JPH02438A - 修飾した低分子量プラスミノーゲン活性化因子およびその製造方法 - Google Patents
修飾した低分子量プラスミノーゲン活性化因子およびその製造方法Info
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- JPH02438A JPH02438A JP63253674A JP25367488A JPH02438A JP H02438 A JPH02438 A JP H02438A JP 63253674 A JP63253674 A JP 63253674A JP 25367488 A JP25367488 A JP 25367488A JP H02438 A JPH02438 A JP H02438A
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
光匪勿ｉ景
フィブリン溶解系の個々の成分、特にプラスミノーゲン
活性化因子がフィブリン熔解プロセスの開始を制御でき
るので、最近それらの治療能力に多くの注意が向けられ
てきた。
活性化因子がフィブリン熔解プロセスの開始を制御でき
るので、最近それらの治療能力に多くの注意が向けられ
てきた。
血栓溶解療法は通常、ヒト尿から単離したセリンプロテ
アーゼであるウロキナーゼまたは細菌性タンパク質であ
るストレプトキナーゼを用いて行われる。これらのプラ
スミノーゲン活性化因子は共にプラスミノーゲンを活性
化してプラスミンを形成することができ、今日の臨床診
療で使用されている。しかし乍ら、ウロキナーゼは酵素
的に充分活性な形態で存在しそしてこの形態は体液中の
比較的高濃度のプロテアーゼインヒビターによって不活
性化されるので、ウロキナーゼはヒトに注射した後の有
効半減期が非常に短い（３〜１５分）。
アーゼであるウロキナーゼまたは細菌性タンパク質であ
るストレプトキナーゼを用いて行われる。これらのプラ
スミノーゲン活性化因子は共にプラスミノーゲンを活性
化してプラスミンを形成することができ、今日の臨床診
療で使用されている。しかし乍ら、ウロキナーゼは酵素
的に充分活性な形態で存在しそしてこの形態は体液中の
比較的高濃度のプロテアーゼインヒビターによって不活
性化されるので、ウロキナーゼはヒトに注射した後の有
効半減期が非常に短い（３〜１５分）。
この物質は半減期が短いため、大量のウロキナーゼを治
療処置中に注入することが必要である。
療処置中に注入することが必要である。
ストレプトキナーゼはウロキナーゼより入手し易く、ま
してより高価ではないので現在量も広範に使用される血
栓熔解剤であるが、直栓溶解療法でのストレプトキナー
ゼの使用は細菌性起源の事実によって制限される。スト
レプトキナーゼは、ベーター型溶血性ストレプトコッカ
スのランスフィールド（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ）Ｃ群株
が産生ずる非酵素タンパク質であり、そしてストレプト
キナーゼは、プラスミノーゲンを直接活性化してプラス
ミンにするウロキナーゼとは異なって、プラスミノーゲ
ンとコンプレックスを形成することによって間接的にフ
ィブリン熔解系を活性化して修飾されたプラスミノーゲ
ン部分を産生ずる。しかし乍ら、これら物質、即ちウロ
キナーゼおよびストレプトキナーゼの両者による血栓熔
解は、凝固タンパク質の無差別的消化を生しさせ得るプ
ラスミノーゲンの全身的活性化に時には関係し、そして
治療中の出血の危険性をかなり増加させる。それ故、こ
れらの血栓溶解剤はプラスミノーゲンの活性化において
血栓溶解選択性またはフィブリン特異性を欠くと言われ
ている。
してより高価ではないので現在量も広範に使用される血
栓熔解剤であるが、直栓溶解療法でのストレプトキナー
ゼの使用は細菌性起源の事実によって制限される。スト
レプトキナーゼは、ベーター型溶血性ストレプトコッカ
スのランスフィールド（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ）Ｃ群株
が産生ずる非酵素タンパク質であり、そしてストレプト
キナーゼは、プラスミノーゲンを直接活性化してプラス
ミンにするウロキナーゼとは異なって、プラスミノーゲ
ンとコンプレックスを形成することによって間接的にフ
ィブリン熔解系を活性化して修飾されたプラスミノーゲ
ン部分を産生ずる。しかし乍ら、これら物質、即ちウロ
キナーゼおよびストレプトキナーゼの両者による血栓熔
解は、凝固タンパク質の無差別的消化を生しさせ得るプ
ラスミノーゲンの全身的活性化に時には関係し、そして
治療中の出血の危険性をかなり増加させる。それ故、こ
れらの血栓溶解剤はプラスミノーゲンの活性化において
血栓溶解選択性またはフィブリン特異性を欠くと言われ
ている。
プラスミノーゲン活性化因子は正常組成および腫瘍組織
から抽出されており、そして培養液中成る種の細胞によ
って産生される。これらの供給源由来のプラスミノーゲ
ン活性化因子はそれらのプラスミノーゲン活性化におい
て高い血栓熔解選択性またはフィブリン特異性を有する
セリンプロテアーゼである。それ故、これらの活性化因
子は選択的にプラスミノーゲンをプラスミンに変える。
から抽出されており、そして培養液中成る種の細胞によ
って産生される。これらの供給源由来のプラスミノーゲ
ン活性化因子はそれらのプラスミノーゲン活性化におい
て高い血栓熔解選択性またはフィブリン特異性を有する
セリンプロテアーゼである。それ故、これらの活性化因
子は選択的にプラスミノーゲンをプラスミンに変える。
このプラスミンはフィブリン凝塊を溶解させるが、Ｗｉ
環している凝固タンパク質の多くは保護する。
環している凝固タンパク質の多くは保護する。
血栓溶解選択性の高い２つのタイプのプラスミノーン活
性化因子があるｍ−プロウロキナーゼまたは１本鎖ウロ
キナーゼ（ｓｃｕ−ＰＡ）として知られているウロキナ
ーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子および組織タ
イプのプラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ＾）−一これ
らはその免疫学的特性の差異によって容易に区別される
。ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子は
４１１個のアミノ酸残基長さのトリプシン様セリンプロ
テアーゼである。この分子は３つのドメインを有する：
上皮成長因子（ＥＧＦ）と相同であるのでＥＧＰドメイ
ンと称される４５個のアミノ酸残基のシスティンに冨む
アミノ−末端領域、 ＥＧＦ ドメインに隣接した８
７個のアミノ酸残基からなるクリングル領域またはクリ
ングルドメイン；並びに分子のカルボキシ末端領域に活
性部位残基ヒスチジン、アスパラギン酸塩およびセリン
を有するセリンプロテアーゼ領域。
性化因子があるｍ−プロウロキナーゼまたは１本鎖ウロ
キナーゼ（ｓｃｕ−ＰＡ）として知られているウロキナ
ーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子および組織タ
イプのプラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ＾）−一これ
らはその免疫学的特性の差異によって容易に区別される
。ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子は
４１１個のアミノ酸残基長さのトリプシン様セリンプロ
テアーゼである。この分子は３つのドメインを有する：
上皮成長因子（ＥＧＦ）と相同であるのでＥＧＰドメイ
ンと称される４５個のアミノ酸残基のシスティンに冨む
アミノ−末端領域、 ＥＧＦ ドメインに隣接した８
７個のアミノ酸残基からなるクリングル領域またはクリ
ングルドメイン；並びに分子のカルボキシ末端領域に活
性部位残基ヒスチジン、アスパラギン酸塩およびセリン
を有するセリンプロテアーゼ領域。
リジン１５８−イソロイシン１５９結合のプラスミンに
よる加水分解によって１木ｔｆｆｕ−ＰＡ（ｓｃｕ−Ｐ
＾またはプロウロキナーゼとしても知られている）が２
本鎖分子のウロキナーゼに変えられる。この分子内の２
本鎖は少なくとも１つのジスルフィド結合によってお互
いに連結されており、それはシスティン残基１４Ｂから
システィン残基２７９までであると提案されている（ダ
ブリュ・イー・ホームズ（Ｗ、Ｅ、）Ｉｏｌｍｅｓ）、
デイ−・ペニカ（Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ） 、エム・プレ
イバー（Ｍ、Ｂｌａｂｅｒ）、エム・ダブリュ・レイ（
Ｍ、Ｗ、Ｒｅｖ） 、ダブリュ・エイ・グエンッラー（
Ｗ。
よる加水分解によって１木ｔｆｆｕ−ＰＡ（ｓｃｕ−Ｐ
＾またはプロウロキナーゼとしても知られている）が２
本鎖分子のウロキナーゼに変えられる。この分子内の２
本鎖は少なくとも１つのジスルフィド結合によってお互
いに連結されており、それはシスティン残基１４Ｂから
システィン残基２７９までであると提案されている（ダ
ブリュ・イー・ホームズ（Ｗ、Ｅ、）Ｉｏｌｍｅｓ）、
デイ−・ペニカ（Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ） 、エム・プレ
イバー（Ｍ、Ｂｌａｂｅｒ）、エム・ダブリュ・レイ（
Ｍ、Ｗ、Ｒｅｖ） 、ダブリュ・エイ・グエンッラー（
Ｗ。
＾、Ｇｕｅｎｚｌｅｒ） 、ジー・プレイ・ステフェン
ス（Ｇ、ＪＳＬｅｆｆｅｎｓ）およびエイチ・エル・ハ
イネ力−（１１，Ｌ。
ス（Ｇ、ＪＳＬｅｆｆｅｎｓ）およびエイチ・エル・ハ
イネ力−（１１，Ｌ。
ｌ１ｅｙｎｅｋｅｒ） 、１９８５年、バイオテクノロ
ジー（Ｂｉｏｔ６゜ｃｈｎｏｌｏｇＹ） ３．９２３
〜９２９）、システィン１４８でのこのジスルフィド結
合は本願明細書では「リンキング」架橋と称する。アル
ギニン１５６−フェニルアラニン１５７結合のトロンビ
ンによる加水分解によっても１木鎖ｕＰＡは２本鎖分子
に変えられ、その際、２本鎖は同一のジスルフィド結合
によって保持されている。プラスミンによる切断および
トロンビンによる切断は共に生理学的に重要な役割を果
たすと思われる。
ジー（Ｂｉｏｔ６゜ｃｈｎｏｌｏｇＹ） ３．９２３
〜９２９）、システィン１４８でのこのジスルフィド結
合は本願明細書では「リンキング」架橋と称する。アル
ギニン１５６−フェニルアラニン１５７結合のトロンビ
ンによる加水分解によっても１木鎖ｕＰＡは２本鎖分子
に変えられ、その際、２本鎖は同一のジスルフィド結合
によって保持されている。プラスミンによる切断および
トロンビンによる切断は共に生理学的に重要な役割を果
たすと思われる。
組織クイブのプラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）も
セリンプロテアーゼであり、５２７個のアミノ酸の１本
のポリペプチド鎖からなっている。 ＴＰＡはアルギ
ニン２７５−インロイシン２７６結合のプラスミン切断
によって少なくとも１つのジスルフィド結合が連結され
ている２本鎖形態に変えられる。
セリンプロテアーゼであり、５２７個のアミノ酸の１本
のポリペプチド鎖からなっている。 ＴＰＡはアルギ
ニン２７５−インロイシン２７６結合のプラスミン切断
によって少なくとも１つのジスルフィド結合が連結され
ている２本鎖形態に変えられる。
ＴＰＡの一次構造は、ＴＰＡが４３個のアミノ酸残基長
さのアミノ−末端領域を有する点を除いて、ｕ−ＰＡの
構造との類似度が高い。このアミノ−末端領域はフィブ
ロネクチンのフィブリン親和性に寄与するフィンガード
メイン、およびフィブリンに対するＴＰＡの親和性でも
役割を果たすと思われる第２のクリングルドメインと相
同性である。
さのアミノ−末端領域を有する点を除いて、ｕ−ＰＡの
構造との類似度が高い。このアミノ−末端領域はフィブ
ロネクチンのフィブリン親和性に寄与するフィンガード
メイン、およびフィブリンに対するＴＰＡの親和性でも
役割を果たすと思われる第２のクリングルドメインと相
同性である。
組換え体ＤＮＡ技術によるＴＰＡおよびプロウロキナー
ゼの両者の製造によって充分な量の物質が製造されてい
るので、肺塞栓症、深静脈血栓症、心臓発作および卒中
での使用の有効性が決定されるとこれらの治療に使用す
ることができる。ＩＩＡえ体１）ＮＡ技ｊネｉを適用す
ると、プラスミノーゲン活性化因子分子を大量に提供す
ることによる著しい経済的および治療的利益がもたらさ
れる。新規なプラスミノーゲン活性化因子が組換え体Ｄ
ＮＡ技術によって製造され、そしてこのプラスミノーゲ
ン活性化因子分子が本願発明の主題である。この新規プ
ラスミノーゲン活性化因子はプロウロキナーゼのプラス
ミノーゲン活性化因子特性およびフィブリン特異性を保
持しているが、「リンキング」ジスルフィド架橋のない
低分子量物質である。
ゼの両者の製造によって充分な量の物質が製造されてい
るので、肺塞栓症、深静脈血栓症、心臓発作および卒中
での使用の有効性が決定されるとこれらの治療に使用す
ることができる。ＩＩＡえ体１）ＮＡ技ｊネｉを適用す
ると、プラスミノーゲン活性化因子分子を大量に提供す
ることによる著しい経済的および治療的利益がもたらさ
れる。新規なプラスミノーゲン活性化因子が組換え体Ｄ
ＮＡ技術によって製造され、そしてこのプラスミノーゲ
ン活性化因子分子が本願発明の主題である。この新規プ
ラスミノーゲン活性化因子はプロウロキナーゼのプラス
ミノーゲン活性化因子特性およびフィブリン特異性を保
持しているが、「リンキング」ジスルフィド架橋のない
低分子量物質である。
主所豊要貨
高い血栓溶解選択性およびフィブリン特異性を有し且つ
ｌ、＄ｔＮ１分子構造の外観を有する低分子量のプラス
ミノーゲン活性化因子を提供することが本願発明の１つ
の目的である。
ｌ、＄ｔＮ１分子構造の外観を有する低分子量のプラス
ミノーゲン活性化因子を提供することが本願発明の１つ
の目的である。
本願発明のもう１つの目的は、上記目的に従ってそのア
ミン末端の近くにプラスミン切断部位そして成る場合に
は更にトロンビン切断部位を有する低分子量プラスミノ
ーゲン活性化因子を提供することである。
ミン末端の近くにプラスミン切断部位そして成る場合に
は更にトロンビン切断部位を有する低分子量プラスミノ
ーゲン活性化因子を提供することである。
本願発明の更にもう１つの目的は上記目的の低分子量プ
ラスミノーゲン活性化因子を製造する手段および方法を
提供することである。
ラスミノーゲン活性化因子を製造する手段および方法を
提供することである。
本願発明の更にもう１つの目的は、組換え体手段によっ
て形質転換した宿主生物により発現された修飾プラスミ
ノーゲン活性化因子生成物が宿主内で適切に処理され次
いで細胞膜を通して運ばれることを示すことである。
て形質転換した宿主生物により発現された修飾プラスミ
ノーゲン活性化因子生成物が宿主内で適切に処理され次
いで細胞膜を通して運ばれることを示すことである。
もう１つの目的は分泌された低分子量のプラスミノーゲ
ン活性化因子を提供することである。
ン活性化因子を提供することである。
本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子は組換
え体ＤＮＡ技術により製造され、そして製造されたポリ
ペプチドがＥＧＦドメイン、クリングルドメイン、連結
領域および「リンキング」ジスルフィド結合は欠くが未
だプラスミノーゲン活性化因子活性およびフィブリン特
異性は保持するように、プロウロキナーゼのアミノ酸シ
ーケンスの欠失によりもたらされることができる。
え体ＤＮＡ技術により製造され、そして製造されたポリ
ペプチドがＥＧＦドメイン、クリングルドメイン、連結
領域および「リンキング」ジスルフィド結合は欠くが未
だプラスミノーゲン活性化因子活性およびフィブリン特
異性は保持するように、プロウロキナーゼのアミノ酸シ
ーケンスの欠失によりもたらされることができる。
本朝発明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子は、望
ましくない身体変化を生しさせることなく凝塊を溶解さ
せるのに十分な投与値で身体内の血液中にインビボで注
入することができる。心筋梗塞に使用する典型的なパラ
メーターはストレプトキナーゼについてこれまで知られ
ているようなものである。
ましくない身体変化を生しさせることなく凝塊を溶解さ
せるのに十分な投与値で身体内の血液中にインビボで注
入することができる。心筋梗塞に使用する典型的なパラ
メーターはストレプトキナーゼについてこれまで知られ
ているようなものである。
本願発明は、ニス・ニス・フセイン（Ｓ、Ｓ。
１ｌｕｓａｉｎ） 、ビー・リピンスキー（Ｂ、１．１
ｐｉｎｓｋｉ）およびケイー・ダレウィッチ（Ｖ、Ｇｕ
ｒｅｗｉｃｈ） （米国特許４、３８Ｌ ３４６）によ
って最初に単離されたヒトブロウａキナーゼと驚くこと
に同等の活性を示す新規な低分子量プラスミノーゲン活
性化因子に関する。
ｐｉｎｓｋｉ）およびケイー・ダレウィッチ（Ｖ、Ｇｕ
ｒｅｗｉｃｈ） （米国特許４、３８Ｌ ３４６）によ
って最初に単離されたヒトブロウａキナーゼと驚くこと
に同等の活性を示す新規な低分子量プラスミノーゲン活
性化因子に関する。
本願発明に包含される特別の低分子量プラスミノーゲン
活性化因子にはアミノ酸シーケンスが欠失しているプロ
ウロキナーゼに由来するものが含まれるので、例えば新
規低分子量プラスミノーゲン活性化因子はヒトプロウロ
キナーゼアミノ酸シーケンスの１５０から１５５のいず
れか１つの位置のアミノ酸残基で始まっており、例えば
プロウロキナーゼのＥＧＦドメイン、クリングフレドメ
イン、運霧古領域および「リンキング」ジスルフィド結
合が欠失している。更に、同様な特性を有する低分子量
活性化因子は、ヒトプロウロキナーゼのアミノ酸残基１
５６で始めることによって得ることができる。
活性化因子にはアミノ酸シーケンスが欠失しているプロ
ウロキナーゼに由来するものが含まれるので、例えば新
規低分子量プラスミノーゲン活性化因子はヒトプロウロ
キナーゼアミノ酸シーケンスの１５０から１５５のいず
