＰ　ＥＳ
Ｓ　２１Ｆ　（前記の会社）　３０ｇを懸濁した。この
混合物を１夜揺動し、次いでグルタルアルデヒド（２５
％水溶液）８１ｇを混合した。さらに１時間攪拌したの
ち、濾過し、燐酸塩緩衝液８０部、グリセリン１０部及
びインプロノ（ノール１０部からの前記の混合物８１０
ｇで洗浄し、よ（吸引した。

３０°Ｃにおける比活性２４６９　ｕ／ｇの固定化物８
２ｇが得られた。この固定化物を使用例で用いた。

比較例１ 粗製豚膵臓リパーゼ２ｇをＥＰ−Ａ　２１０４９９によ
り、ｐＨ８の５０ｍモル−燐酸塩緩衝液５０部及びグリ
セリン５０部からの溶液８ｇ中に懸濁し、ツルピッ）　
−ＥＯｇ（、−エポキシド（実施例６参照）６．５ｇ及
びポリエチレンイミノ溶液（２５％水溶液、ＨＣｌでｐ
Ｈ８，０に調整）４．０ｇを混合した。２４時間後に生
成したゲルを目幅１ｗｎのふるいを通して押出した。

比較例２ ｐＨ８，０の２００ｍモル−燐酸塩緩衝液８０部、グリ
セリン１０部及びイソプロパノール１０部からの混合物
１８ｇ中に、粗製豚膵臓リパーゼ２Ｉを懸濁した。この
懸濁液に、ＵＳ−ＰＳ　４２４７４９８により製造した
多孔性ポリエチレン（Ａｃｃｕｒｅｌ■ＨＤＰＥ−粉末
、Ｅｎｋａ　ＡＧ　）　１　ｇを加え、１夜攪拌した。

グルタルアルデヒド（２５％水溶液）５．４．９の添加
の１時間後に吸引濾過した。

固定化物２．１ｇが得られた。

比較例６ 実施例５と同様に操作し、ただしアルコールをｐＨ８，
０の燐酸塩緩衝液により置き換えた。

リゾープス・ヤポニクスからのリパーゼサイケン１００
、大阪サイヒン研究所製 ムコール・リパーゼＭ−ＡＰ　１０、大野製薬社製ムコ
ール・ご−ヘイからのビカンターゼーＡ、Ｇ１５ｔ−Ｂ
ｒｏｃａｄｅｓ社製 カンジダ・シリンドラセアからのリパーゼＭＹ名糖産業
社製 最初の６種は、エステル分割において酵素活性を示さな
かった。リパーゼＭｙの比活性を次光に示す。

比較例４ 実施例１と同様に操作し、ただし下記の４種の他のリパ
ーゼを用いた。

使用例 ｐＨ７，０に調整した０、０５モル−緩衝ａ＜Ｎａ２Ｂ
４０７−１０Ｈ２０、濃塩酸で調整）１．４−＆を６°
Ｃに冷却した。ラセミ体グリンジルプチレート２１６、
１　ｇ（１，５モル）及びｐＨ７の緩衝液で洗浄された
実施例８の湿った固定化物１０ｇを加えた。この混合物
を９〜１００Ｃで激しく攪拌し、１ＯＮ−ＮａＯＨ（合
計８２．５ｍ１１０．８２５モル、５５％加水分解に相
当）のポンプ供給によりｐＨ７６付近に保持した。１３
０分後に前記のＮａＯＨ量が消費された。一定化物を濾
過し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回、ｐＨ８の緩衝液で１回洗浄
し、次いでｐＨ７の緩衝液中に懸濁し、５〜８℃で保存
した。

原液と洗浄液を一緒にし、振とうし、有機相を分離した
。水相をＣＨ２Ｃｌ２でさらに３回抽出した。

−緒にした有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、回転し
ながら真空中で蒸発濃縮し、蒸留した。

Ｒ（＝）グリシジルブチレート７８ｇが得られた（　０
．５５モル、５５％の加水分解において理論的に得られ
るＲ（−）グリシジルブチレート０゜６７モルに対して
収率８０％）。旋光度〔α１２０＝３０．００、沸点８
３°Ｃ／１４ｍバール。

この固定化物は何回も反復使用することができ、その際
活性は緩慢に低下し、約７０％でかなり安定化した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）担体として親水化ポリオレフィン繊維及び（
   ｂ）リパーゼとして粗製豚膵臓リパーゼを用い、そして
   （ｃ）後記の水性混合物に、２〜６個の炭素原子を有す
   る２〜６価の水溶性アルコールの少なくとも１種を混合
   することを特徴とする、担体をリパーゼ及び水性緩衝液
   とｐＨ５〜９及び０〜４０℃で混合し、１分ないし３日
   後にろ過し、そしてフィルターケーキを洗浄することに
   よる生体触媒の製法。 ２、担体として親水化ポリエチレン繊維を用いることを
   特徴とする、第１請求項に記載の方法。 ３、水溶性アルコールとして、少なくとも１種の多価ア
   ルコール又は１価及び多価アルコールの混合物を用いる
   ことを特徴とする、第１又は第２請求項に記載の方法。 ４、水溶性アルコールとして、グリセリン又はグリセリ
   ンとメタノール、エタノール、イソプロパノール及び１
   ，５−ペンタンジオールから成る群から選ばれた少なく
   とも１種の成分との混合物を用いることを特徴とする、
   第３請求項に記載の方法。 ５、水溶性アルコールとして、グリセリンとイソプロパ
   ノールとの混合物を用いることを特徴とする、第３請求
   項に記載の方法。 ６、フィルターケーキを架橋剤で処理することを特徴と
   する、第１ないし第５請求項のいずれかに記載の方法。 ７、架橋剤として、グルタルアルデヒドを用いることを
   特徴とする、第６請求項に記載の方法。 ８、架橋剤として、２〜６個の炭素原子を有する多機能
   性アルコール又はモノ−もしくはジサツカライドの１当
   量（ＯＨ基に関し）当り１〜３０当量の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中Ｒ＾１、Ｒ＾２及びＲ＾３は水素原子、メチル基
   又はエチル基を示す）で表わされるエポキシドを付加さ
   せ、得られた付加生成物をＯＨ１当量当り１モルのエピ
   クロルヒドリンと反応させ、次いでエポキシドに環化さ
   せることにより製造される水溶性グリシジルエーテルを
   用いることを特徴とする、第６請求項に記載の方法。 ９、各成分を、（ａ）親水化ポリオレフィン繊維１〜５
   ０％、（ｂ）粗製豚膵臓リパーゼ１〜３０％、（ｃ）１
   価又は多価の前記の水溶性アルコール１〜６８％及び（
   ｄ）水３０〜９７％の量比で、並びにｐＨ価調整添加物
   を混合する（％はそれぞれ全混合物の重量に対する）こ
   とを特徴とする、第１ないし第８請求項のいずれかに記
   載の方法。 １０、第１ないし第９請求項のいずれかに記載の方法に
   より得られる生体触媒。 １１、ラセミ体アルコールのエステルを水性媒質中でラ
   セミ分割するために、第１０請求項に記載の生体触媒を
   使用する方法。 １２、グリシジルブチレートのラセミ分割のために第１
   ０請求項に記載の生体触媒を使用する方法。