JPH0244030B2 - - Google Patents
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- JPH0244030B2 JPH0244030B2 JP57095572A JP9557282A JPH0244030B2 JP H0244030 B2 JPH0244030 B2 JP H0244030B2 JP 57095572 A JP57095572 A JP 57095572A JP 9557282 A JP9557282 A JP 9557282A JP H0244030 B2 JPH0244030 B2 JP H0244030B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明の背景
CEAは等電点PH4.5、炭水化物含量約40ないし
75重量％、高いＮ−アセチルグルコサミン含量
（10ないし30重量％）、微量のＮ−アセチルガラク
トサミン、および４ないし20重量％のシヤル酸を
有する熱安定性糖タンパク質である。それは公知
方法によつて腫瘍または組織培養から製造され
る。上昇した血清CEA濃度はある種のがん、特
に胃腸管のそれらに関連しているので、CEAは
意義深い。CEAトレーサー（標識したCEA類縁
体）、CEA抗体および標識したCEA抗体はすべて
既知である（米国特許第3927193号および第
3663684号）。 α1酸性糖タンパク質またはオロソムコイド
（以後AGという）は熱安定性で、そして炭水化
物約40ないし45重量％、シヤル酸およびアスパラ
ギン酸約10重量％、そしてCEAと似た濃度でグ
ルタミン酸、メチオニン、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンを含有す
る。AGは等電点PH2.7、β−グロブリン易動度で
はなくα−グロブリン電気泳動易動度、CEAの
約200000ではなくて約45000の分子量を有するこ
とにおいてCEAと実質的に相違する。不溶性AG
は先行技術に既知である。免疫学的にCEAと交
差反応する種々の正常組織中に存在する物質（非
特異性交差反応抗原またはNCA）は知られてい
るが、これら物質はAG免疫決定因子を有するも
のとして同定されていない。 本発明の一つの目的は既知CEAアツセイの感
度を改良し、そしてこの目的のための新規な試薬
を提供することである。 本発明の他の一目的はCEA測定のための新規
な方法および試薬を提供することである。 これらおよび他の目的は本明細書を全体として
考慮することにより自明であろう。 本発明の概要 驚くべきことに、そして予期せざることに、
CEA分子中にはAGに対し著しい免疫学的相似性
を有する部分が存在することが判明した。この発
明は以下の新規な方法および組成物へ導いた。 １ AG抗体と交差反応しない、CEAトレーサー
および標準の一部分を除くことによつて、
CEAアツセイの感度が改良される。除去は、
交差反応するCEAと、受容体としてAG抗体と
を結合し、そしてCEAを回収することによつ
て達成される。このCEAは、吸着されない
CEA組成物よりもCEA抗体に対して高い親和
性を示す。 ２ CEAアツセイは、ＰセグメントとAG決定因
子の両方を示すCEAだけを測定する新規な方
法によつてさらに改良される。標識したAGは
新規であり、そして本発明を規定する特許請求
の範囲および以後に記載されるこの方法におい
て使用される。 本発明の詳細な説明 この方法によつて精製すべきCEA製剤は任意
の慣用方法によつて得ることができる。CEAは
普通組織培養または腫瘍、例えば胃腸がんの肝転
移の抽出によつて得られる。CEA含有出発物質
の好適な一製造方法が米国特許第3663684号に開
示されている。しかしながらもつと複雑でない方
法が満足であろう。例えば、細胞または組織試料
は水中でホモジネートし、過塩素酸のような糖タ
ンパク質溶媒で抽出し（または熱変性タンパク質
を沈殿するように70℃で加熱する）、不溶物を除
去するため遠心し、残余の過塩素酸を透析または
過塩素酸カリウム沈殿法（米国特許第4180556号）
によつて除去し、そしてCEAを回収することが
できる。このCEAは公知の方法でラジオアイソ
トーブ、酵素、安定なフリーラジカル、補酵素、
螢光基、化学ルミネセンス基、または酵素阻害剤
もしくは賦活剤のような適当な検出可能基をもつ
て、後記の精製操作の以前または以後に標識する
ことができる。 こゝでの精製方法の目的は、AG抗体と交差反
応性のCEAに富む、または実質的に該CEAより
なる天然もしくは標識CEAを調製することにあ
る。市販の放射性ヨード化CEAのかなりの部分
はAG抗体に結合しないか、または非常に弱くし
か結合しない。例えば、そのような放射性ヨード
化CEA製剤の放射能の約３分の１だけがAG抗体
と直ちに反応するに過ぎず、他方該放射能の約50
％以下は一夜インキユベーシヨン後にようやく結
合するであろう。CEA製剤の非結合部分の本体
は現在未知である。それは夾雑タンパクを含有す
るであろう。 CEA製剤の一部はAG抗体を結合し得るが、
CEA抗体はAGを結合し得ないことは興味ある事
項である。このパラドツクスはCEA抗体がつく
られる方法のためであると信じられる。CEA抗
体は慣例的に動物をCEA製剤で免疫化して調製
され、そのためCEAのAG決定因子と、該CEA製
剤中の他のCEA決定因子および夾雑物との両方
に特異性の抗体の発生へみちびく。次に免疫する
CEA製剤中の夾雑物に対して上昇された非CEA
抗体を除去する意図で、抗血清が正常な組織とイ
ンキユーベートされる。しかしながらCEAに対
して上昇された抗体集団は正常組織成分である
AGに特異的な抗体をも含む。このようにAG抗
体は正常組織とのインキユーベシヨンによつて除
去される。残りのCEA抗体は従つてAG抗体と交
差反応性でない、すなわちAGのそれらに類似の
免疫部位を持たないCEAの部分に向けられるだ
けである。以後この部分をCEA Ｐセグメントと
呼ぶ。このセグメントに特異性の抗体はCEA Ｐ
セグメント抗体である。ＰセグメントとAG免疫
部位の両方を含有するCEAを、以後便宜上無傷
のCEAと呼ぶ。 無傷のCEAを精製するための好ましい方法は、
不純出発組成物をAG抗体をもつて吸着し、出発
組成物の未結合残部を除去し、そしてCEAをAG
抗体から分離することを伴う。不純組成物中に存
在するかも知れないAGからCEAを最初に分離す
る必要はない。AGのAG抗体に対する親和性は
無傷のCEAのそれよりも著しく高い。このため、
AG抗体へ結合したAGを遊離するAG抗体結合
CEAの溶離のための条件の注意深い選択および
制御は、二つの物質のAG抗体に対する親和力の
差に基づいてCEAをAGから分離することを可能
にするであろう。 もつて精巧な操作は、不純CEA含有組成物を
CEA Ｐセグメントだけを結合し得る抗体と接触
させ、結合物質を組成物残部から分離し、抗体に
より吸着されたCEAを分離して中間組成物を生
成させ、中間組成物中の無傷のCEAをAG抗体へ
結合させ、結合した無傷のCEAを残部から分離
し、そして無傷のCEAをAG抗体から分離するこ
とを含む。 結合CEAを有する抗体を未結合物質の残部か
ら分離することを含む前述のステツプは、抗体を
溶液から分離するための任意の既知方法によつて
達成することができる。そのような方法は、普通
抗体を不溶化することを伴う。これは抗体を
CEAへ結合する前か、後のいずれでも実施する
ことができる。 好ましくは、該抗体はCEAと接触させる前に
水不溶性化される。これは抗体を水不溶性担体へ
共有結合するか（Biou et al，“Chin.Biochen.”