れか１つの位置のアミノ酸残基で始まっており、例えば
プロウロキナーゼのＥＧＦドメイン、クリングフレドメ
イン、運霧古領域および「リンキング」ジスルフィド結
合が欠失している。更に、同様な特性を有する低分子量
活性化因子は、ヒトプロウロキナーゼのアミノ酸残基１
５６で始めることによって得ることができる。
プラスミンかまたはトロンビンのいずれかによる上記低
分子量プラスミノーゲン活性化因子の切断によって、最
早Ｎ−末端シーケンスは連結領域またはシスティン１４
８でのジスルフィド結合により該分子の残部へ結合する
ことはない。それ故、プラスミンおよびトロンビン切断
部位は、いずれのジスルフィド結合よりもアミノ末端に
近接しており、そして本明細書で使用する用語［遊離末
端」はこのような分子のアミノ末端を言う。遊離末端と
いう用語の意味はまた、プラスミンおよびトロンビン切
断部位のいずれかまたは両方が切断に対し耐性であるよ
うな分子のアミン末端をも含む。
分子量プラスミノーゲン活性化因子の切断によって、最
早Ｎ−末端シーケンスは連結領域またはシスティン１４
８でのジスルフィド結合により該分子の残部へ結合する
ことはない。それ故、プラスミンおよびトロンビン切断
部位は、いずれのジスルフィド結合よりもアミノ末端に
近接しており、そして本明細書で使用する用語［遊離末
端」はこのような分子のアミノ末端を言う。遊離末端と
いう用語の意味はまた、プラスミンおよびトロンビン切
断部位のいずれかまたは両方が切断に対し耐性であるよ
うな分子のアミン末端をも含む。
更に、本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子
ではトロンビン切断部位、即ちアルギニン１５６−フェ
ニルアラニン１５７が欠失していることができ、そして
その場合に、プラスミンの切断部位はいずれのジスルフ
ィド結合よりアミン末端に近接している。後者の場合に
は、開始アミノ酸残基はヒトプロウロキナーゼの１５７
または１５８位にある。得られた新規な低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子、即ちＮ−末端フェニルアラニン
１５７ｓｃｕ−１’ＡおよびＮ−末端リジン１５８−５
ｃｕ−ＰＡは天然の完全な長さの５ｃｕ−ＰＡよりトロ
ンビン切断に抵抗性である。これらの活性化因子は望ま
しくない血栓症の治療法に一層有用であると思われる。
ではトロンビン切断部位、即ちアルギニン１５６−フェ
ニルアラニン１５７が欠失していることができ、そして
その場合に、プラスミンの切断部位はいずれのジスルフ
ィド結合よりアミン末端に近接している。後者の場合に
は、開始アミノ酸残基はヒトプロウロキナーゼの１５７
または１５８位にある。得られた新規な低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子、即ちＮ−末端フェニルアラニン
１５７ｓｃｕ−１’ＡおよびＮ−末端リジン１５８−５
ｃｕ−ＰＡは天然の完全な長さの５ｃｕ−ＰＡよりトロ
ンビン切断に抵抗性である。これらの活性化因子は望ま
しくない血栓症の治療法に一層有用であると思われる。
何んとなれば、これらの活性化因子は天然の完全な長さ
の５ｃｕ−ＰＡよりトロンビンによって「不活性化」を
受けにくいからである（イチノセ（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ）
等、１９８６年、ジャーナル オフ゛ バイオロジカＪ
レケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６１
： ３４８６〜３４８９ ；ブレウィンチ（Ｇｕｒｅ
ｗｉｃｈ）およびパネル（Ｐａｎｎｅｌｌ）、１９８７
年、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） ６９ ： １６９〜１
１２＞。
の５ｃｕ−ＰＡよりトロンビンによって「不活性化」を
受けにくいからである（イチノセ（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ）
等、１９８６年、ジャーナル オフ゛ バイオロジカＪ
レケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６１
： ３４８６〜３４８９ ；ブレウィンチ（Ｇｕｒｅ
ｗｉｃｈ）およびパネル（Ｐａｎｎｅｌｌ）、１９８７
年、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） ６９ ： １６９〜１
１２＞。
更に、本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子
の「リンキング」ジスルフィド結合のない遊離システィ
ンは、ジスルフィド結合を形成し得ないアミノ酸と入れ
換えることもできる０例えば、これら新規低分子量プラ
スミノーゲン活性化因子のシステイン−２７９は適当に
折り重なった分子中のジスルフィド結合には関与してい
ない；しかし乍ら、システイン−２７９はこれらの新規
活性化因子を折り重ねている間に異常な形態のジスルフ
ィド結合に幾らかの頻度で関与することがある。
の「リンキング」ジスルフィド結合のない遊離システィ
ンは、ジスルフィド結合を形成し得ないアミノ酸と入れ
換えることもできる０例えば、これら新規低分子量プラ
スミノーゲン活性化因子のシステイン−２７９は適当に
折り重なった分子中のジスルフィド結合には関与してい
ない；しかし乍ら、システイン−２７９はこれらの新規
活性化因子を折り重ねている間に異常な形態のジスルフ
ィド結合に幾らかの頻度で関与することがある。
この潜在的な問題を避けるために、システィン２７９は
システィン以外の任意のアミノ酸、例えばセリンに換え
ることができる。
システィン以外の任意のアミノ酸、例えばセリンに換え
ることができる。
本願発明の好ましい実施態様によれば、例えばアミノ酸
シーケンスの前記した部分の欠失はプラスミノーゲン活
性化因子およびフィブリン特異性を保有する低分子量分
子を製造するのに役立つ。
シーケンスの前記した部分の欠失はプラスミノーゲン活
性化因子およびフィブリン特異性を保有する低分子量分
子を製造するのに役立つ。
低分子量プラスミノーゲン活性化因子は、酵母、他の真
菌、細菌、咄乳類若しくは他の既知の宿主細胞を使用す
る慣用の遺伝子工学技術または他の技ｊネｉによって製
造することができる。このようにして製造された低分子
量プラスミノーゲン活性化因子はインビボでプラスミノ
ーゲン活性化因子として有用であり、現在使用されてい
る物質以上に治療用途の価値が増大している。例えば、
これらは酵母および真菌を含む種々の宿主生物から、完
全な長さのプロウロキナーゼよりさらに効率的に製造さ
れ、−層経済的な製造過程がもたらされる。
菌、細菌、咄乳類若しくは他の既知の宿主細胞を使用す
る慣用の遺伝子工学技術または他の技ｊネｉによって製
造することができる。このようにして製造された低分子
量プラスミノーゲン活性化因子はインビボでプラスミノ
ーゲン活性化因子として有用であり、現在使用されてい
る物質以上に治療用途の価値が増大している。例えば、
これらは酵母および真菌を含む種々の宿主生物から、完
全な長さのプロウロキナーゼよりさらに効率的に製造さ
れ、−層経済的な製造過程がもたらされる。
好１上土ＪｕＩＪｌΔ糺匪
プラスミノーゲン活性化因子であるプロウロキナーゼは
３個の構造的ドメインを有するポリペプチドであり、そ
のドメインの内２個はプラスミノーゲンを活性化するの
に機能的に重要であると考えられている。これらの内の
１つ、即ち分子のＣ末端に位置するドメインはプラスミ
ノーゲンをプラスミンに変えることができる能力を有す
るプロテアーゼドメインであり、そしてもう１つ、即ち
ＥＧＦドメインに続く Ｎ末端に位置するドメインはプ
ロウロキナーゼ作用のフィブリン特異性に役割を演する
と初めに考えられたクリングル−含有ドメインである。
３個の構造的ドメインを有するポリペプチドであり、そ
のドメインの内２個はプラスミノーゲンを活性化するの
に機能的に重要であると考えられている。これらの内の
１つ、即ち分子のＣ末端に位置するドメインはプラスミ
ノーゲンをプラスミンに変えることができる能力を有す
るプロテアーゼドメインであり、そしてもう１つ、即ち
ＥＧＦドメインに続く Ｎ末端に位置するドメインはプ
ロウロキナーゼ作用のフィブリン特異性に役割を演する
と初めに考えられたクリングル−含有ドメインである。
これらの２個の機能的にｆｆｉ要なドメインはポリペプ
チド鎖（連結領域）によってだけでなく、少なくとも１
つのジスルフィド結合（「リンキング」ジスルフィド架
橋）によっても連結されている。
チド鎖（連結領域）によってだけでなく、少なくとも１
つのジスルフィド結合（「リンキング」ジスルフィド架
橋）によっても連結されている。
プラスミノーゲン活性化因子活性およびフィブリン特異
性を保持していることに関して活性な１本鎮プロウロキ
ナーゼ分子は、このような活性に必須であると考えられ
る領域を保持するものであろう、′ｇｌ！いたことには
、クリングル−含有ドメイン並びにεＧＦドメイン、連
結領域および「リンキングＪジスルフィド架橋の欠失に
よって、本願発明の特徴である完全に活性でフィブリン
特異性の低分子噴プラスミノーゲン活性化因子がもたら
される。
性を保持していることに関して活性な１本鎮プロウロキ
ナーゼ分子は、このような活性に必須であると考えられ
る領域を保持するものであろう、′ｇｌ！いたことには
、クリングル−含有ドメイン並びにεＧＦドメイン、連
結領域および「リンキングＪジスルフィド架橋の欠失に
よって、本願発明の特徴である完全に活性でフィブリン
特異性の低分子噴プラスミノーゲン活性化因子がもたら
される。
ス新ｉ１１
本願発明の特別な実施例では、プロウロキナーゼはヒト
の腎細胞から得られる（ティー・コーン（Ｔ、Ｋｏｈｎ
ｏ） 、ビー・ホンバー（Ｐ、）Ｉｏｐｐｅｒ）、ジヱ
イエス・リルキスト（Ｊ、Ｓ、Ｌｉ１ｌｑｕｉｓｔ）
、アール・エル・サブイス（Ｒ，Ｌ、５ｕｄｄｆｔｈ）
、アール・グリーンリー（Ｒ，Ｇｒｅｅｎｌｅｅ）お
よびデイ−・ティー・モイア（Ｄ、Ｔ、Ｍｏ１ｒ） （
１９８４）、バイオテクノロジー、ｌ二６２８〜６３４
）、プロウロキナーゼは１本のポリペプチド鎖を有する
プラスミノーゲン活性化因子として定義されており、フ
ィブリツリシス（Ｆｉｂｒｉｎ。
の腎細胞から得られる（ティー・コーン（Ｔ、Ｋｏｈｎ
ｏ） 、ビー・ホンバー（Ｐ、）Ｉｏｐｐｅｒ）、ジヱ
イエス・リルキスト（Ｊ、Ｓ、Ｌｉ１ｌｑｕｉｓｔ）
、アール・エル・サブイス（Ｒ，Ｌ、５ｕｄｄｆｔｈ）
、アール・グリーンリー（Ｒ，Ｇｒｅｅｎｌｅｅ）お
よびデイ−・ティー・モイア（Ｄ、Ｔ、Ｍｏ１ｒ） （
１９８４）、バイオテクノロジー、ｌ二６２８〜６３４
）、プロウロキナーゼは１本のポリペプチド鎖を有する
プラスミノーゲン活性化因子として定義されており、フ
ィブリツリシス（Ｆｉｂｒｉｎ。
１ｙｓｉｓ） （アムステルダム シエテーマ ホルキ
ーマ（Ｓｃｈｔｈｅｍａ Ｈｏｌｋｉｍａ）） 、１
１２４にピー・プラークマン（Ｐ、Ｂｒａｋｍａｎ）
（１９６７）が記載したフィブリンブレートアッセイ
で測定されるＣＴＡ （血栓溶解剤委員会（Ｃｏｍｍｉ
ｔｔｅｅ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ Ａｇｅｎ
ｔ））ユニットで表わされるプラスミノーゲン活性化因
子活性を示し、実質的には図１に記載したものである。
ーマ（Ｓｃｈｔｈｅｍａ Ｈｏｌｋｉｍａ）） 、１
１２４にピー・プラークマン（Ｐ、Ｂｒａｋｍａｎ）
（１９６７）が記載したフィブリンブレートアッセイ
で測定されるＣＴＡ （血栓溶解剤委員会（Ｃｏｍｍｉ
ｔｔｅｅ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ Ａｇｅｎ
ｔ））ユニットで表わされるプラスミノーゲン活性化因
子活性を示し、実質的には図１に記載したものである。
細胞は５％の熱−不活性化したＮｕｓｅｒｕｍ （コラ
ボレイティブ リサーチ インコーボレイティソド（Ｃ
ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎｃ
）、マサチューセ、ツ州ヘッドフォード）を補給したダ
ルベツコの修正イーグル培ｔｌｉ！（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
’ ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓｍｅｄ ｉｕ
ｍ）中で集密するまで増殖させる。集密した細胞は０．
２５パーセントのトリプシンを用いて３７°Ｃで１５分
間処理した後遠心して採取し、液体窒素中で冷ｉ束する
。
ボレイティブ リサーチ インコーボレイティソド（Ｃ
ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎｃ
）、マサチューセ、ツ州ヘッドフォード）を補給したダ
ルベツコの修正イーグル培ｔｌｉ！（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
’ ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓｍｅｄ ｉｕ
ｍ）中で集密するまで増殖させる。集密した細胞は０．
２５パーセントのトリプシンを用いて３７°Ｃで１５分
間処理した後遠心して採取し、液体窒素中で冷ｉ束する
。
ポリ（Ａ） ＲＮＡはティー・マニアティス（Ｔ、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）、イー・エフ・フリック（［！、Ｆ、Ｐ
ｒ１ｔｓｃｈ）およびジェイ・サムブルンク（Ｊ、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ） （１９８２）の［分子クローニング、
ｘｕｘマニュアル」（コールドスプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプ
リングハーバ−） １９１−１９８頁の方法に従って
単離する。
ｎｉａｔｉｓ）、イー・エフ・フリック（［！、Ｆ、Ｐ
ｒ１ｔｓｃｈ）およびジェイ・サムブルンク（Ｊ、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ） （１９８２）の［分子クローニング、
ｘｕｘマニュアル」（コールドスプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプ
リングハーバ−） １９１−１９８頁の方法に従って
単離する。
簡単に言えば、５グラムの冷凍細胞をＭＰ −４０で溶
解し、核は超遠心によって除去する。細胞質フラクショ
ンはプロテイナーゼにで処理し、そして蛋白質はフェノ
ール／クロロホルム；イソアミルアルコール抽出を繰り
返して除去する。総細胞質ＲＮＡはエタノールで沈殿さ
せて約１６ミリグラムの収量で回収される。ポリ（Ａ）
ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィ
ーによって約２００マイクログラムの収量で単離される
。単離したポリ（Ａ）ＲＮＡの無傷性はウサギの綱状赤
血球溶解液系でのインビトロ翻訳によって証明される。
解し、核は超遠心によって除去する。細胞質フラクショ
ンはプロテイナーゼにで処理し、そして蛋白質はフェノ
ール／クロロホルム；イソアミルアルコール抽出を繰り
返して除去する。総細胞質ＲＮＡはエタノールで沈殿さ
せて約１６ミリグラムの収量で回収される。ポリ（Ａ）
ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィ
ーによって約２００マイクログラムの収量で単離される
。単離したポリ（Ａ）ＲＮＡの無傷性はウサギの綱状赤
血球溶解液系でのインビトロ翻訳によって証明される。
ポリ（Ａ）ＩＩＩＲＮＡの二ｒｆＬ鎖ｃＤＮ＾の変換は
逆転写酵素による第１鎖合成のプライマーとしてオリゴ
（ｄＴ）を使用する標準的な方法（エム・ビー・ウィノ
ケンズ（Ｍ、Ｐ。
逆転写酵素による第１鎖合成のプライマーとしてオリゴ
（ｄＴ）を使用する標準的な方法（エム・ビー・ウィノ
ケンズ（Ｍ、Ｐ。
Ｗｉｃｋｅｎｓ）、ジー・エフ・ビュエルＣＧ、 Ｎ、
Ｂｕｅｌ Ｉ）およびアール−ティー・ンムケ（Ｒ，
Ｔ、Ｓｃｈｉｍｋｅ） （１９７Ｂ） 。
Ｂｕｅｌ Ｉ）およびアール−ティー・ンムケ（Ｒ，
Ｔ、Ｓｃｈｉｍｋｅ） （１９７Ｂ） 。
ジャーナルオプバイオロジカルケミストリー韮： ２４
８３〜２４９５） 、第２鎖を合成するＤＮＡポリメラ
ーゼ１、末端を確実にプラント末端にするヌクレアーゼ
５１処理およびサイズ選択用バイオゲルＡ１５０？Ｉで
のクロマトグラフィーで行われる。
８３〜２４９５） 、第２鎖を合成するＤＮＡポリメラ
ーゼ１、末端を確実にプラント末端にするヌクレアーゼ
５１処理およびサイズ選択用バイオゲルＡ１５０？Ｉで
のクロマトグラフィーで行われる。
サイズを選択した二重鎖ｃＤＮＡはＨｉｎｄＩｆｆ合成
オリゴヌクレオチドリンカー（コラボレイティブリサー
チインコーボレイティソド、マサチューセソツ州へソド
フォード）に連結され、次いで１重鎮ｆＩファージベク
ターに形質転換される（エフ・デイ・ジングー（１１，
Ｄ、Ｚｔｎｄｅｒ）およびジエイ・デイ・ベータ（Ｊ、
０．Ｂｏｅｋｅ） （１９８２） ジーン（Ｇｅｎｅ
） ＋９．１〜ＩＯ；デイ’ダブリｊＬ’ボーデン（Ｄ
、Ｗ、 Ｂｏｗｄｅｎ＞、ジエイ・マオ（Ｊ、ＭａＯ）
、ティ’ギル（Ｔ、Ｇｊｌｌ）、ケイ・シアオ（Ｋ、
Ｉ（ｓｉａｏ） 、ジェイ・ニス・リルキスト、デイ・
テスタ（Ｄ、Ｔｅ５ｔａ）およびジー・エフ・ボービス
（Ｇ、Ｆ、Ｖｏｖｉｓ） （１９８４） ジーン２７：
８７〜９９）。
オリゴヌクレオチドリンカー（コラボレイティブリサー
チインコーボレイティソド、マサチューセソツ州へソド
フォード）に連結され、次いで１重鎮ｆＩファージベク
ターに形質転換される（エフ・デイ・ジングー（１１，
Ｄ、Ｚｔｎｄｅｒ）およびジエイ・デイ・ベータ（Ｊ、
