JPH0245537A - 固相タンパク質配列決定用膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ド及びタンパク質の配列決定を可能にするためのべブチ
ド及びタンパク質を固定化する材料に関する。本発明の
材料はペプチド及びタンパク質を共有結合し、適当な物
理的性質及びタンパク質を配列決定するのに最適な化学
的官能性を示す。

従来の技術 タンパク質のアミノ酸配列を決定することは最近の分子
生物学にとって非常に重要である。タンパク質及びペプ
チドは全ての生細胞の必須成分であり、細胞壁及び細胞
膜の構造要素、酵素、免疫グロブリン／抗体、輸送分子
、ほとんどのホルモンである。タンパク質のビルデング
ブロックは２０個の天然アミノ酸がアミド結合により一
緒に共有結合され、こうして線状タンパク鎖を形成した
ものである。アミノ酸配列（１次構造）はタンパク質の
生物学的機能を負う極めて複雑な２次及び３次構造を決
定する。

タンパク質或はプロティンの配列は、大体において、ア
ミノ−（Ｎ−）或はカルボキシル＝（Ｃ）のいずれかの
末端から段階的に化学的或は酵素的に減成して判読する
ことができる。ポリペプチド鎖から単一アミノ酸を一つ
ずつ取り、分離して同定する。段階的に化学或は酵素減
成する方法がいくつか考案された（エリジンガ（Ｅｌｉ
ｚｉｎｇａ）。

ＭＩ編集、メンズインブロティンシークエンシング，ヒ
ューマンプレス，クリフトン，ニュージャ巷〒．４：２
８３頁（１９５０年））。

エドマンが記載する方法では、ポリペプチド鎖から１個
のアミノ酸残基を取り去る化学的手順は３段階から成る
。初めに、ポリペプチドのアミン末端をイソチオンアネ
ート（ＩＴＣ）、例えばフェニルイソチオシア不一ト（
ＰＩＴＣ）と溶媒中、塩基性或は無水条件下で反応させ
てフェニルチオカルバメート（ＰＴＣ）を生成する。こ
の段階は通常「カップリング」と呼ばれる。第２に、無
水酸（例えば、トリフルオロ酢酸、ＴＦＡ）の影響下で
、ＰＴＣは環化してアニリノチアゾリノン（ＡＴＺ）に
なり、ポリペプチド鎖からの最後のＮ−末端アミノ酸の
開裂が相伴う。この段階は通常「開裂」と呼ばれる。こ
れはポリペプチド鎖中の次の隣接するアミノ酸のアミノ
基を次の反応サイクルのために暴露させる。ＡＴＺ誘導
体は相対的に不安定であり、よって、第３段階で、水性
酸く例えばＴＦＡ）によって処理して安定なフェニルチ
オヒダントイン（ＰＴＨ）に転化させる。この段階は通
常「転化」と呼ばれる。１つのサイクルのケミストリー
を下記の反応で示す。

ｌも ＡＴＺアミノ酸 １’ＴＨ−アミノ酸 天然アミノ酸の２０　Ｐ　Ｔ　Ｈ誘導体を分離する条件
を高性能液体クロマトグラフィー（［（Ｐ　Ｌ　Ｏ）に
よって求めた。２０　Ｐ　Ｔ　Ｈアミノ酸誘導体の保持
時間が特異なことにより、各々それぞれのサイクルによ
って取り出されるアミノ酸を同定することができる。

アミノ酸を１個だけ短くしたポリペプチドに次の減成サ
イクルを行って配列中に第２のアミノ酸誘導体を供給す
る。ポリペプチド鎖中のアミノ酸の各々について前述の
段階を繰り返して配列を決定する。

エドマンケミストリーのいくつかの変法が提案された二
上記の「液相法」は「スピニングカソク自動シークエン
サー」として自動化されたくエドマン、Ｐ及びベツグ（
Ｂｅｇｇ）　、　Ｇ、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１巻：８０頁（１９６７年）及び
米国特許ａ、　７２５．０１０号）。

エドマンペプチド配列決定において固体支持体を初めて
用いることをジュロウダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）がメ
ンツズインエンジモロジー、１１巻４５５Ｅｆ（１９６
７年）に記載した。この方法では、ペプチド或はタンパ
ク質を紙スリップに適用した。その物質は、配列決定プ
ロセス中、共有結合を形成しないで、紙に吸着されたま
まであった。紙ストリップ及び吸着されたポリペプチド
を気相試薬に暴露させてカップリング及び開裂を行った
。それ故に、このプロセスは気相配列決定と呼ばれる。

そのプロセスはヒユーイック（Ｈｅｖｉｃｋ）、　　Ｒ
０Ｍ　、等がＪ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　＋　２
５６巻、７９９０頁（１９８１年）に記載する通りに自
動化された。残念なことに、この方法は配列決定反応の
間、紙ストリップの表面に不溶性のままのタンパク質に
ついてのみ満足に働いただけであった。よって、その方
法は極めて制限された条件下で実施しなければならなか
った。

上記の制限の結果、配列決定に用いる溶媒は揮発性であ
りかつカップリング段階の後に試薬を定量的に除くこと
を可能にするように注意深く選ばなければならない。シ
グナルを最大にするために、ＡＴＺ誘導体の開裂及び転
移は、固体支持体からタンパク質を何ら溶離させずに行
わなければならない。加えて、使用する溶媒及び試薬は
全て乾燥／蒸発によって紙表面から除き得るにすぎない
ので、それらは純度が非常に高くなければならない。

不揮発性不純物がいくらかでも残ると次のＰＴＨ誘導体
の決定を妨げる。

残念なことに、気相における反応は遅いので、配列決定
のためのサイクル時間はしばしば長くなる。これは、試
薬とタンパク質との接触が対流によってのみ行われるに
すぎないからである。プロセスが気相試薬を用いること
により、速い反応速度、試薬の完全な抽出及びＡＴＺ誘
導体の除去を促進する撹拌及び／又は液体溶媒の使用は
可能でない。加えて、２０ＡＴＺ及びＰＴＨ誘導体の溶
解度は、２０の異なるアミノ酸側鎖の性質が異なること
により、相当に異なる。よって固体支持体から誘導体を
非共有に結合したタンパク質を失なわずに効率的に取り
去ることは困難である。

こうして、配列データは反応条件を折衷して得ることが
できるだけである。これが反応時間を長くし、かつまた
反応及び溶媒抽出を非効率にする。

従って、この方法によって配列決定することができるの
は比較的短かいタンパク質だけである。その上、気相配
列決定法は少世（ピコモルの範囲）のタンパク質を高感
度に配列決定するためには適していない。

気相配列決定法はタンパク質をポリブレン被覆したくポ
リブレンはアボットラボラトリーズの商標である）グラ
スファイバーフィルターに吸着させることによって相当
に改善された（ヒユーイック、Ｒ，Ｍ、等、Ｊ　、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　＋　　２５６巻ニア９９０頁（
１９８１年）及びタール（Ｔａｒｒ）　。

Ｇ、　Ｅ、等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　　
８４巻二６２２頁（１９７８年））が、依然重大な欠点
がある。例えば、ポリブレン被覆したグラスファイバー
フィルターは、サンプル適用する前に３〜５減成サイク
ルを行って抽出しなければならない。このブリサイクリ
ングはいくつかの不純物のバックグラウンドを実用的な
レベルに減少させるが、いくつかのＵＶ吸収性汚染物が
残ってＨＰＬＣ分離及び同定する間にＰ　Ｔ　Ｈ誘導体
を共溶離する（ｃｏｅｌｕｔ　ｉｎｇ）のを妨げる。こ
れは初期収率を予測し得ない、相対的に低いものにする
：例えば、くじら精子ミオグロビンについて、初期収率
２５％（エシュ（Ｅｓｃｈ）、Ｆ、Ｓ、＾ｎａ１．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、　１３６巻：３９頁（１９８４年）及び
７８％（ホーク（Ｉ（ａｗｋｅ）、Ｄ、　Ｈ，等、Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１４７巻：３１５頁（
１９８５年））が報告された。これに加えて、上述した
他の不利益が依然あてはまる。これらの不利益は非共有
的に捕捉されたポリペプチドの流出を防止するための折
衷から生じる。溶媒及び試薬を除くドライダウン段階が
多数あることにより、不純物は表面に濃縮され、超純粋
な（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ）試薬及び溶媒を使用すること
が必要となる。

３−アミノプロピル或はＮ、Ｎ、Ｎ−１−リメチルアン
モニウムブロビル基をグラスファイバーフィルターに共
有結合させることにより、ブリサイクリングが必要でな
（、かっＰＴＨアミノ酸誘導体の初期収率が高くなる点
で、事情をある程度改善した（エイバーソルド（Ａｅｂ
ｅｒｓｏｌｄ）、Ｒ，Ｈ，等、Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、、　２６１巻：４２２９頁（１９８６年））。タン
パク質をグラスファイバー表面に強く静電固定すること
により、バックグラウンドレベルもまた相当に減少させ
た。

前述した問題の内のいくつかを解決する液−固アフィニ
ティクロマトグラフィーが最近の特許（米国特許４．６
６５．０３７号）に記載されている。しかし、その方法
の使用効果を立証するタンパク質配列決定結果は挙げら
れていない。加えて、種々の親和性支持体及び試薬は合
成するのが難かしく、このプロセスを自動化するのは難
かしいと思われる。その上、上述したプロセスでは、ペ
プチド及びタンパク質を配列決定プロセスの前に化学的
に改質していくつかの側鎖官能価をブロックしなければ
ならず、さもないと親和性試薬を妨げることになる。

先の方法及び物質の欠点のほとんどはポリペプチドの固
体支持体への固定が非共有性であることから生じる。タ
ンパク質及びポリペプチドを固体支持体に共有結合させ
るならば、優れた配列決定手順を用いることが可能にな
る。この手順を固相配列決定と呼ぶ。

固相配列決定を実用的にするためには、二組の問題を処
理しなければならない： （１，）ポリマー支持体の選択、及び （２）支持体への共有固定化法。

種々の支持体がエドマンタンパク質配列決定ケミストリ
ーに関して使用されてきた。

例えば、何種類かの多孔質固体支持体は機能化したフェ
ニル基を有するポリスチレン主鎖をベースにしてきた。

フェニル基含有物質を有用な固相配列決定用支持体に転
化させる代表的な反応を下記に挙げる： ［Ｆ］＝ポリスチレン 上記の初めの反応で、フェニル基を有するポリスチレン
をクロロメチルで機能化して物質（１）を形成した。こ
れを次いでエチレンジアミンで処理して（２−アミノエ
チル）−アミノメチルポリスチレン（樹脂（２）と表示
する）に変換する。（ローセン（Ｌａｕｒｓｅｎ）、Ｒ
６Δ、　、　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　２
０巻：８９頁（１９７１年））。ペプチドをこの支持体
に高い収率で結合させることができたが、酸の疎水性ポ
リマーへの浸透が不良なためにＴＦＡ段階における開裂
が不完全なことにより、配列の重なりが重大であった。

アミノ基を主鎖フェニル環に付加して樹脂（３）として
、ＴＦＡの膨潤性は大きく向上するに至った（ローセン
、Ｒ，Ａ、等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２１巻コ
ロ７頁（１９７２年））。