〔Ottawa〕10〔４〕：141−７〔1977〕）、または抗
体を非共有結合的に適当な担体へ吸着する
（Wang et al，“Clin.Chem.”25〔４〕：546−９
〔1979〕）ことによつて達成し得る。代表的な担体
には架橋デキストランのようなポリオール、セル
ロース、ガラスまたはナイロンを含む。担体は繊
維状塊、ビーズまたは顆粒の形でよい。担体が抗
体へ共有結合によつて結合されるとき、アミド、
エーテルまたはエステルのような有機結合基が抗
体を担体へ共有結合するために用いられる。抗体
を不溶化するための適当な手法は当業者によつて
容易に選択され、そして本発明にとつて重要でな
い。 AG抗体およびCEA Ｐセグメント抗体は市販
されており、またはそれらは既知方法で調製する
ことができる。AG抗体はアジユバンド中のAG
溶液により免疫化することにより、ウサギまたは
ヤギのような実験動物中に容易につくられる。 CEA Ｐセグメント抗体は前述のようにCEAを
調製し、実験動物を免疫化し、そしてCEAと同
じ起源からの正常組織で抗血清を吸着することに
よつて製造される。この最後の工程は一般に慣用
であり、そしてそれはAG抗体を除去するけれど
も、その目的として動物を免疫化するために使用
したCEA製剤中に存在し得た正常な非CEA夾雑
物に対する抗体の除去を含む。免疫化した動物か
らの抗血清はそのまゝ使用してもよく、または既
知の態様、例えばクロマトグラフイー、電気泳
動、および所望の類似方法でさらに精製すること
ができる。 典型的には、無傷のCEAは抗体を臭化シアン
活性化架橋デキストランへ結合することにより、
標識した、または天然すなわち標識しないCEA
製剤から回収される。不溶性抗体はカラムに充填
され、そして中性PH近くで緩衝液で平衡化され
る。標識された、または天然CEAはカラム中の
非特異性結合を減らすのを助けるため、正常血清
と混合される。次にCEA組成物が通常室温でカ
ラムへ加えられる。組成物が抗体と接触を保つて
いる時間は数分（通過時間）から約24時間まで変
化するであろう。約10時間が一般に好ましい。イ
ンキユベーシヨン時間が長ければ長い程、より多
量のCEA回収を得るであろうが、時間は重要で
ない。 インキユーベシヨンが終了した後、残りの未結
合分画は中性近くに保つた緩衝液で溶離される。
次に結合した分画が遊離剤で溶離される。抗原−
抗体複合体を分離させる任意の物質または条件が
遊離剤として使用し得る。酸のほかの例は、尿素
および塩類を含む。溶離工程はCEA溶離を最大
にしながら、AG溶離を最小にするように最適化
される。このことを念頭に置き、当業者は出発組
成物の本質、不溶性抗体、所望の精製度、CEA
が標識化されているかどうか、もしそうなら標識
の本質に依存して溶離条件を調節し、適当な溶離
液を選択するであろう。 回収された無傷の、標識または天然CEAは、
もし望むならば残りのAGを除去するためさらに
精製し、そして使用するまで凍結乾燥もしくは冷
凍保存することができる。精製した無傷のCEA
はこれまでCEAに適したどんな用途にも、例え
ば既知のCEAアツセイにおいてトレーサー（標
識した類縁体）として、またはCEA抗体製造の
ための免疫源として供することができる。上記の
ように調製した精製CEAトレーサーの使用は、
既知アツセイで実行されているような試料の過塩
素酸もしくは熱抽出が省略でき、そして血清のよ
うな未処理試料が直接使用できるので、イムノア
ツセイの感度を増す。 イムノアツセイ 上で調製された精製した標識したCEAを典型
的な競合型イムノアツセイに使用することは本発
明の範囲内である。このことは、標識したCEA
とテスト試料とが限られた数のCEA抗体結合部
位に対して競合し、その後抗体結合物質が標識に
ついて定量される。もし多量の試料CEAが存在
すれば、そのときは標識したCEAの大部分は競
合的に抗体から置換され、も試料中のCEAが低
ければその反対である。AG抗体によつて結合さ
れないタンパク質を実質上含まない標識した
CEA、すなわち、そのように結合されないタン
パク質を約40％以下しか含まない標識したCEA
により、ホフマン、ラ、ロシユおよびCISから販
売されている市販のラジオイムノアツセイにかな
りの改善を得ることができる。精製した標識
CEAは未精製トレーサーよりもCEA抗体に対し
て著しく免疫反応性である。問題は、これまで
CEAは大部分均一であると考えられていたが、
実際には無傷のCEA中にAGおよびＰセグメント
決定部分が存在し、テスト試料CEAの未知割合
だけがＰセグメント決定部分であるということで
ある。試料Ｐセグメントは従来の競合型イムノア
ツセイにおいて標識および試料の無傷のCEAと
競合し、それにより無傷のCEAの定量を妨害す
るものと推測される。この潜在的な妨害は、この
点を考慮に入れたアツセイプロトコールを選ぶこ
とによつて排除される。従つて、本発明の改良は
無傷のCEAのみ、すなわちAGおよびＰセグメン
トに共通な免疫学的に表われる決定因子を含有す
る物質のみを測定することを含む。これは非AG
抗体交差反応性物質をテスト試料から予備精製に
よつて除去し、次に試料を競合系によつて定量す
ることによつて達成することができる。しかしな