０．Ｂｏｅｋｅ） （１９８２） ジーン（Ｇｅｎｅ
） ＋９．１〜ＩＯ；デイ’ダブリｊＬ’ボーデン（Ｄ
、Ｗ、 Ｂｏｗｄｅｎ＞、ジエイ・マオ（Ｊ、ＭａＯ）
、ティ’ギル（Ｔ、Ｇｊｌｌ）、ケイ・シアオ（Ｋ、
Ｉ（ｓｉａｏ） 、ジェイ・ニス・リルキスト、デイ・
テスタ（Ｄ、Ｔｅ５ｔａ）およびジー・エフ・ボービス
（Ｇ、Ｆ、Ｖｏｖｉｓ） （１９８４） ジーン２７：
８７〜９９）。
各々１４個の塩基長さでＰｔ１Ｋコード化領域の部分に
相同性の１５個のオリゴヌクレオチドロブロープは自動
ホスホラミダイト方法（応用バイオシステム自動ＤＮＡ
合成器）によって合成する。これらプローブ（１から１
５番）は遺伝子内の位置と共に図２に図式的に示す。
相同性の１５個のオリゴヌクレオチドロブロープは自動
ホスホラミダイト方法（応用バイオシステム自動ＤＮＡ
合成器）によって合成する。これらプローブ（１から１
５番）は遺伝子内の位置と共に図２に図式的に示す。
ファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めに、プローブ゛は（昆合し、ポリヌクレオチドキナー
ゼおよびガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰによって３２Ｐで標識
しそしてポリアクリルアミドゲルによって残有する標識
から単離する。得られた標識プローブは、ダブリュ・デ
イ・ベントン（Ｗ、Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎ）およびアール・
ダブリｊ−’デービス（Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ） （１９
７７）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） １９６ ：
１８０〜１８２の方法に木質的に従って、ライブラリ
ーからニトロセルロースプラークをつり上げるために使
用される。
めに、プローブ゛は（昆合し、ポリヌクレオチドキナー
ゼおよびガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰによって３２Ｐで標識
しそしてポリアクリルアミドゲルによって残有する標識
から単離する。得られた標識プローブは、ダブリュ・デ
イ・ベントン（Ｗ、Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎ）およびアール・
ダブリｊ−’デービス（Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ） （１９
７７）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） １９６ ：
１８０〜１８２の方法に木質的に従って、ライブラリ
ーからニトロセルロースプラークをつり上げるために使
用される。
多重プローブを使用すると、予測不可能な構造若しくは
シーケンス関連問題に起因する成る種のプローブによる
遺伝子内の予期されなかった一時的な多重性またはハイ
ブリダイゼーションの劣悪さがプロウロキナーゼを含む
クローンの同定を確実に妨害しないようになる。この方
法では、約５００００のクローンがプロウロキナーゼノ
ーケンスに対してスクリーニングされる。コロニーの１
つはプローブの内の１１個とのハイブリダイゼーション
を示す。後者のクローンのジデオキシ−配列および制限
分析によって、このクローンが２．２キロベースの挿入
物を含有しそしてシグナルシーケンス（ＳＳ）の中央で
始っていることが示される（図１参照）、シグナルシー
ケンスの領域に相補性のプローブを使用して更にスクリ
ーニングするとそのシグナルシーケンスの欠落部分を含
有する別のクローンが現れる。
シーケンス関連問題に起因する成る種のプローブによる
遺伝子内の予期されなかった一時的な多重性またはハイ
ブリダイゼーションの劣悪さがプロウロキナーゼを含む
クローンの同定を確実に妨害しないようになる。この方
法では、約５００００のクローンがプロウロキナーゼノ
ーケンスに対してスクリーニングされる。コロニーの１
つはプローブの内の１１個とのハイブリダイゼーション
を示す。後者のクローンのジデオキシ−配列および制限
分析によって、このクローンが２．２キロベースの挿入
物を含有しそしてシグナルシーケンス（ＳＳ）の中央で
始っていることが示される（図１参照）、シグナルシー
ケンスの領域に相補性のプローブを使用して更にスクリ
ーニングするとそのシグナルシーケンスの欠落部分を含
有する別のクローンが現れる。
この２つの挿入物は、両種入物に共通しているＢｇｌ
Ｉ［制限部位で発現ベクターにサブクローン化される
。得られたサブクローンに対して制限分析を実施し、そ
して後者のｃＤＮＡが完全な長さのプ［」ウロキナーゼ
をコードしていることが示される。
Ｉ［制限部位で発現ベクターにサブクローン化される
。得られたサブクローンに対して制限分析を実施し、そ
して後者のｃＤＮＡが完全な長さのプ［」ウロキナーゼ
をコードしていることが示される。
図３は、哺乳類動物細胞、即ちＣ１１０細胞中で複製お
よび発現可能であるｐｓｖ ２と称される真核生物の発
現ベクターにプロウロキナーゼをコード化するｃＤＮＡ
の導入を描写する。ｐｓｖ ２発現ベクターはプロウロ
キナーゼの発現を指令するＳＶ４０初朋プ初子プロモー
ターする。プラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
分析によって正しい構造が形成されていることが証明さ
れ、そしてこのプラスミドはｐｃｃ旧６と呼称する。
１ｉｔ）１３Ｔ３細胞からのＰＵＫの分泌はフィブリ
ンプレート分析（プラークマン（１９６７年）、上記）
によってそしてアミド分解活性分析（コーン等（１９８
４年）、上記）によって証明される。
よび発現可能であるｐｓｖ ２と称される真核生物の発
現ベクターにプロウロキナーゼをコード化するｃＤＮＡ
の導入を描写する。ｐｓｖ ２発現ベクターはプロウロ
キナーゼの発現を指令するＳＶ４０初朋プ初子プロモー
ターする。プラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
分析によって正しい構造が形成されていることが証明さ
れ、そしてこのプラスミドはｐｃｃ旧６と呼称する。
１ｉｔ）１３Ｔ３細胞からのＰＵＫの分泌はフィブリ
ンプレート分析（プラークマン（１９６７年）、上記）
によってそしてアミド分解活性分析（コーン等（１９８
４年）、上記）によって証明される。
修飾された低分子量プロウロキナーゼｃＤＮＡを含有す
るプラスミドを構築するには図４に示される図式に従い
、それによって図１の１から１４９番のアミノ酸残基が
欠失する。プラスミドｐＣＧ旧６は、Ｂｇｌｌｌ、次い
でＢｓ５ｌｌＩＩで切断されて７．１キロヘースのＢｓ
５ｌｌ ＩＩ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメントおよび３０
６塩基対のＢｓ５ｌｌ■−Ｂｇｌ［フラグメントが生じ
る。Ｂｓ５Ｈ■の制限エンドヌクレアーゼ切断部位は図
１に示される−２０から−ｌのアミノ酸残基を含むシグ
ナルシーケンスの６番目のコドン（図１の−１５のアミ
ノ酸コドン）である。７．１キロベロースのフラグメン
トはゲル電気泳動で確認し、そしてゲル精製する。
るプラスミドを構築するには図４に示される図式に従い
、それによって図１の１から１４９番のアミノ酸残基が
欠失する。プラスミドｐＣＧ旧６は、Ｂｇｌｌｌ、次い
でＢｓ５ｌｌＩＩで切断されて７．１キロヘースのＢｓ
５ｌｌ ＩＩ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメントおよび３０
６塩基対のＢｓ５ｌｌ■−Ｂｇｌ［フラグメントが生じ
る。Ｂｓ５Ｈ■の制限エンドヌクレアーゼ切断部位は図
１に示される−２０から−ｌのアミノ酸残基を含むシグ
ナルシーケンスの６番目のコドン（図１の−１５のアミ
ノ酸コドン）である。７．１キロベロースのフラグメン
トはゲル電気泳動で確認し、そしてゲル精製する。
各々４４個のヌクレオチド長さの２つの合成オリゴヌク
レオチドは上記したようにして合成する。
レオチドは上記したようにして合成する。
合成ヌクレオチドは、既に欠失したシグナルシーケンス
部分に相補的である。合成ヌクレオチドのシーケンスは
次のとおりである： ５ ’ ＣＧ ＣＧＣＣＴＧ ＣＴＴ ＣＴ
ＣＴＧＣＧＴＡ ＣＴＡ ＣＴＣ３Ｇ ＧＡＣＧ
ＡＡ ＧＡＧ ＡＣＧ ＣＡＴ ＧＡＴ Ｃ
ＡＧＧＴＧ ＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧ ＧＧＡ
３ ’ＣＡＣＴＣＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴ
ＣＣＣＴ ＣＴＡ Ｇ ５ ′上記の合成ヌクレオ
チドは、７．１キロベースのフラグメントのＢｓ５ｌｌ
［切断端に相補的なりｓｓＨＩｆ「付着」端および７．
１キロベースのフラグメントのＢｇｌＩｌ切断端に相補
的なりｇｌ■「付着」端を有するように構築される。更
にＳｐｅ Ｉ （ＡＣＴＡ ＧＣ）制限部位が今や相補
的ヌクレオチドシーケンス内に見い出される。ヌクレオ
チドをアニーリングし、次いで７．１キロベースのフラ
グメントに上記したようにして１５゛Ｃで５時間連結さ
せてｐＣＧＭ３８と称する新規プラスミドベクターを創
製し、次いで細胞形質転換を行う、制限エンドヌクレア
ーゼ消化およびＤＮＡ配列化によって、プロウロキナー
ゼの完全なシグナルシーケンス並びにＢｇｌｌｌおよび
Ｂｓ５Ｈ■制限部位が再生されているのでフラグメント
の連結が正しいことが確認され、そして新規で独特のＳ
ｐｅ ｌ制限部位が見い出される。
部分に相補的である。合成ヌクレオチドのシーケンスは
次のとおりである： ５ ’ ＣＧ ＣＧＣＣＴＧ ＣＴＴ ＣＴ
ＣＴＧＣＧＴＡ ＣＴＡ ＣＴＣ３Ｇ ＧＡＣＧ
ＡＡ ＧＡＧ ＡＣＧ ＣＡＴ ＧＡＴ Ｃ
ＡＧＧＴＧ ＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧ ＧＧＡ
３ ’ＣＡＣＴＣＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴ
ＣＣＣＴ ＣＴＡ Ｇ ５ ′上記の合成ヌクレオ
チドは、７．１キロベースのフラグメントのＢｓ５ｌｌ
［切断端に相補的なりｓｓＨＩｆ「付着」端および７．
１キロベースのフラグメントのＢｇｌＩｌ切断端に相補
的なりｇｌ■「付着」端を有するように構築される。更
にＳｐｅ Ｉ （ＡＣＴＡ ＧＣ）制限部位が今や相補
的ヌクレオチドシーケンス内に見い出される。ヌクレオ
チドをアニーリングし、次いで７．１キロベースのフラ
グメントに上記したようにして１５゛Ｃで５時間連結さ
せてｐＣＧＭ３８と称する新規プラスミドベクターを創
製し、次いで細胞形質転換を行う、制限エンドヌクレア
ーゼ消化およびＤＮＡ配列化によって、プロウロキナー
ゼの完全なシグナルシーケンス並びにＢｇｌｌｌおよび
Ｂｓ５Ｈ■制限部位が再生されているのでフラグメント
の連結が正しいことが確認され、そして新規で独特のＳ
ｐｅ ｌ制限部位が見い出される。
プラスミドｐｃＧｌ’１３８はＳｐｅ ｌ 、次いでＫ
ｐｎ ｌで切断されて５．１キロヘースのＳｐｅ Ｉ
Ｋｐｎ ［フラグメントおよび２．１キロベースの
にρｎ１−５ρｅ１フラグメントが生しる。５．１キロ
ヘースのフラグメントは、５．１キロヘースのフラグメ
ントがプロウロキナーゼのシグナルシーケンスの最初の
１４個のコドンを含有するように図１に示される−９か
ら−７のアミノ酸コドン内に位置するＳｐｅ ［の制限
エンドヌクレアーゼ切断部位で始まり、そしてプロウロ
キナーゼ遺伝子の外側に位置するＫｐｎ １部位で終了
する。５．１キロベースのＳｐｅ Ｉ Ｋｐｎ １
フラグメントはゲル電気泳動で６１認して精製する。
ｐｎ ｌで切断されて５．１キロヘースのＳｐｅ Ｉ
Ｋｐｎ ［フラグメントおよび２．１キロベースの
にρｎ１−５ρｅ１フラグメントが生しる。５．１キロ
ヘースのフラグメントは、５．１キロヘースのフラグメ
ントがプロウロキナーゼのシグナルシーケンスの最初の
１４個のコドンを含有するように図１に示される−９か
ら−７のアミノ酸コドン内に位置するＳｐｅ ［の制限
エンドヌクレアーゼ切断部位で始まり、そしてプロウロ
キナーゼ遺伝子の外側に位置するＫｐｎ １部位で終了
する。５．１キロベースのＳｐｅ Ｉ Ｋｐｎ １
フラグメントはゲル電気泳動で６１認して精製する。
同様にして、プラスミドｐＣＧ旧６をＫｐｎ Ｉで切断
し、次いでＢａ１ｌで部分的に切断して１．９キロベー
スのＢａｌ ｌ −Ｋｐｎ ｌフラグメントを生しさせ
る。１．９キロヘースのＢ ［ｌａｌ ｌ −Ｍｐｎ
ｌフラグメントは図１に示されるプロウロキナーゼのア
ミノ酸コドン１５０に位置するＢａ１ｌ制限工ンドヌク
レアーゼ部位で始まり、上記で単離された５、１ キロ
ヘースのＳｐｅ Ｉ −Ｋｐｎ ｌのにρｎ＋制限エン
ドヌクレアーゼ部位で終了する。
し、次いでＢａ１ｌで部分的に切断して１．９キロベー
スのＢａｌ ｌ −Ｋｐｎ ｌフラグメントを生しさせ
る。１．９キロヘースのＢ ［ｌａｌ ｌ −Ｍｐｎ
ｌフラグメントは図１に示されるプロウロキナーゼのア
ミノ酸コドン１５０に位置するＢａ１ｌ制限工ンドヌク
レアーゼ部位で始まり、上記で単離された５、１ キロ
ヘースのＳｐｅ Ｉ −Ｋｐｎ ｌのにρｎ＋制限エン
ドヌクレアーゼ部位で終了する。
２つの合成オリゴヌクレオチド（１つのオリゴヌクレオ
チドは２３個のヌクレオチド長さであり、もう１つのオ
リゴヌクレオチドは１９個のヌクレオチド長さである）
は上記したようにして合成する。
チドは２３個のヌクレオチド長さであり、もう１つのオ
リゴヌクレオチドは１９個のヌクレオチド長さである）
は上記したようにして合成する。
合成ヌクレオチドはシグナルシーケンス３゛からＳｐｅ
１部位の部分（図１に示される−７から−１のアミ
ノ酸コドン）に相補性である。合成ヌクレオチドのシー
ケンスは次のとおりである：５ ′ＣＴＡ ＧＴＣＧＴ
Ｇ ＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧ ＧＧ ３ ’３ ’
ＡＧ ＣＡＣＴＣＧ ＣＴＧ ＡＧ［； ＴＴ
ＣＣＣ５’該ヌクレオチドをアニーリングし、次いで５
．１キロヘースのＳｐａ ｌ −Ｋｐｎ ｌフラグメン
トおよび１．９キロベースのＢａｌ ｌ Ｋｐｎ
ｒフラグメントとの３モル反応で連結する。このフラグ
メントを１５°Ｃで５時間連結させてρＣＧＭ４２と称
するプラスミドベクターを創製し、次いで細胞形質転換
を実施する。低分子量プラスミノーゲン活性化因子ｃＤ
ＮＡを含有するプラスミドｐＣＧＭ４２の構築は、プロ
ウロキナーゼのシグナルシーケンスが完全でありそして
適切な制限エンドヌクレアーゼフラグメントが生じてい
ることを示す制限エンドヌクレアーゼ分析によって証明
される。生物学的特徴決定およびインビボ研究に十分な
量の上記低分子量プラスミノーゲン活性化因子を得るた
めに、新しいプラスミノーゲン活性化因子遺伝子を有す
る発現プラスミドは、カルシウム沈澱法（アール・アク
セル（Ｒ。
１部位の部分（図１に示される−７から−１のアミ
ノ酸コドン）に相補性である。合成ヌクレオチドのシー
ケンスは次のとおりである：５ ′ＣＴＡ ＧＴＣＧＴ
Ｇ ＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧ ＧＧ ３ ’３ ’
ＡＧ ＣＡＣＴＣＧ ＣＴＧ ＡＧ［； ＴＴ
ＣＣＣ５’該ヌクレオチドをアニーリングし、次いで５
．１キロヘースのＳｐａ ｌ −Ｋｐｎ ｌフラグメン
トおよび１．９キロベースのＢａｌ ｌ Ｋｐｎ
ｒフラグメントとの３モル反応で連結する。このフラグ
メントを１５°Ｃで５時間連結させてρＣＧＭ４２と称
するプラスミドベクターを創製し、次いで細胞形質転換
を実施する。低分子量プラスミノーゲン活性化因子ｃＤ
ＮＡを含有するプラスミドｐＣＧＭ４２の構築は、プロ
ウロキナーゼのシグナルシーケンスが完全でありそして
適切な制限エンドヌクレアーゼフラグメントが生じてい
ることを示す制限エンドヌクレアーゼ分析によって証明
される。生物学的特徴決定およびインビボ研究に十分な
量の上記低分子量プラスミノーゲン活性化因子を得るた
めに、新しいプラスミノーゲン活性化因子遺伝子を有す
る発現プラスミドは、カルシウム沈澱法（アール・アク
セル（Ｒ。
１１ｘｅｌ）およびエム・エイチ・ウィグラー（Ｌｌ＋
。
。
匈１ｇ１ｅｒ） 、米国特許第４．３９９．２１６号）
によって選択的マーカーと共に哺乳類細胞培養液中に同
時トランスフェクションする。２倍体ジヒドロフオレー
トリダクターゼ（ＤＩＩＦＲ）ｉｌｔ伝子座を完全に欠
き０Ｇ４４と称されるチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＩＩＯ）株（ジー・ウアラウブ（Ｇ、 １ｌｒｌａｕｐ
）、イー・カス（Ｅ。
によって選択的マーカーと共に哺乳類細胞培養液中に同
時トランスフェクションする。２倍体ジヒドロフオレー
トリダクターゼ（ＤＩＩＦＲ）ｉｌｔ伝子座を完全に欠
き０Ｇ４４と称されるチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＩＩＯ）株（ジー・ウアラウブ（Ｇ、 １ｌｒｌａｕｐ
）、イー・カス（Ｅ。
Ｋａｓ）、エイ・エム・カルーサーズ（Ａ、Ｍ、Ｃａｒ
ｕｔｈｅｒｓ）およびエル エイ・カシン（Ｌ、Ａ、Ｃ
ｈａｓｉｎ） （１９８３）、セル（Ｃｅｌｌ）刹：４
０５〜４１２）を発現用宿主として使用する。組換えＤ
ＩＪＡ工学のマウス［１ＩＩＦＲミニ遺伝子を有するｐ
ｄｈｆｒ２．９と称されるプラスミド（ジー・エフ・ク
ラウス（Ｇ、Ｆ、Ｃｒｏｕｓ） 、アール・エフ・マノ
クエバン（Ｒ，Ｎ、ＭｃＥ￥４ａｎ）およびエム・エル
・ピアソン（Ｍ、Ｌ、Ｐｅａｒｓｏｎ）（１９８３）
、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Ｍｏ１．
Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、） ３ ： ２５７〜２６６）
を同時トランスフェクション用の選択的ベクターとして
使用する。
ｕｔｈｅｒｓ）およびエル エイ・カシン（Ｌ、Ａ、Ｃ
ｈａｓｉｎ） （１９８３）、セル（Ｃｅｌｌ）刹：４
０５〜４１２）を発現用宿主として使用する。組換えＤ
ＩＪＡ工学のマウス［１ＩＩＦＲミニ遺伝子を有するｐ
ｄｈｆｒ２．９と称されるプラスミド（ジー・エフ・ク
ラウス（Ｇ、Ｆ、Ｃｒｏｕｓ） 、アール・エフ・マノ
クエバン（Ｒ，Ｎ、ＭｃＥ￥４ａｎ）およびエム・エル
・ピアソン（Ｍ、Ｌ、Ｐｅａｒｓｏｎ）（１９８３）
、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Ｍｏ１．
Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、） ３ ： ２５７〜２６６）
を同時トランスフェクション用の選択的ベクターとして
使用する。
同時トランスフェクションによって［１ｌＩＦＩｌｌ＋
コロニーは、グリシン、ヒボキサンチンまたはグアニン
を使い尽した成長培地での選択によって得られる。コロ
ニーを取り出し、標準細胞培養Ｔ−フラスコ中に拡げ、
それらの条件培地をエリザ（ＥＬＩＳ＾）アッセイ法を
用いて分析する。エリザで使用される抗体はヒトのプロ
ウロキナーゼに対して生しさせたウサギのポリクローナ
ル抗血清であり、プロウロキナーゼに由来する低分子量
プラスミノーゲン活性化因子と交叉反応する。それ故、
突然変異プラスミノーゲン活性化因子を発現する個々の
コロニーはエリザ法の陽性結果によって確認される。
コロニーは、グリシン、ヒボキサンチンまたはグアニン
を使い尽した成長培地での選択によって得られる。コロ
ニーを取り出し、標準細胞培養Ｔ−フラスコ中に拡げ、
それらの条件培地をエリザ（ＥＬＩＳ＾）アッセイ法を
用いて分析する。エリザで使用される抗体はヒトのプロ
ウロキナーゼに対して生しさせたウサギのポリクローナ
ル抗血清であり、プロウロキナーゼに由来する低分子量
プラスミノーゲン活性化因子と交叉反応する。それ故、
突然変異プラスミノーゲン活性化因子を発現する個々の
コロニーはエリザ法の陽性結果によって確認される。
製造されるタンパク質の生産値を増加させるために、上
記株は次に遺伝子増幅系に付す（アールノエイ・カウフ
マン（Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ）およびジエイ シャー
プ（Ｊ、５ｈａｒｐ） （１９８２） 、ジャーナルオ
ブバイオロジカルケミストリ−１５９： ６０１〜６
２１１ジー・リンゴールド（Ｇ、Ｒｉｎｇｏｌｄ） 、
ビー・デイエックスマン（Ｂ、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ）お
よびエフ・リー（Ｆ。
記株は次に遺伝子増幅系に付す（アールノエイ・カウフ
マン（Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ）およびジエイ シャー
プ（Ｊ、５ｈａｒｐ） （１９８２） 、ジャーナルオ
ブバイオロジカルケミストリ−１５９： ６０１〜６
２１１ジー・リンゴールド（Ｇ、Ｒｉｎｇｏｌｄ） 、
ビー・デイエックスマン（Ｂ、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ）お
よびエフ・リー（Ｆ。
Ｌｅｅ） （＋９８１）、ジャーナルオブモレキュラー
アプライドジエネティノクス（Ｊ、Ｍｏ１．八ｐｐ、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）上；１６５〜１７５）。遺伝子増幅法
には、Ｄ ｉｌ Ｆ Ｒの特異的阻害剤であるメトトレ
キ・セード（ＭＴＸ）の濃度を増加させて細胞を刺激す
ることが含まれる。ＭＴＸに応答して、Ｄ ＩＩ Ｐ
Ｒ遺伝子は増幅され、遺伝子のコピー数は数百または数
千にまで増加する。同時トランスフェクションは通常同
時組込みをもたらすので、突然変′！４ｐｕに遺伝子は
新規に導入されたＤＩＩＦＲ遺伝子で同時に増幅される
。定型的には、ＩＩＴＸ濃度の連続的増加は１０ｎＭ、
５０ｎＭ、０．２マイクロＨ１１マイクロ門、５マイク
ロＨおよび２０マイクロｈである。しかし乍ら、実験の
途中で、生産値がエリザ法で判定して充分であるとき、
この増幅法は終了する。ｌリットル当たり約２から１０
ｍｇの収量が、５０ｎＭのＭＴＸ刺激の段階の後に得ら
れる。全部の増幅法を行うと１す７）ル当たり少なくと
も５０■の値が得られる。
アプライドジエネティノクス（Ｊ、Ｍｏ１．八ｐｐ、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）上；１６５〜１７５）。遺伝子増幅法
には、Ｄ ｉｌ Ｆ Ｒの特異的阻害剤であるメトトレ
キ・セード（ＭＴＸ）の濃度を増加させて細胞を刺激す
ることが含まれる。ＭＴＸに応答して、Ｄ ＩＩ Ｐ
Ｒ遺伝子は増幅され、遺伝子のコピー数は数百または数
千にまで増加する。同時トランスフェクションは通常同
時組込みをもたらすので、突然変′！４ｐｕに遺伝子は
新規に導入されたＤＩＩＦＲ遺伝子で同時に増幅される
。定型的には、ＩＩＴＸ濃度の連続的増加は１０ｎＭ、
５０ｎＭ、０．２マイクロＨ１１マイクロ門、５マイク
ロＨおよび２０マイクロｈである。しかし乍ら、実験の
途中で、生産値がエリザ法で判定して充分であるとき、
この増幅法は終了する。ｌリットル当たり約２から１０
ｍｇの収量が、５０ｎＭのＭＴＸ刺激の段階の後に得ら
れる。全部の増幅法を行うと１す７）ル当たり少なくと
も５０■の値が得られる。
紙分７−壇のプラスミノーゲン活性化因子（図１で示さ
れるアミノ酸コドン１５０で開始）を産生ずる増幅した
ＣＩ（Ｏ細胞（２％のウシ胎児血清中で増殖）の条件培
地（約２．５リツトル）を０．２ミクロンのひだ付きカ
プセルフィルター（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ））でろ過
して微粒子物を除去する。
れるアミノ酸コドン１５０で開始）を産生ずる増幅した
ＣＩ（Ｏ細胞（２％のウシ胎児血清中で増殖）の条件培
地（約２．５リツトル）を０．２ミクロンのひだ付きカ
プセルフィルター（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ））でろ過
して微粒子物を除去する。
ＣＮＢｒ ｉ’ｉ！ｉ性化セファロース４Ｂ（スウェ
ーテンのファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａ
ｒ＋ｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の活性
化樹脂を使用して調製した）にカップリングさせた抗−
ウロキナーゼモノクローナル抗体からなるイムノアフィ
ニティーカラム（１，５ｃｍＸ １４ｃｍ （２５ｍｆ
ｆｉ））を使用して低分子量のプラスミノーゲン活性化
因子を精製する。カラムは２カラム容量のりん酸塩緩衝
食塩水で、次いでｌｏｏｍＭの塩化ナトリウムを含有す
る２カラム容量のｐＨ４，８の１００ｍＭ酢酸ナトリウ
ムで洗浄する。
ーテンのファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａ
ｒ＋ｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の活性
化樹脂を使用して調製した）にカップリングさせた抗−
ウロキナーゼモノクローナル抗体からなるイムノアフィ
ニティーカラム（１，５ｃｍＸ １４ｃｍ （２５ｍｆ
ｆｉ））を使用して低分子量のプラスミノーゲン活性化
因子を精製する。カラムは２カラム容量のりん酸塩緩衝
食塩水で、次いでｌｏｏｍＭの塩化ナトリウムを含有す
る２カラム容量のｐＨ４，８の１００ｍＭ酢酸ナトリウ
ムで洗浄する。
低分子量プラスミノーゲン活性化因子は概ね３カラム容
量のｐｌ＋ ２．０の５０ｍＭグリシンでカラムからン
容出し、その溶出液は２８０ｎＭでの吸収を追跡してモ
ニターする。溶出した低分子量プラスミノーゲン活性化
因子を含をするフラクシヨンをプールする。
量のｐｌ＋ ２．０の５０ｍＭグリシンでカラムからン
容出し、その溶出液は２８０ｎＭでの吸収を追跡してモ
ニターする。溶出した低分子量プラスミノーゲン活性化
因子を含をするフラクシヨンをプールする。
プールの純度５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（」−−・ケイ・レムリ（口、に、Ｌａｅｍｌｉ） （
１９７０）不イチ＋ （Ｎａｔｕｒｅ） ２２ユニ
６８０）で贋り定する。プールの試料は０．１％のＳＤ
Ｓを含有する１２．５％のアクリルアミドゲル上に流し
、クーマシーブルー染色およびシルバー染色の両方によ
って分析する（ジエイ・ヒユーケスホーベン（Ｊ、ＩＩ
ｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ）およびアー／Ｌ／ ＝デルニッ
ク（Ｒ，Ｄｅｒｎｉｃｋ） （１９８５） 、エレクト
ロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
６ ： １０３〜１１２）、プールのタンパク質バンド
の分子量は約３５．０００ダルトンであると推定される
。プールのタンパク質含量はロウリー（Ｌｏｗｒｙ）の
方法（オー・エイチ・ロウリー（０，１１，Ｌｏｗｒｙ
） 、エフ・ジエイ・ローゼンブロー（Ｎ、Ｊ、Ｒｏｓ
ｅｎｂｒｏｕｇｈ） 、エイ・エル・ファル（＾几、Ｆ
ａｒｒ）およびアール・ジエイ・ラント（Ｒ，Ｊ、Ｒａ
ｎｄＬ） （１９５１） 、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカルケミストリー１９３ ： ２６５〜２７５）で
測定する。
（」−−・ケイ・レムリ（口、に、Ｌａｅｍｌｉ） （
１９７０）不イチ＋ （Ｎａｔｕｒｅ） ２２ユニ
６８０）で贋り定する。プールの試料は０．１％のＳＤ
Ｓを含有する１２．５％のアクリルアミドゲル上に流し
、クーマシーブルー染色およびシルバー染色の両方によ
って分析する（ジエイ・ヒユーケスホーベン（Ｊ、ＩＩ
ｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ）およびアー／Ｌ／ ＝デルニッ
ク（Ｒ，Ｄｅｒｎｉｃｋ） （１９８５） 、エレクト
ロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
６ ： １０３〜１１２）、プールのタンパク質バンド
の分子量は約３５．０００ダルトンであると推定される
。プールのタンパク質含量はロウリー（Ｌｏｗｒｙ）の
方法（オー・エイチ・ロウリー（０，１１，Ｌｏｗｒｙ
） 、エフ・ジエイ・ローゼンブロー（Ｎ、Ｊ、Ｒｏｓ
ｅｎｂｒｏｕｇｈ） 、エイ・エル・ファル（＾几、Ｆ
ａｒｒ）およびアール・ジエイ・ラント（Ｒ，Ｊ、Ｒａ
ｎｄＬ） （１９５１） 、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカルケミストリー１９３ ： ２６５〜２７５）で
測定する。
低分子量プラスミノーゲン活性化因子のプラスミンによ
る切断に対する感受性は、プラスミンの存在下および不
存在下で、精製したプラスミノーゲン活性化因子の分別
物をインキュベートして試験する。分析すべき分別物を
ｐＨ７，０に調節し、ｐｌ！８．８の５０ｍＭ ）リス
−Ｈｃｌ 、３８ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％のト
ウィーン−８０（アンセイ緩衝液）で希釈する。重複試
料（１００マイクロリツトル）は更に、総反応混合物１
ｍ１１当たり０．０１２５カゼインユニツトのプラス
ミンの不存在下および存在下でア。
る切断に対する感受性は、プラスミンの存在下および不
存在下で、精製したプラスミノーゲン活性化因子の分別
物をインキュベートして試験する。分析すべき分別物を
ｐＨ７，０に調節し、ｐｌ！８．８の５０ｍＭ ）リス
−Ｈｃｌ 、３８ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％のト
ウィーン−８０（アンセイ緩衝液）で希釈する。重複試
料（１００マイクロリツトル）は更に、総反応混合物１
ｍ１１当たり０．０１２５カゼインユニツトのプラス
ミンの不存在下および存在下でア。
セイ緩衝液で希釈する。反応混合物は３７゛Ｃで１０分
間インキュベートし、次いで１００マイクロリノトルの
カビ（Ｋａｂｉ）基質５２４４４を加えそしてインキュ
ベーションを更に５分間継続する。反応は１００マイク
ロリンドルの５０％氷酢酸を加えて集結させる。
間インキュベートし、次いで１００マイクロリノトルの
カビ（Ｋａｂｉ）基質５２４４４を加えそしてインキュ
ベーションを更に５分間継続する。反応は１００マイク
ロリンドルの５０％氷酢酸を加えて集結させる。
活性は反応混合物の４０５ｎｍでの吸収に比例し、分光
光度計を使用して測定する。プラスミン切断前および後
の低分子量プラスミノーゲン活性化因子の活性は、ウロ
キナーゼ標準（国ｆｉ ＷＩＩＯウロキナーゼ参考製剤
と比軽しで標準化した）を使用した同一のアッセイで生
した標準曲線と比較して測定する。この結果、低分子量
プラスミノーゲン活性化因子製剤は９７％以上の１木鎮
プラスミノーゲン活性化因子からなることが示され、該
活性化因子はプラスミンによって基ｆ ５２４４４に対
しより高いアミド分解活性を有する二本鎖形態に変える
ことができる。
光度計を使用して測定する。プラスミン切断前および後
の低分子量プラスミノーゲン活性化因子の活性は、ウロ
キナーゼ標準（国ｆｉ ＷＩＩＯウロキナーゼ参考製剤
と比軽しで標準化した）を使用した同一のアッセイで生
した標準曲線と比較して測定する。この結果、低分子量
プラスミノーゲン活性化因子製剤は９７％以上の１木鎮
プラスミノーゲン活性化因子からなることが示され、該
活性化因子はプラスミンによって基ｆ ５２４４４に対
しより高いアミド分解活性を有する二本鎖形態に変える
ことができる。
上記実施例は、図１で示されるアミノ酸コドン１５０で
始まるプロウロキナーゼの部分から誘導された修飾低分
子量プラスミノーゲン活性化因子の代わりに図１で示さ
れる１５１番から１５８番のアミノ酸残基のいずれかで
始まるプロウロキナーゼ分子を使用して成巧裡に繰り返
すことができる。
始まるプロウロキナーゼの部分から誘導された修飾低分
子量プラスミノーゲン活性化因子の代わりに図１で示さ
れる１５１番から１５８番のアミノ酸残基のいずれかで
始まるプロウロキナーゼ分子を使用して成巧裡に繰り返
すことができる。
大亙貫（
本願発明の第２の実施例では、アルギニン１５４の７ミ
ノ末端を有する低分子量５ｃｕ−ＰＡは次の方法に従っ
てチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＩＩＯ）で製造
した。ＤＮＡベクター構築に関して、約ｓ、ｌｋｂのＤ
ＮＡフラグメントは上記実施例１に記載したとおり」匹
Ｉおよび」ＬＩ制限エンドヌクレアーゼ消化によってプ
ラスミドρＣＧＭ３８から単離した。次に、プラスミド
四Ｇ旧６のＤＮ八は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
で部分的に切断しく切断所望の部位はアミノ酸残基１６
３おコドン内にある。
ノ末端を有する低分子量５ｃｕ−ＰＡは次の方法に従っ
てチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＩＩＯ）で製造
した。ＤＮＡベクター構築に関して、約ｓ、ｌｋｂのＤ
ＮＡフラグメントは上記実施例１に記載したとおり」匹
Ｉおよび」ＬＩ制限エンドヌクレアーゼ消化によってプ
ラスミドρＣＧＭ３８から単離した。次に、プラスミド
四Ｇ旧６のＤＮ八は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
で部分的に切断しく切断所望の部位はアミノ酸残基１６
３おコドン内にある。
図１参照）、次いで、エンドヌクレアーゼＵ？ＡＩで完
全に切断した。５ｃｕ−ＰＡをコードするＤＮＡの大部
分を含有する約１．８９ｋｂのフラグメントはアガロー
スゲル電気泳動によって単離した。
全に切断した。５ｃｕ−ＰＡをコードするＤＮＡの大部
分を含有する約１．８９ｋｂのフラグメントはアガロー
スゲル電気泳動によって単離した。
単離したこれら２つのフラグメントは、５ｃｕ−ＰＡ分
泌シグナルの残りのコドン（−１から−６のアミノ酸残
基のコドン）および１５４から１６３のアミノ酸残基の
コドンを提供する２つの合成オリゴデオキシヌクレオチ
ドの存在下で一緒に連結する。
泌シグナルの残りのコドン（−１から−６のアミノ酸残
基のコドン）および１５４から１６３のアミノ酸残基の
コドンを提供する２つの合成オリゴデオキシヌクレオチ
ドの存在下で一緒に連結する。
合成オリゴデオキシヌクレオチドのンーケンスは、以下
に示すとおりである。２つのオリゴの末端は、プラスミ
ドｐＣＧＭ３８およびｐｃＧｌ’ｌ１６からの２つのＤ
ＮＡフラグメントの生成中に創製される上１および匡ｏ
Ｒ１と結合性である。
に示すとおりである。２つのオリゴの末端は、プラスミ
ドｐＣＧＭ３８およびｐｃＧｌ’ｌ１６からの２つのＤ
ＮＡフラグメントの生成中に創製される上１および匡ｏ
Ｒ１と結合性である。
単離した２つのＤＮＡフラグメントは、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼの存在下でアニーリングした２つの合成オリゴデオ
キンヌクレオチドと一緒にインキュベートし、得られた
連結ＤＮＡは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩを
アンピシリン耐性に形質転換するために使用した。幾つ
かの形質転換体から単離したプラスミドは制限エンドヌ
クレアーゼ消化で試験し、所望の構造を有するプラスミ
ドをｐＣＧＭ７６と命名した。このプラスミドは、５ｃ