ＴＦＡがもたらす酸性条件下で、アミ７基はプロトン付
加され、これより、樹脂の極性は増大される。

ジイソチオシアネート結合法のそれ以上の発展は、ロー
セン等がＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ、、　２１巻＝６７頁（
１９７２年））に記載している。アミノポリスチレン樹
脂（４）は、ペプチド結合の場合の樹脂（３）と同等に
満足すべきものであることが立証された。

（４）の製法は（３）よりもずっと容易であり、それで
（４）は急速にこの結合法についてのえり抜きの樹脂に
なった。しかし、アミノポリスチレン樹脂は、アリール
アミンの求核性が比較的乏しいため所定のカルボキシル
活性化ケミストリーによってペプチドを固定化するには
それ程効率的でないことがわかった。

ホーン（Ｈｏｒｎ）及びローセンはＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ。

３６巻＝２８５頁（１９７３年）においてトリエチレン
テトラミン（ＴＥＴＡ）樹脂（５）ヲ開発シた。該樹脂
は樹脂（３）の望ましい性質の多くを示し、加えて合成
がずっと簡単であるという魅力を有するものであった。

長鎖脂肪族アミン基は、また、試薬、並びにペプチド及
びタンパク質にずっと接近容易性であった。しかし、冷
凍下でさえ、数カ月貯蔵した後に、安定性にいくつか問
題のあることがわかった。

ポリスチレンベースの樹脂は、固相タンパク質配列の初
期作業の多くで用いられて良い結果を得たが、製造及び
使用の両方の困難性を増大する固有の性質をいくつか示
す。例えば、置換及び架橋の両方の度合を注意深く調節
しなければならない。

良好な結果を得る樹脂のほとんどはジビニルベンゼン１
〜２％を架橋させた樹脂（メリーフィールド（Ｍｅｒｒ
ｉｆ　１ｅｌｄ）樹脂）から誘導された。樹脂の架橋度
が大きくなる程、試薬の透過度は著しく低下した。およ
そ１５％のクロロメチレン置換が最も実用的であること
がわかった。このレベルを上げても単にメチレンブリッ
ジの架橋を増大するだけであった（パターソン（Ｐａｔ
ｔｅｒｓｏｎ）、　　Ｊ　、Ａ、、　ｒバイオケミカル
アスベクツオブリアクションズオンソリノドサポーツ」
、スターク（Ｓｔａｒｋ）、　　Ｇ、Ｒ。

編集、アカデミツクプレス、ニューヨーク。

１９７１年、１８９頁）。

代表的なエドマン減成サイクルの間に、所定の溶媒（例
えばピリジン或はＴＦＡ）中で樹脂が溶媒誘起膨潤した
後に、他の溶媒（例えばメタノール）中で収縮すること
は、樹脂を直接反応塔に充填した場合に閉塞や溶媒チャ
ンネリングによる問題を相当に生じた。ローセンはこの
問題を、樹脂に５０倍過剰のガラスピーズを混合して塔
に充填することによって一部解決した（ローセン、Ｅｕ
ｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　２０巻：８９頁（１９７１年
）参照）。

ニれは、ビーズの間の隙間で膨潤を起こさせて害を与え
ないようにするものであった。インマン（Ｉｎｍａｎ）
等はその問題を一層直接に挙げて、架橋度の高いポリス
チレンから誘導した樹脂を作った（「ソリッドフェース
メソッズインプロラインシーケンスアナラシス」、プレ
ピエロ（Ｐｒｅｖｉｅｒｏ）。

Ａ、及びコレソチ（Ｃｏｌｅｔｔｉ）−ブレビｆｆ１ｆ
ｆ、　Ｍ、Ａ、。

編集、ノースホランドプレス、アムステルダム。

１９７８年、８１頁）。生成した物質は極めて非圧縮性
であり、極めて耐溶媒誘起化容積変化性であり、大きい
試薬接近容易な表面積を保持していた。

初期のポリスチレン樹脂のそれ以上の１つの欠点は、マ
トリックスが大きいタンパク質或はペプチドを透過させ
ないことであった。効率的な結合についての実用限界は
一般に長さがほんの３０〜５０残基のペプチドであると
考えられた（ローセン、Ｒ，Ａ、及びマクレイト（Ｍａ
ｃｈｌｅｉｄｔ）　、　Ｗ、。

「メン、ズオブバイオケミカルアナラシス」、グリツク
（Ｇｌｉｃｋ）　、　　Ｄ、、編集、２６巻、２０１頁
（１９８０年））。

ポリスチレン樹脂に加えて、ポリアクリルアミド樹脂も
また固相配列決定用に用いられてきた。

ポリアクリルアミドとの代表的な反応を下記に挙げる： （ＣＨ２）６ すＨ Ｃ＝０ （Ｊｈ Ｃｌ（２ Ｎ夏１□ 初期の実験は、ポリアクリルアミドビーズ（Ｂｉ。

Ｇｅ１Ｐ、　　バイオ−ラドラボラトリーズ）及びエチ
レンジアミンから親水性配列決定用樹脂（６）を作るに
終った。カバドー（Ｃａｖａｄｏｕ）等、ＦＥＢＳＬｅ
ｔｔｅｒｓ、　　６６巻：１５５頁（１９７６年）は、
Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　　７０　（弱カチオン交換体）から酸
クロリドに転化した後にエチレンジアミンを反応させて
（６）と同様の樹脂を作って使用した。カバドー及びパ
レット（Ｍａｌｌｅｔ）　、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｎ、　８４巻：４０２頁（１９７８年）は、１，４−ジ
アミノベンゼンスルホン酸をポリアクリルクロリドにカ
ップリングして別の親水性活性ポリアクリルアミド（８
）を作った。次いで、遊離のアリールアミノ基を現場で
インチオシアネートに転化させた。スルホン残基は親水
特性を樹脂に付与し、イオン交換によって非共有性タン
パク質結合を増大させた。

アサ−トン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）等、　ＦＥＢＳ　　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ。

６４巻＝１７３頁（１９７６年）はまたベーターアラニ
ルへ牛すメチレンジアミン側鎖を有するポリアクリルア
ミド支持体（７）を作り、これをガラスピーズと混合し
て配列決定用支持体として用いて流れの問題を克服した
。

ポリアクリルアミドベースの樹脂は、初期のポリスチレ
ン支持体に比べて一層大きいペプチド及びタンパク質を
結合することができるが、依然重大な流れの問題に会っ
た。これらは、支持体の溶媒誘起膨潤及び収縮が流体流
路の閉塞を引き起こすことから生じた。樹脂はＴＦＡに
長期に繰り返し暴露されることに敏感であり、いくつか
の配列決定サイクルの後に塔から溶出する汚染物のレベ
ルが増大する１ζ至った。初期にある程度関心が持たれ
た後、上記のポリアクリルアミド樹脂の内で広く配列決
定において用いられるものは無くなった（ローセン、Ｒ
ｌＡ、及びマクレイト、Ｗ、。

「メソッズオブバイオケミカルアナラシス」。

グリツク（Ｃ１１ｃｋ）、　　Ｄ　、　＋編集、２６巻
、２０１頁（１９８０年））。

大部分、上述したポリマー支持体の性質が不良でありか
つ接近容易な表面積が限られていることから、固相配列
決定用のはるかに最も良好な結果を得られる支持体が、
制御細孔グラス（Ｃ，ＰＧ）をアルキルシランで誘導化
して作られてきた（マクレイト、Ｗ及びワヒター（ｆａ
ｃｈｔｅｒ）、　Ｅ　、、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、、　４７巻、２６３頁（１９７７年）参照
）。これらの材料をベースにした種々の支持体を下記に
示すニ アリールアミノガラス１４ ２つのタイプのＣＰＧ支持体が広く用いられてきた：Ｃ
ＰＧと３−アミノプロピルトリエトキシシランとを反応
させて作る３−アミノプロピルガラス（ＡＰＧ）（（９
）と表示する）（ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　、
　Ｐ、　Ｊ、　、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ。

２４２巻＝６５９頁（１９７１年）；ワヒターＥ、等、
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　３５巻；９７頁（１９７
３年）及びＣＰＧと対応するトリメトキシシランとを反
応させて得られるＮ−（２−アミノエチル）−３−アミ
ノプロピルガラス（Ａ　Ｅ　Ａ　Ｐ　Ｇ’）　（１０）
、（ブリッジエン（Ｂｒｉｄｇｅｎ）、　Ｊ、　、　Ｆ
ＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　５０巻：１５９頁（１９７
５年））。称呼細孔寸法大を有する制御細孔ガラスがほ
とんどの固相配列決定用途に適していると考えられた（
上記ローダン、Ｒ，Ａ、及びマクレイト、Ｗ、（１９８
０年）参照）が、清浄剤の存在において一層大きい（約
３０、　Ｇｏｏダルトンより大きい）タンパク質の一層
効率的な結合を、称呼細孔寸法５００人までのＣＰＧ支
持体を用いて達成することができた（例えば、ブリッジ
エン、　Ｊ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、、　４７巻：３２１頁（１９７７年））。

同相タンパク質配列決定が原理的に優れているのは、主
に、配列決定ケミストリーについての条件を選定する際
に、融通性が大きいことから来る。

しかし、過去の固相タンパク質配列決定は、ペプチド及
びタンパク質を固体支持体上に固定させる効率的な方法
が、特に極めて少量で作業する場合に、利用し得なかっ
たことから、ひどく限られた。

数多（の方法が用いられてきた：ホーン及びローセン、
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋　３６巻：２８５頁（１９
７３年）はタンパク質を臭化シアノゲン開裂した後に得
られたホモセリンラクトンを末端基とする断片をアミン
支持体に固定化した。リタリアン（Ｌ’　Ｉｔａｌｉｅ
ｎ）及びストリックラ−（Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ）。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　１２７巻＝１９８頁（
１９８２年）は水溶性カルボジイミドを用いてペプチド
をアルファーカルボキシル基によりアミン支持体に選択
的に共有結合させた。チャン（Ｃｈａｎｇ）等、ＦＥＢ
ＳＬｅｔｔｅｒｓ、　８４巻：１８７頁（１９７７年）
はジアゾフェニル支持体を用いてペプチドをチロシン側
鎖を通して結合させることを研究した。２つのアミノ官
能性支持体Ａ　Ｐ　Ｇ　（９）及びＡ　Ｅ　Ａ　Ｐ　Ｇ
　（ｔｏ）はまたペプチド或はタンパク質をシスティン
残基のスルフヒドリル基を経て固体支持体へ結合する前
駆体として働いた。これは、ＡＰＧとヨード酢酸とをジ
シクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）の存在にお
いて反応させてヨード−ガラス支持体（１３）を製造す
ることによって達成された。セリン、トリオエン及びチ
ロシンのヒドロキンル基との或はメチオニンとの併発反
応はほとんど或は何ら観察されなかった（チ＋７．Ｊ、
Ｙ、等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

７８巻：１４７頁（１９７７年））。アリールアミノ支
持体（１４）が、ＡＰＧ（９）と塩化ｐ−ニドベンゾイ
ルとを反応させた後に、アリールアミンをナトリウムジ
チオナイトで還元して作られた（ライ−トール（Ｗｅｅ
ｔａｌｌ）、　　Ｈ，Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　２１２巻：１頁（１９７０年））。この支
持体はカルボキシル機能をカルボジイミドで活性化した
後にペプチドを結合するのに特に適していることかわか
った。種々の結合方法が一層詳細にレビューに載ってい
る（ローセン及びマクレイト。