がら、好適な定量法は本発明によつては改良した
サンドイツチ法である。 サンドイツチイムノアツセイ法はよく知られて
いる。一般的に、このアツセイに使用される試薬
は被分析物質に対する不溶性抗体と、被分析物質
に対する標識した可溶性抗体とである。予期され
る試料被分析物質集団よりも少数の被分析物質結
合部位を含有する量の不溶性抗体が使用される。
このアツセイは一般に不溶性抗体をテスト試料、
次に標識した抗体と順番に接触させ、結合した標
識をアツセイすることによつて実施される。被分
析物質は不溶性抗体と標識抗体との間にサンドイ
ツチされる。これには勿論被分析物質が少なくと
も二つの免疫結合部位を持つていることを要す
る。無傷のCEAのアツセイ中のCEA Ｐセグメン
トの存在の可能性はこのアツセイの一つの変法を
好ましいものとする。可溶性の標識した抗体と不
溶性抗体とは、共に同じ被分析物質と結合するけ
れども同じ抗体ではなく、すなわち一方の抗体は
無傷のCEAのＰセグメント決定因子に向い、第
二の抗体はCEA AG決定因子を結合することが
できる。これはAGまたはＰセグメントのどちら
かが無傷のCEAの模倣をすることを防止する。 この改良したサンドイツチ法は、 (a) テスト試料をCEAのＰセグメントに対する
水不溶性抗体を含むテストマトリツクスと接触
させること、 (b) テスト試料の残りを除去すること、 (c) テストマトリツクスをAGに対する標識した
抗体と接触させること、 (d) 結合しない標識した抗体を除去すること、 (e) 結合または未結合標識の量を測定すること を含む。 例示のため、この方法の最終生成物は以下のよ
うになるであろう。 【表】 上記において点線は免疫結合であり、※は標識
である。 結合したCEA Ｐセグメントは標識した抗体に
よつて結合されず、従つてCEAとして定量され
ない。存在することがあるCEA Ｐセグメントは
AG抗体を結合しない。２またはそれ以上の別々
の免疫部位を結合することができる各種の抗体を
使用することができる。勿論Ｐセグメント抗体は
AGと交差反応性であつてはならず、またAG抗
体はCEA Ｐセグメントを結合してはならない。
それにもかゝわらず、抗体はそれぞれできるだけ
均一であることが望ましく、すなわち既知手法で
ハイブリドーマ培養によつて得ることができるよ
うな、単一の免疫部位に向けられた単一の抗体を
使用すべきである。 Ｐセグメント抗体は、AG抗体が先に製造され
た方法と同じ方法で不溶性化することができる。
好ましくは、抗体はそれをポリスチレンビーズま
たはポリプロピレン試験管内底へ吸着させること
によつて不溶性化される。 標識した抗AG抗体は新規であると思われる。
前述のCEAに対する標識のどれもがAG抗体にも
使用でき、他の標識した抗体と同じ方法で製造さ
れる。例えば、放射標識した抗CEA抗体の製造
法を記載する米国特許第3927193号参照。好まし
い標識は酵素およびラジオアイソトープであり、
最も好ましいのは放射性ヨードである。放射性ヨ
ード化のための好ましい方法は、Dermody et
al.，“Clinical Chemistry”25(6)；989−995
（1979）またはParsons et al.，“Analytical
Biochemistry”95：568−574（1979）に記載され
ているようにクロラミン−Ｔまたはラクトペルオ
キシダーゼ、（ 125I）ヨードヒドロキシフエニル
プロピオネート−Ｎ−ヒドロキシスクシニメート
エステル（Bolton et al.，“Biochem.Journal”
133：529−533〔1973〕）、（ 125I）ジヨードフルオ
レセインイソチオシアネート（Gabel et al.，
“Analytical Biochemistry”86：396−406
〔1973〕）、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−（125I）
ヨードチロシン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエ
ステル（Assoian et al.，“Analytical
Biochemistry”103：70−76〔1980〕）、またはIC1
（Montelaro et al.，“Analytical
Biochemistry”99：92−96〔1979〕）のような外
部放射性ヨード化小分子を使用する。クロラミン
Ｔ法が好ましい具体例である。 本発明は以下の実施例にさらに詳しく記載され
る。 実施例 １（参考例） AG抗体（ヘキストまたはマイルス）をこの意
図した実施例およびGreenwood et al.，
“Biochem.J.”89：114−123（1963）の方法によ
つて 125Iで標識した。抗体の50μｇ部分標本を
Greenwoodらの方法で処理し、セフアデツクス
Ｇ−50のカラムを通過させることによつて遊離ヨ
ードを分離した。標識した抗体分画は、５％子ウ
シ血清および抗菌剤として0.1％NaN3を含む希釈
液中に約3μCi／mlに希釈される。製品は４℃で
貯蔵する。 実施例 ２ この方法は無傷のCEAを測定するための企図
された改良サンドイツチイムノアツセイを記載す