ｕ−ＰＡ分泌シグナルをコード化するＤＮＡに融合した
Ｓν４０初期プロモーターを有しており、この５ｃｕ−
ＰＡ分泌シグナルは次に１５４から４１１ までのアミ
ノ酸残基の５ｃｕ−ＰＡをコド化するＤＮＡに融合され
る。このプラスミドで形質転換したＣｌｌ０細胞はアミ
ノ酸残基アルギニン１５４で始まる、切断された５ｃｕ
−Ｐ＾を分泌する。
ーゼの存在下でアニーリングした２つの合成オリゴデオ
キンヌクレオチドと一緒にインキュベートし、得られた
連結ＤＮＡは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩを
アンピシリン耐性に形質転換するために使用した。幾つ
かの形質転換体から単離したプラスミドは制限エンドヌ
クレアーゼ消化で試験し、所望の構造を有するプラスミ
ドをｐＣＧＭ７６と命名した。このプラスミドは、５ｃ
ｕ−ＰＡ分泌シグナルをコード化するＤＮＡに融合した
Ｓν４０初期プロモーターを有しており、この５ｃｕ−
ＰＡ分泌シグナルは次に１５４から４１１ までのアミ
ノ酸残基の５ｃｕ−ＰＡをコド化するＤＮＡに融合され
る。このプラスミドで形質転換したＣｌｌ０細胞はアミ
ノ酸残基アルギニン１５４で始まる、切断された５ｃｕ
−Ｐ＾を分泌する。
更なる分析用に多量のＮ−末端アルギニンー１５４ｓｃ
ｕ−ＰＡを製造するために、Ｃ１１０細胞への同時トラ
ンスフエフシコン、メトトレキセート増幅およびＣ１１
０細胞の培養、借地からの採取並びに切断された５ｃｕ
−ＰＡの＋ｎ＊の方法は、プラスミドｐＣＧＭ７６をｐ
ｃＧｌ’１４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究
するため更に高度にネｎ製したプラスミノーゲン活性化
因子を生じさせるために第２の精製工程を導入した以外
は上記実施例１に記載した方法に本質的に従った。その
方法は下記実施例７に記載したものと同じであった。
ｕ−ＰＡを製造するために、Ｃ１１０細胞への同時トラ
ンスフエフシコン、メトトレキセート増幅およびＣ１１
０細胞の培養、借地からの採取並びに切断された５ｃｕ
−ＰＡの＋ｎ＊の方法は、プラスミドｐＣＧＭ７６をｐ
ｃＧｌ’１４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究
するため更に高度にネｎ製したプラスミノーゲン活性化
因子を生じさせるために第２の精製工程を導入した以外
は上記実施例１に記載した方法に本質的に従った。その
方法は下記実施例７に記載したものと同じであった。
本願発明のもう１つの実施例では、アルギニン１５６の
アミノ末端を有する低分子４ｉｓｃｕ−ＰＡを、異なる
１対の合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用した点を
除いて、上記実施例２に記載した方法に従ってチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞で製造した。この合成オリゴデ
オキシヌクレオチドのシーケンスは以下に示すとおりで
ある。この２つのオリゴの末端は、プラスミドｐＣＧＭ
３８およびｐＣＧＭ１６からの２つのＤＮＡフラグメン
トの生成中に創製される上ＩおよびＥｃｏＲ１末端と結
合性である。
アミノ末端を有する低分子４ｉｓｃｕ−ＰＡを、異なる
１対の合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用した点を
除いて、上記実施例２に記載した方法に従ってチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞で製造した。この合成オリゴデ
オキシヌクレオチドのシーケンスは以下に示すとおりで
ある。この２つのオリゴの末端は、プラスミドｐＣＧＭ
３８およびｐＣＧＭ１６からの２つのＤＮＡフラグメン
トの生成中に創製される上ＩおよびＥｃｏＲ１末端と結
合性である。
３ ’ ＡＧ ＣＡＣＴＣＧ ＣＴＧ ＡＧＧ
ＴＴＴ ＣＣＣＧＣＧ ＡＡＡ単離した２つのＤＮＡ
フラグメントはＴ４ＤＮＡリガゼの存在下で、アニーリ
ングした２つの合成オリゴデオキノヌクレオチドと一緒
にインキユベートし、そして得られた連結ＤＮＡは大腸
菌株ＨＢＩＯＩをアンビンリン耐性に形質転換するため
に使用した。幾つかの形質転換体から単離したプラスミ
ドは制限エンドヌクレオアーゼ消化で試験し、所望の構
造を有するプラスミドをｐＣＧ）’１７Ｂと命名した。
ＴＴＴ ＣＣＣＧＣＧ ＡＡＡ単離した２つのＤＮＡ
フラグメントはＴ４ＤＮＡリガゼの存在下で、アニーリ
ングした２つの合成オリゴデオキノヌクレオチドと一緒
にインキユベートし、そして得られた連結ＤＮＡは大腸
菌株ＨＢＩＯＩをアンビンリン耐性に形質転換するため
に使用した。幾つかの形質転換体から単離したプラスミ
ドは制限エンドヌクレオアーゼ消化で試験し、所望の構
造を有するプラスミドをｐＣＧ）’１７Ｂと命名した。
このプラスミドは、５ｃｕ−Ｐ＾分泌シグナルをコード
化するＤＮＡに融合したＳＶ４０初期プロモーターを有
しており、この５ｃｕ−Ｐ＾分泌シグナルは次に１５６
から４１１までのアミノ酸残基の５ｃｕ−ＰＡをコード
化するＤＮＡに融合される。このプラスミドで形質転換
したＣｌ１（ＤＩ胞はアミノ酸残基アルギニン−１５６
で始まる、切断された５ｃｕ−ＰＡを分泌する。
化するＤＮＡに融合したＳＶ４０初期プロモーターを有
しており、この５ｃｕ−Ｐ＾分泌シグナルは次に１５６
から４１１までのアミノ酸残基の５ｃｕ−ＰＡをコード
化するＤＮＡに融合される。このプラスミドで形質転換
したＣｌ１（ＤＩ胞はアミノ酸残基アルギニン−１５６
で始まる、切断された５ｃｕ−ＰＡを分泌する。
更なる分析用に多量のＮ−末端アルギニン−１５６ｓｃ
ｕ−ＰＡを製造するために、Ｃｌｌ０ＩＩ胞への同時ト
ランスフェクション、メトトレキセート増幅およびＣ１
１０細胞の培養、培地からの採取並びに切断された５ｃ
ｕ−ＰＡの生成の方法は、プラスミドｐＣＧＭ７８をｐ
ｃＧｌ’１４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究
するため更に高度に精製したプラスミノーゲン活性化因
子を生じさせるために第２のｔｘｔ工程を導入した以外
は上記実施例１に記載した方法に本質的に従った。その
方法は下記実施例７に記載したものと同じであった。
ｕ−ＰＡを製造するために、Ｃｌｌ０ＩＩ胞への同時ト
ランスフェクション、メトトレキセート増幅およびＣ１
１０細胞の培養、培地からの採取並びに切断された５ｃ
ｕ−ＰＡの生成の方法は、プラスミドｐＣＧＭ７８をｐ
ｃＧｌ’１４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究
するため更に高度に精製したプラスミノーゲン活性化因
子を生じさせるために第２のｔｘｔ工程を導入した以外
は上記実施例１に記載した方法に本質的に従った。その
方法は下記実施例７に記載したものと同じであった。
裏隻且土
本願発明のもう１つの実施例では、フェニルアラニン−
１５７のアミノ末端を有する低分子１ｓｃｕＰＡを、異
なる１対の合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用した
点を除いて、上記実施例２に記載した方法に従ってチャ
イニーズハムスター卵巣細胞で製造した。この合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドのシーケンスは以下に示すとお
りである。この２つのオリゴの末端は、プラスミドｐＣ
ＧＭ３８およびｐＣＧＣＣＡらの２つのＤＮＡフラグメ
ントの生成中にｆｉｌＭされるシ徂１およびＥｃｏＲ１
末端と結合性である。
１５７のアミノ末端を有する低分子１ｓｃｕＰＡを、異
なる１対の合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用した
点を除いて、上記実施例２に記載した方法に従ってチャ
イニーズハムスター卵巣細胞で製造した。この合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドのシーケンスは以下に示すとお
りである。この２つのオリゴの末端は、プラスミドｐＣ
ＧＭ３８およびｐＣＧＣＣＡらの２つのＤＮＡフラグメ
ントの生成中にｆｉｌＭされるシ徂１およびＥｃｏＲ１
末端と結合性である。
３ ’ ＡＧ ＣＡＣＴＣＧ ＣＴＧ Ａ
ＧＧ ＴＴＴ ＣＣＧ ＡＡＡ ＴＴＴＴＡＧ Ｔ
ＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＡＡ ５ ’単
離した２つのＤＮＡフラグメントはＴ４ＤＮ＾リガーゼ
の存在下で、アニーリングした２つの合成オリゴデオキ
ンヌクレオチドと一緒にインキュベトし、そして得られ
た連結ＤＮＡは大腸菌株ＨＢＩＯ＋をアンピンリン耐性
に形質転換するために使用した。幾つかの形質転換体か
ら単離したプラスミドは制限エンドヌクレアーゼ消化で
試験し、所望の構造を有するプラスミドをｐＣＧＭ７２
と命名した。このプラスミドは、５ｃｕ−ＰＡ分泌シグ
ナルをコード化するＤＮＡに融合したＳν４０初期プロ
モーターを有しており、この５ｃｕ−ＰＡ分泌シグナル
は次に１５７から４１１までのアミノ酸残基の５ｃｕ−
ＰＡをコード化するＤＮＡに融合される。このプラスミ
ドで形質転換したＣ！１０細胞はアミノ酸残基フェニル
アラニン−１５７で始まる、切断された５ｃｕ−ＰＡを
分泌する。
ＧＧ ＴＴＴ ＣＣＧ ＡＡＡ ＴＴＴＴＡＧ Ｔ
ＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＡＡ ５ ’単
離した２つのＤＮＡフラグメントはＴ４ＤＮ＾リガーゼ
の存在下で、アニーリングした２つの合成オリゴデオキ
ンヌクレオチドと一緒にインキュベトし、そして得られ
た連結ＤＮＡは大腸菌株ＨＢＩＯ＋をアンピンリン耐性
に形質転換するために使用した。幾つかの形質転換体か
ら単離したプラスミドは制限エンドヌクレアーゼ消化で
試験し、所望の構造を有するプラスミドをｐＣＧＭ７２
と命名した。このプラスミドは、５ｃｕ−ＰＡ分泌シグ
ナルをコード化するＤＮＡに融合したＳν４０初期プロ
モーターを有しており、この５ｃｕ−ＰＡ分泌シグナル
は次に１５７から４１１までのアミノ酸残基の５ｃｕ−
ＰＡをコード化するＤＮＡに融合される。このプラスミ
ドで形質転換したＣ！１０細胞はアミノ酸残基フェニル
アラニン−１５７で始まる、切断された５ｃｕ−ＰＡを
分泌する。
更なる分析用に多量のＮ−末端フェニルアラニン１５７
−ｓｃｕ−ＰＡを製造するために、Ｃ１１０細胞への同
時トランスフェクション、メトトレキセート増幅および
ｃｏｏ ｍ胞の培養、培地からの採取並びに切断された
５ｃｕ−ＰＡのｔ（１ｍの方法は、プラスミドρＣＧＭ
７２をｐＣＧＭ４２の代わりに使用し、そしてウサギで
研究するため更に高度に精製したプラスミノーゲン活性
化因子を生じさせるために第２の精製工程を導入した以
外は上記実施例１に記載した方法に本質的に従った。そ
の方法は下記実施例７に記載したものと同じであった。
−ｓｃｕ−ＰＡを製造するために、Ｃ１１０細胞への同
時トランスフェクション、メトトレキセート増幅および
ｃｏｏ ｍ胞の培養、培地からの採取並びに切断された
５ｃｕ−ＰＡのｔ（１ｍの方法は、プラスミドρＣＧＭ
７２をｐＣＧＭ４２の代わりに使用し、そしてウサギで
研究するため更に高度に精製したプラスミノーゲン活性
化因子を生じさせるために第２の精製工程を導入した以
外は上記実施例１に記載した方法に本質的に従った。そ
の方法は下記実施例７に記載したものと同じであった。
１隻爽工
本願発明のもう１つの実施例では、リジン−１５８のア
ミノ末端を有する低分子量５ｃｕ−ＰＡを、異なる１対
の合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用した点を除い
て、上記実施例２に記載した方法に従ってチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞で！ｉ造した。この合成オリゴデオ
キシヌクレオチドのンーケンスは以下に示すとおりであ
る。この２つのオリゴの末端は、プラスミドｐＣＧＭ３
ＢおよびｐＣＧ旧６からの２つのＤＮＡフラグメントの
生成中に創製される５ＰＬＩおよびＥｃｏ ＲＩ末端と
結合性である。
ミノ末端を有する低分子量５ｃｕ−ＰＡを、異なる１対
の合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用した点を除い
て、上記実施例２に記載した方法に従ってチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞で！ｉ造した。この合成オリゴデオ
キシヌクレオチドのンーケンスは以下に示すとおりであ
る。この２つのオリゴの末端は、プラスミドｐＣＧＭ３
ＢおよびｐＣＧ旧６からの２つのＤＮＡフラグメントの
生成中に創製される５ＰＬＩおよびＥｃｏ ＲＩ末端と
結合性である。
ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＡＡ
５ ’単離した２つのＤＮＡフラグメントはＴ４Ｄｌ
ＩＡリガーゼの存在下で、アニーリングした２つの合成
オリゴデオキシヌクレオチドと一緒にインキュベートし
、そして得られた連結ＯＮ雇ま大腸菌株１１８ＩＯＩを
アンピシリン耐性に形質転換するために使用した。幾つ
かの形質転換体から単離したプラスミドはｔ、＋１１５
エンドヌクレアーゼ消化でＸｓし、所望の構造を有する
プラスミドをｐｃＧＭ７０と命名した。このプラスミド
は、５ｃｕ−Ｐ＾分泌シグナルをコード化するＤＮＡに
融合したＳＶ４０初期プロモーターを有しており、この
５ｃｕ−ＰＡ分泌シグナルは次に１５８から４１１ ま
でのアミノ酸残基の５ｃｕ−ＰＡをコード化するＤＮＡ
に融合される。このプラスミドで形質転換したＣ１（０
綱胞はアミノ酸残基リジン−１５８で始まる、切断され
た５ｃｕ−ＰＡを分泌する。
５ ’単離した２つのＤＮＡフラグメントはＴ４Ｄｌ
ＩＡリガーゼの存在下で、アニーリングした２つの合成
オリゴデオキシヌクレオチドと一緒にインキュベートし
、そして得られた連結ＯＮ雇ま大腸菌株１１８ＩＯＩを
アンピシリン耐性に形質転換するために使用した。幾つ
かの形質転換体から単離したプラスミドはｔ、＋１１５
エンドヌクレアーゼ消化でＸｓし、所望の構造を有する
プラスミドをｐｃＧＭ７０と命名した。このプラスミド
は、５ｃｕ−Ｐ＾分泌シグナルをコード化するＤＮＡに
融合したＳＶ４０初期プロモーターを有しており、この
５ｃｕ−ＰＡ分泌シグナルは次に１５８から４１１ ま
でのアミノ酸残基の５ｃｕ−ＰＡをコード化するＤＮＡ
に融合される。このプラスミドで形質転換したＣ１（０
綱胞はアミノ酸残基リジン−１５８で始まる、切断され
た５ｃｕ−ＰＡを分泌する。
更なる分析用に多量のＮ−末端リジン−１５８−ｓｃｕ
−ＰＡを製造するために、ＣＨＯ細胞への同時トランス
フエクション、メトトレキセート増幅およびＣ１１０綱
胞の培養、培地からの採取並びに切断された５ｃｕ−Ｐ
Ａの精製の方法は、プラスミドｐｃＧＭ７０をｐＣＧＭ
４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究するために
更に高度にＩＩＩ製したプラスミノーゲン活性化因子を
生じさせるために第２のｔｉＭ工程を導入した以外は上
記実施例１に記載した方法に本質的に従った。その方法
は下記実施例７に記載したものと同じであった。
−ＰＡを製造するために、ＣＨＯ細胞への同時トランス
フエクション、メトトレキセート増幅およびＣ１１０綱
胞の培養、培地からの採取並びに切断された５ｃｕ−Ｐ
Ａの精製の方法は、プラスミドｐｃＧＭ７０をｐＣＧＭ
４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究するために
更に高度にＩＩＩ製したプラスミノーゲン活性化因子を
生じさせるために第２のｔｉＭ工程を導入した以外は上
記実施例１に記載した方法に本質的に従った。その方法
は下記実施例７に記載したものと同じであった。
スｊ１４Ｊ！ｕ
本願発明のもう１つの実施例では、２７９位にシスティ
ンの代わりにセリンを有する修飾したＮ−末端グルタミ
ン−１５０−ｓｃｕ−Ｐ＾が以下の方法に従ってチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞で生成された。
ンの代わりにセリンを有する修飾したＮ−末端グルタミ
ン−１５０−ｓｃｕ−Ｐ＾が以下の方法に従ってチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞で生成された。
２７９位にシスティンの代わりにセリンを有するＮ末端
グルタミン−１５０−ｓｃｕ−ＰＡの産生を指令するベ
クターを構築するために、プラスミドｐＣＧＭ４２ （
実施例１参照）のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ■Ｌ
Ｉ （所望の部位は５ｃｕ−ＰＡアミノ酸残基２６９用
コドン内にある）（図１参照）で部分的に切断し、次い
でエンドスフレアーゼ造ｗ工１で完全に切断した（図４
参照）、消化で生じたＩ既ね５．５：ＴｈｂのＤＮＡフ
ラグメントはアガロースゲルでの電気泳動によって単離
した。
グルタミン−１５０−ｓｃｕ−ＰＡの産生を指令するベ
クターを構築するために、プラスミドｐＣＧＭ４２ （
実施例１参照）のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ■Ｌ
Ｉ （所望の部位は５ｃｕ−ＰＡアミノ酸残基２６９用
コドン内にある）（図１参照）で部分的に切断し、次い
でエンドスフレアーゼ造ｗ工１で完全に切断した（図４
参照）、消化で生じたＩ既ね５．５：ＴｈｂのＤＮＡフ
ラグメントはアガロースゲルでの電気泳動によって単離
した。
もう１つの消化では、プラスミドｐＣＧＭ４２のＯＮ八
は制限エンドヌクレアーゼＸｂａ Ｉおよび肢Ｌｌで
完全に切断し、全ての５ｃｕ−Ｐ＾コード化ヌクレオチ
ドを有する概ね２．０６ｋｂのＤＮＡフラグメントをア