［メソノズオブバイオケミカルアナラシス」、グリツク
、Ｄ、１編集、２６巻、２０１頁（１９８０年））。

ペプチド及びタンパク質を固体支持体に結合させる断熱
液も広く用いられている方法はりジン残基のイプシロン
アミノ基と活性化インチオシアネート支持体との結合。

例えば（１１）或は（１２）に関係する。これらの支持
体はＡＰＧ（９）か或はＡＥＡＰＧ（１０）のいずれか
とｐ−フェニレン−１，４−ジイソチオシアネートとを
反応させて作られる（ワヒタ−Ｅ、等（１９７３年））
。タンパク質のアミノ基とイソチオンアネート部分との
反応は、温和な塩基性水溶液（ｐＨ８）中で、温度２５
〜５５°Ｃにおいて容易に達成される。清浄剤（例えば
、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ））、或は
カオトロビズム（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤、例えば３
Ｍ尿素或は飽和グアニジニウム塩化水素の存在すること
は結合ケミストリーに有意な効果を与えない（７クレイ
ト、ｗ、　等、ｒアドパンストメンツズインプロテイン
シークエンスアナラシス」、ウィットマンーリーボルド
（Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ）、　　Ｂ、。

サルニコフ（Ｓａｌｎｉｋｏｗ）、　　Ｊ、及びアート
マン（Ｅｒｄｍａｎｎ）　、　Ｖ、Ａ、、編集、スフリ
ンカー−ハーラク、バーリン、ハイデルベルグ、９１頁
（１９８６年）。

よって、タンパク質或はペプチドのＤＩＴＣ支持体への
結合は一般に固相配列分析の選り抜きの方法と認められ
ている。

初期のポリマー樹脂を越えるＣＰＧ支持体の利点は多数
ある。単位重量当りの非常に大きい表面積（代表的には
、称呼平均細孔寸法２００人の２００〜４００メツシユ
ＣＰＧの場合、１００１／ｇ）はタンパク質及びペプチ
ドについての結合容量を大きく向上させる（容、ｆｉｌ
Ｏ，２ミリモルアミン／ｇ支持体が代表的であり：シュ
ミット（ＳｃｈｍｉＬｔ）　、　　Ｈ、Ｗ　、　及びウ
ォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）。

Ｊ、Ｅ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　８１巻：、
４０３頁（１９７７年））。多孔質ガラス支持体上の官
能基は全ての種類の溶媒に接近容易性であり、硬質無機
マトリックスは全ての実用的な目的について非圧縮性で
ある。２００〜４００メツンユＣＰＧビーズから作った
支持体は連続流れ反応塔の効率的なバッキングとなり、
流体背圧は非常に小さい。

カップリング用媒体はペプチド及びタンパク質の溶解度
及びカップリングケミストリーの要求に従って自由に選
ぶことができる：例えば、ミトコンドリアのＡＴＰａｓ
ｅの疎水性ＤＣＣＤ結合サブユニットをクロロホルムと
メタノールとの混合物中でＤＩＴＣ活性化Ａ　Ｐ　Ｇ　
（１１）に結合させた（ワヒター　Ｅ、及びウイアハー
ン（Ｗｅｅｒｈａｈｎ）　、　Ｒ，＋「ソリットーフェ
ースメソッズインブロテインシークエンスアナラシス」
、プレピエロ、Ａ、　及びコレソチープレピエロ、Ｍ、
Ａ、、　編集、１−１ランドプレス、アムステルダム、
　　１８５Ｅ（（１，９７８年））。

多孔質ガラスピーズは反応塔において水性、並びに無水
有機溶媒と共に用いることができる。ガラスピーズの物
理的安定性が効率的なエドマン減成ケミストリーをデザ
インするのを容易にし、速度及びそれぞれの段階収率を
有意に向上させた（ウォーカー、Ｊ、Ｅ、、　等、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、、　　２３７巻＝７３頁（１９８
６年））。

代表的なエドマン減成の部分について必要とする高温（
５６°Ｃまで）及び塩基性条件（ｐＨ１，０１１）にお
いて表面シロキサン基ののろい加水分解的損失（おそら
く、サイクル当り、０．５％までの結合ペプチドを失う
）に関するわずかな問題は別として、ガラスピーズを固
相配列分析用に用いる主たる不利益はサンプル調製（ペ
プチド或はタンパク質のカップリング）及び取扱いの主
たる問題に関係する。

サンプル調製に関する代表的な一連の工程は下記の通り
である： （１）　　タンパク質或はペプチドを５０ｍＭ重炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，０）　　（おそらく、溶解性
を助けるためＳＤＳ　　１〜２％ｗ／ｖを含有する）０
、２−０．８　ｘ　Ｑに溶解し、溶液を１０−１００夏
９ＤＩＴＣＡＰＧ（１１）に加える。

（２）　　４０〜５０°Ｃで２〜４時間培養した後に、
ｎ−プロピルアミン０．２１Ｑを加えて支持体上の過剰
のインチオシアネート基をブロックする。

（３）次いで、ガラス／タンパク質懸濁液を遠心分離し
、上澄み液（すべての未結合ペプチドを含有する）を回
収する。

（４）　ガラスピーズを次いで小さいフリツテドフィル
ター漏斗に移し、重炭酸塩及びメタノール（微量のトリ
エチルアミン、ＴＥＡを含有する）で洗浄する。

（５）洗浄した支持体を次いで軽い減圧を数分間かけて
乾燥し、シークエンサー反応塔に乾燥状態で充填する。

同様の技法を上述したポリスチレンベースの支持体につ
いて用いる。各々の場合、これらの手順は注意深い注意
及び熟練技術を要し、少量のビーズ（代表的には１０１
．９より少ない）で作業する場合は、特にそうである。

ビード（ｂｅａｄｅｄ）支持体（ＣＰＧか或はポリスチ
レン樹脂のいずれか）を用いることは、また、タンパク
質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルから回収し、ノート
或は膜支持体に移すことを要するエレクトロブロノチン
グ技術を用いることを排除する。

ペプチド及びタンパク質を配列決定するための上記物質
及び方法は極めて有益であったが、それらの内の多くは
分子生物学における現行の要求を満足することができな
い。この分野における最近の発展はタンパク質及びペプ
チド配列をピコモル範囲及びそれ以下で決定することを
要する。これは、生物学的に大きな感心のあるタンパク
質の多くはこれらの少量で得られ得るにすぎないからで
ある。タンパク質のＮ−末端における短いペプチド配列
を確立すれば、対応する遺伝子を同定し、ＤＮＡ配列を
決定することによって全タンパク質配列を生じるのに向
けた実験を開示することが可能になる。正常な細胞或は
種々の疾患の有る組織（例えば、がん、変性神経疾患（
バリントン（Ｈａｒｒｉｎｔｏｎ、　Ｍ、Ｇ、及びメリ
ル（Ｍｅｒｒｉｌｌ）　。

Ｃ，に、、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
　３０巻：　１９３３頁（１９８４年）、遺伝病）に由
来する細胞からの１ｍなタンパク質パターンを、２Ｄポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を用いて１−１０ナノグ
ラム量のタンパク質を分離することによって視覚化する
ことができる（オファレル（０’Ｆａｒｅｌｌ）　。

Ｐ、Ｈ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５０巻：４
００７頁（１９７５年））。このような希なタンパク質
から配列情報を得ることは、ビード支持体について上述
したサンプル操作のタイプを可能にしない。

ＩＤ及び２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動の後にそ
れぞれのタンパク質を直接プロットすることができるフ
ラット支持体を利用し得ることが必要である。加えて、
これらの極めて少量のタンパク質をプロッチングプロセ
スの間にフラット支持体に共有的に固定化させる効率的
な方法も同様に必要とする。こうして、ポリアクリルア
ミドゲル片から電気溶出により或はＨＰＬＣ法（骨が折
れかつ回収率が非常に小さくなることが極めてしばしば
である）によるタンパク質の分離を回避することができ
る。

エイバーソルド等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２
６１巻：４２２９頁（１９８６年）；ケント（Ｋｅｎｔ
）、　Ｓ等、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　５巻　
３１４頁（１９８７年）；バンデカークホウブ（Ｖａｎ
ｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）、　Ｊ。

等、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｒａ、、　　１５２巻
二９頁（１９８５年）はグラスファイバーソートの表面
を３−アミノプロピルトリメトキシンランで誘導化し、
これからＤＩＴＣ類似体と反応させて活性化イソチオシ
アネート表面を作ってグラスファイバー（１１）を形成
した。ＤｒＴＣグラスファイバーを用いてＳＤＳポリア
クリルアミドゲルから直接エレクトロプロットしたタン
パク質を共有結合して配列決定して良い結果を得た（上
記エイバーソルド等（１９８６年）参照）。グラスファ
イバー紙の重大な欠点は、染色するための慣用のクーマ
シーブルーを用いてタンパク質を検出するのが困難なこ
と（上記エイバーソルド等（１９８６年）参照）、非最
適の織物がプロッチングプロセスの間、物質の緊密な接
触及び非変形の移動をもたらさないこと、タンパク質を
結合する容量が非常に小さいこと（７〜１０μｇ　／　
ｃ　ｘ　”の範囲）、及びグラスファイバーシーＩ・に
エレクトロプロットしたタンパク質をカップリングする
反復収率及び初期収率の両方が、タンパク質の存在する
量が少ない程、減少することである（ニーエン（Ｙｕｅ
ｎ）、　　Ｓ、等、アブライドバイオシスラムズユーザ
ープリチン、２４巻ホスターシティ−、カリフォルニア
（１９８６年））。

ペプチド或はタンパク質とグラスファイバー紙の表面上
のＩＴＣ基との間のカップリング反応が遅くなるにつれ
て、ペプチド或はタンパク質の捕捉プロセスはカップリ
ングの効率を増し、ＤＩＴＣ−グラスファイバー紙は、
ＤｒＴＣと反応した後に残されるアミ７基と静電的に相
互作用することによってのみこれをもたらすことができ
る。グラスファイバー表面上のアンモニウム基とペプチ
ド或はタンパク質の表面上の同様に荷電した基との間に
も反発作動があり得るので、これは予期し得ない、変動
し得る非能率なプロセスである。

ＤＩＴＣ−グラスファイバーシートが特に小さいペプチ
ドをカップリングするのに非能率であり、ピコモル範囲
及びそれ以下のタンパク質の配列に明らかに適していな
いことは自明である。

タンパク質の一層効率的なエレクトロブロッチングをも
たらすその他のフラット材料はニトロセルロース（トウ
ビン（Ｔｏｖｂｉｎ）、　　Ｈ，等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　７６巻：４３５０頁（１
９７９年））、ジアゾフェニル紙（リナート（Ｒｅｎａ
ｒｔ）　、　　Ｊ　、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ、　７６巻：３１１６頁（１９７
９年）、電荷改質されたナイロンシート（ガーショニ（
Ｇｅｒｓｈｏｎｉ）　、　　Ｊ、Ｍ、及びバラド（Ｐａ
１ａｄｅ）、　Ｇ　、　Ｅ　、、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、＋　１２４巻：３９６１（１９８２年））である
。ニトロセルロースはタンパク質の共有結合をもたらす
ようには機能化されなかったし、加えて、種々の配列決
定反応の間に溶解する。エドマン減成ケミストリーにか
けた際に、電荷改質ナイロンはつぶれて固体ペレットに
なり、ジアゾフェニル紙は配列決定法に伴う繰り返しの
サイクリングに耐える程に十分に物理的或は化学的に安
定ではない。ジアゾフェニル紙は、また、タンパク質の
結合を、比較的希なチロシン残基が存在する場合に限る
。