る。 CEAは結腸の一次アデノカルチノーマの肝転
移から、該組織のWarringブレンダー中等量の蒸
留水中にホモジナイズすることによつて精製され
た。ホモジネートは8000rpmにおいて30分間５℃
で遠心することにより清澄化された。上清を1M
過塩素酸と混合し、沈殿を遠心によつて除去し
た。上清を蒸留水で５日間透析した。 タンパク質50mg／mlを含んでいる過塩素酸抽出
分画をPH7.8の0.05Mリン酸緩衝液で平衡化した
セフアデツクスＧ−200カラム（170×1.5cm）で
ゲルロ過することによつて精製した。溶出液を４
mlづつの部分標本として集め、タンパク質を
280nmにおいて、そしてCEAをラジオイムノア
ツセイでモニターした。溶出液の最初のタンパク
質ピーク（空隙体積）を集めて濃縮し、次にゲル
ロ過をくり返した。 CEA Ｐセグメント抗体は、上記CEA製剤の５
mgを完全なフロインドアジユバント中に乳化し、
エマルジヨンをウサギに注射し、CEAタイター
が上昇した後に血清20mlを採取し、そして抗血清
を非がん肝臓組織および正常ヒト血清へ吸着させ
ることによつて作られた。製剤は４℃で貯蔵し
た。 約１mlのCEA Ｐセグメント抗血清を米国特許
第3686346号によつてポリプロピレン試薬管の内
表面の底に塗布した。腸のアデノカルチノーマを
有することが既知の患者の血清試料0.1mlと、正
常コントロール0.1mlとを２系列塗布試験管中に
ピペツトし、12時間インキユベートした。結合し
ない試料を水で各試験管から洗浄し、実施例１に
おいて調製した標識したAG抗体0.3mlを各試験管
へ加え、24時間インキユベートし、結合しない標
識抗体を水で試験管から洗浄し、そして試験管へ
結合した放射能を測定した。試料試験管へ結合し
た放射能はコントロール中のそれよりも著しく大
であつた。 実施例 ３（参考例） この実施例は放射性ヨード化CEA製剤（ホフ
マン、ラ、ロシユ、＞1000000cpm）の精製法を記
載する。AGに対する不溶性抗体はAG抗体（ガ
ンマグロブリン−Dako）300mgを臭化シアン活性
化セフアローズ4B（フアルマシア）30mlへ結合す
ることによつて作られた。不溶性抗体は５×1.0
cmのカラムに充填された。 125I標識CEAの部分
標本を正常ウサギ血清と混合し、前記カラムへ注
ぎ、PH7.8の0.05Mリン酸緩衝液で溶離し、２番
目の部分標本を注加した直後５℃で一夜インキユ
ベートし、正常ウサギ血清0.1mlをカラムに注加
し、そしてカラムをリン酸緩衝液で溶離した。こ
れらの分画を未結合分画と呼ぶ。結合分画は未結
合分画を集めた後、両方の場合ともPH2.2の0.1M
グリシン緩衝援で溶離した。各分画の放射能をカ
ウントした。表１はその結果を記録する。 【表】 トレーサーの少量がカラムに残るので、結合お
よび未結合放射等は全体で100％に達しない。同
様な結果は他の２供給源（ヘキストおよびマイル
スラボラトリーズ）からのAG抗体を使用した放
射性ヨード化CEAのポリエチレングリコール促
進沈殿法によつて得られた。殆んどすべての結合
溶離放射能はAG抗体（Dako）でも、CEA抗体
でも沈殿したが、しかし未結合分画中にはコント
ロールに比較して有意な沈殿放射能は発見されな
かつた。AG抗体を結合するCEAは、(1)AGはAG
抗体からのCEA放射能を用量反応的に置換し、
(2)他の血清タンパク質に対する抗血清はCEAを
沈殿しないことから免疫特異性であることが示さ
れた。 結合した溶離分画は、市販CEA測定キツト
（CISおよびホフマン、ラ、ロシユ）の未精製ト
レーサーに代えて用いられた。
75重量％、高いＮ−アセチルグルコサミン含量
（10ないし30重量％）、微量のＮ−アセチルガラク
トサミン、および４ないし20重量％のシヤル酸を
有する熱安定性糖タンパク質である。それは公知
方法によつて腫瘍または組織培養から製造され
る。上昇した血清CEA濃度はある種のがん、特
に胃腸管のそれらに関連しているので、CEAは
意義深い。CEAトレーサー（標識したCEA類縁
体）、CEA抗体および標識したCEA抗体はすべて
既知である（米国特許第3927193号および第
3663684号）。 α1酸性糖タンパク質またはオロソムコイド
（以後AGという）は熱安定性で、そして炭水化
物約40ないし45重量％、シヤル酸およびアスパラ
ギン酸約10重量％、そしてCEAと似た濃度でグ
ルタミン酸、メチオニン、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンを含有す
る。AGは等電点PH2.7、β−グロブリン易動度で
はなくα−グロブリン電気泳動易動度、CEAの
約200000ではなくて約45000の分子量を有するこ
とにおいてCEAと実質的に相違する。不溶性AG
は先行技術に既知である。免疫学的にCEAと交
差反応する種々の正常組織中に存在する物質（非
特異性交差反応抗原またはNCA）は知られてい
るが、これら物質はAG免疫決定因子を有するも
のとして同定されていない。 本発明の一つの目的は既知CEAアツセイの感
度を改良し、そしてこの目的のための新規な試薬
を提供することである。 本発明の他の一目的はCEA測定のための新規