ガロースゲルでの電気泳動分層によって単離した。
は制限エンドヌクレアーゼＸｂａ Ｉおよび肢Ｌｌで
完全に切断し、全ての５ｃｕ−Ｐ＾コード化ヌクレオチ
ドを有する概ね２．０６ｋｂのＤＮＡフラグメントをア
ガロースゲルでの電気泳動分層によって単離した。
この単なした［ｌＮＡフラグメントは次いでハ虹１エン
ドヌクレアーゼで部分的に消化した（所望の部位は５ｃ
ｕ−Ｐ＾アミノ酸残基２８２のコドン内にあり、単離し
たＸｂａ ｌからＬ２Ｌｌのフラグメントは総計３
ＩＩＩのｈ虹１部位を有する）。所望の１．５３ｋｂ
Ｉ）ＮＡフラグメントはアガロースゲルでの電気泳動に
よって単離した。
ドヌクレアーゼで部分的に消化した（所望の部位は５ｃ
ｕ−Ｐ＾アミノ酸残基２８２のコドン内にあり、単離し
たＸｂａ ｌからＬ２Ｌｌのフラグメントは総計３
ＩＩＩのｈ虹１部位を有する）。所望の１．５３ｋｂ
Ｉ）ＮＡフラグメントはアガロースゲルでの電気泳動に
よって単離した。
単離した５、５３ｋｂおよび１．５３ｋｂのＤＮＡフラ
グメントは、１．５３ｋｂフラグメントのＴＵＬｆ末端
の付着端およびアミノ酸残基２７８〜２８０用コドンの
新しい１１ｉｎｄｌ［［制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を５．５３ｋｂフラグメントの匝１末端に連結させる
プラント末端を提供する、下記のアニーリングした合成
オリゴデオキノヌクレオチド対の存在下で相互に連結し
た。
グメントは、１．５３ｋｂフラグメントのＴＵＬｆ末端
の付着端およびアミノ酸残基２７８〜２８０用コドンの
新しい１１ｉｎｄｌ［［制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を５．５３ｋｂフラグメントの匝１末端に連結させる
プラント末端を提供する、下記のアニーリングした合成
オリゴデオキノヌクレオチド対の存在下で相互に連結し
た。
ＴＣＧ ＡＡＣＧＧＧ ＡＧＣ
５′
この連結混合物は大腸菌株１１８ＩＯＩをアンピシリン
耐性に形質転換させるために使用した。プラスミドＤＮ
Ａは得られた幾つかの形質転換体から単離し、制限エン
ドヌクレアーゼｌ１ｉｎｄｌｌｌで消化して分析し、そ
の後アガロースゲルで電気泳動を行った。幾つかのプラ
スミドは、アミノ酸残基２７８〜２８０用コドン内の新
しい１Ｉｉｎｄ［１部位の存在を示す正しい制限エンド
ヌクレアーゼ消化パターンを有しており（上記オリゴデ
オキンヌクレオチ１′のシーケンス参照；」凰ｄｌ［１
部位＋ ５ ’ ＴＴＣＧＡＡ３ ’ ）、そしてジブ
オキソ１￥終結化法（イー・ワイ・チェノ（Ｅ、Ｙ、Ｃ
ｈｅｎ）およびピー・エイチ・ソーバーブ（Ｐ、１１．
Ｓｅｅｂｕｒｇ）、１９８５年、デイ−・エフ・ニー
（ＤＮＡ）土：１６５〜１７５）によってＯＮ＾シーケ
ンスを決定して、ＤＮＡ シーケンスが所望の変化をし
ていることが確認された。このプラスミドはρＣＧＭ８
４と命名した。
耐性に形質転換させるために使用した。プラスミドＤＮ
Ａは得られた幾つかの形質転換体から単離し、制限エン
ドヌクレアーゼｌ１ｉｎｄｌｌｌで消化して分析し、そ
の後アガロースゲルで電気泳動を行った。幾つかのプラ
スミドは、アミノ酸残基２７８〜２８０用コドン内の新
しい１Ｉｉｎｄ［１部位の存在を示す正しい制限エンド
ヌクレアーゼ消化パターンを有しており（上記オリゴデ
オキンヌクレオチ１′のシーケンス参照；」凰ｄｌ［１
部位＋ ５ ’ ＴＴＣＧＡＡ３ ’ ）、そしてジブ
オキソ１￥終結化法（イー・ワイ・チェノ（Ｅ、Ｙ、Ｃ
ｈｅｎ）およびピー・エイチ・ソーバーブ（Ｐ、１１．
Ｓｅｅｂｕｒｇ）、１９８５年、デイ−・エフ・ニー
（ＤＮＡ）土：１６５〜１７５）によってＯＮ＾シーケ
ンスを決定して、ＤＮＡ シーケンスが所望の変化をし
ていることが確認された。このプラスミドはρＣＧＭ８
４と命名した。
更なる分析用に２７９位にシスティンの代わりにセリン
を有する、多量の■−末端グルタミンー１５０５ＣＬＩ
−ＰＡを製造するために、Ｃ１１０細胞への同時トラン
スフェクノヨン、メトトレキセート増幅およびＣＨＯ細
胞の培養、培地からの採取並びに切断された５ｃｕ−Ｐ
Ａの精製の方法は、プラスミドｐＣＧＭ８４をｐＣＧＭ
４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究するため更
に高度に精製したプラスミノーゲン活性化因子を生じさ
せるために第２の精製工程を導入した以外は上記実施例
１に記載した方法に本質的に従った。その方法は下記実
施例７に記載したものと同しであった。
を有する、多量の■−末端グルタミンー１５０５ＣＬＩ
−ＰＡを製造するために、Ｃ１１０細胞への同時トラン
スフェクノヨン、メトトレキセート増幅およびＣＨＯ細
胞の培養、培地からの採取並びに切断された５ｃｕ−Ｐ
Ａの精製の方法は、プラスミドｐＣＧＭ８４をｐＣＧＭ
４２の代わりに使用し、そしてウサギで研究するため更
に高度に精製したプラスミノーゲン活性化因子を生じさ
せるために第２の精製工程を導入した以外は上記実施例
１に記載した方法に本質的に従った。その方法は下記実
施例７に記載したものと同しであった。
尖施貫ユ
本願発明のもう１つの実施例では、前期実施例の、ミリ
グラム量の切断されたｌ＊鎖プラスミノーゲン活性化因
子は、Ｃｌｌ０細胞によって産生じ、精製し、そして分
子サイズおよび合成ペプチド基質Ｓ−２４４４（５−２
４４４（Ｇｌｐ−Ｇｌｙ−Ａｒ ；カビ・ビトラム（Ｋ
ａｂｉ−Ｖｉ ｔｒｕｍ、スウエ−−ｉ’ ７０’）ス
） ｙ ’） ホＪｌ／ム）にλ・１する特異的活性に
関して特ｉ枚を決定した。
グラム量の切断されたｌ＊鎖プラスミノーゲン活性化因
子は、Ｃｌｌ０細胞によって産生じ、精製し、そして分
子サイズおよび合成ペプチド基質Ｓ−２４４４（５−２
４４４（Ｇｌｐ−Ｇｌｙ−Ａｒ ；カビ・ビトラム（Ｋ
ａｂｉ−Ｖｉ ｔｒｕｍ、スウエ−−ｉ’ ７０’）ス
） ｙ ’） ホＪｌ／ム）にλ・１する特異的活性に
関して特ｉ枚を決定した。
プラスミドｐＣＧＭ４２、ｐｃｃ門７０、ｐｃＧ７１７
２、ｐＣＧＭ７６、ｐｃＧｌ’１７ＢおよびｐＣＧＭ８
４は各々、２倍体Ｄ）ＩＦＲ遺伝子座を完全に欠いてい
るチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＧ４４ （ジー
・ウアラウプ、イー・カス、エイ エム・カルーサーズ
およびエル・エイ・カシン、１９８３年、セルηメ４０
５〜４１２）を同時形質転換するために選択可能なマー
カーを供給する別のプラスミドと共に使用した。同時形
質転換した選Ｉ尺可能なフ゛ラスミドはｐｓν２−ＤＨ
Ｆｌ’ｌ （ニス・サフ′ラマニ（Ｓ、Ｓｕｂｒａｍ
ａｎｉ） 、アール・マリガン（Ｒ。
２、ｐＣＧＭ７６、ｐｃＧｌ’１７ＢおよびｐＣＧＭ８
４は各々、２倍体Ｄ）ＩＦＲ遺伝子座を完全に欠いてい
るチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＧ４４ （ジー
・ウアラウプ、イー・カス、エイ エム・カルーサーズ
およびエル・エイ・カシン、１９８３年、セルηメ４０
５〜４１２）を同時形質転換するために選択可能なマー
カーを供給する別のプラスミドと共に使用した。同時形
質転換した選Ｉ尺可能なフ゛ラスミドはｐｓν２−ＤＨ
Ｆｌ’ｌ （ニス・サフ′ラマニ（Ｓ、Ｓｕｂｒａｍ
ａｎｉ） 、アール・マリガン（Ｒ。
Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびピー・ハーグ（Ｐ、Ｂｅｒｇ
）、１９８１年、モレキュラーアンドセルラーバイオロ
ジー土：８５４−８６４）かまたはｐｄｈｆｒ２．９
（ジー・エフ・クラウス、アール・エフ・マンクエバン
およびエム・エル・ピアソン、１９８３年、モレキュラ
ーアンドセルラーバイオロジー３ ： ２５７〜２６６
）かのいずれかであった。同時形質転換はエフ・エル・
グラハム（Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ）およびパンデルニブ
（νａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）のカルシウム沈降法（１９７
３年、パイアラロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２ ：
４５６−４６７）によって達成した。形質転換体は、１
０％のウシ胎児血清をｔＩＭ給しているがグリシン、ヒ
ポキサンチンおよびチミジンを欠いているハム（ｌｌａ
ｍ）のＦ１２培地で選択したゆプラスミノーゲン活性化
因子の発現レベルを高めるために、得られた同時形質転
換体は、メトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度を増加させ
乍ら細胞を刺激する段階的遺伝子増幅法Ｃアール・カウ
フマン（Ｒ，Ｋａｕｆｍａｎ）およびビー・シャープ（
Ｐ、５ｈａｒｐ）、１９８２年、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．旧ｏＩＨ５９
： ６０１−６２１）を行った。
）、１９８１年、モレキュラーアンドセルラーバイオロ
ジー土：８５４−８６４）かまたはｐｄｈｆｒ２．９
（ジー・エフ・クラウス、アール・エフ・マンクエバン
およびエム・エル・ピアソン、１９８３年、モレキュラ
ーアンドセルラーバイオロジー３ ： ２５７〜２６６
）かのいずれかであった。同時形質転換はエフ・エル・
グラハム（Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ）およびパンデルニブ
（νａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）のカルシウム沈降法（１９７
３年、パイアラロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２ ：
４５６−４６７）によって達成した。形質転換体は、１
０％のウシ胎児血清をｔＩＭ給しているがグリシン、ヒ
ポキサンチンおよびチミジンを欠いているハム（ｌｌａ
ｍ）のＦ１２培地で選択したゆプラスミノーゲン活性化
因子の発現レベルを高めるために、得られた同時形質転
換体は、メトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度を増加させ
乍ら細胞を刺激する段階的遺伝子増幅法Ｃアール・カウ
フマン（Ｒ，Ｋａｕｆｍａｎ）およびビー・シャープ（
Ｐ、５ｈａｒｐ）、１９８２年、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．旧ｏＩＨ５９
： ６０１−６２１）を行った。
適切な高レベルのプラスミノーゲン活性化因子を産生ず
るクローンは、高レベルのＭＴＸに耐性のある細胞培養
物のアミド分解アッセイによって＆Ｙ１認した。クロー
ンは、チミジンおよびヒポキサンチンを欠くが１０％の
ウシ胎児血清を補給した１：１のＤＭＥ ： Ｆ１２か
らなる培地中で増殖させた。Ｔ−フラスコおよびローラ
ーボトル中で増殖させた後、２から２ｃｕｇ／Ｉｄ、の
間のプラスミノーゲン活性化因子を含有する条件培地が
得られた。
るクローンは、高レベルのＭＴＸに耐性のある細胞培養
物のアミド分解アッセイによって＆Ｙ１認した。クロー
ンは、チミジンおよびヒポキサンチンを欠くが１０％の
ウシ胎児血清を補給した１：１のＤＭＥ ： Ｆ１２か
らなる培地中で増殖させた。Ｔ−フラスコおよびローラ
ーボトル中で増殖させた後、２から２ｃｕｇ／Ｉｄ、の
間のプラスミノーゲン活性化因子を含有する条件培地が
得られた。
突然変異プラスミノーゲン活性化因子は、動物モデル系
での試験に適切な純度を確保するために特別の工程を加
えた以外は実施例１に記載した方法と本質的に同様にし
て精製した。この方法は次のとおりであった。条件培地
は０．２ ミクロンのひだ付きカプセルフィルター（ゲ
ルマン、ミシガン州アンアーハー）でろ過して微粒子物
を除去し、滴定してｐｌ！７としそして１０ｍＭリン酸
ナトリウム（ａｌ１７．４） 、Ｏ，１４Ｍ塩化ナトリ
ウム、ｌ０ＫＩＩＩ ７ｍｌアプロチニン（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ） 、ミズーリー州セントルイス）からなる緩
衝液で平衡化した抗−５ｃｕ−ＰＡ−セファロース（セ
ファロース各１ ｍＱに抗−５Ｃｕ−ＰＡモノクローナ
ル抗体２０ｍｇが結合）のカラムに適用した。平衡緩衝
液で洗浄した後、カラムは５０ｍＭのグリシン（ρ１１
２）で展開して抗体−セファロースと結合していたタン
パク質を溶出した。
での試験に適切な純度を確保するために特別の工程を加
えた以外は実施例１に記載した方法と本質的に同様にし
て精製した。この方法は次のとおりであった。条件培地
は０．２ ミクロンのひだ付きカプセルフィルター（ゲ
ルマン、ミシガン州アンアーハー）でろ過して微粒子物
を除去し、滴定してｐｌ！７としそして１０ｍＭリン酸
ナトリウム（ａｌ１７．４） 、Ｏ，１４Ｍ塩化ナトリ
ウム、ｌ０ＫＩＩＩ ７ｍｌアプロチニン（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ） 、ミズーリー州セントルイス）からなる緩
衝液で平衡化した抗−５ｃｕ−ＰＡ−セファロース（セ
ファロース各１ ｍＱに抗−５Ｃｕ−ＰＡモノクローナ
ル抗体２０ｍｇが結合）のカラムに適用した。平衡緩衝
液で洗浄した後、カラムは５０ｍＭのグリシン（ρ１１
２）で展開して抗体−セファロースと結合していたタン
パク質を溶出した。
溶出液は、１／４容量の１００ ｍＭ酢酸ナトリウム（
ｐ）１５．３＞、１Ｍ塩化ナトリウムで希釈し、ｐ）１
５．３に調節し、そして２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐｌ
＋５．３）、０．１Ｍ塩化ナトリウムからなる緩衝液で
平衡化したρ−アミノヘンズアミジンーセファロースー
■カラム（コラボレイティブリサーチインコーボレイテ
ィ・ンド、マサチューセン゛ン州へソドフォード）に適
用した。カラムを流れるタンパク質は２８０ｎｍでの吸
収度でモニターし、採集しそして更なる分析用に約１■
／ＩＩＪｌにａ！Ｉした。
ｐ）１５．３＞、１Ｍ塩化ナトリウムで希釈し、ｐ）１
５．３に調節し、そして２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐｌ
＋５．３）、０．１Ｍ塩化ナトリウムからなる緩衝液で
平衡化したρ−アミノヘンズアミジンーセファロースー
■カラム（コラボレイティブリサーチインコーボレイテ
ィ・ンド、マサチューセン゛ン州へソドフォード）に適
用した。カラムを流れるタンパク質は２８０ｎｍでの吸
収度でモニターし、採集しそして更なる分析用に約１■
／ＩＩＪｌにａ！Ｉした。
プラスミノーゲン活性化因子の純度およびその分子サイ
ズはレムリ（１９７０年：上記）の方法に従ってＳＤＳ
を含有するポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によっ
て測定した。Ｎ−末端グルタミン１５０ 、Ｎ−末端ア
ルギニン１５４ 、Ｎ−末端アルギニン１５６ 、Ｎ−
末端フェニルアラニン１５７およびＮ−末端リジン１５
８の１本鎖プラスミノーゲン活性化因子並びに２７９位
にシスティンの代わりにセリンを有するＮ−末端グルタ
ミン−１５０の１本鎖プラスミノーゲン活性化因子は全
て、約３５，０００の分子量と一致する速度で移動し、
一方ＴＣＬ−５９８細胞（コーン等、１９８４年、上記
）から単離した完全な長さの５ｃｕ−ＰＡは約５０，０
００の分子量と一致する移動を示した。このサイズの違
いは上記実施例１から６で意図した八−鎖の大部分の損
失と一致する。
ズはレムリ（１９７０年：上記）の方法に従ってＳＤＳ
を含有するポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によっ
て測定した。Ｎ−末端グルタミン１５０ 、Ｎ−末端ア
ルギニン１５４ 、Ｎ−末端アルギニン１５６ 、Ｎ−
末端フェニルアラニン１５７およびＮ−末端リジン１５
８の１本鎖プラスミノーゲン活性化因子並びに２７９位
にシスティンの代わりにセリンを有するＮ−末端グルタ
ミン−１５０の１本鎖プラスミノーゲン活性化因子は全
て、約３５，０００の分子量と一致する速度で移動し、
一方ＴＣＬ−５９８細胞（コーン等、１９８４年、上記
）から単離した完全な長さの５ｃｕ−ＰＡは約５０，０
００の分子量と一致する移動を示した。このサイズの違
いは上記実施例１から６で意図した八−鎖の大部分の損
失と一致する。
Ｎ−末端にグルタミン１５０、アルギニン１５４、アル
ギニン１５６、リジン１５８、および２７９位にシステ
ィンの代わりにセリンを有するグルタミン１５０ををす
る切断された低分子量プラスミノーゲン活性化因子のア
ミド分解活性はヒトプラスミン（ＧＣＣ１０９０、緑十
字Ｉｎ（Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｒｐ）、日本の
大阪）でのインキュベーションの前および後に合成ペプ
チド１ｉｓ−２４４４（カビビトラム、スウェーデン）
ヲ使用して測定した。このアッセイはコーン等（１９８
４年、上記）が記載したように実施した。
ギニン１５６、リジン１５８、および２７９位にシステ
ィンの代わりにセリンを有するグルタミン１５０ををす
る切断された低分子量プラスミノーゲン活性化因子のア
ミド分解活性はヒトプラスミン（ＧＣＣ１０９０、緑十
字Ｉｎ（Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｒｐ）、日本の
大阪）でのインキュベーションの前および後に合成ペプ
チド１ｉｓ−２４４４（カビビトラム、スウェーデン）
ヲ使用して測定した。このアッセイはコーン等（１９８
４年、上記）が記載したように実施した。
精製した各プラスミノーゲン活性化因子製剤のクンバク
［１度はロウリ−（１９５１年、上記）の方法によって
測定した。これらの測定は表１に示し、その際それらは
プラスミン処理前後の特異的活性として表す。
［１度はロウリ−（１９５１年、上記）の方法によって