最近、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ；当分野でまた
ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）としても知られている
）膜が効率的なエレクトロブロッチング及び気相配列決
定用に用いられるようになった（マツダイラ、　　Ｐ、
、　Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６２巻：１００
３５頁（１９８７年）；プラスカル（Ｐｌｕｓｋａｌ）
、　Ｍ、Ｇ、等、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　４
巻：２７２頁（１９８６年））。ＰＶＤＦ膜がタンパク
質を結合する容量は、アンモニウム基で誘導化したグラ
スファイバーシートに比べて相当に良好である（ＰｖＤ
Ｆの場合１７０μ９／ｃｍ”であるのに対し、誘導化グ
ラスファイバーシートの場合７〜２５μ９／ＣｊＩ″；
マツダ４９，１９８７年参照）。

グラスファイバーシートにエレクトロプロットしたタン
パク質について得た初期収率１５〜２５％に比べて、Ｐ
ＶＤＦに吸着したタンパク質についての初期の配列決定
収率（７６〜９７％）もまた有利であった（上記マッダ
イラ。１９８７年参照）。

タンパク質についてＰＶＤＦ膜の極めて効率的かつ高い
吸着特性は他のいくつかの利点を有する。

タンパク質溶液は、膜表面にドツトプロットし、水で洗
浄して緩衝塩を除くことによって迅速に脱塩することが
できる。これに加えて、希釈タンパク質サンプルは、複
数のローディングにより膜表面上で何倍かに濃厚され得
る。

ＰＶＤＦは直接気相タンパク質配列決定用に用いられて
きた（マッダイラ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　
２６２巻：　１００３５頁（１９８７年））。タンパク
質がＰＶＤＦに吸着する機構は知られていないがタンパ
ク質とポリマー表面との間の疎水性或は双極子相互作用
から生じるのであろう。これより、ペプチド及びタンパ
ク質が固体支持体に非共有結合することから生じる上述
した不利益はＰＶＤＦにも同様に当てはまる。

米国特許４．３４０．４８２号は予備成形したＰＶＤＦ
膜の表面に高塩基性条件下でアミノ酸分子をグラフトす
るプロセスを記載している。強塩基性条件下で（特に相
転移触媒の存在において）、フッ化水素が除かれ、炭素
二重結合がもっばらＰＶＤＦ膜の表面」二で形成される
ことは明らかである（ディーアス（ＤＩａＳ）、Ａ、Ｊ
、１等、　Ｍａｃｒｏｍｏｂｃｕｌｅｓ＋１７巻：　２
５２９頁（１９８４年）。アミンとフルオロカーボンポ
リマーとの反応もまたプロ（Ｂｒｏ）がＪ　、Ａｐｐｌ
、Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ、＋　１巻＝３０頁（１９５
９年））に記載した）。プロは、アミンの影響下で、フ
ッ化水素（ＨＦ）が除かれた後に、アミンが二重結合に
付加されることを提案する。いくつかの反応は架橋し及
び第１アミンの付加部位における別のＨＦ分子の排除を
含んでイミノ構造を形成し、これが互変異性化してエナ
ミン構造になり得る結果として起こり得る（スミス、Ｊ
、Ｒ，等、　　Ｊ、Ａｐｐｔ。

Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ、、　５巻：４６０頁（１９６
１年））。

水性Ｋ　ＯＨがアミンに比べてＨＦを除く反応性に相当
に劣ることは明らかである（チャンバーズ。

Ｒ，Ｄ、等、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ、　ｌ　０巻：６２９頁（１９６３年））。

米国特許４．３４０．４８２号に記載されているプロセ
スにより、アミノ酸は明らかにアミン機能を経てＰＶＤ
Ｆの表面に共有的に結合され、該プロセスは疎水性ＰＶ
ＤＦ表面を親水性にする。ポリマー表面の性質を改質す
る異なる方法が米国特許４、６１８．５３３号に記載さ
れている。この特許では、適当なモノマーを微孔質構造
の溶媒接近容易な全ての表面積に共重合させることによ
って、恒久のコーティングを膜の表面にグラフトし及び
／又は付着させる。ヒドロキシプロピルアクレートのよ
うなモノマーをコーティングとして用いるならば、疎水
性表面を親水性表面に変換することができる。

１９８７年９月４日に出願した同時係属米国特許出願第
０９３．０１１号（ケスター（Ｋｏｅｓｔｅｒ）、　　
Ｈ、及びクール（Ｃｏａｌｌ）、　　Ｊ、Ｈ，、名称「
メンブレンズウイズバウンドオリゴヌクレオチズアンド
ペブチズ」）に、保護ヌクレオンド或はアミノ酸に結合
した化学的に誘導化した膜を記載している。これらの膜
は核酸及びペプチドを合成するのに有用である。

発明の構成 本発明は、ペプチド及びタンパク質を効率的に共有結合
させるのに及び固相タンパク質配列決定するのに適した
ポリマー支持体に関する。ポリマー支持体は微孔質膜形
成性の薄い、フラットな軟質性シートであり、該シート
は均一な連続多孔質構造及び溶媒接近容易な表面積上に
ペプチド及びタンパク質と反応して共有結合を形成する
ことができる官能基を有する。膜表面は単一タイプの官
能価或は異なる官能価の混合物を保持してペプチド及び
タンパク質のアミノ酸側鎖における１つ或はいくつかの
異なる官能基の方に向いた化学反応性を有する膜表面に
することができる。膜の官能価に応じて、タンパク質に
ついた特異な官能基に対する膜の反応性を規定すること
ができる。

誘導した膜の総括の化学的性質は、ポリマーの特有のタ
イプ、コーティング材料の存在、膜表面の官能基に応じ
て、疎水性か或は親水性のいずれかになることができる
。

本発明の誘導化膜は、従来固相タンパク質配列決定用に
用いられた固体支持体と異なる利点を数多く提供する。

例えば、膜表面の多孔質構造から生じる大きい表面積に
より、タンパク質及びペプチドを固相に極めて効率的に
共有結合させるのを可能にする。

加えて、材料がフラットな軟質性膜であるため、タンパ
ク質或はペプチドを分離性ゲル（例えば、−一或はニー
次元のポリアクリルアミド電気泳動ゲル）から直接膜表
面に移動させるプロッチングの間に、共存カップリング
を行うことができる。

よって、配列決定プロセス用の結合タンパク質或はペプ
チドを作るのに、それ以上の取扱い、分離或は精製が必
要でない。追加の処理加工工程を排除することによって
、プロットして材料の損失を相当に排除することができ
る。

その上、膜の構造がフラットで軟質性であることにより
、種々の形状に形成することができ（例えば、ロール掛
けにより）或は事実上任意の形状に切断することができ
る。加えて、水膜は固定化プロセスを簡単にしかつ物理
的及び化学的に多能であることから、自動化配列決定シ
ステムにおいて用いるのによく適している。

膜に移したタンパク質バンド或はスポットを、例えばク
マシーブルー、銀染色或は放射線標識を用いる慣用の染
色手順によって検出することができる。プロットした後
に、膜のタンパク質含有面積を簡単に切り取って直接配
列決定手順にかけることができる。代って、精製したペ
プチド或はタンパク質の利用し得る量が多ければ、材料
を直接膜にスポットすることができる。

ペプチド或はタンパク質を共有結合によって膜に結合さ
せるので、種々の溶媒或は試薬条件を配列決定反応に用
いることができる。これらは不純物を最少にしかつ膜上
のバックグラウンドシグナルを減少させることを望む強
いインターサイクル、並びに試薬のフロースルーによる
速い反応条件を含む。こうして、本誘導化膜は固相タン
パク質配列決定系が速いサイクル時間及び高い感度を達
成するのを可能にする。これは、タンパク質がピコモル
の量で存在する場合でさえ、極めて効率的なタンパク質
と膜とのカップリングから生じる。本発明の膜は、酸性
及び塩基性の両方の条件に耐性の材料を選ぶことにより
、特定のタンパク質配列決定プロセスにおいて用いるの
に限られず、むしろ広範囲の種々の化学的或は酵素的配
列決定プロセスについて実用性を有する。これらのプロ
セスは固相、液相或は気相で或はこれらを組合わせた多
相で実施することができ、かつ溶媒及び試薬を広いｐＨ
値の範囲で使用することができる。

好ましい実施態様の説明 本発明のポリマー膜は多孔質構造を有する薄い、フラッ
トな、極めて軟質性の膜である。護膜はペプチド及びタ
ンパク質を共有結合することができ、かつ化学的及び酵
素的タンパク質配列決定プロセスに耐えることができる
。ポリマー膜は種々の方法によって作ることができる。

最も広い実施態様では、膜はペプチド及びタンパク質を
共有結合することができるフラットな軟質性ポリマー組
成物である。

本明細書中で用いる通りのポリマー組成物なる用語は１
種或はそれ以上のモノマ一種から作った材料を言う。代
表的な材料は下記を含む：ポリオレフィン、例えばポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、等；
ポリスチレン或は置換ポリスチレン；フッ素化ポリマー
、例えばポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリニフッ
化ビニリデン、等；ポリスルホン、例えばポリスルホン
、ポリエーテルスルホン、等；ポリエステル、例工ばポ
リエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレー
ト、等；ポリアクリレート及びポリカーボネート；ビニ
ルポリマー、例えばポリ塩化ビニル、ポリアクリロニト
リル、加えて、コポリマー例えばブタジェンとスチレン
とのコポリマーフッ素化エチレン−プロピレンコポリマ
ー、エチレン−クロロトリフルオロエチレンコポリマー
等を適したポリマー材料として用いることができる。好
ましいポリマー材料はポリマーフルオロカーボン、例え
ばボリニフノ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）である。

ポリマー材料は多孔質構造を持つべきである。

好ましい実施態様では、膜は平均細孔寸法約０．００１
〜約１０．０ミクロンを有し、平均細孔寸法約０．１〜
約５．０ミクロンが最も好ましい。加えて、膜の少なく
とも１つのセクションは連続して多孔質にすべきであり
、それにより流体が膜を通って及び／又は膜を横切って
流れるのを可能にする。

膜は被覆するか或は未被覆のいずれかにすることができ
る。膜を被覆する場合、コーティングは好ましくは実質
的に膜の溶媒接近容易な表面積全体をおおうポリマーで
ある。

フリーラジカルによって重合を開始することができるな
らば及びモノマーの内の１つがペプチド及びタンパク質
を膜支持体上のコーティングに共有結合するのに直接或
は次に化学変換した後に用いることができる官能価を保
持するならば、膜を被覆する任意のモノマー或はモノマ
ーの組合せを使用することができる。コーティングの重
合は、コーティング付着の前、間或は後に実施すること
ができる。好ましい実施態様では、コーティングを架橋
し、架橋はコーティング付着の間か或は後のいずれかに
行う。

膜コーティングとして用いるのに適した代表的なモノマ
ーは下記を含む：ヒドロキシアルキルアクリレート或は
メタクリレート、例えば１−ヒドロキシプロピル−２−
アクリレート、２−ヒドロキシプロピル−１−アクリレ
−！・、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキ
シエチルメタクリレート、２−アミノエチルメタクリレ
ート、等或はこれらの混合物。その他の適した重合性モ
ノマーは下記のようなものを含むニアクリル／メタクリ
ル酸、アクリル／メタクリル酸エステル（例エバペンタ
フルオロフェニル−或は４−ニトロフェニルエステル）
、　２−Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート
、スルホエチルメタクリレート、等、アクリルアミド、
メタクリルアミド、エタクリルアミド、等。