な方法および試薬を提供することである。 これらおよび他の目的は本明細書を全体として
考慮することにより自明であろう。 本発明の概要 驚くべきことに、そして予期せざることに、
CEA分子中にはAGに対し著しい免疫学的相似性
を有する部分が存在することが判明した。この発
明は以下の新規な方法および組成物へ導いた。 １ AG抗体と交差反応しない、CEAトレーサー
および標準の一部分を除くことによつて、
CEAアツセイの感度が改良される。除去は、
交差反応するCEAと、受容体としてAG抗体と
を結合し、そしてCEAを回収することによつ
て達成される。このCEAは、吸着されない
CEA組成物よりもCEA抗体に対して高い親和
性を示す。 ２ CEAアツセイは、ＰセグメントとAG決定因
子の両方を示すCEAだけを測定する新規な方
法によつてさらに改良される。標識したAGは
新規であり、そして本発明を規定する特許請求
の範囲および以後に記載されるこの方法におい
て使用される。 本発明の詳細な説明 この方法によつて精製すべきCEA製剤は任意
の慣用方法によつて得ることができる。CEAは
普通組織培養または腫瘍、例えば胃腸がんの肝転
移の抽出によつて得られる。CEA含有出発物質
の好適な一製造方法が米国特許第3663684号に開
示されている。しかしながらもつと複雑でない方
法が満足であろう。例えば、細胞または組織試料
は水中でホモジネートし、過塩素酸のような糖タ
ンパク質溶媒で抽出し（または熱変性タンパク質
を沈殿するように70℃で加熱する）、不溶物を除
去するため遠心し、残余の過塩素酸を透析または
過塩素酸カリウム沈殿法（米国特許第4180556号）
によつて除去し、そしてCEAを回収することが
できる。このCEAは公知の方法でラジオアイソ
トーブ、酵素、安定なフリーラジカル、補酵素、
螢光基、化学ルミネセンス基、または酵素阻害剤
もしくは賦活剤のような適当な検出可能基をもつ
て、後記の精製操作の以前または以後に標識する
ことができる。 こゝでの精製方法の目的は、AG抗体と交差反
応性のCEAに富む、または実質的に該CEAより
なる天然もしくは標識CEAを調製することにあ
る。市販の放射性ヨード化CEAのかなりの部分
はAG抗体に結合しないか、または非常に弱くし
か結合しない。例えば、そのような放射性ヨード
化CEA製剤の放射能の約３分の１だけがAG抗体
と直ちに反応するに過ぎず、他方該放射能の約50
％以下は一夜インキユベーシヨン後にようやく結
合するであろう。CEA製剤の非結合部分の本体
は現在未知である。それは夾雑タンパクを含有す
るであろう。 CEA製剤の一部はAG抗体を結合し得るが、
CEA抗体はAGを結合し得ないことは興味ある事
項である。このパラドツクスはCEA抗体がつく
られる方法のためであると信じられる。CEA抗
体は慣例的に動物をCEA製剤で免疫化して調製
され、そのためCEAのAG決定因子と、該CEA製
剤中の他のCEA決定因子および夾雑物との両方
に特異性の抗体の発生へみちびく。次に免疫する
CEA製剤中の夾雑物に対して上昇された非CEA
抗体を除去する意図で、抗血清が正常な組織とイ
ンキユーベートされる。しかしながらCEAに対
して上昇された抗体集団は正常組織成分である
AGに特異的な抗体をも含む。このようにAG抗
体は正常組織とのインキユーベシヨンによつて除
去される。残りのCEA抗体は従つてAG抗体と交
差反応性でない、すなわちAGのそれらに類似の
免疫部位を持たないCEAの部分に向けられるだ
けである。以後この部分をCEA Ｐセグメントと
呼ぶ。このセグメントに特異性の抗体はCEA Ｐ
セグメント抗体である。ＰセグメントとAG免疫
部位の両方を含有するCEAを、以後便宜上無傷
のCEAと呼ぶ。 無傷のCEAを精製するための好ましい方法は、
不純出発組成物をAG抗体をもつて吸着し、出発
組成物の未結合残部を除去し、そしてCEAをAG
抗体から分離することを伴う。不純組成物中に存
在するかも知れないAGからCEAを最初に分離す
る必要はない。AGのAG抗体に対する親和性は
無傷のCEAのそれよりも著しく高い。このため、
AG抗体へ結合したAGを遊離するAG抗体結合
CEAの溶離のための条件の注意深い選択および
制御は、二つの物質のAG抗体に対する親和力の
差に基づいてCEAをAGから分離することを可能
にするであろう。 もつて精巧な操作は、不純CEA含有組成物を
CEA Ｐセグメントだけを結合し得る抗体と接触
させ、結合物質を組成物残部から分離し、抗体に
より吸着されたCEAを分離して中間組成物を生
成させ、中間組成物中の無傷のCEAをAG抗体へ
結合させ、結合した無傷のCEAを残部から分離
し、そして無傷のCEAをAG抗体から分離するこ
とを含む。 結合CEAを有する抗体を未結合物質の残部か
ら分離することを含む前述のステツプは、抗体を
溶液から分離するための任意の既知方法によつて
達成することができる。そのような方法は、普通
抗体を不溶化することを伴う。これは抗体を
CEAへ結合する前か、後のいずれでも実施する
ことができる。 好ましくは、該抗体はCEAと接触させる前に
水不溶性化される。これは抗体を水不溶性担体へ
共有結合するか（Biou et al，“Chin.Biochen.”