測定した。これらの測定は表１に示し、その際それらは
プラスミン処理前後の特異的活性として表す。
以下余白
表 １
活性化因子
５ｃｕ−ＰＡ
Ｎ−ＧＩｎ１５０−ｓｃｕ−ＰＡ
プラスミン 処理 ＋プラスミン 処理＜＋ ０
００ １４５ ０００ｄ、０００ １
７２，００Ｏ Ｎ−Ａｒｇ１５４−ｓｃｕ−ＰＡ ＜１．００
０ １２０．００ＯＮ−ａｒｇ１５６−ｓｃｕ−
ＰＡ ＜１．０００ １３２．００ＯＮ
−Ｉｙｓ１５８−ｓｃｕ−ＰＡ ＜１．０００
１４０．０００これらの結果によって、本願発明の
低分子量プラスミノーゲン活性化因子がブラスミンイン
キュヘーションに対してＴＣＬ−５９８細胞から得た完
全な長さの天然５ｃｕ−ＰＡと同し様に応答することが
証明される。完全な長さの天然５ｃｕ−ＰＡと同様に、
これらの新規活性化因子は合成基質Ｓ−２４４４に対し
てプラスミン処理後にかなり一層活性のように思われる
。それ故、これらの新規活性化因子はより小さいタンパ
ク質であるが、このプラスミン「活性化」の特性を完全
な長さの天然５ｃｕ−ＰＡと同じく有しており、そして
プラスミン処理前には比較的不活性なチモーゲンである
と思われる。
００ １４５ ０００ｄ、０００ １
７２，００Ｏ Ｎ−Ａｒｇ１５４−ｓｃｕ−ＰＡ ＜１．００
０ １２０．００ＯＮ−ａｒｇ１５６−ｓｃｕ−
ＰＡ ＜１．０００ １３２．００ＯＮ
−Ｉｙｓ１５８−ｓｃｕ−ＰＡ ＜１．０００
１４０．０００これらの結果によって、本願発明の
低分子量プラスミノーゲン活性化因子がブラスミンイン
キュヘーションに対してＴＣＬ−５９８細胞から得た完
全な長さの天然５ｃｕ−ＰＡと同し様に応答することが
証明される。完全な長さの天然５ｃｕ−ＰＡと同様に、
これらの新規活性化因子は合成基質Ｓ−２４４４に対し
てプラスミン処理後にかなり一層活性のように思われる
。それ故、これらの新規活性化因子はより小さいタンパ
ク質であるが、このプラスミン「活性化」の特性を完全
な長さの天然５ｃｕ−ＰＡと同じく有しており、そして
プラスミン処理前には比較的不活性なチモーゲンである
と思われる。
裏施貫主
本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子がイン
ビトロでフィブリン凝塊の溶解を触媒し得る１例として
、Ｎ−末端グルタミン１５０−ｓｃｕ−ＰＡおよび２７
９位にシスティンの代わりにセリンを有するＮ−末端グ
ルタミン１５０−ｓｃｕ−ＰＡをヴイー・ダレウィッチ
、アール・パネル（Ｒ，Ｐａｎｎｅｌｌ） 、ニス・ル
イ（Ｓ、Ｌｏｕｉｅ） 、ピー・ケリー（Ｐ、Ｋｅｌ
＋ｅｙ）、アール・エル・サブイスおよびアール・グリ
ーンリー（１９８３年、ザ・ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスチゲーソヨン（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖ
ｅｓｔ、）７３ ： １７３１〜１７３９）のインビト
ロでのフィブリン凝塊溶解モデルで試験した。簡単に言
うと、１．５ｕＣｉ ＩＢＲＩＮ（’”ｌ１ｊｉ識フィ
ブリン；アマーシャムコーボレーンヨン（Ａａ＋ｅｒｓ
ｈａｍ Ｃｏｒｐ、）、イリノイ州アーリントンハイツ
）を含有する、クエン酸を加えたヒト血漿の分別物に２
０ｍｒＩの塩化カルシウムおよび１０μＰのトロンボプ
ラスチン（Ｔ−０２６３；シグマ、ミズーリー州セント
ルイス）を加え、５ｍｍ（内径）のガラス管中３７゛Ｃ
で４時間インキュベートした。凝塊をガラス管から取り
出し、切断されたプラスミノーゲン活性化因子または対
照として約１０から５０ｎＭの濃度の精製した野性型５
ｃｕ−ＰＡを含有する２、５ ｄのブー ルしたヒト血
漿中に浸した。溶解は、溶解性の ２５１−フィブリン分解生成物の放出をモニターして定
量した。効力は表２に示されるように凝塊溶解の程度に
よって判定し、そしてヒト細胞株ＴＣＬ−５９８（コレ
ン等、１９８４年、上記）から得た天然の５ｃｕ−ＰＡ
で得られた値と比較した。切断されたプラスミノーゲン
・活性化因子は表２に示される野性型の５ｃｕ−ＰＡの
効力と本質的に同等の効力を示す。
ビトロでフィブリン凝塊の溶解を触媒し得る１例として
、Ｎ−末端グルタミン１５０−ｓｃｕ−ＰＡおよび２７
９位にシスティンの代わりにセリンを有するＮ−末端グ
ルタミン１５０−ｓｃｕ−ＰＡをヴイー・ダレウィッチ
、アール・パネル（Ｒ，Ｐａｎｎｅｌｌ） 、ニス・ル
イ（Ｓ、Ｌｏｕｉｅ） 、ピー・ケリー（Ｐ、Ｋｅｌ
＋ｅｙ）、アール・エル・サブイスおよびアール・グリ
ーンリー（１９８３年、ザ・ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスチゲーソヨン（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖ
ｅｓｔ、）７３ ： １７３１〜１７３９）のインビト
ロでのフィブリン凝塊溶解モデルで試験した。簡単に言
うと、１．５ｕＣｉ ＩＢＲＩＮ（’”ｌ１ｊｉ識フィ
ブリン；アマーシャムコーボレーンヨン（Ａａ＋ｅｒｓ
ｈａｍ Ｃｏｒｐ、）、イリノイ州アーリントンハイツ
）を含有する、クエン酸を加えたヒト血漿の分別物に２
０ｍｒＩの塩化カルシウムおよび１０μＰのトロンボプ
ラスチン（Ｔ−０２６３；シグマ、ミズーリー州セント
ルイス）を加え、５ｍｍ（内径）のガラス管中３７゛Ｃ
で４時間インキュベートした。凝塊をガラス管から取り
出し、切断されたプラスミノーゲン活性化因子または対
照として約１０から５０ｎＭの濃度の精製した野性型５
ｃｕ−ＰＡを含有する２、５ ｄのブー ルしたヒト血
漿中に浸した。溶解は、溶解性の ２５１−フィブリン分解生成物の放出をモニターして定
量した。効力は表２に示されるように凝塊溶解の程度に
よって判定し、そしてヒト細胞株ＴＣＬ−５９８（コレ
ン等、１９８４年、上記）から得た天然の５ｃｕ−ＰＡ
で得られた値と比較した。切断されたプラスミノーゲン
・活性化因子は表２に示される野性型の５ｃｕ−ＰＡの
効力と本質的に同等の効力を示す。
以下余白
表２
プラスミノーゲン 投与量溶 解
活性化囚子 （μｇ／ｍ１） （４時間後の％）
１．２ ８Ｏ Ｎ−Ｇｌｎ１５０−ｓｃｕ−ＰＡ ２．４
１００Ｎ−ＧＩｎ１５０−ｓｃ
ｕ−ＰＡ ２．０ １００（ｓ
ｅｒ ２７９） ３．０
１００ウサギでのインビボの凝塊熔解の効力およ
びフィブリン特異性を本願発明の低分子量プラスミノー
ゲン活性化因子の１つについて証明した。本願発明の他
の低分子量プラスミノーゲン活性化因子はこのアンセイ
系で同様に作用するものと思われる。実施例７の、精製
した突然変異プラスミノーゲン活性化因子に一末端グル
タミン＋５Ｏ−ｓｃｕ−ＰＡは、デイ−・コレン（Ｄ、
Ｃｏ１１ｅｎ）、ジエイ・エム・スタソセン（Ｊ、Ｍ、
５Ｌａｓｓｅｎ）およびエム・ヴエルストレート（Ｍ、
ＶｅｒｓＬｒａｅｔｅ） （１９８３年、ザ・ジャーナ
ルオブ・クリニカル・インへスチゲーション互：３６８
〜３７６）のプロトコールに従ってウサギ頚静脈血栓症
モデルでの凝塊溶解の効力について試験した。
１．２ ８Ｏ Ｎ−Ｇｌｎ１５０−ｓｃｕ−ＰＡ ２．４
１００Ｎ−ＧＩｎ１５０−ｓｃ
ｕ−ＰＡ ２．０ １００（ｓ
ｅｒ ２７９） ３．０
１００ウサギでのインビボの凝塊熔解の効力およ
びフィブリン特異性を本願発明の低分子量プラスミノー
ゲン活性化因子の１つについて証明した。本願発明の他
の低分子量プラスミノーゲン活性化因子はこのアンセイ
系で同様に作用するものと思われる。実施例７の、精製
した突然変異プラスミノーゲン活性化因子に一末端グル
タミン＋５Ｏ−ｓｃｕ−ＰＡは、デイ−・コレン（Ｄ、
Ｃｏ１１ｅｎ）、ジエイ・エム・スタソセン（Ｊ、Ｍ、
５Ｌａｓｓｅｎ）およびエム・ヴエルストレート（Ｍ、
ＶｅｒｓＬｒａｅｔｅ） （１９８３年、ザ・ジャーナ
ルオブ・クリニカル・インへスチゲーション互：３６８
〜３７６）のプロトコールに従ってウサギ頚静脈血栓症
モデルでの凝塊溶解の効力について試験した。
フィブリン熔解のフィブリン選択性は、標準アッセイ（
エイ・クラウス（Ａ、ＣＩａｕｓｓ）、１９５７年、ア
クタヘマトロジ力（ＡｃＬａ Ｈｅｎ＋ａｔｏ１．）
１７ ： ２３７〜２４６；シー・ヴエルミレン（Ｖｅ
ｒｍｙｌｅｎ Ｃ，） 、アール・エイ・ドブレカ（Ｒ
，Ａ 、 ｄｅｖｒｅｋｅｒ）およびエム・ヴエルスト
レート、１９６３年、クリニカケミカ・アクタ（ＣＩｉ
ｎｉｃａＣｈｅｍｉｃｓ Ａｃｔａ） ８ ：４１８
〜４２４ ；ジエイ・エデイ（Ｊ、Ｅｄｙ）、エフ・
ドクノク（Ｐ 、 Ｄｅｃｏｏｋ）およびデイ−・コレ
ン、１９７６年、トロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏ＋
ｉｂ、Ｒｅｓ、） ８ ： ５１３〜５１Ｂ ）によ
って残有する血漿フィブリノーゲンおよびアルファー２
−抗プラスミン値を測定することによって決定した。驚
いたことには、切断されたプラスミノーゲン活性化因子
は野性型５ｃｕ−ＰＡの効力とほぼ等しい効力（凝塊溶
解％）を示し、そしてその作用におけるフィブリン選択
性（残有するフィブリノーゲンおよびアルファー２＝抗
プラスミン％）は天然の野性型５ｃｕ−ＰＡのそれに匹
敵するＪ＋ｚ ｊたは超えていた（表３参照）。
エイ・クラウス（Ａ、ＣＩａｕｓｓ）、１９５７年、ア
クタヘマトロジ力（ＡｃＬａ Ｈｅｎ＋ａｔｏ１．）
１７ ： ２３７〜２４６；シー・ヴエルミレン（Ｖｅ
ｒｍｙｌｅｎ Ｃ，） 、アール・エイ・ドブレカ（Ｒ
，Ａ 、 ｄｅｖｒｅｋｅｒ）およびエム・ヴエルスト
レート、１９６３年、クリニカケミカ・アクタ（ＣＩｉ
ｎｉｃａＣｈｅｍｉｃｓ Ａｃｔａ） ８ ：４１８
〜４２４ ；ジエイ・エデイ（Ｊ、Ｅｄｙ）、エフ・
ドクノク（Ｐ 、 Ｄｅｃｏｏｋ）およびデイ−・コレ
ン、１９７６年、トロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏ＋
ｉｂ、Ｒｅｓ、） ８ ： ５１３〜５１Ｂ ）によ
って残有する血漿フィブリノーゲンおよびアルファー２
−抗プラスミン値を測定することによって決定した。驚
いたことには、切断されたプラスミノーゲン活性化因子
は野性型５ｃｕ−ＰＡの効力とほぼ等しい効力（凝塊溶
解％）を示し、そしてその作用におけるフィブリン選択
性（残有するフィブリノーゲンおよびアルファー２＝抗
プラスミン％）は天然の野性型５ｃｕ−ＰＡのそれに匹
敵するＪ＋ｚ ｊたは超えていた（表３参照）。
これらの結果により、本願発明の低分子量プラスミノー
ゲン活性化因子Ｎ−グルタミン１５０−ｓｃｕ−ＰＡが
ウサギの静脈血栓症モデル系での凝塊溶解でＴＣＭ−５
９８細胞からの天然の完全な長さの５ｃｕ−ＰＡと同じ
様にを効であること並びにＵ−グルタミン１５０ｓｃｕ
−ＰＡがフィブリン選択的に作用し、天然の５ｃｕＰＡ
と少なくとも同程度にそして多分−層より高度に循環フ
ィブリノーゲンおよびアルファー２−抗プラスミンに害
を与えないことが証明される。
ゲン活性化因子Ｎ−グルタミン１５０−ｓｃｕ−ＰＡが
ウサギの静脈血栓症モデル系での凝塊溶解でＴＣＭ−５
９８細胞からの天然の完全な長さの５ｃｕ−ＰＡと同じ
様にを効であること並びにＵ−グルタミン１５０ｓｃｕ
−ＰＡがフィブリン選択的に作用し、天然の５ｃｕＰＡ
と少なくとも同程度にそして多分−層より高度に循環フ
ィブリノーゲンおよびアルファー２−抗プラスミンに害
を与えないことが証明される。
以下余白
表 ３
無し
０ １３ ９＋／−０，８９０＋／−２，１８９＋／−
２，７ｓｃｕ−ＰＡ” １．０ ２ ３３＋／−３
，６５６＋／−４０７８＋／４．４２．０ ３ ４２
＋／−２，６５１÷／−８，１３７＋／−１５，７Ｎ−
ＧＩｎ１５０ １．０ ｓｃｕ−ＰＡ ２．０ ＋１８ ９５ ８３ ４ ３６＋／−４，１７２＋／−７，８６５＋／−１１
＊天然の５ｃｕ−ＰＡはコーン等（１９８４年、上記）
が記載したヒト細胞株ＴＣＬ−５９８から得た。
２，７ｓｃｕ−ＰＡ” １．０ ２ ３３＋／−３
，６５６＋／−４０７８＋／４．４２．０ ３ ４２
＋／−２，６５１÷／−８，１３７＋／−１５，７Ｎ−
ＧＩｎ１５０ １．０ ｓｃｕ−ＰＡ ２．０ ＋１８ ９５ ８３ ４ ３６＋／−４，１７２＋／−７，８６５＋／−１１
＊天然の５ｃｕ−ＰＡはコーン等（１９８４年、上記）
が記載したヒト細胞株ＴＣＬ−５９８から得た。
以下の実施例は、その実験が未だ行われていないという
意味で理論的である。しかし乍ら、この実施例は本願発
明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子の内の２つの
トロンビン抵抗性をどのようにして測定できるかを示す
のに役立つ。
意味で理論的である。しかし乍ら、この実施例は本願発
明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子の内の２つの
トロンビン抵抗性をどのようにして測定できるかを示す
のに役立つ。
ｚ脂班刊
この実施例では、Ｎ−フェニルアラニン１５７−ＳＣＵ
ＰＡおよびＮ−リジン１５８−ｓｃｕ−ＰＡのトロンビ
ン切断に対する抵抗性を示す。イチノセ（Ｉｃｈｉｎｏ
ｓａ）等（１９８６年、ジャーナルオブバイオロジカル
ケミストーリー２６１ ：３４Ｂ６〜３４８９）並び
にブレウィンチおよびパネル（１９８７年、）′ランド
的＝７６９〜７７２）は、活性を合成ペプチド基質Ｓ−
２４４４（カビビトラム、スウェーデンのストンクホル
ム）のアミド分解として測定するとき、天然５ｃｕ−Ｐ
Ａのトロンビン切断によって分子のプラスミンによる「
活性化」が妨げられることを示している。本実施例の結
果によって、本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性
化因子Ｎ−フェニルアラニン１５７−ｓｃｕ−ＰＡおよ
びＷ−リジン１５８−ｓｃｕ−ＰＡがこのトロンビン効
果に抵抗性でありそしてトロンビン処理後でさえプラス
ミンにより活性化可能なままであることが示される。
ＰＡおよびＮ−リジン１５８−ｓｃｕ−ＰＡのトロンビ
ン切断に対する抵抗性を示す。イチノセ（Ｉｃｈｉｎｏ
ｓａ）等（１９８６年、ジャーナルオブバイオロジカル
ケミストーリー２６１ ：３４Ｂ６〜３４８９）並び
にブレウィンチおよびパネル（１９８７年、）′ランド
的＝７６９〜７７２）は、活性を合成ペプチド基質Ｓ−
２４４４（カビビトラム、スウェーデンのストンクホル
ム）のアミド分解として測定するとき、天然５ｃｕ−Ｐ
Ａのトロンビン切断によって分子のプラスミンによる「
活性化」が妨げられることを示している。本実施例の結
果によって、本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性
化因子Ｎ−フェニルアラニン１５７−ｓｃｕ−ＰＡおよ
びＷ−リジン１５８−ｓｃｕ−ＰＡがこのトロンビン効
果に抵抗性でありそしてトロンビン処理後でさえプラス
ミンにより活性化可能なままであることが示される。
実施例７の、精製した低分子量プラスミノーゲン活性化
因子Ｎ−フェニルアラニン１５７−ｓｃｕ−ＰＡおよび
Ｎ−リジン１５８−ｓｃｕ−ＰＡは下記方法に従ってヒ
トトロンビンで処理する０反応混合物（１，８＋ｆｆ１
）は５０ｍＭのトリス−ＩＩＣＩ（ｐＨ７，４）、０．
１５Ｍの塩化ナトリウム、プラスミノーゲン活性化因子
１■当たり１００ユニ２トのトロンビン（Ｔ−６７５９
、シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ、）、ミズーリー州セントルイス）および
０．３から０．６ｍｇのプラスミノーゲン活性化因子を
含有する。この混合物を３７°Ｃで１時間インキユヘー
トし、そして過剰のヒルジン（プラスミノーゲン活性化
因子１＋ａｇ当たり１１０ユニツト、 ｌｔ−４２５６
、上記のシグマケミカルカンパニー）を加え氷上で冷却
して停止させる。トロンビン処理したプラスミノーゲン
活性化因子のアミド分解活性は、合成ペプチド基質Ｓ−
２４４４（カビビトラム、スウェーデンのストックホル
ム）およびプラスミン処理を使用してコーン等（１９８
４年、上記）のアンセイに従って測定する。 ＴＣＬ−
５９８細胞（コーン等、１９８４年、上記）から得たト
ロンビン−処理した天然の５ｃｕ−ＰＡは１，０００１
０７■以下の特異的アミド分解活性を示し、これはプラ
スミン処理不存在下での特異的アミド分解活性に一致し
、（上記表１参照）そしてトロンビン−処理した分子を
プラスミンが「活性化」できないことと一致する。
因子Ｎ−フェニルアラニン１５７−ｓｃｕ−ＰＡおよび
Ｎ−リジン１５８−ｓｃｕ−ＰＡは下記方法に従ってヒ
トトロンビンで処理する０反応混合物（１，８＋ｆｆ１
）は５０ｍＭのトリス−ＩＩＣＩ（ｐＨ７，４）、０．
１５Ｍの塩化ナトリウム、プラスミノーゲン活性化因子
１■当たり１００ユニ２トのトロンビン（Ｔ−６７５９
、シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ、）、ミズーリー州セントルイス）および
０．３から０．６ｍｇのプラスミノーゲン活性化因子を
含有する。この混合物を３７°Ｃで１時間インキユヘー
トし、そして過剰のヒルジン（プラスミノーゲン活性化
因子１＋ａｇ当たり１１０ユニツト、 ｌｔ−４２５６
、上記のシグマケミカルカンパニー）を加え氷上で冷却
して停止させる。トロンビン処理したプラスミノーゲン
活性化因子のアミド分解活性は、合成ペプチド基質Ｓ−
２４４４（カビビトラム、スウェーデンのストックホル
ム）およびプラスミン処理を使用してコーン等（１９８
４年、上記）のアンセイに従って測定する。 ＴＣＬ−
５９８細胞（コーン等、１９８４年、上記）から得たト
ロンビン−処理した天然の５ｃｕ−ＰＡは１，０００１
０７■以下の特異的アミド分解活性を示し、これはプラ
スミン処理不存在下での特異的アミド分解活性に一致し
、（上記表１参照）そしてトロンビン−処理した分子を
プラスミンが「活性化」できないことと一致する。
対照的に、本願発明の２つの低分子量プラスミノーゲン
活性化因子、即ちＮ−フェニルアラニン１５７ｓｃｕ−
ＰＡおよびＮ−リジン−１５８−ｓｃｕ−ＰＡは、トロ
ンビンおよびプラスミン処理後にプラスミンだけによる