適した重合開始剤及び薬剤は当分野でよ（知られている
。これらの詳細な検討及びコーテッドポリマーに関する
それ以上の検討については、上述した米国特許４．６１
８．５３３号を参照。

ペプチド及びタンパク質を共有結合する膜の能力は、膜
の表面に或は膜上のコーティングにかつまたペプチド或
はタンパク質それ自体に結合することができる求核基に
よってもたらす。好ましい実施態様において、疎水性ポ
リマーフルオロカー。

ボン、例えば好ましいＰＶＤＦの方に向いた疎水性求核
基の反応性を利用する。

広範囲の疎水性求核基がポリマーフルオロカーボンを誘
導化する際に用いるのに適している。最も広い実施態様
において、本発明で用いる求核基は下記の構造を有する
ニ −Ｎ−Ｙ ここで、Ｘは膜或は膜上のコーティングに結合すること
ができる官能基であり、Ｙはペプチド或はタンパク質を
共有結合することができる或はペプチド或はタンパク質
を共有結合するように誘導化することができる官能基で
あり、ＮはＸ及びＹを結合する働きをする結合ラジカル
である。結合配位子はアルキルラジカル、置換された或
は未置換のいずれかのフェニル環を有するアラルキルラ
ジカル、或は置換された或は未置換のフェニル環を有す
るアリールラジカルであるのが好ましい。後者の２つの
場合において、フェニル環のオルト及び／又はメタ位に
おいて水素置換が行なわれることができる。窒素、ハロ
ゲン及びシアノゲンが水素置換に適した種の例であるが
、このリストはこれらに限るつもりのものではない。

満足すべき求核基の１つのクラスは下記式を有するアル
ファ、オメガ置換されたアミノ及び／又はチオアルカン
である： Ｘ　　（ＣＨｚ）ｎ　　Ｙ ここでｎ＝２−２０．Ｘ及びＹは下記に示す通りである
： Ｘ　　　　　　　　　　　　Ｙ ＮＨｔ　　　　　　　　　ＮＨｘ ＮＨｔ　　　　　　　　　　５Ｈ ＮＨ２０Ｈ ＮＨ，Ｃ００Ｈ ３Ｈ３）（ ＳＨＱ）（ ＳＨＣ０ＯＨ このタイプの好ましい求核基は１．２−ジアミノエタン
、１．１０−ジアミノデカン、ジチオールｌ、　６−ジ
チオヘキサンのジアミン類を含む。

満足すべき求核基の第２のクラスは下記式のアラルキル
アミン及びアラルキルチオールである：ここで、アリー
ル基は未置換であるか或は置換されているかのいずれか
であり、Ｎ＝１−２０、ｍ＝１−３、Ｘ及びＹは下記に
示す通りである：Ｘ　　　　　　　Ｙ ＮＨ，ＮＨ。

Ｎ　Ｈ、Ｓ　Ｈ ＮＨ，０Ｈ ＮＨ，Ｃ００Ｈ ３ＨＳＨ ３ＨＮＨ。

ＳＨ０Ｗ ＳＨＣ００Ｈ ＯＨＳＨ ＯＨＮ　Ｈ。

Ｃ０ＯＨ５ｌ（ ＣＯＯＨＮＨ。

このタイプの好ましい求核基は２−（４−アミノフェニ
ル）エチルアミン、２−　（４−アミノフェニル）フェ
ネチルアミン、６−（４−アミノフェニル）ヘキシルア
ミン、１−チオ−（４−チオフェニル）エタンを含む。

満足すべき求核基の第３のクラスは下記式の第−或は第
ニアリールアミン及びアリールチオールである： ここで、アリール基は未置換であるか或は置換されてい
るかのいずれかであり、ｍ＝１−３、Ｘ及びＹは下記に
示す通りである： ＮＨ。

Ｈｔ ＮＨ。

ＮＨ。

ＯＨ ＯＨ ＯＨ ＮＨ。

ＯＨ ＯＨ ＯＯＨ ＯＨ ＯＨ ＯＯＨ このタイプの好ましい求核基は１．４−ジアミノベンゼ
ン、１．４−ジチオベンゼンを含む。

しかし、誘導化する求核基は上に挙げたものに限るつも
りではない。むしろ、求核基は広い範囲で用いることが
でき、下記を含み、これらに限定されないニアミノ基を
含有するポリマー、例えばポリビニルアミン、第二及び
／又は第一アミノ機能をいくつか有する化合物、例えば
スペルミン、スペルミジン、ポリエチレンイミン。上に
示した通すに、アルキル、アラルキル或はアリール結合
配位子上に混合アミノ及びチオール機能を有する化合物
もまた適している。これらの化合物の例は１−アミノ−
２−チオエタン（システアミン）、２−（４−チオフェ
ニル）エチルアミン、２−チオ（４−アミノフェニル）
エタン、４−アミノチオフェノールを含む。また、アル
キル、アラルキル或はアリール結合配位子を有する二官
能性化合物は１つの官能基として第−或は第ニアミノ基
か或はチオール基のいずれかを有し、かつ他の官能基と
してＯＨ基か或はカルボキシル基のいずれかを有するこ
とができる。よって、ＯＨ或はカルボキシル機能を膜の
表面上において、直接ペプチド或はタンパク質を共有結
合するのに用いることができるか、或は機能を規定した
第二誘導化のために用いた後にペプチド或はタンパク質
結合することができる。

上に挙げた例の多くは二官能性化合物のみを示すが、ポ
リビニルアミン、ポリエチレンイミン等の化合物がオリ
ゴ−或はポリ−官能価を膜に付与し得ることを指摘しな
ければならない。

上記の求核基を用いてＰＶＤＦ等の材料を誘導化する場
合、反応は多くのタイプにすることができる。例えば、
誘導は無機塩基を使用して強アルカリ性条件下で行なわ
れることができる。別法として、反応は相転移触媒を利
用することができ、或は好ましい実施態様において、反
応はアミン或はチオール置換された化合物をそれ自体を
用いて膜のカラーリゼーション（ｃｏｌｏｒｉｚａｔｉ
ｏｎ）及び脆性を回避するか或は最小にする。求核基を
疎水性或は双極子／双極子相互作用によって膜表面に付
着させるならば、反応は通常温和な条件下で進行する。

アミノ及びチオールの両機能を有する求核基とＰＶＤＦ
とを接触させる場合、チオール機能が反応して求核基を
膜表面に結合させ、それでアミ７機能を自由なままにし
てペプチド或はタンパク質を膜にカップリングすること
ができる。このカップリングは種々の方法を用いて達成
することができる。第１の方法では、ペプチド或はタン
パク性向のカルボキシル基を、カルボジイミド（好まし
くは水溶性のもの）を用いてアミノ基と反応させること
ができる。別法として、カルボキシル基をオメガ−チオ
ール置換されたカルボン酸、例えばチオグリコール酸と
の反応を経て膜の表面に導入することができる。この場
合、ペプチド或はタンパク性向のアミノ基を、カルボジ
イミドを用いてカルボキシル置換された膜に反応させる
。

発明の最も好ましい実施態様では、イソチオシアネート
機能を用いてアミノ官能価を有する膜を誘導化し、それ
でペプチド或はタンパク性向のアミン機能を膜上のアミ
ノ機能に共有結合する膜にする。これは、アミノ機能化
膜にジイソチオシアネートを反応させて容易に行なうこ
とができる。

種々のジイソチオシアネートを用いることができ、下記
を含み、これらに限定されない：アルキル鎖中に炭素原
子２〜ｌＯを有するアルファ、オメガアルキルジインチ
オシアネート（例えば、■、６ジイソチオシアナトへ牛
サン）；アルキル鎖中に炭素原子１〜１０を有しかつ３
個までのフェニル環を結合させたアラルキルジインチオ
シアネート（例えば、２−インチオシアナト−（４−イ
ンチオシアナト−フェニル）エタン）；可変数の水素原
子を窒素、ハロゲン、シアノゲンで置換させたアリール
ジインチオシアネート。代表的なアリールジイソチオシ
アネートは１．４−フェニレンジインチオシアネート、
２，５−ジクロロ−１，４−フェニレンジインチオシア
ネートを含む。

上述したタイプの種々の代表的な反応を下記のスキーム
Ｉ　（ａ）〜Ｉ　（ｅ）に示す。

スキーム１（ａ）では、第１ポリニフツ化ビニリデン（
ＰＶＤＦ）膜に、アルキル鎖上に炭素原子２〜２０を有
するアルキルジアミンを反応させる。

反応生成物に、次いでジイソチオシアネート、例えば１
，４−フェニレンジインチオシアネートを反応させてペ
プチド及びタンパク質を共有結合するための第１の完全
に誘導体合成されたＰＶＤＦ膜にする。１．４−フェニ
レンジインチオシアネートはＲいＲ１、Ｒ３及びＲ４基
を有し、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ３、Ｒ４基は各々独立に水素、
窒素、ハロゲン及びシアノゲンから成る群より選ぶ。

スキーム１（ｂ）では、第２のＰ　Ｖ’　Ｄ　Ｆ膜にア
ルキル鎖上に炭素原子２〜２０を有するチオアルミノア
ルカンを反応させる。反応生成物にスキーム１（ａ）の
ジイソチオシアネートを反応させてペプチド及びタンパ
ク質を共有結合するための第２の完全に誘導体合成され
たＰＶＤＦ膜にする。

スキーム１（Ｃ）では、第３のＰＶＤＦ膜にチオアミノ
ベンゼンを反応させる。反応生成物はペプチド及びタン
パク質を直接共有結合するのに有用であり、或は代って
、更にスキームｌ　（ａ　’）のジイソチオシアネート
を反応させてペプチド及びタンパク質を共有結合するた
めの第３の完全に誘導体合成されたＰＶＤＦ膜にするこ
とができる。

スキーム１（ｄ）では第４のｐ　Ｖ　Ｄ　Ｉ；’膜にポ
リビニルアミンを反応させる。反応生成物にスキーム１
（ａ）のジイソチオシアネートを反応させてペプチド及
びタンパク質を共有結合するだめの第４の完全に誘導体
合成された膜にする。

スキーム１（ｅ）では、第５のＰＶＤＦ膜にアルキル鎖
上に炭素原子１〜２０及び１〜３のフェニレン基を有す
るジアミノアラルカンを反応させる。

反応生成物はペプチド及びタンパク質を直接共存結合す
るのに有用であり、或は代って、更にスキーム１（ａ）
のジインチオシアネートを反応させてペプチド及びタン
パク質を共有結合するための第５の完全に誘導体合成さ
れたＰＶＤＦ膜にする。

ペプチド及びタンパク質を共有結合するのに適した官能
基は種々の方法によって被覆膜の表面に導入することが
できる。下記にスキーム２で表わす通りの好ましい実施
態様では、コーティングをヒドロキシル化し、それで膜
の表面上に−ＯＨ機能を与える。ヒドロキシル化コーテ
ィングを次いで１，１′−カルボニルジイミダゾール（
ＣＤＩ）等の材料で活性化した後に、前述の通りにして
誘導体を合成する。前の通りに、広範囲の求核基が誘導
体合成段階用に適しており、上述したアミノ及び／又は
チオアルカン、アラルキルアミン、アラルキルチオール
、アリールアミン、アリールチオールを含む。