〔Ottawa〕10〔４〕：141−７〔1977〕）、または抗
体を非共有結合的に適当な担体へ吸着する
（Wang et al，“Clin.Chem.”25〔４〕：546−９
〔1979〕）ことによつて達成し得る。代表的な担体
には架橋デキストランのようなポリオール、セル
ロース、ガラスまたはナイロンを含む。担体は繊
維状塊、ビーズまたは顆粒の形でよい。担体が抗
体へ共有結合によつて結合されるとき、アミド、
エーテルまたはエステルのような有機結合基が抗
体を担体へ共有結合するために用いられる。抗体
を不溶化するための適当な手法は当業者によつて
容易に選択され、そして本発明にとつて重要でな
い。 AG抗体およびCEA Ｐセグメント抗体は市販
されており、またはそれらは既知方法で調製する
ことができる。AG抗体はアジユバンド中のAG
溶液により免疫化することにより、ウサギまたは
ヤギのような実験動物中に容易につくられる。 CEA Ｐセグメント抗体は前述のようにCEAを
調製し、実験動物を免疫化し、そしてCEAと同
じ起源からの正常組織で抗血清を吸着することに
よつて製造される。この最後の工程は一般に慣用
であり、そしてそれはAG抗体を除去するけれど
も、その目的として動物を免疫化するために使用
したCEA製剤中に存在し得た正常な非CEA夾雑
物に対する抗体の除去を含む。免疫化した動物か
らの抗血清はそのまゝ使用してもよく、または既
知の態様、例えばクロマトグラフイー、電気泳
動、および所望の類似方法でさらに精製すること
ができる。 典型的には、無傷のCEAは抗体を臭化シアン
活性化架橋デキストランへ結合することにより、
標識した、または天然すなわち標識しないCEA
製剤から回収される。不溶性抗体はカラムに充填
され、そして中性PH近くで緩衝液で平衡化され
る。標識された、または天然CEAはカラム中の
非特異性結合を減らすのを助けるため、正常血清
と混合される。次にCEA組成物が通常室温でカ
ラムへ加えられる。組成物が抗体と接触を保つて
いる時間は数分（通過時間）から約24時間まで変
化するであろう。約10時間が一般に好ましい。イ
ンキユベーシヨン時間が長ければ長い程、より多
量のCEA回収を得るであろうが、時間は重要で
ない。 インキユーベシヨンが終了した後、残りの未結
合分画は中性近くに保つた緩衝液で溶離される。
次に結合した分画が遊離剤で溶離される。抗原−
抗体複合体を分離させる任意の物質または条件が
遊離剤として使用し得る。酸のほかの例は、尿素
および塩類を含む。溶離工程はCEA溶離を最大
にしながら、AG溶離を最小にするように最適化
される。このことを念頭に置き、当業者は出発組
成物の本質、不溶性抗体、所望の精製度、CEA
が標識化されているかどうか、もしそうなら標識
の本質に依存して溶離条件を調節し、適当な溶離
液を選択するであろう。 回収された無傷の、標識または天然CEAは、
もし望むならば残りのAGを除去するためさらに
精製し、そして使用するまで凍結乾燥もしくは冷
凍保存することができる。精製した無傷のCEA
はこれまでCEAに適したどんな用途にも、例え
ば既知のCEAアツセイにおいてトレーサー（標
識した類縁体）として、またはCEA抗体製造の
ための免疫源として供することができる。上記の
ように調製した精製CEAトレーサーの使用は、
既知アツセイで実行されているような試料の過塩
素酸もしくは熱抽出が省略でき、そして血清のよ
うな未処理試料が直接使用できるので、イムノア
ツセイの感度を増す。 イムノアツセイ 上で調製された精製した標識したCEAを典型
的な競合型イムノアツセイに使用することは本発
明の範囲内である。このことは、標識したCEA
とテスト試料とが限られた数のCEA抗体結合部
位に対して競合し、その後抗体結合物質が標識に
ついて定量される。もし多量の試料CEAが存在
すれば、そのときは標識したCEAの大部分は競
合的に抗体から置換され、も試料中のCEAが低
ければその反対である。AG抗体によつて結合さ
れないタンパク質を実質上含まない標識した
CEA、すなわち、そのように結合されないタン
パク質を約40％以下しか含まない標識したCEA
により、ホフマン、ラ、ロシユおよびCISから販
売されている市販のラジオイムノアツセイにかな
りの改善を得ることができる。精製した標識
CEAは未精製トレーサーよりもCEA抗体に対し
て著しく免疫反応性である。問題は、これまで
CEAは大部分均一であると考えられていたが、
実際には無傷のCEA中にAGおよびＰセグメント
決定部分が存在し、テスト試料CEAの未知割合
だけがＰセグメント決定部分であるということで
ある。試料Ｐセグメントは従来の競合型イムノア
ツセイにおいて標識および試料の無傷のCEAと
競合し、それにより無傷のCEAの定量を妨害す
るものと推測される。この潜在的な妨害は、この
点を考慮に入れたアツセイプロトコールを選ぶこ
とによつて排除される。従つて、本発明の改良は
無傷のCEAのみ、すなわちAGおよびＰセグメン
トに共通な免疫学的に表われる決定因子を含有す
る物質のみを測定することを含む。これは非AG
抗体交差反応性物質をテスト試料から予備精製に
よつて除去し、次に試料を競合系によつて定量す
ることによつて達成することができる。しかしな
がら、好適な定量法は本発明によつては改良した
サンドイツチ法である。 サンドイツチイムノアツセイ法はよく知られて
いる。一般的に、このアツセイに使用される試薬
は被分析物質に対する不溶性抗体と、被分析物質
に対する標識した可溶性抗体とである。予期され
る試料被分析物質集団よりも少数の被分析物質結
合部位を含有する量の不溶性抗体が使用される。
このアツセイは一般に不溶性抗体をテスト試料、
次に標識した抗体と順番に接触させ、結合した標
識をアツセイすることによつて実施される。被分
析物質は不溶性抗体と標識抗体との間にサンドイ
ツチされる。これには勿論被分析物質が少なくと
も二つの免疫結合部位を持つていることを要す
る。無傷のCEAのアツセイ中のCEA Ｐセグメン
トの存在の可能性はこのアツセイの一つの変法を
好ましいものとする。可溶性の標識した抗体と不
溶性抗体とは、共に同じ被分析物質と結合するけ
れども同じ抗体ではなく、すなわち一方の抗体は
無傷のCEAのＰセグメント決定因子に向い、第
二の抗体はCEA AG決定因子を結合することが
できる。これはAGまたはＰセグメントのどちら
かが無傷のCEAの模倣をすることを防止する。 この改良したサンドイツチ法は、 (a) テスト試料をCEAのＰセグメントに対する