処理の後に見られるのと実質的に同一の特異的アミド分
解活性を示す（上記表１参照）、それ故、トロンとンは
これら新規低分子量プラスミノーゲン活性化因子をプラ
スミン「活性化Ｊに対して耐性にし得ず、そしてこのこ
とはこれら分子内のトロンビン−感受性部位、即ちアル
ギニン１５６−２工ニルアラニン１５７ペプチド結合の
不存在と一致する。
活性化因子、即ちＮ−フェニルアラニン１５７ｓｃｕ−
ＰＡおよびＮ−リジン−１５８−ｓｃｕ−ＰＡは、トロ
ンビンおよびプラスミン処理後にプラスミンだけによる
処理の後に見られるのと実質的に同一の特異的アミド分
解活性を示す（上記表１参照）、それ故、トロンとンは
これら新規低分子量プラスミノーゲン活性化因子をプラ
スミン「活性化Ｊに対して耐性にし得ず、そしてこのこ
とはこれら分子内のトロンビン−感受性部位、即ちアル
ギニン１５６−２工ニルアラニン１５７ペプチド結合の
不存在と一致する。
上記したように、低分子量プラスミノーゲン活性化因子
はプロウロキナーゼから誘導され、９つのアミノ酸残基
（プロウロキナーゼの１５０から１５８のアミノ酸残基
）のいずれか１つから始まっている。修飾した低分子量
プラスミノーゲン活性化因子はＥＧＦドメイン、クリン
グルドメイン、連結領域を欠き、そしてその結果［リン
キング」ジスルフィド結合を欠いている。プロウロキナ
ーゼと同様に、低分子量プラスミノーゲン活性化因子は
プラスミンで切断可能であって、合成基質５２４４４で
測定するとき、より高いアミド分解活性を有するスピシ
ーズを産生する。これらの低分子量プラスミノーゲン活
性化因子はまた、プロウロキナーゼと同様のフィブリン
特異性も示す、低分子量プラスミノーゲン活性化因子は
、図１で示されるプロウロキナーゼｃＤＮＡの１５０か
ら１５８の残基でコード化されるアミノ酸の両端を含み
その間のアミノ酸のいずれか１つで始まることができる
。このような低分子量のプラスミノーゲン活性化因子は
、プラスミノーゲン活性化因子からＥＧＦドメイン、ク
リングルドメイン、連結領域、および「リンキング」ジ
スルフィド架橋が無くなるアミノ酸残基の欠失によって
生じる。プロウロキナーゼを化学的修飾で処理して、本
願発明による低分子量プラスミノーゲン活性化因子を作
成することもできる。
はプロウロキナーゼから誘導され、９つのアミノ酸残基
（プロウロキナーゼの１５０から１５８のアミノ酸残基
）のいずれか１つから始まっている。修飾した低分子量
プラスミノーゲン活性化因子はＥＧＦドメイン、クリン
グルドメイン、連結領域を欠き、そしてその結果［リン
キング」ジスルフィド結合を欠いている。プロウロキナ
ーゼと同様に、低分子量プラスミノーゲン活性化因子は
プラスミンで切断可能であって、合成基質５２４４４で
測定するとき、より高いアミド分解活性を有するスピシ
ーズを産生する。これらの低分子量プラスミノーゲン活
性化因子はまた、プロウロキナーゼと同様のフィブリン
特異性も示す、低分子量プラスミノーゲン活性化因子は
、図１で示されるプロウロキナーゼｃＤＮＡの１５０か
ら１５８の残基でコード化されるアミノ酸の両端を含み
その間のアミノ酸のいずれか１つで始まることができる
。このような低分子量のプラスミノーゲン活性化因子は
、プラスミノーゲン活性化因子からＥＧＦドメイン、ク
リングルドメイン、連結領域、および「リンキング」ジ
スルフィド架橋が無くなるアミノ酸残基の欠失によって
生じる。プロウロキナーゼを化学的修飾で処理して、本
願発明による低分子量プラスミノーゲン活性化因子を作
成することもできる。
本願発明の好ましい実施態様の低分子量プラスミノーゲ
ン活性化因子を製造するためのプロウロキナーゼの修飾
は既知の組換え体ＤＮＡ技術のいずれかまたはアミノ酸
を選択的に欠失させる種々の試薬を用いる他の手段によ
って実施することができる。１度この修飾が達成される
と、本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子は
既知の遺伝子工学技術を用いてクローン化して、最小の
費用および高い効率で大量に生産することができる。
ン活性化因子を製造するためのプロウロキナーゼの修飾
は既知の組換え体ＤＮＡ技術のいずれかまたはアミノ酸
を選択的に欠失させる種々の試薬を用いる他の手段によ
って実施することができる。１度この修飾が達成される
と、本願発明の低分子量プラスミノーゲン活性化因子は
既知の遺伝子工学技術を用いてクローン化して、最小の
費用および高い効率で大量に生産することができる。
本願発明の好ましい実施態様を記載したので、開示した
実施Ｂ様に種々の修飾を行うことができ、そしてこのよ
うな修飾が本願発明の範囲内で意図されていることは当
該技術分野の通常の技庸を有する者には自明であろうゆ
実施Ｂ様に種々の修飾を行うことができ、そしてこのよ
うな修飾が本願発明の範囲内で意図されていることは当
該技術分野の通常の技庸を有する者には自明であろうゆ
図１はプロウロキナーゼｃＤＮ＾のヌクレオチドシーケ
ンスおよびプロウロキナーゼのアミノ酸シーケンスを表
す。成熟プロウロキナーゼのアミノ酸に１から４１１ま
での数字を付ける。矢印は単離された初期クローンの開
始点を示し、括弧は低分子１プラスミノーゲン活性化因
子の好ましい開始領域を示す。 図２は、プロウロキナーゼｃＤＮＡのファージライブラ
リーをスフ−リングする際に使用されるプロ−ブの図式
的描写である。 図３は、ｐＳν２に由来しそしてマウスＮ１）１３Ｔ３
細胞でプロウロキナーゼｃＤＮＡの発現に使用されるブ
ラスミ）−ｐｃＧＨＩ６を示す。 図４は、成熟プロウロキナーゼの１から１４９番のアミ
ノ酸残基用コドンが欠失している低分子量プラスミノー
ゲン活性化因子ｃＤＮＡを含有するプラスミドの構造を
示す。 図５はプロウロキナーゼ分子の図式的２次元描写を示す
（ホームズ等、１９８５年、上記）。星印は、本願発明
の主題である低分子量プラスミノーゲン活性化因子分子
の１つのＮ−末端アミノ酸を示す。 （＋０２） イＯ トー（ｊ １２＜ 一 一く ロー（コ Ｌ３【コ Ｃ／Ｊ）− シス 一く （コ（コ ＜（コ 第 図 （々の３） 第 図 （代のり 第 図 （＋のり 第 図 （＋のｌ））
ンスおよびプロウロキナーゼのアミノ酸シーケンスを表
す。成熟プロウロキナーゼのアミノ酸に１から４１１ま
での数字を付ける。矢印は単離された初期クローンの開
始点を示し、括弧は低分子１プラスミノーゲン活性化因
子の好ましい開始領域を示す。 図２は、プロウロキナーゼｃＤＮＡのファージライブラ
リーをスフ−リングする際に使用されるプロ−ブの図式
的描写である。 図３は、ｐＳν２に由来しそしてマウスＮ１）１３Ｔ３
細胞でプロウロキナーゼｃＤＮＡの発現に使用されるブ
ラスミ）−ｐｃＧＨＩ６を示す。 図４は、成熟プロウロキナーゼの１から１４９番のアミ
ノ酸残基用コドンが欠失している低分子量プラスミノー
ゲン活性化因子ｃＤＮＡを含有するプラスミドの構造を
示す。 図５はプロウロキナーゼ分子の図式的２次元描写を示す
（ホームズ等、１９８５年、上記）。星印は、本願発明
の主題である低分子量プラスミノーゲン活性化因子分子
の１つのＮ−末端アミノ酸を示す。 （＋０２） イＯ トー（ｊ １２＜ 一 一く ロー（コ Ｌ３【コ Ｃ／Ｊ）− シス 一く （コ（コ ＜（コ 第 図 （々の３） 第 図 （代のり 第 図 （＋のり 第 図 （＋のｌ））
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）低分子量のポリペプチドプラスミノーゲン活性化因
子であって、その際該プラスミノーゲン活性化因子はそ
のプラスミノーゲン活性化活性において高いフィブリン
特異性を有し、１本鎖分子構造および遊離末端の外観を
有している。 ２）低分子量のプラスミノーゲン活性化因子であって、
その際該活性化因子はプロウロキナーゼの１５０から４
１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成されて
いる。 ３）組換え体ＤＮＡ技術によってプロウロキナーゼから
製造されそしてトロンビン切断およびプラスミン切断部
位を有する特許請求の範囲第２項に記載のプラスミノー
ゲン活性化因子。 ４）更にアミノ酸欠失からなる特許請求の範囲第２項に
記載のプラスミノーゲン活性化因子。 ５）更に化学的修飾からなる特許請求の範囲第２項に記
載のプラスミノーゲン活性化因子。 ６）血液凝固溶解の開始において高いフィブリン特異性
を有するプラスミノーゲンを活性化する高分子量のプラ
スミノーゲン活性化因子の機能を実質的に減少させるこ
となく、上記高分子量プラスミノーゲン活性化因子から
低分子量のプラスミノーゲン活性化因子を製造する方法
であって、その際該方法は、アミノ酸シーケンスのＥＧ
Ｆ領域、クリングル領域、連結領域およびリンキングジ
スルフィド結合を修飾するようにプロウロキナーゼを処
理することを特徴とする方法。 ７）上記高分子量のプラスミノーゲン活性化因子が欠失
によって修飾されている特許請求の範囲第６項に記載の
方法。 ８）「リンキング」ジスルフィド結合のない「遊離末端
」を有し、薬理学的に受容可能な賦形剤と混合した、治
療的に有効濃度の低分子量のプラスミノーゲン活性化因
子からなる組成物。 ９）上記活性化因子がトロンビン切断部位を有する特許
請求の範囲第８項に記載の組成物。 １０）上記活性化因子がプラスミン切断部位を有する特
許請求の範囲第８項に記載の組成物。 １１）上記活性化因子がプラスミン切断部位およびトロ
ンビン切断部位を有する特許請求の範囲第８項に記載の
組成物。 １２）「リンキング」ジスルフィド架橋のない遊離末端
を有する低分子量のプラスミノーゲン活性化因子を、身
体に望ましくない変化を生じさせることなく凝塊を溶解
させるのに十分な投与値で身体内の血液に加えることに
よって身体を治療する方法。 １３）上記プラスミノーゲン活性化因子が修飾されたウ
ロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子である特許請
求の範囲第１項に記載のプラスミノーゲン活性化因子。 １４）上記プラスミノーゲン活性化因子が修飾されたプ
ロウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子である特許
請求の範囲第１項に記載のプラスミノーゲン活性化因子
。 １５）低分子量のポリペプチドプラスミノーゲン活性化
因子であって、その際該プラスミノーゲン活性化因子は
そのプラスミノーゲン活性化活性において高いフィブリ
ン特異性を有し、１本鎖分子構造および遊離末端の外観
を有しそしてシステインがブロッキングアミノ酸に換わ
っているもの。 １６）上記活性化因子がヒトプロウロキナーゼでありそ
して上記システインがシステイン−２７９である特許請
求の範囲第１５項に記載の低分子量ポリペプチドプラス
ミノーゲン活性化因子。 １７）上記システイン−２７９がセリンと入れ換えられ
ている特許請求の範囲第１５項に記載の低分子量ポリペ
プチドプラスミノーゲン活性化因子。 １８）１５０から１５５のいずれかまでのアミノ酸残基
が欠失している特許請求の範囲第１５項に記載の低分子
量プラスミノーゲン活性化因子。 １９）上記活性化因子が、プロウロキナーゼのほぼ１５
０から４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形
成されている特許請求の範囲第１５項に記載の低分子量
プラスミノーゲン活性化因子。 ２０）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５１か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。 ２１）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５２か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。 ２２）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５３か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。 ２３）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５４か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。 ２４）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５５か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。 ２５）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５６か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。 ２６）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５７か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。 ２７）上記活性化因子が、プロウロキナーゼの１５８か
ら４１１までのアミノ酸部分からなるアミノ酸で形成さ
れている特許請求の範囲第１項に記載の低分子量プラス
ミノーゲン活性化因子。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10737087A | 1987-10-09 | 1987-10-09 | |
| US107370 | 1987-10-09 | ||
| US24872788A | 1988-09-27 | 1988-09-27 | |
| US248727 | 1988-09-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02438A true JPH02438A (ja) | 1990-01-05 |
Family
ID=26804711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63253674A Pending JPH02438A (ja) | 1987-10-09 | 1988-10-07 | 修飾した低分子量プラスミノーゲン活性化因子およびその製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0316068A1 (ja) |
| JP (1) | JPH02438A (ja) |
| AU (1) | AU2354588A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8809093D0 (en) * | 1988-04-18 | 1988-05-18 | Erba Carlo Spa | Low molecular weight derivatives of prourokinase |
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| DE4101736A1 (de) * | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Gruenenthal Gmbh | Neue als plasminogenaktivatoren einsetzbare polypeptide, dafuer codierende plasmide und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
| WO1998005762A1 (de) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Thrombinaktivierbarer plasminogenaktivator |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI88932C (fi) * | 1982-04-15 | 1993-07-26 | Genentech Inc | Framstaellning av funktionellt maenskligt urokinasprotein |
| EP0236040A3 (en) * | 1986-02-26 | 1989-05-03 | Collaborative Research Inc. | Amino acid modified prourokinase and method of preparation |
| DE3786317T2 (de) * | 1986-03-28 | 1994-02-03 | Creative Biomolecules Inc | Proteinanaloge des gewebs-plasminogenaktivators. |
| NL8601240A (nl) * | 1986-05-15 | 1987-12-01 | Leuven Res & Dev Vzw | Plasminogeenactivator en trombolytisch geneesmiddel. |
-
1988
- 1988-10-07 AU AU23545/88A patent/AU2354588A/en not_active Abandoned
- 1988-10-07 JP JP63253674A patent/JPH02438A/ja active Pending
- 1988-10-07 EP EP88309417A patent/EP0316068A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2354588A (en) | 1989-04-20 |
| EP0316068A1 (en) | 1989-05-17 |
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