好ましい実施態様では、膜表面上の−ＯＨ官能基を、ア
ミノ官能価を与えるやり方で誘導化する。

次いで、このアミノ機能を用いてペプチド及びタンパク
質を、カルボジイミドを用いてカルボキシリック基を経
て膜表面に共有結合することができる。しかし、最も好
ましい実施態様では、ジイソチオシアネートを用いて更
に膜表面を誘導化する。

これは表面にインチオシアネート官能価を付与し、これ
は膜表面を、アミノ基を経てペプチド及びタンパク質に
共有結合することができる。

代表的な膜誘導化反応をスキーム２（ａ）−２（Ｃ）に
表わす： スキーム２（ａ） スキーム２（ａ）では、第１のヒドロキシル化膜表面を
ＣＤＩで活性化する。このＣＤＩで活性化した表面に１
−３フエニレン基を有するアリールジアミンを反応させ
る。フェニレン基をオルト及び／又はメタ位置で置換す
るか或は未置換のいずれかにすることができる。生成し
た表面はペプチド及びタンパク質を直接共有結合するの
に有用であり、或は代って、更にスキーム１（ａ）に示
す通りにジイソチオシアネートを反応させてペプチド及
びタンパク質を共有結合するための第１の完全に誘導体
合成された被覆膜にすることができる。

スキーム２（ｂ） スキーム２（ｂ）では、第２のヒドロキシル化膜表面を
スキーム２（ａ）のようにＣＤＩで活性にする。ＣＤＩ
で活性化した表面に、次いで、アルキル鎖上に炭素原子
１〜２０及び１〜３フエニレン基を存するジアミノアラ
ルカンを反応させる。

フェニレン基をオルト及び／又はメタ位置で置換するか
或は未置換のいずれかにすることができる。

生成した表面はペプチド及びタンパク質を直接共有結合
するのに有用であり、或は代って、更にスキーム１（ａ
）に示す通りにしてジイソチオシアネートを反応させて
タンパク質及びペプチドを共有結合するための第２の完
全に誘導体合成された被覆膜にすることができる。

ｎ＝１−２０　　　ｍ＝１−３ スキーム２　（Ｃ）では、第３のヒドロキシル化膜表面
をスキーム２（ａ）に示す通りにしてＣＤＩで活性化す
る。このＣＤＩで活性化した表面に、次いで、アルキル
鎖上に炭素原子２〜２０を有するアルキルジアミンを反
応させる。反応生成物に、次いで、スキーム１（ａ）に
示す通りにしてジイソチオシアネートを反応させてペプ
チド及びタンパク質を共有結合するための第３の完全に
誘導体合成された被覆膜にする。

本明細書中に記載する誘導化膜はペプチド及びタンパク
質をマニュアル或は自動化固相配列決定するのに有用で
ある。ペプチド或はタンパク質の配列は、Ｎ−末端か或
はＣ−末端のいずれかから段階的に化学或は酵素減成し
て決定することができる。

配列決定するタンパク質を分離ゲルから移して膜に、直
接プロットするか或は電気プロットし、次いで−或は二
次元電気泳動するかのいずれかによって膜に共有結合す
ることができる。いずれの場合でも、タンパク質或はペ
プチドの任意の化学的或は酵素的分断及び精製を管理条
件下で直接膜表面上に行うことができる。これは配列決
定手順用に適した共有結合した断片をもたらし、直接か
つ簡便なプロセスで固定されていた。直接の固定化は自
動化配列決定法によく適したプロセスになる。

配列決定する間にタンパク質及びペプチドを膜表面に共
有結合することによって、数多（の利点を達成すること
ができる。配列決定する間の表面からのタンパク質損失
を最少にし、それで配列決定サイクルが繰り返されるに
もかかわらず、決定を極めて有効なままにさせることが
できる。加えて、共有結合は効率的なケミスト−及び配
列決定サイクルの間にきびしい洗浄段階を用いることを
可能にし、それで全配列決定時間を短縮させる。

きびしい洗浄は、また、高感度の配列決定法を用いるこ
とを可能にし、ＰＴＨアミノ酸のＨＰＬＣ分析を妨げ得
る化学不純物の量を減少させる。

官能基を用いてペプチド及びタンパク質を固体基質に共
有結合することを、何ら特定の配列決定法に限るつもり
はない。それと反対に、種々の異なる固相配列決定法が
当分野で提案されてきた。

本発明は、ペプチド及びタンパク質を固体支持体マトリ
ックスに共有結合することが望まれる全ての固相、液相
、気相或は多相配列決定法に実用性を有する意図である
。

しかしながら、好ましい実施態様では、好ましい配列決
定プロセスは前述したエドマン配列決定プロセスである
。本材料は、エドマン法の間に用いられる化学試薬が苛
酷であるにもかかわらず、物理的及び化学的の両方の性
質を保つことができるので、この方法にとって特に有用
である。

発明をここで、下記の例において、−層特別に示す。

何 例」２　ポリニフッ化ビニリデン膜とアミンとの反応 Ａ、マサチューセッツ、ベトフォード在ミリポアコーポ
レーションからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ　トランスファ
ー膜として市販されているボリニフッ化ビニリゾ７（Ｐ
ＶＤＦ）膜（１３ＸＩ３ｃＲ１細孔寸法０．４５μ）５
シートにメタノール３００ｊｌＱを湿潤させた。メタノ
ール湿潤材料を脱イオン水（５００ｚＬ）の皿に入れて
膜の表面からのメタノール除去を行った。血中の水を流
し、２分間隔で全５回フレッシュな脱イオン水に取り代
えた。水湿潤膜シートを次いで１，１０−ジアミノデカ
ンの０．１Ｍ水溶液４００ｘＱ中に浸漬して７５°Ｃに
保った。膜のシートをジアミン溶液に浸漬した後２．５
．４．０．８．０．１２．０及び２４．０分の間隔で取
り出した。

膜を、メタノール５００１を収容する皿に入れた。

血中のメタノールを流し、５分間隔で全４回フレッシュ
メタノール（２５０ｍＬ）に取り代えた。次いで、膜シ
ートを減圧乾燥した。ピクリン酸結合アセイを用いて膜
表面上に存在するアミン基の１を求めた。ピクリン酸結
合アセイは、膜の片（５ｍｇ）を精確に計り分け、それ
をジクロロメタン中のピクリン酸０．２Ｍ溶液で処理す
ることによって行った。膜断片をジクロロメタンで洗浄
し、新しく調製したジクロロメタン中４％のトリエチル
アミンｔｏ、ｏｚｇ中に２０分間入れた。脱ｊ？シたト
リエチルアンモニウムピクレートの吸光度を３５８ｎｍ
　（Ｅ３５８”１４，５００）において記録した。

結果を下記の表Ｉに挙げる。

表　　　１ 反応時間（分）　　　　ＵモルＮｉ＋、／ｇ膜２、５　
　　　　　　　　　５．８ ４、０　　　　　　　　　　６．６ ８、０　　　　　　　　　　６．８ １２、０　　　　　　　　　　　？、　０２４、０　　
　　　　　　　　　？、　５Ｂ、マサチューセッツ、ベ
トフォード在ミリボアコーポレーションからＩｍｎ＋ｏ
ｂｉｌｏｎ　Ｐ　トランスファー膜として市販されてい
るボリニフッ化ビニリデン膜のシート（１３Ｘ１３ＣＪ
Ｉ、細孔０．４５μ）にメタノール１００１ｉ２を湿潤
させて脱イオン水（５００ＪＩＩＬ）の皿に入れた。皿
中の水を流し、２分ごとに全５回取り代えた。次いで膜
シートを２（４−アミノフェニル）エチルアミンの０．
１Ｍ水溶液１００１１２中に２４時間浸漬し、５５°Ｃ
に保った。シートをアミン溶液から取り出してメタン−
ル１００峠を収容する皿に入れた。メタノールを流して
５分毎に全４回フレッシュメタノールに取り代えた。最
後のメタ／−ル洗浄の後に、シートを減圧で乾燥した。

例１、パートＡに記載するピクリン酸結合アセイはその
材料が乾燥膜１グラム当り約２４μモルのアミ７基を含
有することを示した。

Ｃマサチューセッツ、ベトフォード、ミリポアコーポレ
ーションから１ｍａ＋ｏｂｉｌｏｎ　Ｐ　ｔ−ランスフ
ァー膜として市販されているボリニフッ化ビニリデン膜
のシー）（１３Ｘ１３ｃｍ、細孔寸法０．４５μ）５つ
にメタノール３００ｊ！ｆ２を湿潤させた。メタノール
湿潤材料を脱イオン水（５００ｘＱ）の皿に入れて膜の
表面からのメタノールの除去を行った。皿中の水を流し
、２分間隔で全５回フレッシュな脱イオン水に取り代え
た。水湿潤膜シートを次いで５％（Ｗ／Ｖ）の水性炭酸
ナトリウム中ボノール５００　ＲＱを収容する皿に入れ
た。皿中のメタノールを流し、５分間隔で全４回フレッ
シュメタノール（２５０ｘｃ）に取り代えた。次いで、
膜シートを減圧で乾燥した。例１、パー１−Ａに記載す
るピクリン酸結合アセイを用いて膜表面上に存在するア
ミ７基の量を求めた。材料は乾燥膜１グラム当り約１０
．７μモルのアミノ基を含有した。

Ｄ、マサチューセッツ、ベトフォード在ミリポアコーポ
レーションからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ　トランスファ
ー膜として市販されているボリニフッ化ビニリデンのシ
ート（１０Ｘ３０ｃｍ、細孔寸法０．４５μ）３つにメ
タノールを湿潤させた。メタノール湿潤材料を脱イオン
水（５００１１２）の皿に入れて膜の表面からのメタノ
ールの除去を行った。次いで、水湿潤膜シートを、５５
％の水性水酸化テトラブチルアンモニウム１％（Ｖ／Ｖ
）を含有する３０％（Ｖ／ｖ）の水性エチレンジアミン
２００　ｘＱ中に５分間浸漬した。シートをエチレンジ
アミン溶液から取り出し、ロータリーフィルム乾燥機で
８５°Ｃにおいて１．２或は３分の間隔の間加熱した。

加熱した後に、シートを脱イオン水で長く洗浄し、減圧
で乾燥した。例１、パート八に記載するピクリン酸結合
アセイを用いて膜表面上に存在するアミノ基の量を求め
た。結果を下記の表Ｈに挙げる： 表　　■ 加熱時間（分）　　　　ＵモルＮＨ，／９膜１８．０ ２　　　　　　　　　　１１．０ ３　　　　　　　　　　　１３．５ 遅ス　　ボリニフノ化ビニリデン膜とチオールとの反応 Ａ、マサチューセッツ、ベトフォード在ミリボアコーポ
レーションからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐとして市販され
ているボリニフッ化ビニリデン膜（細孔０．４５μ）の
３　Ｘ　ｌ　ａｘ片にメタノールを湿潤させて脱イオン
水２５ＲＱを収容する皿に入れた。脱イオン水を２分毎
に全５回取り代えた。脱イオン水４．０１中に４−アミ
ノチオフェノール２．０ミリモル及びトリエチルアミン
２．５ミリモルを含有する溶液中に膜片を６５°Ｃにお
いて３５分間浸漬した。膜をメタ／−ルで洗浄して減圧
で乾燥した。ピクリン酸アセイ（例１、バートＡに記載
する）は、膜が乾燥ＭＬグラム当り約４．１μモルのア
ミ７基を含有することを示した。