水不溶性抗体を含むテストマトリツクスと接触
させること、 (b) テスト試料の残りを除去すること、 (c) テストマトリツクスをAGに対する標識した
抗体と接触させること、 (d) 結合しない標識した抗体を除去すること、 (e) 結合または未結合標識の量を測定すること を含む。 例示のため、この方法の最終生成物は以下のよ
うになるであろう。 【表】 上記において点線は免疫結合であり、※は標識
である。 結合したCEA Ｐセグメントは標識した抗体に
よつて結合されず、従つてCEAとして定量され
ない。存在することがあるCEA Ｐセグメントは
AG抗体を結合しない。２またはそれ以上の別々
の免疫部位を結合することができる各種の抗体を
使用することができる。勿論Ｐセグメント抗体は
AGと交差反応性であつてはならず、またAG抗
体はCEA Ｐセグメントを結合してはならない。
それにもかゝわらず、抗体はそれぞれできるだけ
均一であることが望ましく、すなわち既知手法で
ハイブリドーマ培養によつて得ることができるよ
うな、単一の免疫部位に向けられた単一の抗体を
使用すべきである。 Ｐセグメント抗体は、AG抗体が先に製造され
た方法と同じ方法で不溶性化することができる。
好ましくは、抗体はそれをポリスチレンビーズま
たはポリプロピレン試験管内底へ吸着させること
によつて不溶性化される。 標識した抗AG抗体は新規であると思われる。
前述のCEAに対する標識のどれもがAG抗体にも
使用でき、他の標識した抗体と同じ方法で製造さ
れる。例えば、放射標識した抗CEA抗体の製造
法を記載する米国特許第3927193号参照。好まし
い標識は酵素およびラジオアイソトープであり、
最も好ましいのは放射性ヨードである。放射性ヨ
ード化のための好ましい方法は、Dermody et
al.，“Clinical Chemistry”25(6)；989−995
（1979）またはParsons et al.，“Analytical
Biochemistry”95：568−574（1979）に記載され
ているようにクロラミン−Ｔまたはラクトペルオ
キシダーゼ、（ 125I）ヨードヒドロキシフエニル
プロピオネート−Ｎ−ヒドロキシスクシニメート
エステル（Bolton et al.，“Biochem.Journal”
133：529−533〔1973〕）、（ 125I）ジヨードフルオ
レセインイソチオシアネート（Gabel et al.，
“Analytical Biochemistry”86：396−406
〔1973〕）、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−（125I）
ヨードチロシン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエ
ステル（Assoian et al.，“Analytical
Biochemistry”103：70−76〔1980〕）、またはIC1
（Montelaro et al.，“Analytical
Biochemistry”99：92−96〔1979〕）のような外
部放射性ヨード化小分子を使用する。クロラミン
Ｔ法が好ましい具体例である。 本発明は以下の実施例にさらに詳しく記載され
る。 実施例 １（参考例） AG抗体（ヘキストまたはマイルス）をこの意
図した実施例およびGreenwood et al.，
“Biochem.J.”89：114−123（1963）の方法によ
つて 125Iで標識した。抗体の50μｇ部分標本を
Greenwoodらの方法で処理し、セフアデツクス
Ｇ−50のカラムを通過させることによつて遊離ヨ
ードを分離した。標識した抗体分画は、５％子ウ
シ血清および抗菌剤として0.1％NaN3を含む希釈
液中に約3μCi／mlに希釈される。製品は４℃で
貯蔵する。 実施例 ２ この方法は無傷のCEAを測定するための企図
された改良サンドイツチイムノアツセイを記載す
る。 CEAは結腸の一次アデノカルチノーマの肝転
移から、該組織のWarringブレンダー中等量の蒸
留水中にホモジナイズすることによつて精製され
た。ホモジネートは8000rpmにおいて30分間５℃
で遠心することにより清澄化された。上清を1M
過塩素酸と混合し、沈殿を遠心によつて除去し
た。上清を蒸留水で５日間透析した。 タンパク質50mg／mlを含んでいる過塩素酸抽出
分画をPH7.8の0.05Mリン酸緩衝液で平衡化した
セフアデツクスＧ−200カラム（170×1.5cm）で
ゲルロ過することによつて精製した。溶出液を４
mlづつの部分標本として集め、タンパク質を
280nmにおいて、そしてCEAをラジオイムノア
ツセイでモニターした。溶出液の最初のタンパク
質ピーク（空隙体積）を集めて濃縮し、次にゲル
ロ過をくり返した。 CEA Ｐセグメント抗体は、上記CEA製剤の５
mgを完全なフロインドアジユバント中に乳化し、
エマルジヨンをウサギに注射し、CEAタイター
が上昇した後に血清20mlを採取し、そして抗血清
を非がん肝臓組織および正常ヒト血清へ吸着させ
ることによつて作られた。製剤は４℃で貯蔵し
た。 約１mlのCEA Ｐセグメント抗血清を米国特許
第3686346号によつてポリプロピレン試薬管の内
表面の底に塗布した。腸のアデノカルチノーマを
有することが既知の患者の血清試料0.1mlと、正
常コントロール0.1mlとを２系列塗布試験管中に
ピペツトし、12時間インキユベートした。結合し
ない試料を水で各試験管から洗浄し、実施例１に
おいて調製した標識したAG抗体0.3mlを各試験管
へ加え、24時間インキユベートし、結合しない標
識抗体を水で試験管から洗浄し、そして試験管へ
結合した放射能を測定した。試料試験管へ結合し
た放射能はコントロール中のそれよりも著しく大
であつた。 実施例 ３（参考例） この実施例は放射性ヨード化CEA製剤（ホフ
マン、ラ、ロシユ、＞1000000cpm）の精製法を記
載する。AGに対する不溶性抗体はAG抗体（ガ
ンマグロブリン−Dako）300mgを臭化シアン活性
化セフアローズ4B（フアルマシア）30mlへ結合す
ることによつて作られた。不溶性抗体は５×1.0
cmのカラムに充填された。 125I標識CEAの部分
標本を正常ウサギ血清と混合し、前記カラムへ注
ぎ、PH7.8の0.05Mリン酸緩衝液で溶離し、２番
目の部分標本を注加した直後５℃で一夜インキユ
ベートし、正常ウサギ血清0.1mlをカラムに注加