Ｂ、ミリボアコーポレーションからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ
Ｐとして市販されているポリニフッ化ビニリデン膜（細
孔寸法０．４５μ）のＩ　ＣＩＸ　４　ｃｚ膜片つにメ
タノールを湿潤させて脱イオン水２５ｘ（ｌを収容する
皿に入れた。脱イオン水を２分毎に全５回取り代えた。

膜片を４０％の水性エタノールｔｏ、ｓｘＱ中水酸化ナ
トリウム２．０９及び２−アミノエタンチオールハイド
ロクロリド２．５ｇの室温溶液に浸漬した。膜片を種々
の時間に溶液から取り出して脱イオン水で洗浄した。片
をメタノールで洗浄した後に、減圧で乾燥した。各々の
片のピクリン酸結合容量（例１、パー１−Ａに記載する
）を求め、結果を下記の表■に挙げる： 」　　１ １５　　　　　　　　　　　　　３．７３３　　　　　
　　　　　　　　　４、４４ｇ　　　　　　　　　　　
　　　　４．５１１０　　　　　　　　　　　　　　６
．１１６９　　　　　　　　　　　　　　８、３２１２
　　　　　　　　　　　　　　８．７２５１　　　　　
　　　　　　　　１０、３県　アミン改質親水性膜の合
成 Ａ、先に検討した米国特許４．６１８．５３３号に記載
されかつミリポアコーポレーションからＤＶＰＰ膜とし
て入手し得る２−ヒドロキシプロピルアクリレート被覆
したポリニフッ化ビニリデンの１５．５ｃｚＸ　１９　
ａｍ膜片つを、１．１′−カルボニルジイミダゾール２
．０９を含有するアセトン４．０１１Ｑに室温において
１６時間入れた。次いで、膜をアセトンで洗浄して減圧
で乾燥した。

Ｂ、上記の活性化した膜の１５．５ｃａ＋Ｘ　ｌ　９　
ａｘ　（例３、バートＡに記載する）３つをアセトン中
０．５Ｍ１，４−フェニレンジアミンの溶液２０ＭＱ中
に室温において１６時間入れた。膜片をアセトンで洗浄
して減圧で乾燥した。ピクリン酸結合アセイ（例１、バ
ートＡに記載する）は、材料が乾燥膜１グラム当り１３
９μモルのアミノ基を含有することを示した。

Ｃ１上記の活性化した膜の１５．５ＣＩＸ　ｌ　９　ａ
ｍ　（例３、パー）Ａに記載する）３つをアセトン中０
．５Ｍ２−（４−アミノフェニル）エチルアミンの溶液
２０ｘＱ中に室温において１６時間入れた。膜片をアセ
トンで洗浄して減圧で乾燥した。ピクリン酸結合アセイ
（例１、バートＡに記載する）は、材料が乾燥膜１グラ
ム当り約１３０μモルのアミノ基を含有することを示し
た。

Ｄ、上記の活性化した膜の１５．５ｃｘＸ　ｌ　９ｃ貢
片（例３、バートＡに記載する）２つをアセトン中０．
５Ｍ１．３−ジアミノプロパンの溶液２０　ｘＱ中に室
温において１６時間入れた。膜片をアセトンで洗浄して
減圧で乾燥した。ピクリン酸結合アセイ（例１、バート
Ａに記載する）は、材料が乾燥膜１グラム当り約１３２
μモルのアミ７基を含有することを示した。

１　イソチオシアネート機能化膜の合成例１、パートＡ
、Ｃ，Ｄ；例２、ノく一トＢ；例３、パー１−　Ｄにお
いて誘導体合成した通りのアミ７機能化ＰＶＤＦ膜のシ
ートを、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の１，３
−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）或は２
，５°−ジクロロ１．４−フェニレンジイソチオシアネ
ート（ＤＣＤ　Ｉ　ＴＣ）の０．５　Ｍ溶液中に室温に
おいて浸漬した。３時間の後に、シートを乾燥ＴＨＦで
、次いでメタノールで洗浄した。膜を減圧で乾燥し、水
分を排除して一２０℃で貯蔵した。前述したピクリン酸
結合アセイを用いて種々の膜のサンプルをアミノ基の存
在についてアセイした。反応の収率を、膜表面上のアセ
イ可能なアミノ基の損失から計算した。結果を下記の表
■に挙げる：鯉五　　インチオシアネート機能化　に共
　　合しＡ２例４（Ｇ）に挙げる通りの膜ディスク（直
径Ｉｆ、　５ｃｍ）にメタノールを湿潤させ、脱イオン
水で洗浄した。次いで、水湿潤させたディスクを、０．
２５％（ｗ／ｖ）ナトリウムドデシルスルフェート ーリ、セントルイス在シグマケミカルカンノくニー）２
００ｐモルを含有する０．　２　Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．　８　）　０．　２　ｚＱ中に浸漬した
。ディスクをこの溶液中で（アルゴン下）５５℃におい
て３０分間インキュベートし、次いでｎ−プロピルアミ
ン０．０５％（　Ｖ　／　Ｖ　）を含有する脱イオン水
で洗浄した。

次いで、膜ディスクを直接自動化固相シークエンサー（
モデル８５００、マサチューセ・ソツ、ベトホード在ミ
リボアコーポレーションのミリゲン、デイビジョン）の
反応室に入れて本質的にＲ，Ａ。

ローセンがＢｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　、　２
　０巻：８９頁（１９７１年）に記載する通りにして３
０サイクルの固相エドマン減成にかけた。エドマン減成
ケミストリーをこうして遂行することの重要な特徴は、
開裂酸（ＴＦΔ）を含む全ての試薬及び溶媒を液体溶液
として反応室に送出することである。

インチオシアネート誘導化膜に共有結合しなかった全て
のタンパク質或はペプチド物質は反応室から溶出して廃
棄物になる。

開裂したアニリノチアゾリノン（ＡＴＺ）アミノ酸を３
０％（Ｖ／Ｖ）水性トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）中
で７０℃において１６時間インキュベートして、対応す
るフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体に転化さ
せた。シマーマン（　ｚｉＨｅｒｍａｎ）等、Ａｎａｌ
ｙｔ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、　７　７巻＝５６９頁（１
９７７年）に由来する方法を用いて、３ＱｃｚＸ３．９
ｉｘ５ミクロンｒＲｅｓｏｌｖｅＪ　Ｃ　−　１　８カ
ラム（マサチューセリン、ミルホード在ミリボアコーポ
レーション、ウォーターズクロマトグラフィーディビジ
ョン）の逆転相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ’
Ｃ）によってＰＴＨアミノ酸を同定した。クロマトグラ
フィー装置はウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６　０　０
　Ｅ流体ポンピング系、ウォーターズモデル７１２Ｄオ
ートサンプラー　ウォーターズモデル４９０ＵＶ／Ｖｉ
ｓ検出器から成るものであった。ウォーターズ８２０ク
ロマトグラフィーワークステーション及び「マキシマ（
Ｍａｘｉｍａ）Ｊデータ分析ソフトウェアを使用してＰ
ＴＨアミノ酸を２　６　９　ｎｍにおいて定量した。セ
リン及びトレオニン残基を、それらのベータ脱離生成物
の出現を３１３ｎｍにおいてモニターすることによって
確認した。

配列データをログ［ＰＴＨ収！！］対サイクル数のセミ
ログプロットに変え、線を回帰分析によって合わせた。

結果を第１（ａ）図に示す。このサンプルについて、初
期配列決定収量は９７．６ｐｍｏｌ　（初期サンプルの
４８％に相当する）であり、平均反復配列決定収率（合
わせた線の傾配から引き出す）は９４．８％であった。

Ｂ．例４（Ｅ）に挙げる通りの膜ディスク（直径１１、
５ｃｍ）にメタノールを湿潤させ、脱イオン水で洗浄し
た。水湿潤させたディスクを次いでワット７　：／　（
Ｗｈａｔｍａｎ）　４番ｉ戸紙（英国メイトストーン在
ワットマンリミテッド）の二重層の上にのせ、紙表面に
軽くプレスして過剰の水を除いた。次いで、ナトリウム
ドデシルスルフェート０．　２　５％（Ｗ／Ｖ）を含有
する０．　２　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８
）１５μＱ中の細菌モノオキシゲナーゼカンマサブユニ
ット３００ｐモルを直接ピペットで膜表面に移し、液滴
を毛管作用によって約１０〜１５秒かけて膜ディスクに
通してプロットさせた。この「ドツトプロット」プロセ
スはベースＰＶＤＦ膜のタンパク質結合特性を利用して
、タンパク質が膜を通過するにつれて、水溶液からタン
パク質を非共有に吸着する（Ｎ．ルジャンドル（ＬｅＧ
ｅｎｄｒｅ）及びＰ．マツダイソ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ。

６巻：１５４頁．１９８８年参照）。次いで、膜ディス
クを５０℃に２０分間暖めてタンパク質をイソチオシア
ネート基と共有に反応させ、直接配列反応室に入れ、上
述した通りにして３０サイクルについて配列決定した。

未加工のＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ　トレースの例は第２（ａ）〜
（ｆ）図に示し、各々のサイクルにおいてＰＴＨアミノ
酸の同定を妨げ得るＵＶ吸収材料のバックグラウンドレ
ベルが非常に小さいことを明瞭に立証している。

第２（ａ）　〜（ｆ）図はＤＩＴＣ活性化ＰＶＤＦに共
有結合した細菌モノオキシゲナーゼガンマサブユニット
の固相配列分析からの代表的なシークエンサーサイクル
データを示す。第２（ａ）図：シークエンサーサイクル
３；ロイシン、１４１ｐモル。

第２（ｂ）図：シークエンサーサイクル９；アスパラギ
ン酸、１０１ｐモル。第２（Ｃ）図：シークエンサーサ
イクル１３；アラニン、７７ｐモル。第２（ｄ）図：シ
ークエンサーサイクル１９；アラニン、５５ｐモル。第
２（ｅ）図：シークエンサーサイクル２５；グルタミン
［５Ｌ４８ｐモル。第２（ｆ）図：シークエンサーサイ
クル２８：アラニン、５０ｐモル。示したＨＰＬＣ分析
は回収した全Ｐ　Ｔ　Ｈ留分の６２．５％を構成する。

また、ログ［ＰｒＨ収！！］対サイクル数のセミログプ
ロットを第１（ｂ）図に示す。初期配列決定収量は２０
７ｐモル（初期サンプルの６９％に相当する）であり、
平均反復配列決定収率は９５．９％であった。

Ｃ８馬心臓ミオグロビン（タイプ■；シグマケミカルコ
ーポレーション）２ｍｇを、ベータメルカプトエタノー
ル１％（Ｖ　／　Ｖ　）を含有するｌＱｍＭトリスグリ
シン緩衝液（ｐＨ８，３）２峠中に溶解し、２分間沸騰
させた。次いで、小アリコー）　（１０μｅ）を勾配Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた（　ｌ　
ｆ３ｃｘＸ　ｌ　２ｃｘＸ　Ｑ、　ｌ　５ｃｘゲル；１
０〜２０％アクリルアミド勾配：２５ｍＭ１−リス、１
９２ｍＭグリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む緩
衝液を流す；７０ミリアンペア定電流で４時間電気泳動
する：タンク緩衝液を２０℃に冷却した）。トランスフ
ァー（Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ）エレクトｏ　７’　ｏット
装置（カリフォルニア、サンフランシスコ在ホウファー
（ｔ（ｏｅｆｅｒ）サイエンティフィックインストルー
メンツ）を使用して例４（Ｅ）の通りにしてＤＩＴＣ活
性化ＰＶＤＦシー１−（１０Ｑ真Ｘ１０ｃｍ）にエレク
トロプロットしてＳＤＳゲルからタンパク質サンプルを
回収した。ＳＤＳゲルを初めにトランスファー緩衝液（
２５ｍ　Ｍ　Ｉ−リス、１９２ｍＭグリシン、１０％（
Ｖ／Ｖ）メタノール）中で１５分間予備平衡させ、次い
で６０Ｖにおいて１．２５時間エレクトロプロットし、
タンク緩衝液を２０°Ｃに冷却した。膜をＭ、Ｒ，グリ
ーン（Ｇｒｅｅｎ）等のＡｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、　　５６巻：４３頁（１９７３年）の方法に従っ
てスティンソール（５ｔａｉｎｓａｌｌ）　（着色カチ
オン系染料）で膜を染色してプロットしたタンパク質を
可視化させた。染色されたタンパク質バンドを含む１１
．５ｉｍディスクを膜シートから切り取り、直接シーク
エンサー反応室に入れ、上述した通りにして３０サイク
ルの自動化固相エドマン減成にかけた。ログ［Ｐ　Ｔ　
Ｈ収率］対サイクル数のセミログプロットを第１（Ｃ）
図に示す。初期配列決定収量は７３ｐモルであり、平均
反復配列決定収率は９３．８％であった。

例５（Ａ）〜５（Ｃ）に記載しかつ第１（ａ）〜（ｃ）
に示すサンプルの各々について、配列データをログ［Ｐ
ＴＨＩＪｙ、ｆｆｉ］対サイクサイクル数ログプロット
に変え、線を回帰分析によって合わせた。カップリング
手順或はΔＴＺのＰＴＨへの転化手順（Ｓｅｒ、　Ｔｈ
ｒ、　Ｔｒｐ、　Ｃｙｓ、　Ｌｙｓ）によって一部破壊
された或は低い収率で回収されたＰＴｆ（アミノ酸残基
を回帰分析に入れなかった（ム）。初期配列収量をＹ軸
との切片から誘導した。平均反復配列決定収量は適合し
た線の勾配の真数をとって得た。

（Ｄ）　　例４（Ａ）の通りの膜ディスク（直径１１．
５ＣＩ＋）にメタノールを湿潤させ、脱イオン水で洗浄
した。次いで、ディスクを、Ｓ　Ｄ　３０．２５％（Ｗ
／Ｖ）及び馬心臓ミオグロビン（タイプ■：シグマケミ
カルコーポレーション）３００ｐモルを含有する０、　
１　Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，５）０．３ｙ
Ｉ（ｌ中に浸漬した。ディスクを溶液中で（アルゴン下
）５５°Ｃにおいて３０分間インキュベートし、次いで
ｎ−プロピルアミン０．０５％（Ｖ／Ｖ）を含有する水
で洗浄した。次いで、膜ディスクを直接シークエンサー
反応室に入れ、上述した通りにして１６サイクルの自動
化固相エドマン減成にかけた。初期配列決定収量は９８
ｐモル（初期サンプルの３３％に相当する）であり、反
復収率は９３．５％であった。

均　　等 当業者ならばせいぜい日常の実験を用いて、本明細書に
記載する特定の実施態様の多くの均等物を認める或は突
きとめることができよう。このような均等物は特許請求
の範囲に含むつもりである。

【図面の簡単な説明】

第１（ａ）〜（Ｃ）図は発明の代表的な膜に固定化した
タンパク質を配列決定するために配列データをログ（Ｐ
ＴＨ収１）対サイクル数のセミログプロットの形で示す
。 第２（ａ）〜（ｆ）図は発明の代表的な膜に共有結合し
たタンパク質の固相配列分析からの代表的な配列サイク
ルデータを示す。 第２（Ｃ）図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペプチド及びタンパク質を膜表面に共有結合させる
   官能基を有する、固相タンパク質配列決定法に関して用
   いるのに適した軟質性ポリマー多孔質膜。 ２、前記官能基を−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯ
   Ｈ、イソチオシアネート及びこれらの組合せから成る群
   より選ぶ特許請求の範囲第１項記載の膜。 ３、−ＮＨ＿２官能基をジイソチオシアネートと反応さ
   せ、それによりペプチド及びタンパク質を共有結合する
   ことができる誘導化膜にする特許請求の範囲第１項記載
   の膜。 ４、ポリマーフルオロカーボンを含む特許請求の範囲第
   １項記載の膜。 ５、ポリマーフルオロカーボンがポリ二フッ化ビニリデ
   ンを含む特許請求の範囲第４項記載の膜。 ６、ペプチド及びタンパク質を直接か或は更に化学誘導
   した後のいずれかで共有結合するのに適した架橋ポリマ
   ーを被覆したプラスチック材料を含む特許請求の範囲第
   １項記載の膜。 ７、架橋ポリマーが−ＯＨ官能価を有する特許請求の範
   囲第６項記載の膜。 ８、官能基を求核基によってもたらし、該求核基は膜表
   面或はその上のコーティングに結合することができる第
   １官能基、ペプチド及びタンパク質を共有結合すること
   ができる或はペプチド及びタンパク質を共有結合するよ
   うに誘導することができる第２官能基及び第１及び第２
   官能基を結合する有機結合ラジカルを有する特許請求の
   範囲第１項記載の膜。９、第１官能基を−ＮＨ＿２、−
   ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨから成る群より選ぶ特許請求
   の範囲第８項記載の膜。 １０、第２官能基を−ＮＨ＿２、−ＳＨ、−ＯＨ、−Ｃ
   ＯＯＨ及びイソチオシアネートから成る群より選ぶ特許
   請求の範囲第８項記載の膜。 １１、有機結合ラジカルをアルキルラジカル、アラルキ
   ルラジカル及びアリールラジカルから成る群より選ぶ特
   許請求の範囲第８項記載の膜。 １２、求核基が官能基を２個より多く含有する特許請求
   の範囲第８項記載の膜。 １３、求核基を１，２−ジアミノエタン、１，１０−ジ
   アミノデカン、２−（４−アミノフェニル）エチルアミ
   ン、２−（４−アミノフェニル）フェネチルアミン、６
   −（４−アミノフェニル）ヘキシルアミン、１，４−ジ
   アミノベンゼン、１，６−ジチオヘキサン、２−チオ（
   ４−チオフェニル）エタン、１，４−ジチオベンゼン、
   ２−アミノ−１−チオエタン、２−（４−チオフェニル
   ）エチルアミン、２−チオ（４−アミノフェニル）エタ
   ン、４−アミノチオフェノール、ポリビニルアミン及び
   ポリエチレンアミンから成る群より選ぶ特許請求の範囲
   第８項記載の膜。 １４、ペプチド或はタンパク質を固定させ、該ペプチド
   或はタンパク質を官能基によって膜に共有結合させる特
   許請求の範囲第１項記載の膜。 １５、イソチオシアネート官能基を有するポリ二フッ化
   ビニリデンを含む、固相タンパク質配列決定法に関して
   用いるのに適した軟質性多孔質膜。 １６、架橋ヒドロキシプロピルアクリレートを含む、イ
   ソチオシアネート官能基を有するコーティングを有する
   ポリ二フッ化ビニリデンを含む、固相タンパク質配列決
   定法に関して用いるのに適した軟質性多孔質膜。 １７、ａ、軟質性多孔質ポリマー膜を準備し、ｂ、膜に
   、膜或はその上のコーティングに結合することができる
   第１官能基、ペプチド及びタンパク質を共有結合するこ
   とができる或はペプチド及びタンパク質を共有結合する
   ように誘導することができる第２官能基及び第１及び第
   ２官能基を結合する有機結合ラジカルを有する求核基を
   反応させ、該反応は第１官能基を膜或は膜上のコーティ
   ングに結合させるようにする 工程を含む、ペプチド及びタンパク質を共有結合するこ
   とができる官能基を有する膜の製造方法。 １８、前記軟質性多孔質ポリマー膜がポリマーフルオロ
   カーボンを含む特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、ポリマーフルオロカーボンがポリ二フッ化ビニリ
   デンを含む特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、前記膜が誘導するのに適した架橋ポリマーを被覆
   したプラスチック材料を含む特許請求の範囲第１７項記
   載の方法。 ２１、架橋ポリマーが−ＯＨ官能価を有する特許請求の
   範囲第２０項記載の方法。 ２２、求核基を１，２−ジアミノエタン、１，１０−ジ
   アミノデカン、２−（４−アミノフェニル）エチルアミ
   ン、２−（４−アミノフェニル）フェネチルアミン、６
   −（４−アミノフェニル）ヘキシルアミン、１，４−ジ
   アミノベンゼン、１，６−ジチオヘキサン、２−チオ（
   ４−チオフェニル）エタン、１，４−ジチオベンゼン、
   １−アミノ−２−チオエタン、２−（４−チオフェニル
   ）エチルアミン、２−チオ（４−アミノフェニル）エタ
   ン、４−アミノチオフェノール、ポリビニルアミン及び
   ポリエチレンアミンから成る群より選ぶ特許請求の範囲
   第１７項記載の方法。 ２３、前記第１官能基を−ＮＨ＿２、−ＳＨ、−ＯＨ及
   び−ＣＯＯＨから成る群より選ぶ特許請求の範囲第１７
   項記載の方法。 ２４、前記第２官能基を−ＳＨ、−ＯＨ及び−ＣＯＯＨ
   から成る群より選ぶ特許請求の範囲第１７項記載の方法
   。 ２５、前記第２官能基が−ＮＨ＿２を含む特許請求の範
   囲第１７項記載の方法。 ２６、−ＮＨ＿２官能基をジイソチオシアネートと反応
   させ、それによりペプチド及びタンパク質を共有結合す
   ることができるイソチオシアネート官能基とする追加の
   工程を含む特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、有機結合ラジカルをアルキルラジカル、アラルキ
   ルラジカル及びアリールラジカルから成る群より選ぶ特
   許請求の範囲第１７項記載の方法。 ２８、求核基が官能基を２個より多く含有する特許請求
   の範囲第１７項記載の方法。 ２９、ａ、ペプチド及びタンパク質を共有結合すること
   ができる官能基を有する軟質性ポリマー多孔質膜を準備
   し、 ｂ、ペプチド或はタンパク質を膜表面に共有結合させ、 ｃ、ペプチド或はタンパク質を、サイクル当り１つのア
   ミノ酸誘導体をペプチド或はタンパク質から分離するよ
   うなサイクル方式でペプチドを化学的に減成し、 ｄ、各々の減成サイクルの後に各々の分離したアミノ酸
   誘導体を同定してアミノ酸配列を決定する 工程を含むペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列の決
   定方法。 ３０、エドマンタンパク質配列決定法を用いてペプチド
   或はタンパク質を配列決定する特許請求の範囲第２９項
   記載の方法。 ３１、前記工程を自動化手段を用いて実施する特許請求
   の範囲第２９項記載の方法。