し、そしてカラムをリン酸緩衝液で溶離した。こ
れらの分画を未結合分画と呼ぶ。結合分画は未結
合分画を集めた後、両方の場合ともPH2.2の0.1M
グリシン緩衝援で溶離した。各分画の放射能をカ
ウントした。表１はその結果を記録する。 【表】 トレーサーの少量がカラムに残るので、結合お
よび未結合放射等は全体で100％に達しない。同
様な結果は他の２供給源（ヘキストおよびマイル
スラボラトリーズ）からのAG抗体を使用した放
射性ヨード化CEAのポリエチレングリコール促
進沈殿法によつて得られた。殆んどすべての結合
溶離放射能はAG抗体（Dako）でも、CEA抗体
でも沈殿したが、しかし未結合分画中にはコント
ロールに比較して有意な沈殿放射能は発見されな
かつた。AG抗体を結合するCEAは、(1)AGはAG
抗体からのCEA放射能を用量反応的に置換し、
(2)他の血清タンパク質に対する抗血清はCEAを
沈殿しないことから免疫特異性であることが示さ
れた。 結合した溶離分画は、市販CEA測定キツト
（CISおよびホフマン、ラ、ロシユ）の未精製ト
レーサーに代えて用いられた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a) テスト試料をCEAのＰセグメントに対
する水不溶性抗体を含むテストマトリツクスと
接触させることと、 (b) テスト試料残部を除去することと、 (c) テストマトリツクスを標識したAGに対する
抗体と接触させることと、 (d) 未結合の標識した抗体を除去することと、 (e) 結合した、または結合しない標識を測定する
ことよりなるテスト試料中のCEAの定量方法。 ２ テスト試料残部および未結合標識抗体は洗浄
によつてテストマトリツクスから除去される特許
請求の範囲第１項の方法。 ３ テスト試料はCEA Ｐセグメント抗体との接
触以前に加熱、または糖タンパク質溶媒で抽出さ
れない特許請求の範囲第１項の方法。 ４ テストマトリツクスはCEAのＰセグメント
に対する水不溶性抗体を含む特許請求の範囲第１
項の方法。 ５ 標識はラジオアイソトープまたは酵素である
特許請求の範囲第１項の方法。 ６ テストマトリツクスはポリオレフイン試験管
であり、前記抗体は該試験管の内表面への吸着に
よつて水不溶性にされる特許請求の範囲第１項の
方法。
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|---|---|---|---|
| US06/269,217 US4489167A (en) | 1981-06-02 | 1981-06-02 | Methods and compositions for cancer detection |
| US269217 | 1981-06-02 |
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
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|---|---|
| JPS58758A JPS58758A (ja) | 1983-01-05 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57095572A Granted JPS58758A (ja) | 1981-06-02 | 1982-06-02 | がん胎児性抗原の定量方法 |
| JP2040884A Granted JPH02238000A (ja) | 1981-06-02 | 1990-02-20 | がん胎児性抗原の精製法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2040884A Granted JPH02238000A (ja) | 1981-06-02 | 1990-02-20 | がん胎児性抗原の精製法 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| US4962187A (en) * | 1984-11-28 | 1990-10-09 | Cota Biotech | Common antigen for colorectal and mucinous ovarian tumors and process for isolating the same |
| GB8618443D0 (en) * | 1986-07-29 | 1986-09-03 | Univ London | Monoclonal antibodies |
| US5231009A (en) | 1986-08-13 | 1993-07-27 | Molecular Diagnostics, Inc. | Cdnas coding for members of the carcinoembryonic antigen family |
| US5122599A (en) * | 1986-08-13 | 1992-06-16 | Molecular Diagnostics, Inc. | CDNAS coding for members of the carcinoembryonic antigen family |
| US6022958A (en) * | 1986-08-13 | 2000-02-08 | Bayer Corporation | cDNAs coding for members of the carcinoembryonic antigen family |
| US5241052A (en) * | 1988-03-04 | 1993-08-31 | New England Deaconess Hospital Corporation | Carcinoma orosomucoid-related antigen, a monoclonal antibody thereto, and their uses |
| US4914021A (en) * | 1988-03-04 | 1990-04-03 | New England Deaconess Hospital Corporation | Carcinoma orosomucoid-related antigen, a monoclonal antibody thereto, and their uses |
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